表观遗传学主要研究范文
时间：2024-01-02 17:53:53
导语：如何才能写好一篇表观遗传学主要研究，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
关键词 表观遗传 高中生物 科学的本质 生命观念
中图分类号 G633.91 文献标志码 A
表观遗传学为人们理解遗传现象提供了全新的视角，成为“后基因组”时代的重要研究内容之一。同时，表观遗传学作为一个前沿领域，将是高中生物课程内容的一部分。如何在高中课程中实现其教育价值，对教育工作者又提出了新的要求。
1 表观遗传学：从“意外”发展而来的科学领域
“众所周知，DNA是生命的基本遗传物质，但令人怦然心动的是，你可以继承的不仅仅只有DNA序列，还有表观遗传信息。”表观遗传学是从对经典遗传学理论无法解释的“意外”现象的探索中发展起来的，这也使表观遗传学的研究格外令人着迷。
经典遗传学认为，遗传信息储存于核酸序列中，并通过生殖将遗传信息传递给下一代。它所揭示的“基因型决定表型”的遗传模式被广泛认知。然而，不符合此模式的遗传现象却一直困扰着遗传学研究者们。作为遗传信息完全相同的同卵双胞胎为什么会在成长发育过程中表现出不尽相同的外表特征？在生物体的发育过程中，虽然每个细胞拥有相同的遗传物质，为什么它们却遵循高度的时空特异性，从而分化为不同的组织？在过去的30年中，随着对DNA甲基化、组蛋白修饰、X染色体失活、基因组印记以及非编码RNA等领域的不断深入研究，许多困惑科学家已久的遗传学问题得到了解释，表观遗传学也逐渐成为一个新兴的热点研究领域。
表观遗传现象被定义为“非DNA突变引起的可继承的表型变化”。其中包涵三个关键点：
（1） 不是由DNA突变引起的；
（2） 可以继承的，或是说可遗传的；
（3） 引起了表型的变化。
一直以来，DNA被认为是遗传信息的唯一承载者。表观遗传学的研究表明，子代可以继承的不仅仅有DNA携带的遗传信息，还有“表观遗传信息”。而这些表观遗传信息虽然没有伴随DNA序列的改变却可以遗传下去。例如，在发育过程中，分化后的细胞和组织之间存在明显的表型差异，这些差异一旦形成便可以以一种克隆性的方式遗传给子代细胞。需要说明的是表观遗传现象中的表型变化是“开关”型的，即这种表型非“有”即“无”，而不是程度上的变化。
表观遗传学与克隆、干细胞、衰老与癌症等研究都有密切联系。在“后基因组”时代，表观遗传学的发展对生物学研究以及人类疾病领域的研究都具有深远的意义。
2 发挥表观遗传学在高中生物学中的教育价值的教学策略
表观遗传学现象广泛存在于生命周期的各个过程中，表观遗传学的调控对生物体来说具有普遍且重要的意义。不过，目前国内外高中生物教材几乎都没有完整介绍表观遗传学相P内容的章节。其原因固然比较多，但主要原因有：表观遗传学是近些年来才发展迅速，属于比较新的研究领域；表观遗传的机制非常复杂，要让高中学生理解其内在机制，有一定困难。然而，将表观遗传学的内容纳入我国的高中生物课程，已经基本达成共识。那么，这一内容在高中生物课程中的教育价值究竟表现在哪里？笔者认为，它不仅仅是为了让学生掌握更多的遗传学知识，完善遗传知识体系，更重要的是发挥它在提升学生学科核心素养方面的价值。
2.1 引导学生深入理解科学的本质
目前，人们对“科学的本质”还没有一个统一的定义，《2061计划――面向所有美国人的科学》所阐述的科学的本质得到很多学者的认可：
（1） 科学世界观：自然是可以理解的；科学知识是可改变的；科学知识并非很容易就可以；科学并非万灵丹，能解决所有的问题。
（2） 科学探究活动：证据对科学而言是重要的；科学是逻辑与想象融合成一体；科学知识除了能说明自然界的现象也具有预测的功能；科学家会验证理论以减少误差；既定的科学知识并不具有永久的权威地位。
（3） 科学事业：科学是人类的一项事业。
表观遗传学的发展历程，典型地体现出了科学的本质。因此，表观遗传学内容的教学，应着力于引导学生更好地理解科学的本质。
2.1.1 引导学生理解科学具有开放性
表观遗传学的发展表明，人类对遗传现象和本质的认识是不断发展的，因此，科学知识是一个开放的系统。虽然遗传学已经建立100多年，但是科学家们并没有停止对遗传问题的探索，遗传学仍然在发展。
在教学中，教师可以让学生尝试回答：“为什么遗传背景相同的同卵双胞胎在成长过程中会出现表型差异？”“为什么克隆后的小猫与‘单亲妈妈’会有不同花色？”……学生在寻求答案的过程中，会发现用之前所学的经典遗传学知识并不能回答好这些问题，而是要进一步寻找更合理的科学解释。由此可以让学生直观地感受到科学的开放性。
2.1.2 引导学生感悟科学讲求证据与逻辑
人们对遗传现象的认知程度会随着科学的发展而改变，但所有观点的产生都不是异想天开，而是基于科学实证。表观遗传学从对现象的认知到理论的建立都是基于科学证据的积累。这期间出现了很多假说，也经历了理论的不断提出与的过程。虽然目前仍然有很多还不能够被解答的问题，但是通过科学家们在DNA与组蛋白修饰、染色质重组以及非编码RNA等领域的不断探索，人们已经可以解释很多表观遗传学现象。科学研究的发展往往从认知规律开始，进而通过科学探究来逐步揭示规律形成的机制。教学时，如果教师引导学生基于表观遗传的现象，科学家揭示现象获得的研究事实来得出结论，既可以让学生更好地理解表观遗传学内容，知道知识是如何形成的，也能进一步引导他们认识到科学是重视证据和逻辑的。
2.1.3 引导学生理解科学的连续性
科学的本质特征，一方面表现在科学知识是暂时的、可变的；另一方面表现为科学知识又具有持久性。虽然科学家反对绝对真理的概念，并认为其中不确定性是事物本性的一部分，但绝大部分知识都具有持久性。因此，改变性与连续性是科学一贯的特征。高中阶段学生对表观遗传学相关内容的学习，既需要、也可以体现出科学的连续性。
经典的分子遗传学可以说是从“基因”的层面来进行研究，表型的改变归结于DNA序列的变化。而表观遗传学是从“染色质”的层面来进行研究，表型的改变归结于染色质状态的调整。所以表观遗传学狭义的定义为：通过调整染色质状态，在不改变DNA序列的情况下实现对基因转录的调节。学习有关内容时，教师要引导学生认识：表观遗传学的发展对经典遗传学来说并不是一种质疑和挑战，而是一种补充，是遗传学研究的一种延续。随着表观遗传现象分子机制的揭开，其与经典遗传学以及普遍的生物调控更容易地被结合起来。这种联系是一直就存在的，只是科学家需要通过对科学的不断探究去发现和理解它。科学是人类的一项永无止境的事业，遗传学的探索还将继续为人们揭开更多生命的奥秘。
2.2 注意引导学生进一步建立生命观念
“生命观念”是理解生命的本质所需要的观念，是对观察到的生命现象及相互关系或特性进行解释后的抽象。构建生命观念是发展核心素养的重要组成部分。表观遗传学内容的学习可以帮助学生完善结构与功能观、进化与适应观以及稳态与平衡观。
2.2.1 注意凸显表观遗传学如何体现出结构与功能的统一性
结构与功能观是基本的生命观念之一。结构是功能的基础，功能的有效执行必定依赖于特定的结构。在生物体的生命历程中，结构与功能是一个不可分割的整体。
表观遗传现象充分体现出结构与功能的辩证统一关系。研究结果表明，在表观遗传学“开启”和“关闭”两种不同的表型状态下，总是可以在其中的关键调控点找到结构差异，即结构决定功能。染色质在结构上并不是均一存在的，既有相对松散的有利于基因表达的常染色质，又有高度浓缩使基因沉默的异染色质。常染色质是以一种开放式的、对转录等过程所需的各种酶更为敏感的构象存在，随时可以开启基因的表达。而异染色质以一种超浓缩的致密结构存在，转录等相关的酶无法结合上去，从而抑制表达。这体现出染色质的结构和功能是相适应的。表观遗传学的各种机制之间其实是相互关联的，表观遗传因素通过调节染色质的结构、对染色质进行修饰等来影响基因的转录，从而达到调节功能的目的。
在教学中，教师可以结合表观遗传的实例渗透结构与功能观。例如，表观遗传学因素导致雌性哺乳动物的一条X染色体失活，失活后的染色体以致密的异染色质状态存在，称为巴氏小体。以玳瑁猫为例，玳瑁猫（母猫）的体表有黄色和黑色随机分布的花斑。控制黄色和黑色毛色的基因是位于X染色体上的两个等位基因。在个体的发育过程中，细胞内的一条X染色体随机浓缩而失去活性，从而呈现出这种黄黑相间的花色。
2.2.2 注意发挥表观遗传学在建立进化和适应观念上的价值
“生物进化”是生物学核心概念的重要组成部分，提供了将大部分生物学知识建成一个整体的框架。“遗传”“进化”与“环境”三者之间存在很微妙的关系。生物进化的前提是有可遗传的变异；遗传素材的多样性为自然选择提供了更多的原料从而更好地适应环境；而环境又像是一个有力的推手影响着进化的方向。表观遗传学的学习是一个将遗传、进化与环境很好整合的过程，能够帮助学生进一步理解三者的内在联系。
生物体能够产生后代并稳定遗传依赖于稳定传递的遗传信息与精密的调控机制。表观遗传信息的发现是对遗传信息的重要补充，拓展了遗传密码（DNA）的信息承载量。表观遗传信息的加入相当于扩大了遗传样本量，为自然选择提供了更多的素材。很多表观遗传学现象都是在生物后天的发育中表现出来的，体现出环境的塑造性。借助表观遗传学研究手段，人们能更好地理解环境因素对生命的影响，进一步理解“基因型+环境=表型”这一遗传学命题。研究结果显示，从单细胞到多细胞，表观遗传相关的DNA甲基化、组蛋白修饰的程度与类型以及RNA干扰机制在不同的物种中具有显著的差异，暗示着表观遗传调控在生物进化过程中的作用。表观遗传信息的发现以及表观遗传调控机制的研究对进一步理解遗传与进化具有重要意义。
2.2.3 利用表观遗传学内容引导学生建立稳态与平衡观念
在自然界生存，生物种群会找到一个合适的平衡点来有效地适应环境从而维持稳态。稳态不是恒定不变的，而是一种动态的平衡。动态平衡无处不在，各物种与生存环境之间存在平衡，物种之间存在平衡，种群之间存在平衡，个体之间存在平衡。与此同时，每一个生物个体也是一个复杂而精密的系统，在生存过程中，个体的各种结构之间、各种调控机制之间都存在平衡。在进行表观遗传学的教学时，教师可以通过以下几个层次引导学生建立相关的生命观念。
雌性与雄性之间的平衡：众所周知，X染色体的基因携带量较Y染色体来说是大很多的。如果雌性动物的两条X染色体都具有活性，那么雌性性染色体所携带的基因数目几乎是雄性的两倍之多。在哺乳动物中，雌性个体的一条X染色体会随机失活，从而维持与雄性之间基因的剂量平衡。
染色质结构之间的平衡：基因的表达与沉默是一个复杂且精密的过程。在哺乳动物中，染色质中的常染色质比例只占不到4%，而剩余的96%都为异染色质。需要注意的是，沉默染色质是动态变化的，这增加了问题的复杂性。要维持和延续染色质的这种动态平衡状态必定需要一个十分可靠的调控过程。因此，表观遗传现象往往是多种机制共同作用的结果。
