动物行为学研究方法范文
时间：2024-01-02 17:55:54
导语：如何才能写好一篇动物行为学研究方法，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
1 神经行为学在药理评价中的应用
1.1 抗脑卒中药物的评价
一般用运动行为实验对脑栓塞动物模型（如大鼠）进行卒中后运动和协调能力的评价，从而判定药物是否对脑卒中后神经损伤恢复有效。运动整合及协调能力实验主要包括：平衡木实验、转棒实验、肌力实验、网屏实验、肢体对称实验、肢体放置实验、前肢放置检测、平行杠实验、爬绳实验、爬梯实验、前爪伸屈实验、步态分析实验等。然而，大脑尾状核、皮层和纹状区对运动 - 感觉信息的处理和整合起一定作用，这些区域在大脑中动脉梗死后很容易受损，并累及周围区域如肢体的皮层、额叶和颞叶。因此，目前认为缺血损伤后动物模型的神经行为学评价除了评估一般感觉运动功能，还应该将认知实验加入评估中。有证据表明，卒中后认知缺陷可持续超过一般的感觉运动缺陷。认知实验主要包括 Morris 水迷宫、放射状迷宫和 T 迷宫。
脑卒中动物模型在不同时期的行为学表现不同，因此行为学评价抗脑卒中药物，相关行为学指标表现出的敏感性，同时也存在着广泛的偏差，组织学检查结果和行为学实验相关，另一些则无关或相反。因此，当前的评价方法尚不能全面的反映脑卒中的生理病理状态，这就需要对模型生理病理指标与行为学指标相关性进行研究，综合多种方法进行评估，寻找最敏感稳定的行为学指标。
1.2 抗精神病药物的评价
焦虑模型主要分为 2 类：非条件反射模型和条件反射模型。其中比较经典的研究方法基于动物有畏惧空旷场地的天性和其活动具有趋避性而建立的旷场实验、避暗实验、高架十字迷宫和 Vogels 饮水冲突模型。
目前抑郁症行为学评价方法主要包括强迫游泳实验、悬尾实验、空场实验、获得性无助实验、新奇抑制摄食实验、糖水偏爱实验、间断性行为实验、睡眠干扰实验等。其中，动物强迫性游泳和悬尾测试是评价抗抑郁药作用最常用的方法，因其快速、方便、对多种抗抑郁药物有效，被广为接受和应用。然而，也有学者认为动物漂浮既可以是抑郁的表现，也可以是一种适应机制，动物以此节约能量，漂浮更长的时间，以维持更长的存活时间。
由于应激是导致焦虑和抑郁发生的重要原因之一，应激对心理情感、认知功能及反应判断能力等行为活动均产生影响，研究应激致动物行为方法主要有社会交互实验，动物可出现社会逃避及兴趣缺失的抑郁样行为，此外还有动物束缚实验、糖水偏爱实验、条件性防御掩埋实验、听觉惊跳实验等。
1.3 抗衰老药物的评价
神经退行性病变是由于神经元进行性变性死亡导致的以中枢神经系统损害为主的神经系统疾病，与年龄相关的大脑退行性变化是大脑中枢神经系统在生长、发育、成熟之后走向衰老过程中而表现的生物老化的正常生理现象。其最突出的临床表现是记忆和学习能力下降，因此抗衰老药物行为学评价主要考察对学习记忆障碍的作用。主要研究方法包括空间记忆和非空间记忆，在空间学习记忆中，采用 Morris 水迷宫、八臂迷宫、T 型迷宫、辐射式迷宫等方法。近年来新的认知方法出现，可以对空间学习记忆和非空间学习记忆进行测试，如物体认知测试系统，包含新物体的识别、新物置识别以及情景记忆和时序记忆。其中新物体的识别、情景记忆和时序记忆属于空间记忆；新物置识别属于非空间记忆。在条件反射方法中，非条件刺激可以是惩罚性的也可以是奖励性的。使用惩罚性条件刺激的行为检测方法如穿梭、跳台、避暗等已被广泛应用于学习记忆和巩固相关行为研究。但这些方法检测的学习记忆能力大多是基于对环境刺激的被动反应，而且需要给予惩罚性 / 伤害性刺激使动物完成学习记忆，对动物的生理及心理影响较大，同时影响神经递质的释放。而利用奖励物质的奖赏效应，大脑会向负责决策的区域发送奖赏信号，形成好的记忆。奖赏效应能使机体的认知能力进一步提升，形成良性循环，易化条件反射的形成。
1.4 其他药物的评价
神经行为学方法除了主要用于以上药物的评价，还用于抗疲劳药物、促进睡眠药物以及镇痛药物的评价中，抗疲劳药物大多具有兴奋中枢神经系统的作用，行为学检测主要采用游泳实验、转棒实验。促进睡眠药物主要采用阈下催眠实验。镇痛药物根据作用部位不同可分为中枢镇痛药和外周镇痛药，用于评价外周药物镇痛作用的方法主要有小鼠醋酸扭体实验；评价中枢镇痛药物的方法热板法、热辐射甩尾实验以及福尔马林测痛实验，目前新的研究方法有步态行为测试，通过研究动物运动的步态及足底压力评价药物的治疗作用。
2 神经行为学在药物安全性评价的应用
2.1 在一般毒性评价中的应用
神经行为学实验可以发现一些神经毒性的相关终点，长期毒性实验中增加对特异性终点的评价，可以提高实验动物的利用率，缩短危险评价所用的时间，并获得额外的数据。如评价抗抑郁药物的长期毒性实验可增加对动物自主活性的观察指标。而在一些不确定是否有神经毒性的创新药物评价中，神经毒性筛查也可与长期毒性实验相组合，筛查的目的在于确定是否需要进行附加的更加深入的神经毒理学实验，如步态异常有助于毒性部位的确定，例如下运动神经元疾病可致跨越步态；剪形步态和僵硬步态说明上运动神经元损害；小脑功能不良可致共济失调及步态蹒跚。关于神经系统的毒性特征，犹如靶器官毒性一样，能随染毒期限的长短表现不同。神经毒性作用的意义取决于它的可逆性，一般来说，不可逆作用较可逆作用严重，神经系统的区域对生理功能影响较其他系统更为重要。
2.2 在安全性药理评价中的应用
由于毒物对神经系统的作用范围很广，一般采用功能组合实验来评价药物对神经系统的安全性。目前动物神经行为测试还没有一套标准模式的神经行为功能测试组合，只是经济合作与发展组织（OECD）在感觉、运动、认知等方面推荐了一些测试方法，综合评价被测化学物质的神经行为毒性。国家食品药品监督管理总局（CFDA）规定中枢神经系统药物安全性评价可定性和定量评价给药后动物的运动功能、行为改变、协调功能、感觉 / 运动反射和体温的变化等，以确定药物对中枢神经系统的影响。当核心组合实验及文献报道提示药物存在潜在的与人体安全性有关的不良反应时，应进行追加和 /或补充的安全药理学研究。追加的安全药理实验是除了核心组合实验外，反映受试物对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统的深入研究。如追加的安全药理学实验对中枢神经系统的影响包括对行为、学习记忆、神经生化、视觉、听觉和 / 或电生理等指标的检测。
2.3 药物依赖性的评价
几乎所有的依赖性药物，如阿片、酒精、可卡因、苯丙胺、尼古丁等都会使滥用成瘾者戒断后出现情绪问题，包括抑郁、焦虑、缺乏等，是药物依赖患者急性或慢性戒断期常见的特征，也是引起药物依赖者对药物产生心理依赖和复吸的重要原因。药物依赖与冲动行为有着密切的联系，药物依赖能够使冲动行为发生变化；同时可以诱导动机奖赏系统及学习记忆相关脑区内神经元结构发生可塑性改变，该变化在停药后仍可长期存在。对于精神依赖性由于是机体对药物内在的感知综合体现，如动物心理满足感、欣，同时，本身冲动性不同的个体对依赖药物的易感性存在个体差异。实验评价难度较大，目前评价方法主要结合抑郁、焦虑、学习记忆等神经行为学方法进行研究，其中应用较多的是操作式行为实验方法，如奖赏实验及采用自身给药模拟人的觅药行为和药物辨别行为，因该方法需要仪器设备复杂，实验周期较长。目前广泛用于药物精神依赖的评价方法是条件位置偏爱实验，该方法经济简便。
2.4 在发育神经毒性评价中的应用
发育神经毒性（DONT）评价是药物临床前安全性评价的重要组成部分，是指个体在发育过程中暴露于某些神经毒性物质后引起的神经系统结构和功能的异常改变，进而引起个体的感觉、运动及各种认知功能改变，表现为个体发育产生某些缺陷。常见的有行为改变、智力低下、精神失常、孤僻症等。神经毒性药物评价通常与生殖发育毒性研究相结合，以母体染毒对仔代或在仔代实验中进行神经行为学测试。目前常用的研究动物为大鼠。但是，非人灵长类因与人的行为活动最为相似，是研究发育神经毒性最适合的动物。非人灵长类神经行为学的测试方法包括学习能力、记忆能力、计划控制行为、情绪行为能力、信息处理能力、社会行为、感知功能、视动协调能力以及视觉空间定位能力等测试。其中使用照片、幻灯片、计算机化图象及视频学习行为被越来越多地用在非人灵长类动物发育研究中。然而，由于这些介质都被设计来模拟自然色彩，鉴于人类与非灵长类动物不同物种之间和内部存在的色彩感觉的差异，有必要考虑识别这些介质的适用性变化，使用的摄影和录像的刺激应该在复制自然的颜色接近该物种的视觉感官。研究药物对灵长类动物的发育毒性行为变化可以为人类精神发育病理学提供独特的见解。
篇2
[关键词] 感染性脑损伤；橙皮苷；强迫游泳
[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）11（c）-0031-02
Influce of hesperidin on forced swimming test of mice with cerebral injury induced by LPS
WU Jian1 LIU Hong-zhi1 WEN Xiang-ru2 FU Yan-yan1 ZHANG Lei3 SUN Ying3 ZHANG Fang1 LIU Yong-min2 DONG Hong-yan1 LIU Yong-hai3 SONG Yuan-jian1
1.Neurobiology Research Center， Basic Courses School of Xuzhou Medical College in Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China；2.Teaching and Research Section of Chemistry， Public Education School of Xuzhou Medical College in Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China；3.Department of Neurology， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College in Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China
[Abstract] Objective To investigate the influence of hesperidin on forced swimming test of mice with cerebral injury induced by lipopolysaccharide （LPS）. Methods 45 ICR mice at 3 weeks were evenly divided into saline group， LPS group and LPS + hesperidin group （Hesp） in random. Mice from 3 groups in accumulative distance and cumulative time within 5 minutes′ swimming were tested by ZH-QPT forced swimming test video analysis system. Results Compared with saline group， the accumulative distance of swimming in LPS group was obviously shorter， but there was no significant change in cumulative time in the two groups. In comparison with the LPS group， the accumulative distance of swimming in LPS+Hesp group became longer， but without obvious changes in cumulative time. Conclusion Hesperidin can remarkably prolong the distance in forced swimming test in mice with infectious cerebral injury.