表观遗传调控与环境因素之间的平衡：在表观遗传学研究还不明确的年代，人们常常把经典遗传学无法解释的现象都归结于“环境”的因素。研究数据表明，环境因素可以通过影响表观遗传标记从而影响基因功能。表观遗传具有时间上的多样性，同卵双胞胎在出生早期具有相似的表型，但随着不断地成长，差异会不断出现。数据显示，同卵双胞胎在遗传学标记的程度和分布上都有明显的不同，说明表观遗传调控与环境的变化之间存在一种动态的联系。
综上所述，高中阶段的表观遗传学内容的教学关键不在于表观遗传知识的深挖和补充，而在于以此为脚手架，引导学生更好地理解科学的本质、构建生命观念，从而使学生建立终生受益的素养基础。
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在Watson和Crick发现DNA双螺旋结构后的50多年里，基因工程药物在治疗人类疾病中逐渐占据一席之地，人类基因组计划的完成为基因治疗开辟了更广阔的空间。近年来随着遗传学的新兴学科——表观遗传学在人类疾病治疗方面获得了越来越多的证据[1]。它从分子水平上揭示复杂的临床现象，为解开生命奥秘及征服疾病带来新希望。
表观遗传学是研究没有DNA序列变化的情况下，生物的表型发生了可遗传改变的一门学科[2]。表观遗传学即可遗传的基因组表观修饰，表观修饰包括：DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、X染色体失活、基因组印记、非编码RNA调控等[3]，任何一方面的异常都可能导致疾病，包括癌症、染色体不稳定综合征和智力迟钝[4]等。表观遗传的改变是可逆的，这就为治疗人类疾病提供了乐观的前景。本文从表观遗传学与人类疾病、环境与表观遗传学的关系以及表观遗传治疗3个方面进行综述。
1 表观遗传学修饰与人类疾病
1.1 DNA甲基化相关疾病
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下，将甲基基团转移到胞嘧啶碱基上的一种修饰方式。它主要发生在富含双核苷酸CpG岛的区域，在人类基因组中有近5万个CpG岛[5]。正常情况下CpG岛是以非甲基化形式(活跃形式)存在的，DNA甲基化可导致基因表达沉默。DNMTs的活性异常与疾病有密切的关系，例如位于染色体上的DNMT3B基因突变可导致ICF综合征。有报道[6]表明，重度女袭性牙周炎的发生与2条X染色体上TMP1基因去甲基化比例增高有关。DNMT基因的过量表达与精神分裂症和情绪障碍等精神疾病的发生也密切相关。风湿性疾病等自身免疫性疾病特别是系统性红斑狼疮(SLE)与DNA甲基化之间关系已经确定[7]，在SLE病人的T细胞发现DNMTs活性降低导致的异常低甲基化。启动子区的CpG岛过度甲基化使抑癌基因沉默，基因组总体甲基化水平降低导致一些在正常情况下受到抑制的基因如癌基因被激活[8]，都会导致细胞癌变。
1.2 组蛋白修饰相关疾病
组蛋白的修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP核糖基化、羰基化等，组成各种组蛋白密码。其中，研究最多的是乙酰化、甲基化。一般来说，组蛋白乙酰化标志着其处于转录活性状态;反之，组蛋白低乙酰化或去乙酰化表明处于非转录活性的常染色质区域或异染色质区域。乙酰化修饰需要乙酰化转移酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)参与。组蛋白修饰酶异常可导致包括癌症在内的各种疾病，例如，H4K20的三甲基化是癌症中的一个普遍现象。甲基化CpG2结合蛋白2(MeCP2)可使组蛋白去乙酰化导致染色质浓缩而失活，其中Rett综合征就是MeCP2的突变所致。
1.3 染色质重塑相关疾病
染色质重塑是DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑复合物的共同作用。它通过影响核小体结构，为其他蛋白提供和DNA的结合位点[9]。其中染色质重塑因子复合物主要包括SWI/SNF复合物和ISW复合物。染色质重塑复合物如果发生突变，可导致染色质不能重塑，影响基因的正常表达，导致人类疾病。如果突变引起抑癌基因出现异常将导致癌症，例如：小儿科癌症中检测到SNF5的丢失。编码SWI/SNF复合物相关的ATP酶的基因ATRX、ERCC6、SMARCAL1的突变可导致B型Cockayne综合征、Schimke综合征甚至肿瘤。ATRX突变可引起DNA甲基化异常，从而导致数种遗传性的智力迟钝疾病如:X连锁α2地中海贫血综合征和SmithFinemanMyers综合征，这些疾病与核小体重新定位的异常引起的基因表达抑制有关[10]。
1.4 X染色体失活相关疾病
哺乳动物雌性个体不论有多少条X染色体，最终只能随机保留一条的活性。X染色体失活由X失活中心(Xic)调控，Xic调控X染色体失活特异性转录基因(Xist)的表达。X染色体的不对称失活可导致多种疾病，例如男性发病率较高的WiskottAldrich综合征是由于WASP基因突变所致。X染色体的PLP基因突变失活常导致PelizaeusMerzbacher病;X染色体的MeCP2基因突变失活导致Rett综合征[11]。在失活的X染色体中，有一部分基因因逃避失活而存在2个有活性的等位基因，使一些抑癌基因丧失功能，这是引发女性癌症的一个重要原因[12]。
1.5 基因组印记相关疾病
基因组印记是指二倍体细胞的一对等位基因(父本和母本)只有一个可以表达，另一个因表观遗传修饰而沉默。已知在人体中有80多种印记基因。印记丢失导致等位基因同时表达或有活性的等位基因突变，均可引起人类疾病。一些环境因素，如食物中的叶酸也会破坏印记。印记丢失不仅影响胚胎发育，并可诱发出生后的发育异常。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活可导致癌症的发生，如IGF2基因印记丢失导致的Wilms瘤[13]。15号染色体的表观遗传异常可导致PraderWilli综合征(PWS)和Angelman综合征(AS)，PWS是由于突变导致父本表达的基因簇沉默，印记基因(如SNURF/SNRPN)在大脑中高表达所致;AS是由于母本表达的UBE3A或ATP10C基因的缺失或受到抑制所致。Beckwithweideman综合征(BWS)是11号染色体表观遗传突变引起印迹控制区域甲基化的丢失，导致基因印记丢失引起[14]。
1.6 非编码RNA介导相关疾病
功能性非编码RNA分为长链非编码RNA和短链非编码RNA。长链RNA对染色质结构的改变起着重要的作用。短链RNA对外源的核酸序列有降解作用以保护自身的基因组。小干涉RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)都属于短链RNA，在人类细胞中小片段的siRNA也可以诱导基因沉默。miRNA能够促使与其序列同源的靶基因mRNA的降解或者抑制翻译，在发育的过程中起着关键性作用。转录的反义RNA可以导致基因的沉寂，引起多种疾病，如使地中海贫血病人的正常球蛋白基因发生甲基化。由于miRNA在肿瘤细胞中的表达显著下调，P53基因可通过调控miRNA34ac的表达治疗肿瘤。在细胞分裂时，短链RNA异常将导致细胞分裂异常，如果干细胞发生这种情况也可能导致癌症。
2 环境表观遗传学
对多基因复杂症状性疾病来说，单一的蛋白质编码基因研究远远不能解释疾病的发生机理，需要环境与外界因素的作用才会发病。疾病是外界因素与遗传因素共同作用的结果。流行病学研究已经证实，人类疾病与环境有明确的关系，高血压、中风、2型糖尿病、骨质疏松症等疾病的发病率与环境有着密切的关系[15]。特别是在发育初期，不利的环境、 营养的缺乏都有可能导致出生低体重、早产、胎儿发育不成熟等[16]。环境与DNA甲基化的关系一旦建立，将为环境射线暴露与癌症发生提供依据[17]。
环境污染等不利因素均有可能增加基因的不稳定性，每个人对环境和饮食的敏感性可因先天遗传不同而不同，环境因素与个体遗传共同作用，决定潜在表观遗传疾病的危险性。有人推测上述因素肯定会在我们基因组上遗留下微量的基因表遗传学痕迹[1]。随着年龄增长，DNA甲基化等化学修饰改变也在长时间中错误积累，这也有助于解释为什么很多疾病总是在人进入老年后才发生。由此可见，如果改变不良生活习惯、减少环境污染，都有可能降低表观遗传疾病的发病率。因此研究环境与表观遗传改变的关系对于预防和治疗人类疾病都有着重要的意义。
3 表观遗传学药物
人类许多疾病都可能具有表观遗传学的改变，表观遗传学治疗研究如火如荼。已经发现许多药物可以通过改变DNA甲基化模式或进行组蛋白的修饰等来治疗疾病。目前，很多药物处于研制阶段，尽管其有效性尚未得到充分证实，但给癌症、精神疾病以及其他复杂的疾病的治疗带来了希望。
3.1 组蛋白去乙酰化酶抑制剂
目前发现的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC Inhibitor)有近百种。其中FK228主要作用机制是抑制肿瘤细胞内组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性，引起乙酰化组蛋白的积聚，从而发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡或分化等作用[18]。FK228单独用药或与其他药物或方法联合应用表现出良好的抗肿瘤作用，同时还可阻碍血管生成，具有抑制肿瘤转移、逆转耐药性、调节免疫力等作用。FK228还具有治疗炎症、免疫性疾病、视网膜新生血管疾病及神经系统等多种疾病的药理学作用。
3.2 DNA甲基转移酶抑制剂
核苷类DNA甲基转移酶抑制剂作用机理是在体内通过代谢形成三磷酸脱氧核苷，在DNA复制过程中代替胞嘧啶，与DNMTs具有很强的结合力。核苷类似物5氮杂胞苷(5azacytidine)是第一个发现的甲基化抑制剂，最初被认为是细胞毒性物质，随后发现它可抑制DNA甲基化和使沉默基因获得转录性，用于治疗高甲基化的骨髓增生异常综合征，低剂量治疗白血病。其他核苷类DNA甲基转移酶抑制剂有5氮2脱氧核苷(5aza2′deoxycytidine)，Zebularine(5azacytidine的衍生物)[19]，5Fluoro2′deoxycytidine，RG108，Procainamide，Psammaplins(4aminobenzoic acid衍生物)，MG98(寡聚核苷酸)等。DNA甲基化抑制剂Procainamide可用于抗心律失常。另外在茶叶和海藻中提取的EGCG也显示具有体外活性。临床中应用反义寡核苷酸对DNA甲基转移酶进行抑制正在进行实验。
3.3 联合治疗
DNA甲基化抑制剂与HDAC抑制剂联合应用治疗疾病可能具有协同作用。进行表观修饰治疗后的细胞可能对于化疗、干扰素、免疫治疗更具有敏感性。在癌症的治疗方面，应当包括遗传治疗和表观遗传治疗两个方面，同时运用两种或两种以上表观修饰的方法对病人进行治疗对人类疾病意义重大。
3.4 其他方法
人胚胎干细胞保留有正常基因印记，这些干细胞可能具有治疗意义[20]。另外，在女性细胞中非活性的X染色体中存在正常的野生型基因，如果选择正确的靶点，就有可能激活这个正常但是未被利用的野生型基因，从而对其进行基因治疗。有报道[21]运用RNAi技术沉默胰岛β细胞相关基因，抑制胰岛淀粉样形成可能用来治疗糖尿病。短链脂肪酸(SCFAs)丙戊酸钠用于抗癫痫，丁酸可用来治疗结肠癌[22]等。siRNA可在外来核酸的诱导下产生，通过RNA干扰(RNAi)清除外来核酸，对预防传染病有重要作用。目前，RNA干扰已大量应用于包括肿瘤在内的疾病研究，为一些重大疾病的治疗带来了新的希望。
4 结 语
从表观遗传学提出到现在，人们对表观遗传学与人类疾病的发生有了更深入的认识。人类表观基因组计划(human epigenome proiect，HEP)已经于2003年开始实施，其目的是要绘制出不同组织类型和疾病状态下的人类基因组甲基化可变位点(methylation variable position ，MVP)图谱。这项计划可以进一步加深研究者对于人类基因组的认识，为表观遗传学方法治疗人类复杂疾病提供蓝图[1]。但是，表观遗传学与人类生物学行为(临床表型)有密切关系，人类对表观遗传学在疾病中的角色研究还处于初级阶段。应更进一步研究表观遗传学机制、基因表达以及与环境变化的关系，有效减少表观遗传疾病的发生风险，努力探索这片造福人类的前沿领域。
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1 DNA甲基化和组蛋白乙酰化
1.1 DNA甲基化 DNA甲基化是指在DNA复制以后，在DNA甲基化酶的作用下，将S-腺苷甲硫氨酸分子上的甲基转移到DNA分子中胞嘧啶残基的第5位碳原子上，随着甲基向DNA分子的引入，改变了DNA分子的构象，直接或通过序列特异性甲基化蛋白、甲基化结合蛋白间接影响转录因子与基因调控区的结合。目前发现的DNA甲基化酶有两种：一种是维持甲基转移酶；另一种是重新甲基转移酶。
1.2 组蛋白乙酰化 染色质的基本单位为核小体，核小体是由组蛋白八聚体和DNA缠绕而成。组蛋白乙酰化是表观遗传学修饰的另一主要方式，它属于一种可逆的动态过程。
1.3 DNA甲基化与组蛋白乙酰化的关系 由于组蛋白去乙酰化和DNA甲基化一样，可以导致基因沉默，学者们认为两者之间存在串扰现象。
2 表观遗传学修饰与恶性肿瘤耐药
2.1 基因下调导致耐药 在恶性肿瘤中有一些抑癌基因和凋亡信号通路的基因通过表观遗传学修饰的机制下调，并与化疗耐药有关。其中研究比较确切的一个基因是hMLH1，它编码DNA错配修复酶。此外，由于表观遗传学修饰造成下调的基因，均可导致恶性肿瘤耐药。
2.2 基因上调导致耐药 在恶性肿瘤中，表观遗传学修饰的改变也可导致一些基因的上调，包括与细胞增殖和存活相关的基因。上调基因FANCF编码一种相对分子质量为42000的蛋白质，与肿瘤的易感性相关。2003年，Taniguchi等证实在卵巢恶性肿瘤获得耐药的过程中，FANCF基因发生DNA去甲基化和重新表达。另一个上调基因Synuclein-γ与肿瘤转移密切相关。同样，由表观遗传学修饰导致的MDR-1基因的上调也参与卵巢恶性肿瘤耐药的形成。
3 表观遗传学修饰机制在肿瘤治疗中的应用
3.1 DNA甲基化抑制剂 目前了解最深入的甲基化抑制剂是5-氮杂脱氧胞苷（5-aza-dc）。较5-氮杂胞苷（5-aza-C）相比，5-aza-dc首先插入DNA，细胞毒性比较低，并且能够逆转组蛋白八聚体中H3的第9位赖氨酸的甲基化。有关5-aza-dc治疗卵巢恶性肿瘤的体外实验研究结果表明，它能够恢复一些沉默基因的表达，并且可以恢复对顺柏的敏感性，其中最引人注目的是hMLH1基因。有关地西他滨（DAC）治疗的临床试验，研究结果显示，结果显示：DAC是一种有效的治疗耐药性复发性恶性肿瘤的药物。 转贴于
3.2 HDAC抑制剂 由于组蛋白去乙酰化是基因沉默的另一机制，使用HDAC抑制剂（HDACI）是使表观遗传学修饰的基因重新表达的又一策略。根据化学结构，可将HDACI分为短链脂肪酸类、氯肟酸类、环形肽类、苯酸胺类等4类。丁酸苯酯（PB）和丙戊酸（VPA）属短链脂肪酸类。PB是临床前研究最深入的一种HDACI，在包括卵巢恶性肿瘤在内的实体肿瘤（21例）Ⅰ期临床试验中有3例患者分别有4~7个月的肿瘤无进展期，其不良反应是短期记忆缺失、意识障碍、眩晕、呕吐。因此，其临床有效性仍有待于进一步在Ⅰ、Ⅱ期临床试验中确定。在VPA的临床试验中，Kuendgen等在对不同类型血液系统肿瘤中使用VPA进行了Ⅱ期临床试验，结果显示，不同的患者有效率差异甚远。辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）是氯肟酸类中研究较深入的一种HDACI。其研究表明，体内使用安全剂量SAHA时，可有效抑制生物靶点，发挥抗肿瘤活性。大量体外研究结果显示，联合使用DNA甲基化抑制剂和HDACI会起到更明显的协同作用。
3.3 逆转耐药的治疗 Balch等使用甲基化抑制剂—5-aza-dc或zebularine处理卵巢恶性肿瘤顺柏耐药细胞后给予顺柏治疗，发现此细胞对顺柏的敏感性分别增加5、16倍。在临床试验中，Oki等将DAC和伊马替尼（imatinib）联合使用治疗白血病耐药患者，结果说明，应用表观遗传学机制治疗恶性肿瘤确实可以对化疗药物起到增敏作用，并且在一定范围内其疗效与体内表观遗传学的改变呈正比。Kuendgen和Pilatrino等对HDACI和化疗药物的给药顺序进行研究，结果显示，在使用VPA达到一定血清浓度时加用全反式维甲酸可增加复发性髓性白血病和骨髓增生异常综合征患者的临床缓解率，这可能与VPA引起的表观遗传学改变增加患者对药物的敏感性有关。
4 展望
总的来说，应用表观遗传学修饰机制治疗肿瘤具有良好的应用前景，与传统化疗药物联合来逆转耐药，将给攻克恶性肿瘤等疾病带来新的希望。
参 考 文 献
篇4
关键词 硒 表观遗传修饰 表观标志物抑制剂 抗癌药 开发
中图分类号：R979.1 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）03-0075-04
Selenium compounds ― looking forward to be developed as epigenetic targeting selenium-containing anti-tumor drugs*
ZHU Huiqiu1**， HUA Yan1， WANG Mingli2***
（1. Anhui Huaxin Pharmaceutical Co. Ltd.， Hefei 230000， China； 2. Anhui Medical University， HeFei 230032， China）
ABSTRACT Selenium compounds can produce an intervention effect on the abnormality of epigenetic modification and then repress the occurrence and metastasis of tumor. They can be used as the inhibitors of some tumor specific epigenetic markers and expected to be developed as a new type of epigenetic targeting selenium-containing anti-tumor drugs.
KEy WORDS selenium； epigenetic modification； inhibitors of epigenetic markers； anti-cancer drugs； development
硒最重要的生物学功能是抗癌，并以多种机制发挥其抗癌作用。近年来的研究发现，硒又可对表观遗传学调控机制异化产生干预影响，特别是对在肿瘤发生机制中的特异性靶点进行干预，进而阻抑肿瘤的发生及转移。硒化物是某些肿瘤特异性表观标志物有效的抑制剂。硒的这个功能不仅对临床肿瘤诊断、治疗、预防具有现实意义，更为“含硒表观靶向抗癌药物”开发提供了科学依据。“含硒表观靶向抗癌药物”是期待开发的新型抗癌药。现就近些年在这些方面的相关研究作一简要介绍。
1 表观遗传学
什么是表观遗传学？从孟德尔遗传规律讲，亲代（一代）把遗传信息传递给子代（二代），主要由携带遗传信息的脱氧核糖核酸（DNA）分子中碱基的排列顺序（即碱基序列）来决定，并在细胞核内遗传。但人们在研究中发现，在DNA碱基序列以外还有一套调控机制，包括 DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA等，它们在不涉及改变DNA碱基序列的情况下，影响转录活性并调控基因的表达，改变机体的性状，并且是一种可以预和逆转的遗传机制。这种非孟德尔遗传现象，称作表观遗传学[1-2]。
2 硒对表观遗传修饰异常产生干预及逆D作用
肿瘤发生发展的主要生物学原因是原癌基因活化和抑癌基因失活[3]。研究显示，DNA甲基化水平同这些基因的表达密切相关。通常情况下，甲基化水平同基因表达呈负相关，甲基化程度越高，基因表达活性越低，甲基化程度越低，基因表达越活跃[4]。
DNA甲基化主要表现为基因组整体甲基化水平降低和局部CpG岛[在哺乳动物中富含胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸的一段DNA称为CpG岛]甲基化程度的异常升高，人类基因组的甲基化主要发生在CpG岛[5]。
研究表明，实体瘤普遍存在基因组广泛低甲基化现象，低甲基化使原癌基因活化，癌细胞异常增殖；低甲基化还使肿瘤转移增加，例如胃癌的甲基化水平越低，癌细胞浸润、转移的倾向越明显[6]。
CpG岛的甲基化程度异常升高，会导致某些抑癌基因表达沉默，进而参与肿瘤的发生发展。在正常情况下，CpG岛为非甲基化。当肿瘤抑癌基因的启动子区域（CpG岛）过度甲基化，就会使抑癌基因的表达沉默。其间DNA甲基转移酶（DNMT）家族中的DNMT1发挥着重要的调控作用，它的高表达导致抑癌基因在CpG岛失活。所以，CpG岛高甲基化成了多种肿瘤特异性表观标志物，已成为临床多种肿瘤早期诊断的依据和指标[7]。
近年来，作为表观遗传学调控机制之一的组蛋白修饰在肿瘤研究领域受到越来越多的关注。组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）共同调控，而编码HAT或HDAC的基因如果发生染色体易位、扩增等突变会导致某些肿瘤的发生。
可见，DNA甲基化和组蛋白乙酰化等表观遗传修饰异常是肿瘤发生的另外一个机制。而近年研究发现，硒通过靶向干预可逆转甲基化和乙酰化异常的过程，从而抑制肿瘤的发生及转移。硒化物成了潜在的治癌新药物，是亟待开发、临床应用前景可观的“含硒表观靶向抗癌药物”。