[Key words] Infectious cerebral injury； Hesperidin； Forced swimming
脑部细菌或病毒感染是导致新生儿、幼儿脑损伤的重要原因之一。脑损伤后常遗留运动功能障碍、认知行为障碍等神经系统后遗症[1]。因此，探究感染性脑损伤后行为学指标的改变有重要意义。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，为脂质和多糖的复合物，属内毒素，具有神经毒性。幼年小鼠的血-脑脊液屏障（blood brain barrier，BBB）尚不健全，LPS会造成小鼠感染性脑损伤。可应用LPS建立小鼠的感染性脑损伤模型，并借助这一模型研究感染性脑损伤后行为学指标的改变。橙皮苷（hesperidin，Hesp）在柑桔类植物的果实中广泛存在，具有多种功能，如抗炎、镇痛、抗氧化、抗癌等[2-3]，另有很好的神经保护作用[4]。它是否会影响感染性脑损伤动物的行为，目前未见报道。
强迫游泳行为学实验可用于初步研究神经或精神类药物的作用，也可初步筛选相关药物[5]。通过强迫游泳实验，考察LPS诱导的感染性脑损伤小鼠的行为学变化，以及橙皮苷对该行为学变化的影响，有助于认识和理解脑损伤导致的行为变化规律，为感染性脑损伤的诊断、治疗和康复提供新的思路和方法。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
LPS购自Sigma公司，Hesp购自郑州荔诺生物科技有限公司；强迫游泳实验设备采用淮北正华公司的ZH-QPT型强迫游泳实验视频分析系统，硬件系统尺寸为直径10 cm，高30 cm；记录分析软件采用Stoelting公司的Any-maze system，版本为4.72版。
1.2动物及分组
3周龄、雄性健康ICR小鼠45只，体重为8～11 g，由徐州医学院实验动物中心提供。将小鼠随机分为3组，每组15只：生理盐水（saline）组，腹腔注射生理盐水；LPS组，腹腔注射LPS；Hesp组，即先用LPS处理，后给予Hesp。
1.3方法
1.3.1 动物模型制备 saline组小鼠腹腔注射生理盐水；LPS组腹腔注射LPS生理盐水溶液，剂量为5 mg/kg；LPS+Hesp组先腹腔注射LPS（5 mg/kg），0.5 h后Hesp（剂量为200 mg/kg，混悬于0.5%羟甲基纤维素钠水溶液中）灌胃。将以上各组小鼠6 h后置于ZH-QPT型强迫游泳实验视频分析系统中观察并记录其行为学指标。
1.3.2 强迫游泳实验行为研究 实验环境的水温20～25℃，首先将小鼠置于水中适应2 min，再记录随后5 min的行为，用Any-maze system软件记录分析活动指标，包括活动路程、累积活动时间及累积静止时间。
1.3.3统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以x±s表示，组间比较采用方差分析，以P
2结果
saline组小鼠在5 min内游动了（14.49±4.08）m，LPS处理后，小鼠游动路程大幅缩短，仅（6.96±1.74）m，差异有统计学意义（P
表1 各组小鼠在强迫游泳实验视频分析系统中的活动路程、累积游动时间和累积静止时间的比较（x±s）
与saline组比较，aP
图1 小鼠强迫游泳实验视频分析系统中的状态图
A.静止状态；B.活动状态
3 讨论
脑损伤中，除创伤性损伤外，感染性脑损伤、渐进性脑损伤的发生、进展的机制多样而复杂。感染性脑损伤常见于新生儿和幼儿，脑损伤可能导致幼儿精神神经异常和行为障碍，治疗困难[6]，康复往往采用高压氧等方法[7]，常会导致患儿认知障碍、精神神经行为异常。幼年小鼠的血-脑脊液屏障不健全，本研究用LPS处理雄性ICR小鼠，建立了感染性脑损伤模型。
除强迫游泳实验外，研究动物的行为变化还可采用旷场实验、水迷宫实验、悬尾实验等，强迫游泳实验是最早用于研究抑郁类行为的方法[8]，结果可靠性强。不同性别小鼠的强迫游泳行为不同[9]，本研究讨论雄性ICR小鼠的强迫游泳行为。温度等理化因素对实验动物的强迫游泳行为也有影响，本研究控制实验水温为20～25℃。结果表明感染性脑损伤小鼠在强迫游泳实验中行为异常，虽然累积静止时间没有变化，但是活动路程显著降低。
Hesp是治疗心血管病的药物，是多效药物，有研究表明其有神经保护作用，但作用机制不明，对动物的行为学有何影响，目前未见报道。本研究通过强迫游泳实验发现Hesp可以逆转LPS对小鼠游泳行为的影响，在维持累积静止时间不变的同时，显著增加活动路程。
因此，从强迫游泳实验结果看，Hesp可以有效减轻LPS诱导的小鼠游泳行为障碍，其中所涉及的分子机制，本实验室正在进一步研究。
[参考文献]
[1] 梁艳苓，陈翔.早期认知功能发育与婴儿脑损伤[J].中国医药导报，2009，6（13）：5-7.
[2] Ahmad ST，Arjumand W，Nafees S，et al.Hesperidin alleviates aceta-
minophen induced toxicity in Wistar rats by abrogation of oxidative stress，apoptosis and inflammation[J].Toxicol Lett，2012，208（2）：149-161.
[3] Lee KH，Yeh MH，Kao ST，et al.The inhibitory effect of hesperidin on tumor cell invasiveness occurs via suppression of activator protein 1 and nuclear factor-κB in human hepatocellular carcinoma cells[J]. Toxicol Lett，2010，194（1-2）：42-49.
[4] Hwang SL，Yen GC.Neuroprotective effects of the citrus flavanones against H2O2-induced cytotoxicity in PC12 cells[J]. J Agric Food Chem，2008，56（3）：859-864.
[5] Petit-Demouliere B，Chenu F，Bourin M.Forced swimming test in mice：a review of antidepressant activity[J]. Psychopharmacology （Berl），2005，177（3）：245-255.
[6] 温小莲，梁卫权，王小东，等.临床护理路径在36例重度脑损伤患儿中的应用分析[J].中国当代医药，2012，19（29）：110-111.
[7] 刘克洪，李景琦，余丹，等.脑损伤意识障碍患者的康复治疗[J].中国当代医药，2012，19（14）：42-43.
[8] Potsolt RD，Le Pichon M，Jalfre M.Depression：a newanimal model sensitive to antidepressant treatments[J].Nature，1977，266（5604）：730-732.
篇3
关键词：帕金森病；大鼠；6-羟基多巴胺
帕金森病（PD）是常见的中老年人中枢神经系统退行性疾病，其病因及发病机制目前尚不清楚， 研究认为可能与遗传、环境因素、线粒体功能障碍、兴奋性氨基酸、氧化应激、过多的自由基形成及神经生长因子缺乏等有关，是多种机制协同作用的结果[1-2]。偏侧6-OHDA损毁模型是目前使用最多的PD动物模型之一，其在症状、病理、生化方面的表现与人类PD有不少相似之处，但该模型的损伤程度因6-OHDA的剂量、浓度、注射位点不同而存有争议，特别是对损伤早期大鼠行为学方面的观察比较缺乏。本实验通过观察6-OHDA损伤早期PD大鼠行为学及黑质部位组织学的变化特点，验证损伤早期PD大鼠模型的稳定性及可靠性。
1资料与方法
1.1一般资料 选用健康雄性SD大鼠40只， 体重 250～300 g，由南通大学实验动物中心提供。6-OHDA、抗坏血酸干粉剂、盐酸阿朴吗啡（apomorphine）、抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase， TH）抗体均购于Sigma公司。
1.2方法
1.2.1实验动物分组 40只SD大鼠随机分为三组：①空白对照组（n=8）；②6-OHDA模型组（n=24）：分为24 h组（n=8）、7 d组（n=8）和28 d组（n=8）3个亚组；③假手术组（n=8）。
1.2.2动物模型 模型组大鼠用复合麻醉剂（含戊巴比妥钠、丙二醇、硫酸镁等，0.25 mL/100 g体重）腹腔注射麻醉，待大鼠后肢回缩反射及角膜反射消失后，将其头部水平位固定在脑立体定位仪上，剪除颅顶鼠毛，碘酒、酒精消毒皮肤，沿中线切开一长约2cm切口，充分暴露前囟，参照Paxinos & Watson（1996）《大鼠脑立体定位图谱》确定左侧前脑内侧束（mfb）三维坐标位置，选取mfb区坐标：前囟后2.8 mm，中线左侧2.0 mm，硬膜下8.2 mm。根据注射位点确定钻颅部位，手术刀尖小心钻开一直径约2 mm颅骨孔，微量进样器缓慢进针至靶点，留针10 min，以9 ng/s的速度注入2 μg/μL 6-OHDA 4 μL（含0.02%抗坏血酸），注射完毕后留针5min，以1mm/min的速度退针。手术完毕，用明胶海绵堵塞颅骨孔，适量青霉素涂敷创口，消毒缝合皮肤，放回笼中饲养。并于24 h、7 d、28 d分别检测大鼠行为学和组织学的改变。假手术组同法予含0.02%抗坏血酸的生理盐水4 μL，空白对照组不作任何处理。
1.2.3行为学检测
1.2.3.1跨步调节试验[3] 将大鼠身体的后半部分拖起 ，并使大鼠身体重量仅由一侧前肢支撑 ，记录10s内大鼠这一前肢走步次数 ，然后同法检测另一前肢的情况，以损伤对侧前肢行走次数所占比例（损伤对侧前肢行走次数/（损伤对侧前肢行走次数+损伤侧前肢行走次数））为评价指标。
1.2.3.2姿势不对称性试验[4] 握住鼠尾的中后部将其提起，悬空于实验台上方约10 cm处，使大鼠头向下处于垂直状态， 以其偏离垂直轴不超过10°为垂直位（标准位），记录大鼠头或上身左右摆动的情况，以摆动偏离垂直位并再返回到垂直位记数为1次。观察45 s内大鼠头或身体转动的方向和次数，以向损伤对侧摆动的次数所占比例（损伤对侧摆动的次数/（损伤对侧摆动的次数+损伤侧摆动的次数））为评价指标。
1.2.3.3阿扑吗啡诱发旋转试验 模型组分别于术后24 h、7 d、28 d于动物腹腔内注射阿扑吗啡0.5 mg/Kg 诱发大鼠向右侧（健侧）旋转，于阿扑吗啡注射后5 min开始记录，持续记录30 min。以24 h诱发旋转次数210次/30 min为合格模型。
1.2.4组织学检测
1.2.4.1动物灌注、固定、取材、切片 各组大鼠在最后一次行为学检测后，用复合麻醉剂麻醉，剪开大鼠胸腔，经主动脉快速灌注生理盐水（37℃）150～200 mL冲洗，至大鼠肝脏发白，流出液基本无色为止。随即灌注4%甲醛（4℃）先快速灌注 200 mL，再缓慢灌注300 mL，至头与四肢均已发硬。断头取脑，置于4%甲醛，放4℃冰箱固定4 h，再依次置入20%及30%蔗糖磷酸盐缓冲液内，存4℃冰箱至脑块沉入瓶底。取中脑黑质组织块进行冠状连续冰冻切片，片厚20 μm。
1.2.4.2抗TH染色 作漂片SABC法染色，具体步骤依次为：冰冻切片用0.01 M（pH7.4）磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次，5 min/次。0.3% H2O2抑制内源性过氧化物酶活性， 0.02 mol/L EDTA（95℃）复性（2 min），非免疫的正常羊血清，室温下孵育30 min，抗TH抗体（1∶1000，抗体稀释液稀释），37℃孵育4 h， SABC试剂，室温下孵育1 h， DAB显色（阳性产物为棕黄色）。以上各步骤之间均以0.01M（PH7.4）PBS漂洗3次，5 min/次，正常羊血清与抗TH抗体孵育之间不漂洗。显色后贴片，自然风干，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
1.2.4.3 TH阳性神经元记数 各组大鼠取包含黑质致密部最明显的中脑切片，在×100倍显微镜下计数两侧黑质有完整细胞体的TH阳性细胞，计算左侧与右侧黑质TH阳性细胞数的百分比（左侧黑质TH阳性细胞数/右侧黑质TH阳性细胞数×100% ）。参照蔡文琴等[5]介绍的神经细胞计数方法进行细胞计数。
1.2.5统计学分析 数据结果均使用 SPSS13.0软件进行统计学分析。数据资料采用均数±标准差（x±s）表示。单因素方差分析进行差异性检验，P
2结果
2.1行为学观察 对照组及假手术组大鼠经阿扑吗啡诱发后无旋转行为，也未出现非药物诱发的行为学改变。模型组大鼠在注射6-OHDA后数小时即出现损毁侧肢体动作减少，身体重心偏向损毁侧，并出现身体向损毁侧缓慢旋转，不能进行直线或随意爬行。
2.1.1跨步调节试验 对照组及假手术组大鼠两侧前肢10 s内跨步次数基本相同，模型组大鼠在左侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h跨步调节试验评分出现有意义减少，7 d及28 d评分进一步减少，见表1。
2.1.2姿势不对称试验 在左侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h，姿势不对称试验结果显示模型组大鼠头部和身体出现向右侧转动次数有意义增加，7 d及28 d姿势不对称试验评分进一步增加，对照组及假手术组大鼠头部和身体向两侧转动次数大致相同，见表2。
2.1.3阿扑吗啡诱发旋转试验 在注射6-OHDA后24 h，阿扑吗啡腹腔注射诱发大鼠以右侧后肢为支点，首尾相接向右侧旋转，30 min旋转次数210次/30 min，对照组及假手术组大鼠未诱发出旋转行为，见表3。
2.2组织学检测 抗TH染色结果显示，在左侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h，大鼠左侧黑质TH阳性神经元数目出现有意义减少，高倍镜下见少部分神经元出现胞体肿胀、核膜界限消失等变性征象，部分神经轴突断裂、错乱；7 d和28 d时大鼠左侧黑质TH阳性神经元几乎消失，残留的TH神经元表现出染色质浓缩坏死现象，神经轴突散在稀疏；模型组大鼠右侧黑质TH阳性神经元数目同时也有部分减少；对照组及假手术组大鼠两侧黑质TH阳性神经元无明显改变，见表4，图1。
3讨论
研究PD需要建立稳定可靠的模型。6-OHDA是一种选择性中枢儿茶酚胺能神经元毒性物质，具有很强的呼吸链抑制作用，偏侧6-OHDA损毁模型是目前使用最多的PD模型之一。1970年Ungerstedl[6]首先报道了应用6-OHDA成功制备大鼠偏侧PD模型，这种模型能够在多巴胺能药物的诱发下产生旋转行为，以便于判断模型成功与否。阿扑吗啡是多巴胺（dopamine，DA）受体激动剂，能够引起该模型向健侧旋转，这是由于损伤侧纹状体多巴胺含量下降，多巴胺D2受体代偿性大量增加，且敏感性增高，出现超敏现象[7]，此时应用DA受体激动剂使损伤侧兴奋作用占优势而产生向健侧旋转。
PD的神经保护治疗需要早期进行，评估6-OHDA损伤早期大鼠行为学变化，可进一步明确模型是否成功及神经保护性治疗是否有效。阿扑吗啡诱发旋转试验结合非药物诱发的行为学试验，其评估结果更加有效、可靠[8]。在偏侧前脑内侧束注射6-OHDA后数小时，大鼠出现肢体动作减少，身体重心偏向损毁侧，并出现身体向损毁侧不自主旋转，不能进行直线或随意爬行，6-OHDA注射后24 h大鼠跨步调节试验和姿势不对称试验出现有意义改变，腹腔注射阿扑吗啡后可诱导大鼠在原地向健侧旋转，以健侧后肢为支点，首尾相接，形成环状，但旋转次数
偏侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h大鼠出现行为学和组织学方面的变化，为检测模型的稳定性和可靠性，实验设立6-OHDA损伤后7d和28d组。结果显示：大鼠行为学改变较24 h组更加显著，阿扑吗啡诱发旋转次数>210次/30 min，符合成功PD模型标准；7 d和28 d时大鼠左侧黑质TH阳性神经元减少90%。偏侧前脑内侧束注射6-OHDA后，损伤对侧有部分DA能神经元丢失，可能与药物的渗透作用或经血液循环等有关。
综上所述，通过早期行为学检测，可为神经保护性研究确立合格的PD模型，避免了药物提前干预存在的药物显效与模型失败之间的争议。
参考文献：
[1]Cookson M R. The Biochemistry of Parkinson's Disease [J]. Annu Rev Biochem， 2005， 74： 29-52.