2.1 硒对DNA甲基化产生干预作用
研究表明，膳食硒通过干预表观遗传过程显示出其抗癌潜力，膳食缺硒时组织呈现整体低甲基化[8]。Davis等[9]早些时候研究发现，给大鼠喂食缺硒膳食，其肝脏和结肠都出现显著DNA低甲基化，而经硒处理的人结肠癌细胞株Caco-2 DNA甲基化水平显著高于未经硒处理的对照组，据此研究者认为，膳食缺硒会增加肝脏和结肠肿瘤的发生。Remely等[8]研究表明，膳食硒营养缺乏会引起动物组织和人体结肠癌DNA低甲基化。我国学者徐世文等[4]通过实验也发现，饲料硒缺乏可导致鸡肌肉组织 DNA甲基化水平降低。硒对DNMT有抑制作用，缺硒会导致DNMT活性增加，使原癌基因活化，引起结肠癌等多种肿瘤发生。保持硒等营养素均衡摄入，有利于维持DNA甲基化正常水平及抑制DNMT活性[6]。
CpG岛DNMT1的高表达是使抑癌基因失活的重要机制。抑制DNMT1靶酶活性，使失活的抑癌基因复活，是肿瘤治疗中探索的新途径。硒在多种肿瘤中有去甲基化的生物学功能，能诱导失活的抑癌基因重新活化和表达[3]。研究发现，硒可以直接干预DNA甲基化，抑制腺癌细胞株DNMT的高表达[8]。膳食硒干预DNA甲基化的方式之一是通过去甲基化过程来调节DNMT1活性的；研究还证实，亚硒酸钠和苯甲基氰酸硒（BSC）、1，4-苯双（亚甲基）氰酸硒（p-XSC）两种合成硒化物对人大肠癌细胞核提取物中DNMT的活性都有抑制作用[10]。
各方面的研究验证，硒对DNA甲基化产生干预影响，是靶酶DNMT有效的抑制剂。
2.2 硒干预影响组蛋白的乙酰化
近年来，国内外学者研究发现，组蛋白去乙酰化酶与肿瘤的发生密切相关。HDACs家族中的HDAC1高表达可明显增加肿瘤细胞的增殖能力。在食管鳞癌、前列腺癌等多种肿瘤中均发现HDAC的高表达，靶酶HDAC已成为首选的攻击靶点。
目前，人们通过体内、体外的研究鉴定出了硒、丁酸盐、曲古抑菌素A（TSA）等一些HDAC的抑制剂，这些抑制剂可在体外诱导多种肿瘤细胞的生长停滞、分化或凋亡[2]。Somech等[11]通过临床试验表明，HDAC抑制剂对人体白血病及实体瘤进行治疗，表现出明显的抗肿瘤增殖效果，研究者认为，各类HDAC抑制剂是另一类新型抗癌药物、“癌症治疗的新工具”。
Xiang等[12]的研究证明，硒可以通过下调DNMT和抑制HDAC活性，活化人前列腺癌LNCaP细胞系中因高甲基化沉默的基因GSTP1， APC和CSR1。这些基因是具有保护免受氧化损伤的抗癌活性物质、化学致癌物解毒剂或肿瘤抑制剂。
甲基硒酸（MSA）是近年来新研制成的一种人工低分子量有机硒化合物，是很具潜力的抗癌制剂。Kassam等[13]通过对弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系（DLBCL）w外研究首次发现，MSA可以抑制该细胞系HDAC的活性。研究者认为，有关MSA抑制HDAC活性的作用以前从未报道过，从而为人们提供了硒元素一种新的机制，MSA是日后临床试验中可以使用的硒化物。
我国科研人员胡琛霏[2]通过蛋白质免疫印迹的方法，检测到MSA可抑制食管鳞癌细胞系HDAC的活性，降低HDACl和HDAC2的蛋白表达，引起细胞内组蛋白乙酰化水平显著升高；同时，还检测到硒甲硫氨酸（SLM）对食管鳞癌细胞系KYSEl50细胞和MCF7细胞的作用，在SLM处理细胞24 h后，细胞中组蛋白去乙酰化酶的活性也显著降低。
这些年，越来越多的含硒组蛋白去乙酰化酶抑制剂被发现和验证。亚硒酸钠、酮C甲基硒丁酸盐（KMSB）、甲基硒代半胱氨酸（MSC）、甲基硒丙酮酸（MSP）等硒化物都可以抑制HDAC活性，提高组蛋白乙酰化水平，作为潜在的HDAC抑制剂，发挥其抗肿瘤的作用[14]。Fernandes 等[15]介绍，KMSB 和 MSP在体外作为HDAC的竞争性抑制剂发挥抗癌作用；还报道，合成的SAHA含硒类似物（5-苯甲酰戊氰硒）二硒醚和5-苯甲酰戊氰硒对不同肺癌细胞株HDAC抑制效果比SAHA更好。SAHA是氧肟酸类HDAC抑制剂，是目前在临床上以皮肤T淋巴细胞瘤（CTCL）为适应症而广泛应用的表观靶向抗癌药物。这也提示，含硒类抑制剂对靶酶HDAC抑制效果优于无硒类抑制剂。
为何上述各种硒化物都可靶向抑制DNMT和HDAC活性，研究发现不管其结构如何改变，硒都是这些化合物生物活性的中心元素，发挥着关键作用，硒的这一生物学功能对含硒抗癌药物的开发具有重要的指导意义[16]。
2.3 硒对非编码RNA调控机制产生干预效应
表观遗传学的一个重要调控机制是非编码RNA。非编码RNA是指不能翻译为蛋白质的RNA分子。近年来，非编码RNA一族中的微小RNA-200（miR-200）受到人们的高度关注。研究发现，miR-200家族中的成员微小RNA-200a（miR-200a）与肿瘤的发生发展关系密切，miR-200a在肿瘤组织中呈现明显低表达。因此，miR-200a的表达下调是肿瘤发生的重要因素之一，miR-200a也成了肿瘤特异性表观标志物[17]。
胡琛霏[2]通过TaqMan芯片，检测了MSA处理食管鳞癌细胞后细胞中微小RNA（miRNA）的变化情况，发现MSA可以上调细胞中miR-200a 的表达水平，miR-200a 表达升高后，负性调控Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）的表达，使Keap1蛋白水平下降，上调转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）蛋白水平并提高其转录活性（Nrf2活性受其细胞质接头蛋白Keap1的调控），从而活化Keap1-Nrf2信号通路。而Keap1-Nrf2信号通路在抗氧化、预防肿瘤发生等诸多方面有重要作用[18]。
体外研究显示[19] ，人脑膜瘤组织中miR-200a表达明显低于正常组织，β-循环蛋白（β-catenin）和其下游靶基因细胞周期蛋白D1表达显著增高，二者和miR-200a呈现负相关，上调miR-200a可降低β-catenin的表达，进而阻断Wnt/β-catenin信号传导通路来抑制脑膜瘤的生长。胡琛霏课题组前期研究也发现MSA可以抑制食管鳞癌细胞系中β-catenin的表达[2] 。研究已证实，Wnt/β-catenin信号通路的激活和高表达可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及抑制肿瘤细胞的凋亡[20]。
由此可见，MSA可能介导、调控着miR-200a表达及参与复杂的分子调控网络，从而抑制肿瘤发生及转移。
3 展望
加强硒与表观遗传学之间关联的研究，有着重要的生物医学意义。它有可能解释硒化学抗肿瘤的新机制，从理论上证明硒元素可能具有表观遗传学的效应[21] 。综上所述，硒在肿瘤形成中对表观遗传修饰异常产生干预影响，靶向抑制肿瘤特异性表观标志物，逆转表观遗传修饰发生异化过程，使我们认识了硒化学抗癌的新机制、新作用，硒化物是潜在开发的新型靶向抗癌药物。Fernandes 等[15]指出，硒化物都是癌症治疗药。目前，非表观类含硒靶向抗癌药如硒唑呋喃、依布硒啉、乙烷硒啉等早已进入临床研究[16]，展示出很有希望的临床应用前景。而含硒表观靶向抗癌药物是亟待开发的抗癌药“富矿”，加快开发含硒表观靶向抗癌药物，可为临床肿瘤治疗增加一种“新的工具”，为癌症患者战胜病魔增添一份新的希望。人们热切期盼“含硒表观分子靶向抗癌药物”早日问世。
致谢：本课题研究得到华中科技大学徐辉碧、黄开勋两位教授和安徽医科大学张文昌硕士的支持，在此表示衷心感谢。
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篇5
一般意义上的遗传学指基于DNA序列改变导致基因表达水平的变化,如基因突变、基因杂合丢失和微星不稳定等,表观遗传学指非DNA序列改变,是细胞内除了遗传信息以外的其它可遗传物质发生的改变。表观遗传学研究主要包括染色体重塑、组蛋白修饰,DNA甲基化,非编码RNA调控等。
真核细胞的特征是有细胞核,细胞核包含了真核生物几乎所有的遗传物质。真核生物基因组DNA储存在细胞核内的染色质中,核小体( nucleosome) 是构成真核生物染色体的基本结构单位。各核小体串联而成染色质纤维,核小体DNA长度约为165个碱基对,其中缠结在组蛋白八聚体周围的核心DNA( core DNA) 约1. 65圈,约合147个碱基对,而相邻的核小体之间的自由区域( linber DNA) 为20 - 50个碱基的长度,也就是基因组的75% ~ 90% 被核小体所占据。组蛋白八聚体由H2A、H2B、H3和H4各2个拷贝组成,每个核心组蛋白都有两个结构域: 组蛋白的球形折叠区和氨基末端结构像一条尾巴( tail) 位于核小体的球形结构以外,可同其它调节蛋白和DNA发生相互作用,染色体的高级结构和基因的转录调控都与组蛋白密切相关。核小体组蛋白的尾巴可以发挥信号位点的作用。
上面已谈到表观遗传学是指非DNA序列改变,而是改变染色质结构导致基因表达水平的变化。那么,染色质结构改变如何导致基因转录和表达水平改变的呢?
其一,在细胞里,DNA-染色质的形式存在,核小体是染色质的基本结构单位,75% ~ 90% 的基因组存在其中,核心组蛋白的尾巴的各种位点通过多种转移酶的作用,发生共价修饰,组蛋白通过电荷相互作用( 组蛋白尾巴带正电荷,DNA带负电荷) 如组蛋白乙酰化修饰可以通过电荷中和方式削弱组蛋白-DNA或核小体 - 核小体的相互作用,或引起构象的变化,破坏核小体结构,使DNA接近转导机构,激活转录。
其二,为保证染色质的DNA与蛋白质的动态结合,细胞内产生了一系列特定的染色体重塑复合物,也称重塑子,它们利用水解ATP的能量通过滑动、重建、移除核小体等方式改变组蛋白与DNA结合状态,使蛋白质易于接近目标DNA。依据重塑子包含的ATP酶中催化亚基结构域的不同,把重塑子分为SWI/SNF、ISWI、CHD、IN080四大家族。组蛋白修饰后如乙酰化的组蛋白可以募集转录复合物进入到一个基因位点,影响转录。
2 认知过程中的表观遗传学机制
通过新信息或经验获得的记忆可保持数月、数年,甚至终生,而长时间保持存活的蛋白质或mRNA的半衰期只有24 h,显然,二者之间存在很大的矛盾,那么记忆的物质基础到底是什么? 1984年,Crick提出了一个假设,即记忆编码在染色体的DNA上,虽然当时他并不是十分确信,但现已澄清,染色体是信息的携带者,而且可以代代传下去,染色体结构或化学上的改变与认知功能的关系可作如下的理解: 表观遗传学的改变是对来到大脑的信息、应激和神经元活性改变做出结构上的适应,最终将信息带至并激活特异性基因表达程序。目前研究证明,在脑的一些区域发生的表观遗传学改变如组蛋白的乙酰化、甲基化、磷酸化可以稳定地改变动物的行为,包括学习、记忆、抑郁、药物依赖、突触可塑性等等,为长记忆的形成、巩固和突触可塑性的形成、维持提供解释[5,6,7,8]。
阅读近十几年发表的有关表观遗传学文章后,解决了长期以来认知过程中令人费解的一些问题,本文着重介绍在脑的不同区域( 主要是海马和脑皮层) 组蛋白修饰和DNA甲基化在认知过程中的作用及其可能的机制。
2. 1组蛋白乙酰化[9,10,11]一系列表观遗传学改变都能影响记忆过程,其中组蛋白乙酰化,具有明确、显著地促进记忆的形成和巩固。组 蛋白乙酰 化是通过 组蛋白乙 酰化酶( HATs) 催化完成的。HATs将带正电荷的乙酰基转移到组蛋白N末端尾区内赖氨酸侧链的-氨基。组蛋白乙酰化酶被分成3个主要家族: GNAT超家族,MYST家族和P300 /CBP家族。将乙酰基从组蛋白移走,由组蛋白去乙酰化酶( HDACs) 催化完成,HDACs被分成4类: Ⅰ类,锌依赖型HDACs,Ⅱ类和Ⅳ类HDACs,Ⅲ类NAD依赖性HDACs。在哺乳动物中,海马在记忆形成中起重要作用。许多学者以海马区域作为研究对象,研究了组蛋白乙酰化对条件性恐惧中的背景记忆( contextual memory) 和空间记忆的影响。研究证明组蛋白乙酰化或抑制HDACs活性都能增强条件性恐惧中的背景记忆和Morris水迷宫中的空间记忆以及增加突触可塑性( synaptic plasticity) 。应当指出的是,脑中组蛋白乙酰化不是独立于其它组蛋白修饰而存在,而是在组蛋白乙酰化的同时,也往往存在组蛋白磷酸化、甲基化。组蛋白乙酰化削弱了组蛋白与DNA之间的静电亲和力,从而促进染色体结构接近转录基因机构,引起基因持续性改变,增加神经元活动,乙酰化修 饰后的组 蛋白也可 以募集其 它相关因子[10,11,12,13],如转录复合物,进入到基因位点,影响转录。
2. 2 组蛋白乙酰化的调节机制[14,15,16]
2. 2. 1神经元活性与组蛋白乙酰化组蛋白乙酰化可由许多类型的神经元活性所调节,例如,KCl介导的神经元去极化引起海马培养中的核心组蛋白H2B乙酰化的增加,再如,特异性受体激动剂可兴奋多巴胺能、乙酰胆碱能、谷氨酸能途径,增加小鼠海马H3K14和H3S10的乙酰化,在所有这些情况下,组蛋白乙酰化都伴有细胞外调节激酶ERK( MAPK家族中的一员) 的激活,直接激活MAPK-ERK信号途径可增加组蛋白乙酰化,而MAPK-ERK抑制剂则可阻断组蛋白乙酰化[16,17,18],这些研究表明,神经元活性引起组蛋白乙酰化是通过MAPK依赖性途径的激活,而且也可能是通过H3S10磷酸化之间的对话。后者常与在蛋白乙酰化同时存在,从染色体脱离的HPAC2引起的神经活性,也能改变组蛋白的乙酰化,用BDNF刺激皮层神经元,能引起HDAC2在胞嘧啶262和274位的硝基化及随后组蛋白的高乙酰化及随后组蛋白的乙酰化,并伴有神经营养因子依赖性基因表达的增强。已知MECP2可增加BDNF的表达,但被HDAC2负面调节。因此,神经活性参与了以HDAC2和BDNF为中心的正性反馈,该系统导致组蛋白乙酰化和基因自身的持续表达。
2. 2. 2突触可塑性与组蛋白乙酰化长时程突触可塑性涉及突触维持和交流有关基因表达的改变,已有充分材料证明,组蛋白乙酰化促进这一改变,例如在海兔( Aplysia) 组蛋白乙酰化能诱导长期易化 ( LTF) 并伴有CREB结合蛋白CBP的增加[19],类似的改变也在突触素( synapsin) 的启动子区域观察到,突触素与LTF和LTD均有关。不过,伴有CREB乙酰化的减少,正常情况下,诱导LTF需施加强电刺激,但如果提前给予RNA干扰( RNAi) ,弱的电刺激也能诱导LTF。这一发现提示,组蛋白乙酰化程度与突触可塑性程度密切相关,HDAC1能增加天然存在的突触传递过程,在哺乳动物的LTP也与组蛋白乙酰化水平有关。LTP诱导可平行出现H3和H4组蛋白乙酰化的增加,从研究中还明显看出LTP促进乙酰化,改变特异地存在于与突触传递有关基因如Reelin和BDNF启动子区域,这一结果与前述看法一致,即在组蛋白乙酰化过程中存在一个基因自身持续性改变的正性反馈系统。此外,有关HATCBP的研究表明,增加组蛋白乙酰化能促进LTP,部分或完全缺失CBP功能的小鼠出现组蛋白乙酰化水平的下降和LTP形成受阻。不过,不依赖转录的早期LTP不受影响。
2. 2. 3记忆形成与组蛋白乙酰化[20,21]在低等生物和哺乳动物进行的研究证明,不管哪种记忆类型或哪种记忆时相( 记忆获得,巩固和再现) 都能对组蛋白乙酰化进行调节,例如背景性和线索性恐惧记忆( fear memory contextual and fearmemory cued) 都能增加H3乙酰化,小鼠眨眼条件反射( eyeblink conditioning) 和大鼠潜伏抑制 ( latent inhibition) 能分别增加组蛋白H3和H4乙酰化,大小鼠物体识别记忆( Objectrecognition memory) 伴有H3和H4乙酰化的增加,此外优先食物转换( social transmission of food preference) 和食物厌恶记忆( food aversion memory) 等均能增加H3乙酰化,空间记忆( spatial memory) 伴有H2B,H3和H4乙酰化。
从上述组蛋白乙酰化研究的论述可得出以下几点结论:
( 1) 组蛋白乙酰化,不是脱离开其它组蛋白修饰而独立存在,即在发生组蛋白乙酰化的同时,也有组蛋白磷酸化、甲基化等的发生,其它表观遗传学改变对组蛋白乙酰化起了协同作用。
( 2) 神经元活性可调节组蛋白乙酰化,神经元活性的启动需要MAPK-ERK信号途径的激活。
长记忆和突触长时程增强均涉及许多基因的转导和表达,最常见和最重要的基因包括即早基因Zif/268,Creb,Bdnf和Reelin等。
( 3) 许多种类的神经活性存在一个以BDNF和HDAC2为中心的正性反馈系统,该系统可导致组蛋白乙酰化和基因自身持续表达程序。
( 4) 在多种生物体和细胞研究中观察到各种不同类型的记忆模式和不同记忆时相都能引起组蛋白乙酰化,进而促进记忆和有关基因的转录和表达。
( 5) 组蛋白乙酰化能引起长记忆的形成和巩固,但对无须转录的短记忆和早期LTP没有影响。
2. 3神经元活性是如何引起组蛋白乙酰化,它的作用机制是什么?[11]途径之一,神经元活性包括LTP和学习激活G蛋白偶联受体( GPCRs) ,然后依次激活腺苷环化酶( AC) 产生c AMP,后者激活PKA,PKA磷酸化MEK( MAPK家族中的一员) ,MAPK的家族成员能直接磷酸化组蛋白,随后启动组蛋白乙酰化。
途径之二,神经元活性可通过钙内流引起膜去极化,然后激活CAMKⅡ,后者磷酸 化甲基-CPG结合蛋白2( MECP2) ,使MECP2从染色体脱离出来,Calmodulin刺激BDNF启动子区域的基因转导。BDNF激活一氧化氮合酶导致组蛋白乙酰化酶2( HDAC2) 的硝基化,在硝基化作用下,HDAC2从染色体中脱离出来并强化硝基化,结果引起BDNF表达并参与正性反馈系统,进而促进记忆 - 持续性基因表达的改变( 见Fig 1) 。
其他一些学者的研究工作指出: 激动NMDA受体,抑制磷酸二酯酶( PDE) ,增加细胞内钙等多种途径均可激活PKA,PKA则可直接激活CBP,如前所述。含有乙酰转移酶活性的CBP与CREB结合,是提高突触可塑性形成长记忆的必备条件; NO启动组蛋白影响记忆的机制有二,一是激活N0-cG MP-Ca MKII-CREB磷酸化的信号转导途径; 二是NO依赖性的HDAC的5-硝基化,可增加组蛋白乙酰化,而NO供体与5-硝基谷胱甘肽,可抑制HDAC活性,因而,也能增加组蛋白乙酰化。此外,神经元活动或突触活动引起胞外钙内流入神经细胞内,使Me CP2的S421磷酸化,S80去磷酸化,后者从染色质分离出来,发挥对神经可塑性和记忆的调控作用。
2. 4 RNA干扰 ( RNA interference,RNAi)指内源性或外源性双链RNA( dsRAN) 介导细胞内mRNA发生特异性降解,导致靶基因表达沉默,产生相应功能表型缺失,RNA干扰下的基因沉默是表观遗传学的重要内容,人工合成的小RNA( SiRNA) 包括miRNA和SiRNA。小RNA序列较短,能指导Argonaute蛋白识别的靶分子并导致基因沉默。
已证明,组蛋白去乙酰化酶HDAC阻遏学习记忆,并在细胞内有广泛分布,人工合成HDACi显然有重要的治疗价值,HDAC2的结构很接近HPAC1,尽管如此,科学家们还是合成许多类型的HDACi,上述各种类型学习记忆和突触可塑性模型证明使用HDAC2i可促进记忆,增强LTP,阻遏记忆下降。
3 组蛋白和 DNA 甲基化[20,21]
甲基化可发生在组蛋白,也可发生DNA上。尽管这二种甲基化产生的方式、调节机制和涉及的酶与蛋白等有所区别,但二者甲基化的结果是一致的,即他们都能激活基因的转录与表达,从而促进长记忆的形成和提高突触可塑性。这点学术界的看法一致,没有任何异议。下面将重点介绍组蛋白和DNA甲基化是如何形成,又如何影响基因转录及长记忆和突触可塑性的?
真核细胞中,甲基化只发生在胞嘧啶第五位碳原子上,是由甲基转移酶所催化,以S-腺苷甲硫氨酸( S-adnosylmethionine,SAM) 作为甲基供体,将甲基转移到胞嘧啶上,DNA甲基化主要发生在Cp G双核苷酸序列的胞嘧啶上,哺乳动物异染色质的DNA约有80% 的CPG被甲基化,根据作用方式和反应酶不同,DNA甲基化分为两种: 维持甲基化( maintenance methylation) 和从头甲基化 ( de novo methylation) ,前者与DNA复制相关联。当甲基化的双链DNA被复制生成两条的新的双链DNA后,只有亲代链是甲基化的,甲基转移酶是DNMT1,后者则是DNA上甲基化状态的重新构建,它不依据DNA复制在完全非甲基化的DNA碱基位点上引入甲基,是甲基化的建立机制。甲基转移酶依赖于DNMT3a和DNMT3b的活性。
对基因转录的影响: 目前研究发现,组蛋白精氨酸甲基化常伴随转录的激活,赖氨酸残基上的甲基化则因赖氨酸所在的位置不同而有差别,赖氨酸甲基化发生在组蛋白H3的第4,第9,第27,第36,第79( K4,K9,K27,K36,K79) 位及H4K20位上,其中,在酵母和哺乳动物细胞中H3K4和H336位点被甲基化可以激活转录,而H3K9 K27 K79和H420的赖氨酸甲基化则可抑制转录。
DNA甲基化对基因表达的调节主要表现为抑制转录活性,一种可能的机制是由于DNA甲基化直接抑制了转录因子的结合,不能形成转录复合体,从而也就抑制了基因转录活性[16,18,20]。