[2]Levy O A， Malagelada C， Greene LA. Cell death pathways in Parkinson's disease： proximal triggers， distal effectors， and final steps [J]. Apoptosis， 2009， 14： 478-500.
[3]Olsson M， Nikkhah G， Bentlage C， et al. Forelimb akinesia in the rat Parkinson model：differential effects dopamine agonists and nigral transplants assessed by a new stepping test [J]. J Neuroecience， 1995， 15（5-2）： 3863-3875.
[4]Roghani M， Behzadi G， Baluchnejadmojarad T. Efficacy of elevated body swing testing the early model of Parkinson disease in rat [J]. Physiology & Behavior， 2002， 76（4-5）： 507-510.
[5]蔡文琴，王泊沄.实用免疫细胞化学及核酸分子杂交技术[M].成都：四川科学技术出版社，1994：180-191.
[6]Ugerstedl U， Arbuthnott G. Quantitative reording of rotational behavior in rats after 6-hydroxydopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system [J]. Brain Res， 1970， 24： 485.
篇4
【摘要】 目的：探讨中药固本祛风汤治疗变应性鼻炎（AR）豚鼠模型的疗效以及对其行为学的影响。方法：将 90 只豚鼠随机分成正常对照组、模型组、辛芩颗粒组和中药治疗组，以卵清蛋白致敏激发造成变应性鼻炎豚鼠模型，分别给予中药和辛芩颗粒，观察各组动物的行为学改变。结果：中药治疗组症状显著低于模型组，其差别有统计学意义（P < 0.05）。结论：固本祛风汤可明显改善变应性鼻炎豚鼠模型的症状，从而发挥对 AR 的治疗作用。
【关键词】 变应性鼻炎；豚鼠模型；固本祛风汤；行为学
〔Abstract〕 Objective To study the effect of Chinese medicine GubenQufeng prescription treating guinea pig model of allergic rhinitis and its reaction on behavioristics. Methods 90 guinea pigs were randomly pided into normal control group， model group， Xinqin particles and the Chinese medicinegroup， sensitized to ovalbumin excitation caused guinea pig model of allergic rhinitis， were given medicine and Xinqin particles， behavioristics observed after treatment. Results Symptoms of Chinese medicine treatment group was significantly lower than that of model group， There was a statistically significant difference (P < 0.05). Conclusion
GubenQufeng prescription can significantly improve the guinea pig model of allergicrhinitis symptoms， thereby play a role in the treatment of AR.
〔Key Words〕
Allergic rhinitis; Guinea pig model; GubenQufeng prescription; Behavioristics
变应性鼻炎（Allergic Rhinitis， AR）是由 IgE 介导的Ⅰ型超敏反应性疾病，由于大气污染等多种原因，近年来发病率不断升高。变应性鼻炎在中医属于“鼻鼽”范畴，历代医家对本病的认识颇不一致，但都认为其发病与外界因素有密切关系。笔者经过多年的临床实践，认为本病病机主要在于肺、脾、肾三脏的虚损，自拟固本祛风汤对变应性鼻炎患者进行治疗，在临床上取得了显著的疗效。为进一步探讨固本祛风汤对变应性鼻炎治疗的机制，我们将其用于卵清蛋白诱发的变应性鼻炎豚鼠模型，用固本祛风汤治疗后观察动物模型的行为学改变，为将其更好地用于临床治疗变应性鼻炎提供实验依据。
1
材料和方法
1.1
实验动物
Hartley 豚鼠 90 只，清洁级，雌雄各半，体重 250~300 g，由中山医科大学动物中心提供。在空调动物房饲养，温度 25~28℃，湿度 40%~50%，饲养房避免过敏原存在，适应性饲养 1 周后开始正式实验。
1.1.1
药物和试剂
固本祛风汤：制附子、黄芪、桂枝、全虫、辛荑花、防风、肉桂、徐长卿、茯苓、甘草。
辛芩颗粒：由上海中医大药业股份有限公司生产（国药准字 Z31020014）。
卵清蛋白（OVA）：由美国 Sigma 公司生产。
1.1.2
动物分组
将豚鼠随机分为 6 个组：A 组（正常对照组），B 组（模型组），C 组（辛芩颗粒组），D 组（中药低剂量组），E 组（中药中剂量组），F 组（中药高剂量组），每组 15 只。
1.1.3
造模方法
采用卵清蛋白致敏的方法[1-5]，对模型组和实验组豚鼠分别以每只腹腔注射卵清蛋白混悬液 1 mL（卵清蛋白 0.3 mg 为抗原，氢氧化铝 30 mg 为佐剂，溶于 1 mL 生理盐水配成），隔日 1 次，共 7 次。
1.1.4
模型评价
于末次鼻腔激发后第 2 日，分别在模型组、对照组和实验组随机各选取 3 只，行 PCA 试验。即每只于球后静脉丛采血 0.3 mL，离心（3 000 r/min）10 min 后分离出血清，取 40 L 生理盐水稀释，分别配成 1:4、1:16、1:64、1:256 浓度；取健康白色大鼠，背部剃毛，将上述不同浓度血清分别注射于背部皮下，间隔 2 cm，并作记号；72 h 后，以卵清蛋白 1 mg、伊文斯兰 5 mg 溶于 1 mL 生理盐水，于大鼠尾静脉注射，30 min 后观察结果，蓝斑直径超过 5 mm 为阳性，即造模成功。观察造模成功后，每侧鼻腔均以 2% 卵清蛋白溶液用微量加样器滴入 40 L，每日 1 次，共 7 次。
1.1.5
给药方法
经 PCA 试验蓝斑呈阳性后，以 2% 卵清蛋白溶液滴鼻，从第 1 次 OVA 滴鼻当日起，实验组和对照组于滴鼻前口饲给药，中药浓煎后用蒸馏水稀释，调整浓度，使每只每天给药量均为 3 mL；模型组和空白组每只每天予口饲 3 mL 生理盐水。每日 1 次，共 7 次。
1.1.6
给药剂量
实验组：低剂量组：每日 7.5 g/kg；中剂量组：每日 15 g/kg；高剂量组：每日 30 g/kg。
对照组：辛芩颗粒每日 6 g 生药 / kg。
1.2
标本采集
所有动物末次给药后 1 h，于球后静脉丛采血 3 mL，离心（3 000 r/min）15 min 后分离出血清，于-20℃ 保存。同时予 10% 水合氯醛溶液以 0.4 mL/kg 腹腔注射麻醉后，分离鼻骨前皮肤，咬除鼻骨，取下鼻中隔及其黏膜，于 4% 多聚甲醛溶液中固定。
1.3
指标检测
1.3.1
行为学观察
记录每次激发后 30 min 内动物的鼻痒、喷嚏、清涕出现的时间、次数与轻重程度，并打分。评分标准：0 分：无喷嚏、抓鼻、喘息及鼻分泌物；1 分：喷嚏 < 4个，轻度抓鼻，喘息急促，前鼻孔有鼻分泌物；2 分：喷嚏 4~10 个，频繁抓鼻，喘息加重，鼻分泌物超过前鼻孔；3 分：喷嚏 > 11 个，持续抓鼻，因喘息致死，脸部布满鼻分泌物。总分 > 5 分表示造模成功[6]。
1.4
统计学方法
统计学方法采用 U 检验或 t 检验。
2
结
果
2.1
死亡情况
PCA 试验：各组死亡 3 只；正常对照组和模型组：各死亡 2 只，剩余 10 只；中药高剂量组、辛芩组：各死亡 1 只，剩余 11 只。
2.2
PCA 试验
PCA 实验发现，以正常对照组血清接种的大鼠背部无蓝斑出现。以其余各组血清接种的大鼠背部，分别于 1:4，1:16，1:64，1:256 浓度处均出现蓝斑，直径最大的为 1.5 cm，最小的为 0.5 cm，浓度越小蓝斑越小。
2.3
行为学改变
A 组仅偶有抓鼻现象，个别豚鼠打喷嚏；B 组于鼻腔滴入抗原后频繁用前爪抓鼻，打喷嚏，并伴有清水样鼻涕，部分豚鼠涕流满面；其余各组症状轻微，出现轻度抓鼻及少数喷嚏，部分可见鼻涕。模型组与其余各组比较差异均有统计学意义 （P < 0.05），正常对照组与各实验组之间差异有统计学意义（P < 0.05），结果见表 1。
3
讨
论
变应性鼻炎是一类主要由 IgE 介导的Ⅰ型变态反应性疾病，近年来发现细胞因子水平与变应性鼻炎的发病关系密切[7，8]。
中药的许多药材经现代研究表明，具有调整机体免疫状况的作用，必将在变应性鼻炎的治疗中占据重要的地位。如黄芪可调节体液免疫，从而抑制组胺等介质的释放；细辛、桂枝等对过敏介质有拮抗作用；防风、甘草、辛荑、五味子、乌梅、蝉蜕均有抗过敏作用。
笔者在多年的临床实践中认识到，变应性鼻炎的发生主要是由肺气虚弱，卫外不固，导致外邪侵袭而成鼻鼽。此外，本病与先天肾气不足和后天脾失健运也有非常密切的关系。历代医家多采用补肺固表、健脾扶正、补肾温阳等方法辨证论治，方药多采用玉屏风散、小青龙汤、桂枝汤、麻黄附子细辛汤等加减治疗本病。固本祛风汤即是在玉屏风散的基础上加减而成。主要由制附子、黄芪、桂枝、全虫、辛荑花、防风、肉桂、徐长卿、茯苓、甘草等组成，本方以制附子、肉桂补肾温阳；茯苓健脾利水；黄芪、桂枝益气固表、助阳化气；辅以防风、辛荑祛风通窍，全虫搜风活络，徐长卿祛风止痒。综观全方，具有补肺散寒，健脾益肾，祛风通窍之功效。现代药理研究认为，黄芪具有双向免疫调节作用，附子、防风、辛荑、徐长卿均有抗炎及增强免疫作用，可以降低炎症细胞的通透性，减轻其水肿、浸润等炎性反应，辛荑还可以抗组胺及收敛鼻黏膜血管，减轻变应性鼻炎所致的鼻痒、打喷嚏、流涕等症状。实验研究结果显示， 固本祛风汤治疗组症状显著低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05），表明固本祛风汤可以显著改善变应性鼻炎的症状，减轻其炎症反应，从而达到治疗变应性鼻炎的作用。
参考文献
〔1〕Monika ME， Garl A， Jonas S. Degranulation status of airway tissue eosinophils in mouse models of allergic airway inflammation 〔J〕. Res Cell Mole Bio1， 2001， 24(3):352-359
〔2〕李华斌， 韩德民. IL-9与呼吸道炎症〔J〕. 国外医学耳鼻咽喉科学分册， 2003， 27(2):75-77
〔3〕Saito H， Matsumoto K， Denburg AE， et al. Pathogenesis of murine experimental allergic Rhinitis: A Study of local and systemic consequences of IL-5， Deficiency〔J〕. J Immunol， 2002， 168(6):3017-3023
〔4〕燕志强， 章凤新. 嗜酸性细胞功能研究进展〔J〕. 国外医学耳鼻咽喉科学分册， 2004， 28(5):304-307
〔5〕毛辉， 王曾民. CD34+细胞与支气管哮喘〔J〕. 国外医学呼吸系统分册， 2002， 22(4):190-193