对记忆的调节作用: Swati Gupta及其同事[21]研究了组蛋白甲基化对成年动物海马部位记忆形成的影响,他们的研究得出如下主要结果: 恐惧记忆能触发海马CA1区H3K4三甲基化( 转录激活标志) 和H3K9二甲基化( 转录抑制标志)的变化; H3K4特异的甲基化转移酶MⅡ缺失的小鼠出现长记忆形成障碍; 改变组蛋白甲基化与去乙酰化酶( HDAC) 抑制相偶联; H3K4三甲基化明显增加两种基因 ( Zif/268和Bdnf) 的启动子,这一事件出现在记忆巩固期间,已知这两种基因在记忆形成和神经可塑性中起重要作用。这些发现支持组蛋白甲基化在长记忆巩固中扮演重要作用,其他许多学者也都证明DNA甲基化与记忆形成和储存有关,如甲基化CpG结合蛋白1( methyl-Cp G-binding protein1) 基因缺失出现空间记忆能力丧失,甲基化CpG结合蛋白2 ( methyl-Cp Gbinding protein 2) 基因缺失的突变小鼠出现恐惧记忆、空间记忆和物体识别记忆的障碍。
海马DNA甲基化,对记忆形成起重要作用,但海马的改变是短暂的,训练后1 d之内便恢复到基础水平,长记忆以及记忆的巩固和储存依赖于脑的不同区域,据信长记忆的形成和巩固主要依赖于背侧前额叶前扣带皮层( dm DFC) ,为此探讨皮层组蛋白甲基化是否能促进长记忆的形成和巩固十分必要。Miller等采用背景性恐惧记忆试验探查皮层DNA甲基化对长记忆的影响,报道认为大鼠恐惧条件化环境中的背景记忆可维持数月,在这期间,近期( recent) 记忆会转变成远期( remote) 记忆,也即记忆从海马( HPC) 转变成依赖于dmP FC的记忆。首先,采用Me DIP即甲基化DNA免疫沉淀法测定皮层三种基因Zif/268,reln和Ca N的甲基化水平。动物试验则观察训练后7 d的背景记忆,将动物分为背景组( C) 、休克组( S) 和背景加休克组( CS) 。结果表明,在所有组和所有测定时间点,即早基因Zif/268均为去甲基化,说明环境刺激能广泛地改变dm PFC Zif/268的甲基化状态,相反的,一个记忆正性调节基因Reln仅在受训练的动物即CS组动物训练后1 h内出现高甲基化,随后即回归对照水平,训练后短时间内Ca N( 一种记忆抑制基因) 的甲基化无改变,但在训练后1 d,这一基因出现持久的甲基化,随后用BSP描绘训练后7 d Ca B甲基化的改变,发现仅CS组动物有显著的Ca N甲基化。为了解皮层DNA甲基化是否能反映联合学习,动物在训练前注射NMDA受体拮抗剂MK-801,证明MK-801干扰了训练后7 d动物恐惧记忆的获得( acquisition) ,也阻断了训练后2 d dmP FC Ca N和Reln的高甲基化,但不影响Zif/268的甲基化,进一步支持Ca N和Reln高甲基化是一种对联合性环境信号的特异性反应。Frankland等前期研究观察了训练后不同时间对ACC( anterior cingulate) 恐惧记忆再现( retrieval) 的干扰。结果证明ACC在18 ~ 36 d( 近期记忆) 经干扰失去记忆再现,但不是训练后1 d或3 d( 近期记忆) ,从这一结果估计记忆的巩固出现在训练后3 ~18 d,研究还证明皮层DNA甲基化可能在训练后1周内出现,该时段也是皮层留下记忆痕迹的时间,随后的实验证明训练后立即向背侧HPC( CA1) 注射NMDA受体选择性抑制剂AVP,证明APV不但能干扰学习,也能阻止训练后7 ddmP FC Ca N和Reln甲基化,表明一次性海马 - 依赖性学习经验就足以驱动皮层长时间、基因特异性甲基化改变,为了进一步探讨皮层DNA甲基化是否伴随长记忆的形成,观察了训练后30 d的皮层甲基化及记忆巩固的情况,结果证明在CS动物皮层的Ca N甲基化仍十分明显,而且与长记忆的出现和维持的时间段相吻合,此外还观察到在HPC有快速甲基化,而在dm PFC有持久的甲基化,以上研究阐明了以下几个问题: 第一,海马HPC可启动学习记忆,产出过渡性短记忆,第二,长记忆的形成和巩固依赖于dm PFC,第三,海马和皮层记忆的形成均缘于海马和皮层DNA的甲基化,或甲基化与其它组蛋白修饰的协同作用,第四,重要的记忆相关基因和受体包括Zif/268,Reln,Bdnf和NMDA受体。组蛋白甲基化是如何调整认知过程,它的生物学机制是什么?Day和Sweatt提出了阐明组蛋白甲基化是表观遗传学标志的假说[20],如在细胞内转变成功能性后果,出现三种可能性: 第一、DNA甲基化驱使神经细胞的反应状态发生了改变,即它允许、容纳其它机制参与进来产生协同效应和维持更加长远的改变; 第二、甲基化事件积极参与和改变基因的读出,促进记忆的进行,例如增加突触强度和突触可塑性; 第三、表观遗传学机制帮助神经细胞无增殖( aplastic) ,在神经元无增殖的情况下可以以稳定突触数量( synaptic weight) 的分布,后者是稳定记忆的必需条件,这一假设强调了突触可塑性在记忆过程中的重要性,事实上,国际上近年的研究表明老年痴呆认知功能的衰减与老年斑、A脑内沉积及神经纤维缠结无明显相关,由于突触在信息传递、信息加工中的重要作用,许多学者都支持突触功能降低( 包括突触效能下降和突触丢失) 是造成认知功能障碍乃至老年痴呆的主要原因,当前治疗老年痴呆和各种认知障碍的治疗方向都在寻找加强突触效能,防止突触丢失、增加突触新生的新药。
3. 1组蛋白磷酸化[25,26,27]组蛋白磷酸化修饰跟乙酰化和甲基化修饰一样具有调节认知功能的作用,这一修饰发生在组蛋白的H3、S1和S10丝氨酸残基上,由一组蛋白激酶包括丝裂原和应激激酶( MSKI) 和Aurora激酶家族催化完成。组蛋白磷酸化可被蛋白磷酸酶PP1和PP2a所逆转,这两种脱磷酸化酶又可被其它分子级联包括多巴胺和c AMP调节的磷酸蛋白32( DARPP32) 所抑制。最具特色的磷酸化标志存在于H3第10位( H3K10) 丝氨酸上,这一修饰招募了含有HAT活性的GCN5,因而能增加邻近组蛋白赖氨酸残基K9和K14的乙酰化,这解释了为什么组蛋白乙酰化和磷酸化常常同时存在。另外,H3S10磷酸化通过改变DNA和组蛋白尾部间的交互作用增加转录因子的结合。
许多研究工作已揭示组蛋白的磷酸化具有调节记忆形成的作用,编码RSK2的基因突变能产生低咖啡摄入综合症( coffin-lowry) ,有精神迟缓、精神异常等表现。在动物模型上的研究,背景性恐惧条件反射形成后,H3S10磷酸化和H3S10 / K14磷酸乙酰化迅速增加,但ERK抑制后可阻断其增加。同样的,缺失MSKI的小鼠出现恐惧记忆和空间记忆障碍,这一缺陷却不因给予HDAC抑制剂所逆转,提示组蛋白磷酸化途径与组蛋白乙酰化并行而不是位于乙酰化的下游,与此相协调的是,组蛋白磷酸化酶PPI受抑制,能改善长时程物体识别记忆和空间记忆而不影响短记忆,从这些发现推测: 通过抑制PPI来增加组蛋白磷酸化对治疗学习记忆障碍可能是一个有明显特色甚至是互补的治疗策略。
除学习记忆外,H3S10磷酸化也与药物成瘾行为学反应有关联。可卡因可引起纹状体H3S10磷酸化的增加,敲除MSKI的小鼠出现对服用可卡因行为反应的障碍。核内积累的DARPP-32能影响对可卡因和蔗糖奖励的行为反应。组蛋白磷酸化也已被证实是抗精神病和抗巴金森氏症下游的一个重要靶标,针对表观遗传学这一组蛋白磷酸化修饰设计和开发有治疗潜能的化合物是很有意义的。一项有意义的研究指出,MSKI主要存在于神经元和纹状体、杏仁核、海马等脑区,MSKI这一选择性分布是治疗干扰药物成瘾的一个很好的候选者。
哺乳动物细胞Aurora激酶家族成员的结构和功能在进化上保守,根据该家族成员在细胞内的定位可分为3种: Aurora-A,Aurora-B和Aurora-C。Aurora-B是有丝分裂中组蛋白H3的第四位丝氨酸磷酸化所必需的激酶。组蛋白H3磷酸化主要由Aurora-B激酶控制,除MSK和Aurora外,IB激酶( nuclear,IKK) 复合物中的异构体( IKK) 也可以调控海马区域组蛋白的磷酸化修饰,IKK是核因子B的一种去抑制调控子,抑制IKK可以阻止背景性环境下长期记忆的再巩固( reconsolidation)[24]。
组蛋白磷酸化促进长记忆形成和巩固的机制主要是磷酸基因携带的负电荷中和了组蛋白上的正电荷,造成组蛋白与DNA亲和力的下降,使DNA容易接近转录机构,激活基因转录,这是长记忆形成所必需的,也解释了为什么组蛋白磷酸化不影响短记忆。
在正常生理和表观遗传学的生化反应中,磷酸化使蛋白质和基因活化,随后的生化和生物学反应才能继续进行,所以在细胞繁殖、分化、细胞存活、DNA复制、转导和重组、细胞凋亡以及信号转导中发挥重要作用。
3. 2 其它组蛋白修饰与认知功能[27,28,29]
组蛋白泛素修饰涉及三类催化酶: 泛素激活酶( ubiquitin activating enzyme,E1 ) ,泛素接合酶 ( ubiquitin conjugatingenzyme,E2) 和泛素连接酶 ( ubiquitin protein ligase,E3 ) 。依赖这三种酶分三步进行泛素化修饰,第一步E1利用ATP形式存在的能量与泛素结合成高能硫酯键,构成泛素 - E1偶联物将泛素激活; 第二步,通过转酯作用将活化的泛素转移到泛素结合酶E2的活性半胱氨酸残基上; 随后,E2将活化的泛素转移至泛素连接酶E3上,形成高能量E3 - 泛素偶联物,最后E3可直接或间接地促使泛素转移到特异靶蛋白上,使泛素的羧基末端与靶蛋白的赖氨酸的-氨基形成肽链或转移到已与靶蛋白相连的泛素形成多聚泛素链,有一个去泛素酶大家族,从赖氨酸残基上移去泛素。
组蛋白泛素化有广泛的细胞功能,最著名的是控制转录的启动和延长,泛素酶/去泛素酶与其它组蛋白修饰,特别是与组蛋白甲基化有牵连,组蛋白泛素化与神经退性病变之间的关联来自亨廷氏病,Huntington与泛素连接酶h PRC12存在交互作用。在多个亨廷氏病动物模型上观察到泛素化的H2A的增加和泛素化的H2B减少,导致组蛋白甲基化模式的改变和基因转录下调,故以泛素连接酶为靶标设计药物对亨廷氏病可能有潜在的治疗价值。
多聚( ADP-核糖) 聚合酶[poly( ADP ribose) polymerases,PARPS]在与记忆行为有关的组蛋白修饰中起一定作用,PARPs可催化ADP核糖单位从NAD+转移到组蛋白靶位点上,不仅可影响染色质的局部结构,还可影响转录因子及染色质重塑复合体的结合,在操作性条件反射和位置回避实验中均证明PARP1可增加长记忆的形成。
3. 3衰老和神经退行性疾病的表观遗传学[27,28,29,30]衰老和年龄相关性神经退行性疾病是一个非常复杂的过程,过去有大量报道衰老与神经退行性疾病没有太多差异,如老年痴呆出现各种病理改变也在衰老过程中出现,但从未从表观遗传学方面去寻找原因,现有的研究揭示,表观遗传学的异常修饰是衰老和神经退行性疾病的主要机制,其主要病理特征表现在两个方面:
其一,组蛋白和基因组DNA甲基化的减少,在衰老和神经退化性疾病中表现突出,如神经细胞和基因组DNA亚甲基化( hypomethylation) 和甲基转移酶( HAT) 活性缺失,在AD患者的病理性神经元和基因组DNA的亚甲基化水平更低。Mastroeni等用免疫组化方法检测了死后AD和非AD( ND) 病人眶内皮层Ⅱ神经元的DNA甲基化和8种甲基化维持因子的免疫反应性,发现ND和AD神经细胞核具有甲基化胞嘧啶免疫反应阳性的神经细胞数分别为91. 7% 1. 3% 和39. 9% 3. 4% ,甲基化胞苷呈阳性的细胞数分别为91. 1% 1. 3% 和51. 8% 6. 1% ,即AD病人的两种甲基化模式比ND病人明显降低,DNMT,MOD2和P662均系甲基化维持因子,在ND病人神经元呈免疫反应阳性,而AD病人神经元免疫呈阴性,此外,RPL26和5. 8 SrRNA也有量的减少。
其二,HDAC2表达增加,研究证明神经退行性改变、衰老和长期应激都能引起HDAC2表达增加,如在神经退行性疾病和衰老时,神经毒性因子如A,氧化应激( H2O2) 和细胞内D25和CDK5激活,糖皮质激素受体( GR) 与临近组蛋白HDAC2启动子区的GR反应元件( CRE) 结合,增加脑内HDAC2水平,HDAC2优先与学习、记忆、神经可塑性有关的基因如BDNF结合,同时降低组蛋白乙酰化和基因的表达,破坏BDNF介导的正性反馈系统,从而降低神经可塑性和记忆的形成与巩固。
篇6
在高校遗传学教学中存在许多经典案例，如：果蝇的翅型、体色、眼色等性状的遗传；豌豆的性状遗传以及玉米籽粒的形状和颜色性状的遗传等。其中，还有一个非常重要的经典案例，即血型遗传。自20世纪初至今,ABO血型遗传一直是复等位基因的一个不可缺少的经典案例。随着科学技术的高速发展，血型的经典内涵得到不断提升，新的研究结果使血型遗传所涵盖的遗传学知识点越来越多，内容越来越丰富。因此，以我们身边最常见的表型--血型为案例开展遗传学教学不仅可以将复杂的知识点简单化、形象化，便于理解，还可以将繁多的基础知识串联起来，便于记忆。另外，以血型遗传作为经典案例在遗传学的教学中还可以不断加人新的研究和新的应用，使经典的内涵不断得到新的提升，让学生的视野接触到前沿的科学知识，为日后的科研接力打好基础。
1血型与遗传学之间的重要关系
开展案例教学，案例的选择是关键。血型是人类血液由遗传控制的个体性状之一，与人类的生活关系密切，用途广泛。自1900年到2005年，已检测出约29个血型系统[21。临床上最常用的有“ABO血型系统”、“Rh血型系统”、“MN血型系统”和“HLA血型系统”。这些血型系统涵盖了复等位基因、基因互作之上位效应等遗传学的孟德尔定律拓展原理，基因的表达调控及群体遗传等遗传学的精髓内容。透过这个知识窗口，可以看到遗传学在血型中的奥秘。
孟德尔遗传定律从建立、发展到不断拓展完善，一直都是贯穿高校遗传学教学的核心知识点。由于现在大学生从高中开始就接触孟德尔定律，如果大学教学还是重复高中阶段所涉及的内容，学生的学习兴趣难以提高。在高中知识的基础上，开展案例教学，引入现代遗传学在人类血型上的最新认识，则不但可以给学生一种似曾相识的感觉，还能自然地激起他们深入探索的兴趣。血型的遗传特征及生化基础可以清晰明了地向学生阐述清楚孟德尔定律的一些重要的延伸知识内容。从红细胞血型到白细胞血型，从常见的ABO血型到罕见的孟买、Rh血型，对于假基因、等位基因、复等位基因和拟等位基因等不容易理解的基因概念以及基因之间的相互作用都可以通过血型案例，把学生带入情境之中，在教师的指引下由学生自己依靠其拥有的基础知识结构和背景，在血型案例情境中发现、分析和解决问题，比较轻松地掌握这些容易混淆不清的概念和一些难以理解的遗传学现象，如非等位基因之间的相互作用之上位效应等。
此外，人的血红蛋白基因在不同发育时期的表达调控还涉及遗传学中的表型和基因型之间的关系，真核生物中的基因表达调控模式等知识点。对血型相关的一些遗传疾病进行分析，还可以引申出基因突变和染色体缺失突变及一些重要的遗传标记。血型的遗传学检测方法及临床上的输血原则和溶血、血型互配等现象也与受基因表达调控的红细胞的细胞膜糖基的特征和生化机制密切 相关，引导遗传学从理论到实验，再到实践中的应用。血型与疾病的关联分析，把科研思维引入高校遗传学教学中，让学生紧跟时展的步伐，理论联系实际，为日后的科研工作打好基础。
遗传学中两大重要的主题是遗传和变异，主要包括孟德尔遗传和连锁遗传、基因突变和染色体畸变。通过以复旦大学遗传学教学大纲为参考，与刘祖洞主编的《遗传学》和乔守怡主编的《现代遗传学》教材内容相比较发现，血型遗传案例除了与上述遗传学四大内容关联外，还涉及到基因的表达调控、群体遗传、表观遗传等知识点，其中大部分知识点都是要求学生重点掌握的内容。目前，血型案例所涵盖的主要遗传学知识内容及在遗传学学科中的重要意义的归纳见表1。因此，把血型作为经典案例，开展遗传学的案例教学既贴近生活，引发学生深刻的思考，又能代表性地进一步阐述探讨遗传学的生物知识。
2血型案例在遗传学教学中的开展
在以血型为案例的教学过程中，我们首先根据高校遗传学的教学目标和培养目标的要求，在学生掌握了一些遗传学的基础知识和理论知识的基础上，结合遗传学的教学进度逐步有序地进行介绍：1.血型基本知识介绍；2.红细胞血型的细胞膜糖基特征和生化机制；3.红细胞血型与输血；4.血型的遗传学规律特征，包括(I)ABO血型复等位基因遗传及其应用，（II)ABO血型基因的克隆，（III)ABO血型的遗传学鉴定；5.ABO血型的拓展，包括(I)孟买血型与拟孟买血型，（II)红细胞血型与白细胞血型。下面主表1血型与高校遗传学教学的重要关系
要选取两个方面阐述在遗传学教学中的开展过程。
2.1血型基本知识在教学中的开展
ABO血型系统是第一个被描述的红细胞血型系统，也是最具有临床意义的一个系统。因此，在进行血型基本知识介绍时往往以ABO血型为例。随着以分子生物学为基础的血型研究的发展，ABO血型的基因遗传背景目前已比较清楚。在介绍血型基因的基本知识同时也涵盖着遗传学知识的传播，而且随着血型基因知识的不断丰富完善，涵盖的遗传学知识也越来越广泛。
ABO血型由3个复等位基因控制，即iA、产和i°o在开展遗传学相关教学活动时，一般都用此作为分析生物界中复等位现象的经典例证。这些基础知识对于高校学生来说可能在高中的时候就已经获得。因此，在大学开展相关教学时，除了简单介绍这3个主要的复等位基因外，还可以深入讲述新的研究结果，到目前为止通过分子生物学方法已经确定了160多个^50等位基因，只是目前国际上以4川7基因作为等位基因的参比序列，其他基因均与其紧密相关，非常保守。在此基础上ABO血型又可分为许多亚群，其中A血型表现出最多的亚型。在红细胞血型系统中还有一种Rh血型，分为Rh阳性和Rh阴性。Rh血型主要由3个紧密连锁的基因D/d、C/c、E/e决定，这3个基因以单倍型方式传递，属于拟等位基因。这样在讲解原有知识基础上，又不局限于原有知识范围，由ABO血型到Rh血型，由复等位基因引出拟等位基因，在教学方法上可以通过相互比较，举例分析，扩大学生的知识面，提
高他们的学习兴趣。
人类的血型是不是一生恒定不变的？面对这个问题，很多学生都会认为血型是由遗传决定，不会改变。其实人类的血型也会发生变异，如急性白血病以及再生障碍性贫血可以使血型抗原减弱，骨髓增生异常综合征可以导致血型抗原丢失等。而且，健康人也存在血型变异的现象，但是这个是与细胞表面血型物质受到掩盖以及人体存在一些稀有ABO等位基因有关。这些新的知识可以向学生很好地展示“遗传和变异”，利用身边的血型案例调动学生的学习积极性，使他们积极主动地掌握遗传学的精髓。
此外，最近几年疾病引发基因甲基化和突变的研究'又可以结合表观遗传学的内容开展教学。
2.2红细胞血型的细胞膜糖基特征和生化机制在教学中的开展
人类ABO基因位于9号染色体长臂(9q34)，其基因产物是一些专一性的糖基转移酶，可以催化血型抗原前体特定部位的糖基转移，从而控制ABO血型抗原的生物合成。其中4基因编码产物为N-乙酰-D-半乳糖胺转移酶(简称A酶)，可以产生常见的A抗原；S基因编码产物ci-l，3-D-半乳糖转移酶(简称B酶)，可以产生常见的B表面抗原；和S基因同时存在产生的等位基因，其编码产物具有A酶和B酶的特异性，在红细胞表面上产生不同强度的A和B抗原；而O基因则是第258位和第349位碱基缺失导致的密码子移位，使终止密码提前出现，合成了无酶活性的短肽，因而体内没有A酶和B酶，也不能催化糖基转移，只有前体物质H的产生为H抗原(图1)。因此ABO血型有时也称为八811型[71。这样，不同的、B、0基因编码不同的多肽，产生具有不同功能的糖基转移酶，非常简单地引出了遗传学中经典的基因与酶的关系的“一个基因一条多肽(一个基因一个酶)假说”,使学生很容易获得一个基因决定一条相应的多肽链(酶)的结构，并相应地
影响这个多肽(以及由单条或多条多肽链组成的酶）的功能这种遗传学思想，达到良好的教学效果。
此外，最新研究发现ABH抗原除表达在血细胞表面以外，还可以出现在除脑脊液外的分泌液中；有大约80%的个体具有产生这些可溶性抗原的遗传基因；这种分泌抗原的表达由双结构基因控制，即第19号染色体2个紧密连锁的Ft/n(用和基因座。ABO血型抗原都由前体H物质合成，SeAe基因和丑冷基因都可以控制合成H物质；简单来说，基因的表达决定体液中是否出现ABH抗原，H/h基因的表达决定红细胞上是否出现ABH抗原。但是，并不是所有带m基因的个体唾液中都分泌ABH物质，还要受到Wh基因的制约，其中hh型(即孟买型)均为非分泌型[7]。这样又引出了遗传学中一个很重要的概念--上位基因，很重要的遗传学现象--上位效应。这些属于遗传学中基因互作的重点内容，而且发生基因相互作用的非等位基因仍然遵循孟德尔分离和自由组合定律，后代的基因型及其比例是可预计的，所以在遗传学教学中还可用于亲子鉴定、重大遗传疾病的关联分析、人种演化、群体遗传分析等相关内容。
2.2相关技术的拓展应用
ABO血型的分子检测是分子遗传学教学中PCR技术拓展应用的案例。血型基因的表达影响血型的表现型，表型相同的个体其基因型不一定相同。如何区分iAiA、Pi0在表现型都是A型和iBiB、iBi0在表现型都是B型的个体，可以根据A、B、0血型基因碱基的差异，应用聚合酶链式反应-限制性片段多态性(PCR-RFLP)技术分型人类ABO血型的方法。这种方法可以对个体血型(血型基因型)进行判定：是属于AA型、AO型，还是BB型或BO型。在这个基础上，我们进行了改进，并结合教学进程，作为自选实验在学生中开设，获得了学生的好评。在135个学生中开展自选实验，其中有80%的学生选择ABO血型鉴定这个实验，并表示对这个实验很感兴趣。
此外，还可通过分析核苷酸来确定分泌型ABH血型的Se基因型。主要基因分型技术有：（l)PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)，这是一种新的基因多态性分析技术，根据基因座某一碱基的差异设计一系列引物，特异性引物仅扩增与其对应的等位基因， 而不扩增其他的等位基因；（2)PCR-DNA测序法，先通过PCR扩增基因的主要片段，然后测定序列;(3)PCR-限制性内切酶法，用对位点特异的限制性内切酶消化基因，再通过Southernblot分析来确定。目前，PCR-SSP常用于胎儿血型鉴定及白血病引起的血型抗原异常等血型鉴定。随着450基因结构和研究方法的迅速发展，AB0血型定型也将进入基因定型的时代，揭示更多的关于AB0基因和AB0血型表观遗传学等方面的奥秘。