〔6〕Sehmi R， Wood LJ， Watson R， et al. A1lergu-induced increases in IL-5 receptor alpha-subunit expression on bone marrow-derived Cd34+ cells from asthmatic subjects〔J〕. Clin Invest， 1997， 120:2457-2466
〔7〕Bjermer L， Diamant Z. Current and emerging nonsteroidal anti-inflammatory therapies targeting specific mechanisms in asthma and allergy〔J〕. Treat Respir Med， 2004， 3(4):235-246
篇5
【摘要】 ：目的 围绕海马结构的形态学研究定志小丸的抗抑郁机制。方法 40只雌性大鼠分为对照组、抑郁症模型组(模型组)、蒸馏水组(DW组)和定志小丸组(中药组)，Open field法检测行为学得分，ELISA法检测血清皮质醇和雌二醇(E2)含量，HE染色和电镜技术观察海马CA3区神经元形态，免疫组化技术检测齿状回神经干细胞(NSC)增殖。结果 与对照组比较，模型组和DW组行为学得分及血清E2含量显著下降，皮质醇水平升高和NSC增殖明显降低，海马CA3区神经元损伤明显；中药组行为学得分和血清E2含量无明显变化，皮质醇明显减少，NSC增殖显著增加，海马CA3区神经元基本正常。结论 定志小丸能够保护海马结构，这可能是其抗抑郁机制之一。
【关键词】 抑郁症 定志小丸 雌二醇 神经干细胞 皮质醇 大鼠
Abstract：Objective To study the anti-depression mechanism of Dingzhixiaowan concerning on histology of hippocampal formation. Methods 40 female rats were pided into control， depression model group (model group)， distilled water group (DW group) and Dingzhixiaowan group (Chinese herb group). Behavior points were measured by open field method. Serum concentrations of cortisol and estradiol (E2) were checked with ELISA. HE staining and electron microscopy were applied to observe the histology of neurons in hippocampal formation. Immunohistochemistry method was employed to detect Nestin expression. Results Compared with the control， behavior points， serum E2 level and Nestin expression decreased obviously and serum cortisol level increased markedly， CA3 neurons were seriously damaged in model and DW groups. While behavior points， serum E2 level did not change， Nestin expression increased obviously and serum cortisol level decreased markedly， CA3 neurons were basically normal in Chinese herb groups. Conclusion Dingzhixiaowan can protect hippocampal formation， which might be one of the anti-depression mechnisms.
Key words：depression；Dingzhixiaowan；estradiol；neural stem cell；cortisol；rat
目前认为，慢性应激刺激造成的海马结构损伤是抑郁症发病的主要原因。对海马结构来说，糖皮质激素是损伤激素，雌激素为保护激素，而女性的雌激素水平变化较大，其保护作用时常减弱，这可能是女性抑郁症发病率较高的原因。本研究以此为出发点，研究定志小丸的抗抑郁机制。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
成年Wistar雌性大鼠(230±20)g，辽宁中医药大学动物实验中心提供，合格证号：SCXK(辽)2004-0018。适应性饲养1周后，选择体重和行为学得分相近的40只大鼠，随机分为对照组、模型组、蒸馏水组(DW组)和定志小丸组(中药组)，每组10只。对照组每笼5只饲养，其余3组每笼1只饲养。
1.2 抑郁症模型的建立
除对照组外，其余3组动物均接受慢性应激刺激，复制慢性不可预见性应激模型。其方法是：在21 d内施加电击足底(36 V交流电，5 min)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、摇晃(1 min)、夹尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)等刺激，每种刺激3～4次。
1.3 给药
对照组不给药；模型组只施加灌胃动作；DW组灌服1 mL蒸馏水；中药组灌服定志小丸。定志小丸为人参、茯苓、远志、石菖蒲的标准提取物(购于安徽宣城百草生物有限公司，提纯比例为5∶1)，剂量分别是10、10、6、6 g，溶于适量水中，加热后浓缩为1 kg/L。按成人用量折算成灌胃剂量[1 mL/100(g? d)]，于刺激前1 h灌服。
1.4 大鼠行为学检测
采用Open field法检测，以3 min内大鼠水平穿越方格数作为水平活动得分，以前肢抬起次数为垂直活动得分。检测过程中保证时间、光照、温度及环境噪音的一致性。检测由3人同时完成，1人负责计时，1人负责观察大鼠的水平活动，1人负责计数垂直活动。正式检测前，3人首先熟悉检测标准，并进行多次训练，尽量减少人为误差。
1.5 血清皮质醇和雌二醇检测
在第22天，大鼠腹腔注射20%氨基甲酸乙酯(0.4 mL/100 g)麻醉后，腹主动脉取血，离心后取血清，冻存备用。于总医院内分泌实验室采用ELISA方法检测血清皮质醇和雌二醇(E2)含量。
1.6 海马组织学观察
将取血后的大鼠用150 mL生理盐水经主动脉快速冲洗，取一侧海马行常规HE染色，另一侧于扫描电镜下观察形态学变化。
1.7 齿状回神经干细胞(NSC)增殖检测
采用Nestin免疫组化方法，取经生理盐水快速冲洗后的海马，4%多聚甲醛固定4～6 h，30%蔗糖溶液沉底。冰冻连续切片，片厚25 μm，隔4片取1片。将切片置含新鲜0.5% H2O2的纯甲醇中30 min；0.1% Triton溶液中30 min；正常山羊血清60 min；兔抗鼠Nestin一抗(1∶2000，Sigma)，25 ℃孵育1 h，4 ℃过夜；生物素化山羊抗兔IgG(博士德二抗试剂盒)，室温下60 min；SABC复合物，室温60 min；DAB显色(博士德)。染色对照：用正常山羊血清和PBS代替Nestin一抗作孵育，其余步骤同上。利用BI-2000医学图像分析系统，计数阳性细胞数。
1.8 统计学方法
实验数据以x±s表示，采用SPSS11.5进行统计处理。
2 结果
2.1 各组大鼠海马CA3区神经元的形态学变化
光镜下可见，对照组CA3区有大量致密锥体细胞，排列整齐，细胞完整，边缘清晰，死亡细胞较少；模型组和DW组可见细胞层次减少、紊乱、中断，大量细胞坏死；中药组神经元形态与对照组基本接近。电镜下可见，对照组细胞器丰富，轮廓清晰，细胞核呈圆形，核膜清晰光滑完整，核染色质分布均匀；模型组和DW组细胞器减少，线粒体空泡化，细胞核变小，不规则，且核膜增厚，核周电子密度降低；中药组与对照组基本相同。
2.2 各组大鼠齿状回Nestin表达
镜下可见Nestin免疫阳性反应产物呈棕黄色，环形分布于核膜周围。对照组镜下可见较多的棕黄色反应物，边缘相对清晰，细胞大小相近；模型组和DW组棕黄色反应物较少，边缘不清，细胞大小不一致；中药组镜下可见大量棕黄色反应物，边缘清晰，细胞大小一致。各组Nestin阳性细胞数见表1。表1 各组大鼠Nestin阳性细胞数(略)注：与对照组比较，*P
2.3 各组大鼠行为学得分
(见表2)表2 各组大鼠的行为学得分(略)注：与本组第0天比较，P
2.4 各组大鼠血清皮质醇和雌二醇含量
(见表3)表3 各组大鼠血清皮质醇和雌二醇含量变化(略)
3 讨论
海马结构具有调节内脏功能、情绪和行为的多种作用，主要由海马和齿状回组成。齿状回存在NSC，能够增殖、迁移至海马CA3区，分化形成新的神经细胞。因为抑制齿状回NSC增殖后，许多抗抑郁药物会失效，所以，海马CA3与齿状回的关系在抑郁症发病中的作用逐渐受到重视。抑郁症的发病机制目前认为是慢性应激刺激引起肾上腺皮质过度分泌糖皮质激素，继而损伤海马神经元。本实验也观察到同样现象。由于高水平的糖皮质激素还能抑制齿状回NSC增殖，从而降低了海马结构的自我修复能力[1]，继而导致海马结构出现不可逆损伤。因此，抑郁症的根治应围绕保护海马成熟神经元和齿状回NSC两方面进行。
定志小丸由远志、石菖蒲、茯苓和人参组成，具有祛痰开窍、健脾益智作用，主治心气不定、五脏不足、忧悲不乐等。实验结果表明，该方能够对抗慢性应激对大鼠行为学的影响，具有抗抑郁作用，这可能与其保护海马CA3区神经元和齿状回NSC增殖有关。尽管定志小丸不能抑制皮质醇的过度分泌，但其维持E2水平的作用可能更为重要，因此，该方可能是替代雌激素的一种选择，成为治疗女性抑郁症的备选药物。
篇6
【关键词】 CCI模型； 大鼠； 疼痛行为学； 痛阈
疼痛是人们一生中经常遇到的不愉觉，它提供躯体受到威胁的警报信号，是生命不可缺少的一种特殊保护功能。另一方面，它又是各种疾病最常见的症状，也是当今困扰人类健康最严重的问题之一。根据神经生理功能，疼痛可分为生理性疼痛和病理性疼痛，神经病理性疼痛是由神经系统损伤或异常引起的一种难以治疗的疼痛状态。CCI模型是最常用的神经病理性疼痛动物模型。本研究主要观察CCI模型大鼠疼痛行为学表现。
1 资料与方法
1.1 实验动物 SPF级SD大鼠，6~8周龄，雄性，体重180~200 g，购自川北医学院实验动物中心。动物饲养环境安静，有良好的通风和空气过滤系统，室温22 ℃左右，湿度50%左右，明暗光照12 h:12 h，自由摄食，隔日更换笼具和垫料。动物适应环境3 d。雄性SD大鼠(n=48只)随机分为三组，即正常对照组(Nave组：n=16，分7、14 d亚组，每亚组8只)、假手术组(Sham组：n=16，分7、14 d亚组，每亚组8只)以及CCI组(n=16，分7、14 d亚组，每亚组8只)。
1.2 CCI模型的建立 (1)按Bennet和Xie[1]方法制作CCI模型；(2)称重：采用腹腔给药10%水合氯醛麻醉，300~500 mg/kg。侧卧位，手术侧在上，消毒，铺巾，选择左后肢，在股骨下方约l cm平行于股骨切开皮肤，用小剥离子经股二头肌间隙钝性分离肌肉，暴露坐骨神经，用神经剥离子轻柔将坐骨神经与周围软组织分离；(3)在坐骨神经分成三支前的主干部位游离神经7 mm左右，在距神经起始处(三支分叉处)上方2 mm处，用4.0含铬羊肠线结扎坐骨神经4道，每道间隔约1 mm，使被结扎的神经长约4~5 mm。注意结扎的松紧度，以打结时可见肌肉轻微抽动为准；(4)局部生理盐水冲洗，间断缝合肌肉筋膜、皮下组织以及皮肤；术毕将大鼠放入鼠笼，于温暖、安静环境自由喂养；(5)假手术组除不结扎坐骨神经外，其余同模型组；手术由同一人操作。
1.3 行为学观察 在手术后2周内，每隔1~2 d观察1次，包括大鼠的步态和左后肢的姿势、局部皮肤以及肌肉张力的改变程度、是否存在舔咬肢体现象等。
1.4 机械刺激伤害感受阈值(MWT)的测量 在安静的环境中，将大鼠单独放置于透明的有机玻璃体中，待大鼠适应环境15~30 min后，以Electronic von Frey刺激针刺激大鼠左、右足底，每只大鼠刺激3次，间隔大于10 s。大鼠会出现抬足、缩足、快速甩足以及甩足后舔足等反应。将3次读数取平均值作为机械缩足反射阈值(MWT)。各组于术前、术后第1、3、6、8、10、13天进行测量。测量时间固定为9:00~13:00。术前测定值为基础机械痛阈。
1.5 统计学处理 采用PASW Statistics 18软件进行统计学处理，计量资料以(x±s)表示，两组样本均数间的比较用t检验，组间比较采用重复资料方差分析和post hoc检验，P
2 结果
2.1 大鼠行为学变化 CCI大鼠术后健康状况良好，体重无明显减轻，毛发富有光泽，觅食饮水基本正常。术后1~2周，手术足趾并拢轻度外翻，下肢行走无力，步态呈现跛行，经常左后足悬空或不敢着地；站立时以右后肢持重，左后肢抬起并紧贴于腹部；术后14 d左右，左后肢出现比较明显的肌肉萎缩，给予轻微von Frey刺激时，大鼠经常迅速将左后肢抬起，有时放入口中舔吮；CCI大鼠左后肢悬空时间常超过25 s，CCI大鼠无自噬肢体现象。
2.2 大鼠体重变化 CCI组大鼠术后健康状况良好，体重无明显减轻，但体重增长较Sham组和Nave组略慢。各组大鼠术前基础值、术后第1、3天体重比较差异无统计学意义(P>0.05)。在术后第6、8、10、13天，CCI组大鼠体重与Nave组、Sham组比较差异有统计学意义(P0.05)，见表1。
2.3 机械刺激伤害感受阈(MWT)变化 各组大鼠术前机械性痛阈比较差异无统计学意义(P>0.05)。手术前、后Nave组大鼠痛阈与Sham组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠非术侧机械性痛阈比较差异无统计学意义(P>0.05)。CCI组大鼠术侧痛阈在手术后第3、6、8、10、13天明显低于非手术侧，亦明显低于Sham组和Nave组(P
篇7
关键词：黑逍遥散；老年性痴呆；动物行为；氢溴酸东莨菪碱；乙酰胆碱酯酶；胆碱乙酰转移酶；小鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）10-0035-03
阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）是一种常见的以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的神经系统退行性病变。目前的治疗主要是根据其不同病理生理学说给予对应性干预，尚未找到有效的防治药物。从中医药中寻找有效防治药物，成为近年研究的热点。本研究选用黑逍遥散组、逍遥散组及其精简方组开展相关研究，探讨黑逍遥散防治AD的作用机理，为本病的辨证论治提供新的思路与有效治疗药物。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级KM小鼠50只，雌雄各半，体质量（20±2）g，甘肃中医学院科研实验动物中心提供，动物质量合格证编号：SCXK（甘）2004-0006-0000994，实验设施使用许可证编号：SYXK（甘）2004-0006-0000308。动物分笼饲养，食固体饲料（甘肃中医学院科研实验动物中心提供），食水自由，室温20～25 ℃，相对湿度45%～52%。
1.2 药物与试剂
实验所用药材均购于甘肃中医学院附属医院药房；黑逍遥散、逍遥散、精简方中各药用量参照2005年版《中华人民共和国药典》及全国高等中医院校规划《方剂学》确立的比例。黑逍遥散：熟地黄∶柴胡∶当归∶白芍∶白术∶茯苓∶生姜∶炙甘草∶薄荷=7.5∶5∶5∶5∶5∶5∶5∶4∶1。逍遥散为黑逍遥散去熟地黄，精简方则进一步减去白芍、薄荷、生姜、炙甘草。各组药物加水冷浸3 h，16倍量水微沸1 h，煎煮2次后合并滤液，制成浓度均为0.50 g原药材/mL的水提液。
氢溴酸东莨菪碱注射液，上海禾丰制药有限公司生产，批号100101。考马斯亮蓝蛋白（批号20100520）、乙酰胆碱酯酶（AchE）试剂盒（批号20100522）、胆碱乙酰转移酶（ChAT）试剂盒（批号20100522）均由南京建成生物化学试剂有限公司生产。
1.3 仪器与设备
Y型水迷宫（自制），甘肃中医学院科研实验中心提供；小鼠避暗自动测试仪（型号BA-200），购于成都泰盟科技有限公司；小鼠跳台仪（型号DT-200），购于成都泰盟科技有限公司；E200NIKON光镜，由甘肃中医学院科研实验中心提供。
2 实验方法
2.1 实验动物筛选
在正式实验前，用Y型水迷宫对小鼠进行游泳测试，以剔除先天运动功能障碍小鼠。
2.2 分组与给药
KM种小鼠随机分为分为空白组、模型组、黑逍遥散组、逍遥散组、精简方组，每组10只。空白组和模型组小鼠每日灌胃生理盐水0.02 mL/g，药物组给予相应的原药材水煎液。按照人临床给药剂量折算动物给药剂量倍数，各组剂量均为2.314 g/（kg・d），每日灌胃1次，连续10 d。
2.3 水迷宫、跳台、避暗测试
灌胃给药第6、8日，除空白组外，其余各组小鼠均在灌胃1 h后腹腔注射氢溴酸东莨菪碱（2.0 mg/kg）进行造模[1]，注射20 min后使用水迷宫进行学习能力跳台、避暗训练，第10日同法造模后进行行为学能力测试。
2.4 生物化学检测
灌胃给药第10日，行为学能力测试完毕后，处死动物，迅速取出脑组织，用生理盐水制成10%匀浆，放入低温离心机中，3000 r/min离心10 min，取上清液装入试管中冷冻备用，按照试剂盒说明书进行AchE和ChAT的测定。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以―x±s表示，组间均数比较采用方差分析。P
4 结果
4.1 Y型水迷宫测试结果
与空白组比较，模型组小鼠的错误次数显著升高，记忆潜伏时间显著延长，差异有统计学意义（P
4.2 跳台测试结果
与空白组比较，模型组小鼠受到电击的次数增多，记忆潜伏时间显著缩短，差异有统计学意义（P
4.3 避暗测试结果
与空白组比较，模型组小鼠受到电击的次数增多，记忆潜伏时间显著缩短，差异有统计学意义（P
4.4 黑逍遥散对痴呆小鼠脑组织匀浆中乙酰胆碱酯酶胆碱、乙酰转移酶活性的影响
与空白组比较，模型组小鼠脑组织匀浆中的ChAT活性显著降低，AchE活性显著增高，差异有统计学意义（P
5 讨论
中医学认为，老年痴呆的发生病位在脑，与心、肾最为密切，属本虚标实，治疗多从益气补血、滋补心肾、活血祛瘀、化痰解毒等立法。而我们通过中医文献回顾分析，结合现代医学研究成果，认为肝郁是导致瘀血、痰浊等标实的主因，提出了从肝、脾论治的新假说。因肝主疏泄条达，气能行血，气能行水，肝郁则气滞，气滞则血瘀，水停而成痰浊。根据这一假说，我们首先选取疏肝健脾的代表方黑逍遥散进行了研究，表明该方具有显著改善AD模型小鼠学习记忆能力，增强其认知、判断能力，调节脑内相关神经递质[2]。说明黑逍遥散能通过疏肝理气、养血活血、健脾除湿而发挥补其虚（补血填精以益髓）、祛其邪（行气、化痰、活血）的作用。
黑逍遥散是在逍遥散的基础上加地黄一味，为逍遥散演化类方，养血填精之力更强。现代药理研究表明，熟地黄通过激活MAP等发挥出抗氧化作用；可以提高超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶活性，减少丙二醛和过氧化脂质含量，能改善衰老大鼠学习记忆能力，延缓大鼠脑衰老[3-4]。因此，我们选用黑逍遥散与逍遥散开展对照研究，以进一步验证药效，印证从肝、脾论治AD的科学性和有效性。
本研究结果表明：黑逍遥散组、逍遥散组及精简方组均能减少水迷宫测试中错误次数，缩短潜伏时间；减少在跳台、避暗测试中电击次数，延长潜伏期时间；均能升高脑组织匀浆ChAT活性、降低AchE活性，与模型组比较，差异有统计学意义（P
参考文献：
[1] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，1994：118-119.
[2] 吴红彦，王虎平.以肝、脾论治AD及逍遥散对老年痴呆模型小鼠学习记忆能力、中枢胆碱能神经元活性的影响[J].中国实验方剂学杂志， 2010，16（5）：168-170.
[3] Park C， So HS， Kim SJ， et al. Samul extract protects against the H2O2-induced apoptosis of H9c2 cardiomyoblasts via activation of extracellular regulated kinases（Erk）1/2[J]. Am J Chin Med， 2006，34（4）：695-706.
[4] 安红梅，史云峰，胡兵，等.熟地黄对D-半乳糖衰老模型大鼠脑衰老的作用研究[J].中药药理与临床，2008，24（3）：59-60.
篇8
关键词：颐脑解郁复方；卒中后抑郁；行为学；海马CA1区；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）07-0049-05
Abstract： Objective To investigate the intervention effects of Yinao Jieyu Prescription on the behaviors and damages in hippocampal CA1 area of the rats with post-stroke depression （PSD）. Methods Totally 168 SPF male SD rats were randomly divided into normal group， sham-operation group， stroke group， PSD group， Western medicine group and TCM group. There were 24 rats in the normal group and sham-operation group， and 30 rats in the other groups. Rats in the normal group received no intervention. Rats in the sham-operation group received no suture. Rats in the stroke group were given middle cerebral artery occlusion operation and normally fed after operation. Rats in the PSD group， Western medicinal group and TCM group were made into PSD models by chronic immobilization stress for one week and individual battery to the end. At the inception of modeling， Western medicine group received fluoxetine hydrochloride for gavage； TCM group received Yinao Jieyu Prescription for gavage； other groups received distilled water for gavage， once a day. At the end of week 2， 4， and 8， the morphology of the hippocampal CA1 area in each rat was observed by microscope after HE stained. Results Except for the week 2， at the same time point， the behavior scores of the rats in the TCM group were higher than those in the PSD group. At the same time point， the CA1 region of the hippocampus in the TCM group was more complete than the PSD group， and the cells were arranged neatly and in normal morphology. Conclusion Yinao Jieyu Prescription can improve the symptoms of PSD rats， and has protective effects on hippocampal CA1 area.
Key words： Yinao Jieyu Prescription； post-stroke depression； behaviors； hippocampal CA1 area； rats
卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是R床脑卒中后常见并发症，主要表现为情绪低落、思维迟滞、兴趣减退及社会角色的紊乱等。我国每年大约有160万～200万新发脑卒中患者，约1/3存活患者发生PSD[1-2]。颐脑解郁复方是本课题组自行研制治疗PSD的中药复方，具有益肾疏肝、活血化瘀的功效，前期临床研究显示疗效显著[3]。本实验建立一种高度模拟临床PSD的大鼠模型，以探讨颐脑解郁复方对PSD大鼠行为学及海马CA1区的干预作用。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级健康雄性SD大鼠168只，2月龄，体质量（300±20）g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于室温（20±2）℃、相对湿度50%～60%环境，光照明暗交替12 h/12 h，自由摄食饮水。
1.2 药物及制备
颐脑解郁复方，北京中医药大学第三附属医院提供，依据前期研究[4]确定灌胃剂量为9.92 g/（kg・d），按照灌胃剂量煎药浓缩，浓度为0.62 g原药材/mL，4 ℃冰箱保存备用，用前加热；盐酸氟西汀胶囊，礼来（苏州）制药公司，批号0943A，临用时溶于蒸馏水，浓度为0.233 g/L，按照成人用量7倍计算大鼠用量为2.33 mg/（kg・d）。
1.3 主要试剂与仪器
戊巴比妥钠（美国Sigma公司，货号P3761-5），磷酸盐缓冲液（粉剂，福州迈新生物技术开发有限公司，货号PBS-0060），尼龙栓线（北京沙东生物技术有限公司，货号2838-A4），苏木素染色液（北京益利精细化学品有限公司，编号201506251323），水溶性伊红染色液（北京益利精细化学品有限公司，编号YZB/京0102-2011），返蓝染色液（北京益利精细化学品有限公司，编号2015032514324659）。旷场试验用敞箱（自制），强迫游泳试验用水箱（自制），自动化智能型正置研究级显微镜（奥林巴斯有限公司，型号BX53）。
2 实验方法
2.1 分组
大鼠实验前适应性饲养1周，采用随机数字法分为正常组24只、假手术组24只、卒中组30只、PSD组30只、西药组30只、中药组30只。正常组不干预，假手术组不插入线栓，卒中组仅进行卒中手术，PSD组、西药组和中药组均在卒中手术后1周进行PSD模型制备。自造模开始至实验结束，西药组和中药组大鼠分别灌胃氟西汀、颐脑解郁复方药液，其余各组每日灌胃等量蒸馏水。根据大鼠体质量计算氟西汀、颐脑解郁复方药液每日灌胃量，自脑卒中造模开始至实验结束，每次约3～4 mL，每日1次。
2.2 造模
参考新式线栓法[5]，制备大脑中动脉阻塞的脑卒中模型，缺血2 h后进行再灌注。入组标准：大鼠于缺血2 h后出现对侧前肢蜷曲、行走D圈或行走向对侧倒体征则纳入，无此体征或于2 h后仍不清醒者弃去。待脑卒中大鼠造模成功1周后，大鼠神经功能恢复后，将群养的PSD组、西药组、中药组大鼠分开单笼饲养至实验结束。孤养同时，每日10：00～16：00期间任取时间，将大鼠限制在特制的T型束缚台[6]（自制）上予2 h的行为限制，连续7 d。
2.3 观测方法
2.3.1 旷场试验 第2、4、8周末对各组大鼠进行旷场试验。将大鼠置于敞箱中心方格内，观察大鼠3 min内水平穿越格数（记为水平运动得分）、后肢直立次数（记为垂直运动得分）。
2.3.2 强迫游泳试验 第2、4、8周末对各组大鼠进行强迫游泳试验。大鼠禁食21 h，水箱内水深25 cm、水温（25±1）℃，连续观察5 min，记录大鼠在水中强迫游泳时间。
2.3.3 糖水偏爱试验 第2、4、8周末对各组大鼠进行糖水偏爱试验。大鼠禁食禁水20 h后，同时给予每只大鼠事先定量好的1瓶1%糖水和1瓶纯水。30 min后调换糖水和纯水的位置，60 min后取走2瓶并称量，计算大鼠糖水消耗比例。糖水偏爱度=糖水消耗量÷总液体消耗量。
2.3.4 病理观察 第2、4、8周末大鼠行为学测试后，各时点大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（0.5 mL/100 g）麻醉，开胸暴露心脏，0.9%氯化钠溶液快速灌注，再用4%多聚甲醛先快后慢灌注固定，断头取脑，4%多聚甲醛溶液内室温固定36 h，石蜡包埋后做冠状切片，HE染色，光镜下观察海马CA1区结构变化。
3 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。实验数据以―x±s表示，组间比较采用方差分析，方差不齐用Welch法分析，两两比较用LSD法。P
4 结果
4.1 旷场试验结果
在2、4、8周时，同一时点PSD组大鼠与卒中组比较水平运动得分均降低，4周时差异有统计学意义（P
4.2 强迫游泳试验结果
在2、4、8周时，同一时点PSD组大鼠与卒中组比较强迫游泳时间均减少，2、4周时差异有统计学意义（P
4.3 糖水偏爱试验结果
PSD组大鼠与卒中组比较，同一时点糖水偏爱度均降低，4、8周时差异有统计学意义（P
4.4 大鼠海马CA1区病理观察结果
2周时，正常组和假手术组大鼠海马CA1区结构完整，有3～4层细胞，排列紧密，呈圆形或椭圆形，胞核、核仁清晰；卒中组大鼠海马CA1区结构尚完整，细胞较假手术组排列疏松，有2～3层细胞，细胞染色加深、核固缩，核仁不明显；PSD组大鼠海马CA1区有2～3层细胞，较卒中组更加疏松，细胞染色深、核固缩，核仁不明显，形态不规则，部分细胞呈空泡状；西药组和中药组大鼠海马CA1区结构完整，有3～4层正常细胞，排列紧密，核仁清晰，有少量细胞出现深染现象（见图1）。4周时，正常组和假手术组大鼠海马CA1区与2周时比较改变不明显；卒中组大鼠海马CA1区结构尚完整，有1～2层细胞，较正常组排列疏松，细胞染色加深、核固缩，核仁不明显；PSD组大鼠海马CA1区结构不完整，有1～2层细胞，较卒中组受损加重，大量细胞呈空泡状；西药组和中药组大鼠海马CA1区结构完整，有2～3层正常细胞，排列较紧密，有少量细胞出现深染现象，正常细胞周围出现浅粉色结构（见图2）。
8周时，正常组和假手术组大鼠海马CA1区与4周时比较变化不明显；卒中组大鼠海马CA1区结构不完整，有1～2层细胞，染色深、核固缩，核仁不明显；PSD组大鼠海马CA1区结构不完整，细胞量少，多呈空泡状；西药组和中药组大鼠海马CA1区结构完整，有1～2层正常细胞，排列较紧密，细胞呈圆形或椭圆形，核仁清晰，深染细胞较少（见图3）。
5 讨论
本实验在脑缺血模型基础上应用慢性束缚应激复合单笼饲养方法制备PSD大鼠模型，观察颐脑解郁复方对PSD大鼠行为学及海马CA1区的干预作用。实验中采用线栓法制备脑卒中模型，在充分考虑大鼠脑卒中病理基础上，选用刺激温和、量小的慢性束缚应激结合孤养的方法制备PSD大鼠模型。该模型既有脑缺血卒中和抑郁发病的病理基础，又有卒中后肢体活动受限、离开亲友等情志刺激因素，模拟了PSD发生的生物学和心理学因素[7]，操作较简单，造模成功率高，是理想的PSD大鼠模型。行为学测试结果显示，4周时可成功建立PSD大鼠模型。
海马与人类的学习及情感等认知功能密切相关，是介导应激反应的最重要的脑区之一。研究表明，PSD大鼠存在脑卒中损伤侧海马神经再生障碍，而海马神经细胞凋亡会引发一系列抑郁症状[8]。本实验观察了大鼠缺血侧海马CA1区病理变化，发现PSD组大鼠海马CA1区较卒中组受损严重，应用药物干预的西药组与中药组大鼠海马CA1区受损情况明显减轻，提示PSD加重卒中后海马CA1区受损情况，而中药颐脑解郁复方可改善海马CA1区受损情况，保护脑内神经细胞。
中医“脑髓”的现代生物学基础是脑内神经元和神经营养因子。肾主生髓，“补肾填髓”中药可减少神经元死亡，促进神经元存活与再生[9]。肝主疏泄，主藏血，具有调畅气机、调节血量的职能，脑的血供和营养依赖于肝所藏之血及肝的疏泄功能[10]。研究表明，舒肝活血中药复方能改善中风后抑郁状态[11]，并可保护脑内神经元，缓解细胞凋亡[12]。本课题组认为脑卒中多因肾虚髓海失充，元神失养致病，而后情志不遂，肝气失调，痰瘀互结，发生PSD。病位在肝肾二脏，肾虚为基础，又兼气、痰、瘀阻滞。故课题组选用补肾填精、疏肝活血中药，立颐脑解郁复方以益肾舒肝、活血化瘀、颐脑醒神。行为学及病理结果显示，颐脑解郁复方可改善大鼠PSD症状，减轻大鼠海马CA1区受损情况，保护海马CA1区细胞。
有研究表明，益肾舒肝中药复方可显著增强PSD大鼠脑内胶质纤维酸性蛋白、脑源性神经营养因子、碱性成纤维生长因子等表达[13]，参与调节PSD的多条信号通路[14-15]，但其防治机制是一个复杂的过程，目前研究尚未完全阐明。本实验从行为学和病理改变探讨颐脑解郁复方对PSD的干预作用，研究尚不深入，未来将在神经干细胞增殖分化及信号分子的变化方面加以探索。
参考文献：
[1] 韩琳，陈宁，何俐.抗抑郁药预防卒中后抑郁有效性的Meta分析[J].中国循证医学杂志，2015，15（10）：1153-1160.
[2] 白慧东，娄育红，杨国萍，等.逍遥散治疗脑卒中后抑郁疗效的Meta分析[J].中国中医药信息杂志，2010，17（9）：26-27，76.
[3] 裴清华，唐启盛，程远.益肾调气法治疗脑卒中后抑郁（血瘀型）临床研究[J].吉林中医药，2008，28（7）：487-488.
[4] 李侠，唐启盛，侯秀娟，等.脑卒中后抑郁模型大鼠脑单胺递质变化及中药颐脑解郁方的干预作用[J].中国临床康复，2006，10（47）：49-51.
[5] 范瑞娟，罗亚非，孙玉凤.新式线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的建立[J].中国民族民间医药，2014，31（6）：26-27.
[6] 陈家旭，李伟，赵歆，等.三种中药复方对慢性束缚应激大鼠皮层和海马BDNF、TrkB的影响[J].中国病理生理杂志，2007，23（7）：1296-1300.
[7] 谢伟坚.缺血性脑卒中后抑郁相关因素分析[J].中国医药导报，2011， 8（18）：67-68.
[8] HUANG X， MAO Y S， LI C， et al. Venlalaxine inhibits apoptosis of hippocampal neurons by up-regulating brain-derived neurotrophic factor in a rat depression model[J]. Pharmazie，2014，69：909-916.
[9] 李林，魏海峰，张兰，等.中医“肾生髓，脑为髓海”现代生物学基础探讨[J].中国中药杂志，2006，31（17）：1397-1400.
[10] 戎志斌，郭文鹏，姚乃礼.从肝论治脑病[J].中国中医药信息杂志， 2014，21（5）：114-116.
[11] 魏玖月，奚燕萍.卒中后抑郁症的中医治疗[J].中医临床研究，2013， 5（24）：109-111.
[12] 樊蔚虹，姚建平，赵文景.柴胡疏肝散对卒中后抑郁大鼠海马组织Bcl-2、Bax蛋白表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（3）：181-183.
[13] 唐启盛，司银楚，裴清华，等.颐脑解郁方对脑卒中后抑郁状态模型大鼠脑内GFAP、BDNF、bFGF的影响[J].北京中医药大学学报，2005，28（4）：32-35.
[14] 赵瑞珍，黄育玲，唐启盛，等.颐脑解郁方对脑出血后抑郁大鼠脑内PI-3K、Akt信号转导通路的影响[J].中医药学报，2008，36（6）：12-14.
[15] 唐启盛，赵瑞珍，李小黎，等.颐脑解郁方对抑郁大鼠脑内ERK通路的影响[J].中华中医药杂志，2012，27（3）：619-621.
篇9
【摘要】 探讨柴郁温胆汤及其拆方对抑郁大鼠血清ACTH、COR和海马cAMP的影响。［方法］健康雄性SD大鼠84只，随机分为正常组、模型组、柴郁温胆汤组、化痰组、调气血组、养心脾组、马普替林组。参照Katz刺激方法制备慢性轻度不可预见性应激(CUMS)抑郁模型。采用放射免疫法测血清ACTH、COR和大鼠海马cAMP含量。［结果］与正常组相比，模型组大鼠血清ACTH和COR水平明显升高、海马cAMP含量明显降低。同模型组相比，柴郁温胆汤组及调气血组能明显降低ACTH浓度(P
【关键词】 柴郁温胆汤；组分；抑郁症；HPA轴；ACTH；COR；cAMP
UniversityAbstract:［Objective］ To explore the effects of the traditional Chinese drugs Chaiyuwendantang (CYWDT) and its component on the plasm levels of ACTH， COR and cAMP in hippocampus of depressed mode. ［Methods］ Eighty-four male rats were pided into seven groups: control group， depressed model group， group of CYWDT， group of HuaTan， group of TiaoQiXue， group of YangXinPi， group of maprotiline equally and made up models in chronic unpredictable mild stress (CUMS). The plasm levels of ACTH， COR and the level of cAMP in hippocampus were detected by radioimmunoassay. ［Results］ We found that the plasm levels of ACTH， COR were significantly increase and cAMP in hippocampus was significantly decreasd in depression model of rat. CYWDT and TiaoQiXue could significantly decreased the level of ACTH(P＜0.05); CYWDT， HuaTan and TiaoQiXue could significantly decreased the level of COR(P＜0.01). CYWDT， HuaTan and TiaoQiXue could significantly increase the level of cAMP in hippocampus. ［Conclusion］ Chronic unpredictable mild stress can increase the plasm levels of ACTH， COR and the level of cAMP in hippocampus of depression rats. CYWDT could reverse all the changes. The mechanism maybe relatd to regulate hypothalamicpituitaryadrenal axis and signal transmission in cell.
Key words: Chaiyuwendantang; component;depression; hypothalamicpituitaryadrenal axis; adrenocorticotropic hormone; cortisol; cyclic adenosine monophosphate
抑郁症(depression)是最常见的心境障碍，严重威胁人类的身心健康。我们在前期研究中证实柴郁温胆汤对脑单胺类神经递质代谢紊乱具有良好的调节作用，且可明显增加大鼠海马部位PKA表达［1］。本实验拟观察柴郁温胆汤及其拆方对抑郁大鼠血清ACTH、COR和海马cAMP的影响。并与四环类抗抑郁药马普替林相对照，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
(1) 实验动物:健康SpragueDawley(SD)雄性大鼠84只，体重（180±20）g，由南京医科大学实验动物中心提供(许可证号：SCXK(苏)20020031)。所有大鼠均用普通饲料喂养两周后开始造模。(2)实验药品:柴郁温胆汤组（柴胡、郁金、半夏、陈皮、竹茹、枳实、人参、茯苓、炙甘草）浓度为1.84g生药量/ml。化痰组（半夏、陈皮、竹茹）浓度为0.64g生药量/ml。调气血组（柴胡、郁金、枳实）浓度为0.6g生药量/ml。养心脾组（人参、茯苓、炙甘草、大枣）浓度为0.5g生药量/ml。以上药物的煎制和浓缩均手工操作，所用煎药器具为陶瓷制品以保证药物在煎制过程中的稳定性。浓缩后的药物中每种单味药的浓度在整方和拆方中均相同，以保证各组实验结果的可比性。盐酸马普替林(北京诺华制药有限公司生产，国药准字H19991047)用去离子双蒸水配制成1mg/ml药物混悬液。(3)主要实验试剂和仪器 促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone ACTH)放射免疫分析试剂盒(北京北方生物技术研究所)、皮质醇(cortisol COR)放射免疫分析试剂盒(北京华英室温技术研究所)、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate cAMP)放射免疫分析试剂盒(上海中医药大学核医学试验室)。仪器：GC911γ放射免疫计数器(科大创新股份有限公司中佳分公司)。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及给药
选取Openfield评分相近的大鼠84只，随机分为正常组、模型组、柴郁温胆汤组、化痰组、调气血组、养心脾组、马普替林组，每组12只。各治疗组在应激的第2天开始均按提取液(浓缩后)1ml/100g灌胃给药；模型组和正常组给予等量生理盐水。每天上午8时给药1次，持续至实验的第23天。
1.2.2 模型制备
正常组每笼饲养6只，正常摄水饮食，不给任何刺激。其余各组，每只均单笼饲养，并接受21天各种不同的应激刺激，参照Katz方法［2］，每天随机给予一种刺激。使大鼠不能预料刺激的发生，以避免产生适应。
1.2.3 行为学测定
Openfield法测定行为 所用自制敞箱规格为高40cm、直径80cm的内空圆柱桶，周壁为黑色，地面用黑线划分为面积相等的25块。以动物四肢完全进入一个分区作为一个水平活动(crossing)得分、以双前肢完全抬离地面至放下作为一次垂直活动(rearing)得分、以及观察大鼠的理毛(修饰)次数和大便颗粒数。每只动物仅进行一次测定，每次观察3min。
1.2.4 糖水消耗实验
在实验第22天所有实验大鼠均单笼饲养并禁食和禁水，只给1%蔗糖溶液150ml，计算大鼠24h饮用1%蔗糖溶液量。
1.2.5 大鼠血清ACTH和COR测定
用10%水合氯醛(0.36ml/100g) 给大鼠腹腔注射，麻醉后开腹，腹主动脉抽取血液5ml，待测ACTH和COR。按试剂盒方法要求分离血清，采用125I标记放免法测定。
1.2.6 大鼠海马cAMP含量测定
按大鼠脑立体定向图谱(包新民等编著，人民卫生出版社，1991年)定位，冰上分离大鼠一侧海马，装于冻存管并立即投入液氮中，待固化后称重，放入-86℃冰箱保存待测。检测时海马置于pH4.75的醋酸缓冲液中匀浆，加入无水乙醇沉淀蛋白，离心取上清液。采用125I标记放免法测定cAMP含量。
1.3 统计学方法
所有数据均以均数±标准差(x±s)表示。用SPSS11.5统计软件对两组间均数进行两独立样本t检验和F检验。
2 结果
各组大鼠行为学变化，见表1。表1 柴郁温胆汤及其组分对大鼠行为学评分的影响(略)．与正常组比较 P
3 讨论
对于抑郁大鼠的行为学观察多采用经典的Openfield法，目前比较肯定的观察指标是大鼠的水平运动得分和垂直运动得分。本试验观察了大鼠的修饰次数以及大便颗粒数。其中水平得分代表动物的活动度；垂直得分代表动物对新鲜事物的好奇程度和对外界环境的探究兴趣［2］。修饰次数代表了动物对周围环境的要求和自身的关注程度，大便颗粒数反应了CUMS抑郁模型大鼠是否有便秘的抑郁症常见并发症。结果显示复方柴郁温胆汤能够显著提升抑郁模型大鼠的水平得分、垂直得分、修饰次数和大便颗粒数。相对于马普替林，更是显示了少或无马普替林的抗胆碱能副作用—便秘。
本实验研究观察到模型组大鼠血清ACTH和COR浓度较正常组显著增高，与上述文献报道一致，这也进一步证实模型组大鼠存在HPA轴功能亢进。柴郁温胆汤组和调气血组能能够逆转ACTH的升高；柴郁温胆汤组、化痰组和调气血组能逆转大鼠COR水平的增高；马普替林组能够同时逆转ACTH和COR的升高。说明柴郁温胆汤具有调节HPA轴功能紊乱的作用，强度与马普替林相似，其中起主要作用的是化痰和调气血组分。
cAMP是细胞内第二信使，可介导多种细胞内激素、神经递质及其他信号分子的作用。本试验研究表明，模型组大鼠海马cAMP含量较正常组明显降低。柴郁温胆汤组、化痰组、马普替林组均能够逆转这种改变，提示柴郁温胆汤参与了细胞信号通路的调节，其中起主要作用的是化痰药，可能为其抗抑郁机理之一。
参考文献
篇10
【关键词】老年痴呆 行为学指标 脑内有关物质含量检测指标 脑组织形态学观察指标 血液检测指标
中图分类号：R592文献标识码：A文章编号：1005-0515（2010）12-030-03
【ABSTRACT】Objective To sum up and appraisal the evaluating indicators and methods of treating senile dementia. Methods Former indicators were summarized from four aspects of the behavior indicator, the examination indicator of related material content in brain, the brain tectology observation indicator and the blood examination indicator and other indicators were carried on the forecast. Results Through the discussion of drug efficacy targets and the methods,it provides newly and important data for the senile dementia mechanism and the treatment research. Conclusion There is a very important significance to find the effective mathods to prevent and treat the senile dementia by intensively studing main evaluating indicators and methods of treating senile dementia .
【KEY WORDS】Senile dementia; Behavior indicator; Examination indicator of related material content in brain; Brain tectology observation indicator ; Blood examination indicator
众所周知，人类社会己经逐渐进入老龄化社会，老年痴呆已成为威胁人类晚年身心健康的主要疾病之一，患病率呈逐年上升趋势。资料显示，研究者已针对脑的结构、功能和信息传递的新认知开发出了许许多多的治疗药物，且防治效果显著，但相关药效评价指标多散在于浩如烟海的文献中，为此本文总结相关文献，从行为学指标、脑内有关物质含量检测指标、脑组织形态学观察指标、血液检测指标四个方面对药物治疗老年痴呆进行药效评价，为老年痴呆机理和治疗的研究提供新的、重要的数据源。
1 行为学指标
1.1 水迷宫指标
20世纪80年代初，Morris发明了水迷宫，它是一种测量空间学习和记忆能力的实验方法，可用来评估啮齿动物由于老年痴呆等因素所造成的学习记忆的影响，目前已被认为是此类研究的经典。
Morris水迷宫实验由两个主要的实验组成，分别是定向航行实验和空间探索实验。
定向航行实验时，将动物从之前划分好的四个象限中随机放入，在最大游泳时间内，可以记录并作为评价指标的主要是逃避潜伏期（指大鼠自进入迷宫开始至找到平台所需的时间，经典的水迷宫实验以此作为主要指标进行统计分析），除此之外还有游泳路程长度（指大鼠自进入迷宫开始至找到平台游过的总距离。它是逃避潜伏期和平均游泳速度的乘积，是一个综合指标，受两者共同的影响，既可以反映大鼠对平台位置的学习记忆能力，又反映了大鼠的运动能力）、游泳速度（指大鼠进入水迷宫运动的快慢，速度的快慢，一般并不反映大鼠的学习记忆能力，仅反映大鼠的游泳能力。但在某种程度上，大鼠的逃避潜伏期短，那么相对消耗的体力也会少，速度也可能会较快。速度较快，那么，行程也可能会较长）、入水角度（指大鼠进入水迷宫后开始运动的方向与入水点和平台连线的夹角。如果与逃避潜伏期结合分析，在某种程度上可以弥补单纯考虑时间的不足）、搜索策略等可作为评价指标的补充，在分析过程中起参考作用，这个实验主要用于评价动物的空间学习能力。对于最大游泳时间，各实验人员有不同看法，通常选择 120s，90s或60s。最大游泳时间会在统计中由于个别动物而影响整组数据，特别是选择较大的游泳时间时，因此，应该在实验前做好动物的筛选工作，并在统计数据时去掉异常值。
定向航行实验进行几天后（按动物学习情况定），开始空间探索实验，将平台撤去，一般探索时间在90s或60s内[2]，可以记录并作为评价指标的主要有寻求原平台的次数（也就是跨平台次数：是在撤去平台后，动物穿越原平台所在位置的次数，反应动物寻找平台的能力，与原平台象限停留时间结合起来考虑更能反应大鼠的学习记忆能力的变化）、原平台象限的游泳时间，原平台象限游泳时间占总时间百分比，这个实验主要用于评价动物的空间记忆能力。
水迷宫实验作为老年痴呆动物的评价指标来说充分而又准确的，是最常用的评价治疗老年痴呆药效的指标，但是它也有不足之处，Graziano [3]认为简单地使用目前常用的观测指标不能准确的反映真实的搜索策略，于是选择了一些自定义的行为种类、大量的数值变量和重要区域，使用判别式分析的方法来获得较高的准确率。Graziano的这种方法虽然准确但是种类繁多比较复杂，所以我们进行日常实验时，只要选择主要的评价指标补充几个次要指标就可以清楚地反映实验的结果了。
1.2 跳台实验指标
跳台实验是药理学常用的评价动物对药物及其他给予的干预后的神经行为学中一个测试现象较为明显的实验，也就是测量大小鼠记忆能力的变化的实验。跳台实验指标是评价药效常用的指标之一，从文献的记录中看实属完善成熟。
检测方法：将大鼠或小鼠放入跳台仪内适应环境,然后通电,大多数跳上跳台逃避电击。从通电到完全稳定上台所用的时间为潜伏期,跳下时大鼠双足同时接触铜栅视为错误反应,训练并记录训练时间内的潜伏期和错误次数作为学习指标。24h后重测,先将大鼠或小鼠放在跳台上,记录第1次跳下跳台时间为潜伏期,并记录错误次数作为记忆能力指标。
2脑内有关物质含量检测指标
老年痴呆发病机制复杂，多种信号通路参与此过程，许多信号分子在其中发挥重要作用[4]。目前已公认，学习记忆与中枢胆碱神经系统关系极为密切。研究还表明，患者的痴呆程度与皮质和海马中信号分子的缺失程度密切相关，在患者脑中，基底前脑的胆碱能神经细胞明显丢失，胆碱能神经纤维发生退变，AchE、谷氨酸、p-KER2等在脑内的表达出现异常，尤以皮质和海马显著。
2.1 胆碱酯酶（AchE）活性的检测
胆碱酯酶是胆碱能神经递质乙酰胆碱的水解酶直接参与自主神经功能调节、肌肉运动、大脑思维记忆等重要功能。研究证实老年痴呆患者中枢胆碱能系统损伤，AchE活性和突触前胆碱能标志在多处脑区均显著降低或缺失患者基底前脑区胆碱能神经元丢失，从基底节到皮质，胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性降低和乙酰胆碱酯酶(AChE)活性明显升高，造成乙酰胆碱 (ACh)的合成、储存和释放减少，皮质 ACh受体数目减少，产生痴呆症状 [5]。总的来说，老年痴呆患者脑组织中胆碱乙酰化酶活性明显降低，胆碱酯酶活性显著升高，造成 ACh含量不足，导致中枢神经系统功能障碍，出现学习记忆及认知功能下降，甚至智力丧失[6]。因此AchE活性的检测作为评价老年痴呆药效的主要指标，且在药效评价中的使用甚为频繁。
检测方法：断头法处死实验动物后，迅速取脑，用预冷的生理盐水冲净表面血液，用滤纸吸干，去除软脑膜血管。取右脑称重，置微型匀浆器中，加无水乙醇研磨，再加生理盐水充分研磨制成匀浆。冷冻离心机离心，取上清液。用羟胺比色法测定AChE活性(可按照试剂盒说明书进行操作)。
2.2 谷氨酸含量的测定
谷氨酸是脑内主要的兴奋性神经递质，介导兴奋性突触传递，并与长时程增强（long term potentiation LTP）的形成密切相关 [7]，也作为老年痴呆药效的相关评价之一。
检测方法：在海马组织中加入HCL溶液，冰浴下超声匀浆，低温离心，取上清液加入正亮氨酸为内标物，利用异硫氰酸苯酯衍生，用内标法测定谷氨酸含量[8]。
2.3 p-KER2含量的测定
p-KER2含量测定：将海马组织放到预冷的裂解液中。低温超声粉碎后，离心，取上清液分装。用Braford法测定蛋白质含量，以牛血清白蛋白为标准品。用磷酸化抗体，常规Western蛋白印迹法测定p-KER2含量[9]。扫描蛋白条带，进行吸光度分析，吸光度值代表p-KER2含量。
2.4 Aβ和S.P含量的测定
Aβ由分泌酶水解β淀粉样前体蛋白产生，称为β-淀粉样肽，Aβ生成的增多对神经元有毒性作用[10]，大脑海马组织形态也发生明显的变化。而Aβ被认为是导致神经元损伤及认知功能衰退的主要致病物质[11]。
S.P是世界上发现最早的神经肽，研究表明，S.P与学习记忆功能有关，且对中枢神经系统具有保护作用，向人们提示了其对老年性痴呆等神经系统疾病具有潜在的防治价值[12]。
因此Aβ和S.P含量的测定对药效的评价有着重要的作用。
2.5 皮质的蛋白含量的测定
检测方法：分离脑皮质，称重，组织加入磷酸盐缓冲液（PBS）液，在组织匀浆器中充分研磨后，离心，吸取上清液，用PBS按1:4的比例配成组织匀浆液。最后用酶标仪微量比色法测定皮质匀浆液的蛋白含量。
3 脑组织形态学观察指标
3.1 海马病理形态观察
海马组织主要负责存储信息,是人学习和记忆的关键部位。海马结构的整合是空间学习的基础，海马区的受损影响大鼠学习行为的实验结果，和临床患者健忘、痴呆等表现是一致的[13] 。海马萎缩被看成是与记忆损伤相关的重要指标，也是评价药效的主要指标之一。
检测方法：断头处死，开颅取出完整的脑组织，用10%的福尔马林固定，切取脑组织，石蜡包埋，连续切片，行HE常规染色，进行细胞形态学观察。
3.2 检测海马及边缘系统的胆碱能神经元丢失状况
老年痴呆患者的病理学特征是大量神经细胞内神经纤维缠结、细胞外老年斑和弥漫性脑萎缩[14]。计算神经元数目检测海马及边缘系统的胆碱能神经元丢失状况可以直观简单地推测出患者的生理状态，是评价药效的重要指标。
3.3 病理组织切片及免疫组织化学染色
病理组织切片及免疫组织化学染色只要在光学显微镜下，老年痴呆动物模型内部结构的病理变化就一目了然，从而透彻地解析老年痴呆的病因和发病机制。
检测方法：开颅取脑后固定、脱水等过程后，进行冠状冷冻切片。切片PBS冲洗，经过溶于 PBST进行过氧化反应，封闭处理后，加入鼠抗摇匀、孵育过夜。然后，在室温下加入生物素化羊抗鼠IgG摇匀、孵育，室温摇匀、孵育，显色。最后，经过常规粘片、干燥、脱水、透明、封片，光学显微镜下观察并拍摄。
4 血液检测指标
近年来的研究表明，血液指标的检测不仅可预测患上老年痴呆的风险，其准确率高达90%，还可以作为不可或缺的药效评价指标，专家认为，血液检测有望为人类防治老年痴呆症带来革命性变化。
4.1 血清β淀粉样蛋白、转化生长因子及类胰岛素样生长因子Ⅱ水平检测
分泌酶水解β淀粉样前体蛋白产生Aβ,而Aβ又是导致认知功能衰退的主要致病物质，所以老年痴呆伴有β-淀粉样蛋白沉积，可通过检测血清β淀粉样蛋白的水平来估计Aβ的含量。
检测方法：取血分离血清,血清β淀粉样蛋白、转化生长因子及类胰岛素样生长因子Ⅱ检测采用放免法。
4.2 超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)羟自由基的含量检测
检测方法：快速开胸，心脏取血，离心取血清，置于低温保存，按试剂盒说明书，紫外分光光度法检测超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)羟自由基的含量观察动物脑组织形态学的病理变化。
4.3 血液流变学检测
研究表明，血液流变学异常是导致血液成分改变的主要因素之一。有研究认为，高黏血症是痴呆的危险因素之一。其机制可能与血液黏滞度异常则血流变慢，血液黏稠度增加而致脑血流量下降，脑部缺血缺氧，损害大脑的学习记忆功能有关[15]。血液流变学检测也可以评价药物疗效的好坏。
5 小结
到目前为止，各种药效评价指标层出不穷，除了上述常用的指标外，按照每种治疗方法或者药物对此疾病改善的不同，检测的指标也会有所不同，如晚期老年痴呆存在严重氨基酸代谢障碍，脑脊液，血浆中兴奋性氨基酸谷氨酸、天门冬氨酸含量的测定具有重要价值；老年痴呆能引起nNOS和NO表达增加，而MTPG(代谢型谷氨酸受体阻断剂α-甲基-（4-四唑基-苯）甘氨酸能阻断老年痴呆诱导的nNOS表达增加[16]，因此nNOS含量的检测在MTPG这种受体阻断剂的影响下有相对重要的意义等。还有血糖指标，海马颞叶中D2受体变化、载脂蛋白E的含量等等都与老年痴呆的机理息息相关，由于这些指标多而杂是近几年的研究发现，还未得到广泛的应用及证实，还未成熟，故本文只选取了一些成熟、常用、重要且有效的指标及其检测方法进行整理归类，为以后的研究提供更方便的查找途径，但是归类的指标中也还很多细节到现在为止还没有透彻，值得进一步研究、完善，使其更加适用于老年痴呆的机制探讨和药理研究。
这些评价指标的整理与总结以老年痴呆药理学的研究为基础，以评价药效为目的，从而为多层次、多角度深入研究老年痴呆的发病机理奠定了基础，为药物治疗老年痴呆提供更多的途径，有利于进一步提高药物治疗老年痴呆的疗效以及临床价值，并为研究开发疗效更高、毒性更小的治疗老年痴呆的药物提供更多思路。
参考文献
[1]毛雪璇,皮荣标.Morris水迷宫实验影响因素的研究进展.中国行为医学科学2008年9月第17卷第9期
[2] de Bruin N.Mahieu M .Patel T.et a1.Performance of F2 B6x129 hybrid mice in the Morris water maze.latent inhibition and preoulse inhibition paradigms:Comparison with C57BI/6J and 129sv inbred mice.Behav Brain Res,2006,172:122-134．
[3] Gmziano A,Petrosini L,Bartoletti A.Automatic recognition nf explorative strategies in the Morris water maze.J Neuosci Methods,2003,130:33-44．
[4] Yang Yun,Bian Guangxing,Lu Qiujun.Chinese Journal of New Drugs2008,Vol.17 No.1
[5]Piceardi M,Congiu D,Squassina A,et a1.Alzhelrner s disease case―control associationstudy of polymorphisms in ACHE CHAT,and BCHE genes in a Sardinian sample[J].Am J MeGenet B Neuropsychiatr Genet,2007,144(7):895 ―899.
[6]周亚宾.醒神丸对老年性痴呆动物模型行为学和脑内胆碱酯酶活性的影响[J],中国中医药科技,2000,7(3):1501.
[7] Watkins JC,Jane DE.The glutamate story[J].Br J Pharmacol,2006,147(Suppl1):S100-S108
[8]Yang J,Sun LG,Bai XZ,Zhou HT.Simultaneous determination of 18 amino acids by reverd-phase high performance liquid chromatography with precolumn phenylisothiocyanate derivatization[J]. Chin J Chromatogr(色谱),2002, 20(4):369-371.
[9] Yang J, Sun LG，Cai K, Zong ZH, Xing W, Liu SY, et al. Effect of acute and chronic lead exposure on CAI-long term potentiantion and active extracellular signal-regulated kinase 2 of rat hippocampus[J].Chin J Pharmacol Toxicol(中国药理学与毒理学杂志),2004,18(1):66-70
[10] Tskeda A,Loveman E,Clegg A,et al.A systematic review of the clinical effectiveness of donepozil, rivastigmmine and adverse eventsin Alzheimer’s disease[J]. Int JC,eriatr Paychiatry, 2006,21(5):17.
[11] Frost D,Gorman PM,Yip CM,et a1.Co-incorporation of A beta 40 and A beta 42 to form mixed pre-fibrillar aggregates,Eur J Biochem,2003,270(4):654-663.
[12 ] 叶静,刘协和,邓红,等.β-淀粉样多肽诱导神经元凋亡和caspase-3蛋白表达的研究[J].中国神经精神病杂志,2003,29(6):465.
[13] Bezard E,Gross CE,Qin L-DOPA reverses the MPTP-induced elevation of the arrestin2 and GRK6 expression and enhanced ERK activation in monkeybrain[J].Neurbiol Dis,2005,18(2):323.
[14] Liu Donghua,Bi Minggang.Journal of International Pharmaceutical Research 2009 Oct;36(5).