在教学过程中还可以设计一系列与血型相关的论题，引导学生査阅相关方面的最新进展，总结出血型与人类疾病和性格之间的关系以及蕴涵的遗传学原理。学生可以分组制作PPT讨论，还可针对某一论题，学生组队分为正反两方，开展辩论式讨论。一学期可以安排一次课时(45分钟)开展辩论式讨论,前30分钟让学生正反方陈述观点，列举证据开展辩论，后15分钟用于总结和点评。在这个模式下，几乎所有的学生都积极主动地参与进来，将引导、鼓励与考评相结合，充分调动了学生学习的积极性[11]。开展“血型是否可以决定性格”类似专题的辩论式讨论，既增加了遗传学教学的兴趣性及可接受性，还可以使学生的思维在辨析中得到操练。正反两方队员通过收集资料和案例，与同学辩论解释的过程中，不仅掌握了深奥的科学知识，而且还与现实生活相联系，并且将遗传学应用于实际，填补了传统教学在知识灵活认知与实践中的不足。
3以血型为案例开展遗传学教学的优点
作为日常生活中被人们广泛熟知的遗传学常识，血型遗传学的研究历程符合遗传学的发展规律与教学规划，其作为遗传学教学案例有着不可替代的优势：
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【关键词】早期经验；幼儿；表观遗传学；大脑结构发育
【中图分类号】G610 【文献标识码】A 【文章编号】1004-4604（2017）03-0027-06
科学家发现，在基因组中除DNA和RNA序列外，还存在其他能够调控基因的信息。虽然这些信息无法改变基因序列，但可以通过其他方式影响和调节遗传基因的功能和特性，并通过发育和细胞增殖过程稳定传递这些功能和特性，这就是表观遗传。表观遗传学是研究在基因DNA序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传变化。换言之，可将其理解为环境因素与遗传因素之间的相互作用，即生活环境与经验对个体基因表达的影响。科学家运用表观遗传学来解释为何环境、饮食等外在因素可以改变生物体的表现型，甚至改变基因型。
大脑发育对早期经验和环境非常敏感，其结构的成熟和基础功能的好坏取决于发育时期的主观和客观环境。生理活动创造的经验会强烈影响大脑的结构，也极大地影响着由基因调控的神经细胞的化学变化。〔1〕研究显示，有早期不良经验的儿童在大脑容量、大脑皮层发育和大脑结构方面都与无早期不良经验的儿童有着显著差异。〔2〕生理活动创造的经验会导致表观遗传的变化，控制神经细胞中基因的表达。〔3〕早期经验对幼儿大脑结构发育的影响详述如下。
一、社会信息获得
幼儿与抚养者的交流，是其社会性发展的重要途径之一。幼儿通过与抚养者交流来获得社会信息，并逐渐学会情绪辨别。研究表明，幼儿在出生后的0～3个月里就已经形成社会和情绪脑机制的核心脑区，〔4〕且在此后的一段时间里会继续发生改变。
幼儿对外界刺激的学习可以促进大脑高级功能的发育。例如，观察卡通面孔或类似视觉组合符号，能够激活右半球，有利于幼儿脑内视觉系统与边缘系统的整合。〔5〕这种整合可以促进幼儿情绪能力及处理其他视觉刺激类型能力的发展。〔6〕同时，儿童期是大脑网络区域合作和功能连通性发展的关键时期。神经连通性方面的缺陷对于解释学习困难和自闭症有重要意义。〔7〕
二、师幼关系
新近的科学研究揭示了情感发展依赖于多个脑区中复杂的神经回路的形成、成熟和相互关联，包括前额叶皮层、边缘系统、基底前脑、杏仁核、下丘脑和脑干等。这些包含了情感调节的脑回路又和那些与“执行功能”（如计划、判断和决策等）相关的脑回路相互影响。良好的情感会增强执行功能，反之则会削弱。〔8〕随着幼儿的发展，其情感经验会被逐渐内化到其大脑结构之中。
研究发现，幼儿与教师之间安全的依恋关系，能促进其认知发展，提高其注意能力和阅读技能。若幼儿与教师没有建立正常的依恋关系，则会影响其认知发展。例如，未与教师建立正常依恋关系的幼儿往往表现出较弱的口头表达能力、计算能力和言语理解能力，且在总体学术成就上落后于师幼间依恋关系良好的幼儿。〔9〕教师的情感支持会对幼儿的大脑发育造成影响。对幼儿唾液中的皮质醇含量和α-淀粉酶测定发现，较低教师情感支持的幼儿可能处于慢性应激状态，其HPA轴（下丘脑-垂体-肾上腺轴）与交感神经系统活动均比有较高教师情感支持的幼儿强，显示其紧张和压力程度较后者高。〔10〕
三、抚养者抑郁
抚养者抑郁会影响亲子关系，危害幼儿的健康成长，尤其是长期和严重的母亲抑郁。
幼儿与成人之间的互动，就像乒乓球中的发球和接球，是经验积累的有效途径。〔11〕例如，当婴儿牙牙学语时，成人用眼神、手势或语言予以恰当回应，这将会让婴儿在大脑中建立相应链接，从而达到支持和强化其交流和社会技能发展的目的。一旦抑郁影响了抚养者为婴幼儿及时提供恰当回应的能力，婴儿大脑中本该形成的链接将无法建立。可以说，是否生活在一个能够得到恰当回应的环境里，决定了婴幼儿大脑结构发展的强弱，这是个体以后学习和行为发展的基础。
神经科学研究表明，当母亲有慢性抑郁症时，会通过两种病态的养育模式破坏亲子间的“发球和接球互动”：敌意-侵入模式和脱离-沉默模式。〔12〕处于敌意或侵入状态的母亲看似在以某种方式“发球”，却会使幼儿的“接球”变得困难。相反，若母亲是脱离和撤退的，幼儿则会成为发球者，而母亲却没有接球。在以上两种情况中，患抑郁症的母亲都不能为幼儿提供积极、和谐的互动，将对幼儿的大脑结构发展产生不利影响。一旦亲子间建立起的是一种消极互动，即使随后母亲的抑郁情绪有所改善，这种互动模式也将持续，并可能使幼儿和其他重要成人间也产生消极的互动。〔13〕
除母亲等抚养者外，幼儿园教师作为幼儿在幼儿园的主要接触者，其抑郁也会对幼儿的大脑结构发育造成显著影响。研究表明，教师的抑郁程度与幼儿在园内表现出的行为问题次数呈显著正相关。〔14〕
四、虐待与忽视
婴儿在6～12个月时就有了恐惧体验并具有将恐惧从其他情绪中区分开来的能力。如果幼儿生长在父母有心理健康问题、药物滥用、家庭暴力或社区暴力的环境中，又或初入幼儿园时适应困难，但被幼儿园教师忽视、责骂等，都会使幼儿出现持续恐惧和焦虑情绪，情感发展会受到很大威胁。〔15〕研究表明，消极经验，如虐待和暴力等，会导致幼儿产生恐惧和慢性焦虑情绪。如若这种压力反应系统长期被激活，会导致其恐惧和慢性焦虑情绪过载。幼年的持久恐惧和慢性焦虑可以通过扰乱大脑的发展架构而造成终身的不良后果。〔16〕持续恐惧和焦虑还会削弱幼儿感知和回应威胁的能力，使其失去区分安全和危险的能力，严重的焦虑和恐惧还会影响幼儿的学习能力和执行功能发展。
1.虐待
幼儿遭遇的虐待主要有：（1）身体虐待，如殴打、体罚。（2）精神虐待，如言语攻击。（3）待。任何类型的虐待都会对幼儿的大脑发育带来负面影响，如家庭暴力、社区暴力和幼儿园虐待等。
在教师辱骂中成长的幼儿，其表情加工能力往往出现异常，对负性情绪更加敏感。幼儿和易怒、有攻击性的抚养者或教育者互动，容易产生恐惧和焦虑情绪，可能导致潜在的应激有害化学物质增加。〔17〕这种反复出现的生理反应不仅会影响幼儿大脑发育，阻滞幼儿的学习能力发展，增加情感障碍的风险，〔18〕而且可能造成器质性、生理功能性损伤，导致幼儿情绪紧张、认知功能低下，出现心理障碍。〔19〕对遭遇过待或有其他童年受虐待经验的儿童进行的磁共振扫描发现，其海马、胼胝体及额叶的体积减小，这些脑区结构和功能的改变会影响儿童的学习、记忆、情绪控制、同伴交往及左右半球的信息传递。〔20〕
研究者对虐待影响大脑发育的原因做了解释：虐待导致幼儿长期处于高压状态，造成有关焦虑反应和恐惧反应的神经回路和相关脑区被经常激活，使得这些神经回路和脑区过度发育，而其他功能的神经回路和脑区则出现发展延缓现象。〔21〕同时，虐待还会导致皮质醇受体的数量减少，致使下丘脑和垂体收到的反馈信息减少，增加了促皮质素释放因子（CRF）的释放，延长了压力反应。〔22〕
有童年受虐待经验的父母在养育子女时常会表现出虐待行为。研究发现，有儿童期受虐待验的成年人右侧腹外侧前额叶体积较小，且功能受到损害，导致这些成人容易出现情绪失调和攻击性，增加出现虐待行为的概率。〔23〕
2.忽视
忽视是指照看者对幼儿缺少照看，包括缺乏对幼儿健康和教育的关注、缺乏情感支持、无视幼儿生理需求的满足及危险的防护等。〔24〕忽视现象不仅会发生在家庭中，幼儿园里也会产生不同程度的忽视问题。研究表明，忽视对幼儿造成的心理伤害并不亚于其他形式的虐待，其“潜在影响可能是由长期的、弥漫性的、自然的疏忽而产生的。它可能反映出整个家庭、幼儿园功能紊乱的一般性水平”。〔25〕
忽视可能会导致幼儿大脑器质性的损伤，同时被忽视的经验会导致大脑结构异常，如造成胼胝体缩小。〔26〕Perry 等人发现，受忽视幼儿会出现大脑脑室增大及皮层萎缩现象。〔27〕遭受严重忽视的幼儿，其大脑皮质、边缘系统及中脑的结构会出现发育异常，全脑明显小于正常幼儿。〔28〕这些被忽视的幼儿对负性情绪更加敏感，并缺乏情绪控制技巧。〔29〕一些因为被忽视而遭受饥饿、寒冷的幼儿，因为需要集中精力关注自己的生存情况而导致压力反应系统发育异常，进而造成学习、记忆、情绪认知等能力的受损。〔30〕
五、幼儿学习和游戏经验
重复高度紧张的经验会导致表观遗传的变化，从而损伤逆境管理系统。而积极的环境和丰富的学习经验则会使个体产生积极的表观遗传标记，激活基因潜力。积极学习经验会刺激与激活大脑语言、记忆等回路，进而促使表观遗传变化，提高学习能力。例如，有关幼儿语言学习的研究发现，语言是大脑不同系统协作的共同机能，幼儿在1～3岁时语法信息加工能力的不断提高会促使大脑左半球后部得到更好的发展。〔31〕幼儿早期接受艺术教育也会刺激大脑突触发育并刺激左右半球连接，进而促使全脑均衡发展。〔32〕虽然随着年龄的增长，新的经验会继续改变表观基因组，但胎儿和婴儿时的经验可以对脑部结构产生重大影响并持续一生。〔33〕个体的基因表达实际上受很多环境因素的影响。在幼儿的早期发展中，基因的表达处于一种不定时、不定位会发生改变的开放性状态，因而为幼儿提供积极学习经验是非常必要的。
游戏是幼儿早期的主要活动和经验，是幼儿表达自我的方式。幼儿通过游戏感知外部世界，并在相互作用中获得外界的第一手资料。大脑具有高度的经验可塑性。游戏可促进幼儿音乐、美术、语言、运动、思维、执行功能等认知能力及其对应脑功能的发展，对与情绪发展相关的神经回路的建立也有重要作用。
从表观遗传学视角看，除上述早期经验可直接影响大脑结构的发育外，还有一些因素会间接影响大脑结构发育，如家庭贫富、社会支持、抚养者受教育水平等。
六、对不良早期经验的预防和干预
综上所述，早期经验可以修改表观基因组，影响大脑结构的发育。积极的早期经验有助于大脑结构的发育和其他社会能力的发展。不良的早期经验不仅会损害大脑结构发育，而且会影响幼儿的环境适应和人际交往能力，故应做好早期预防和干预工作，从源头上阻止不良经验对大脑结构及功能的伤害。此外，以往认为不良早期经验造成的表观基因组的改变是永久的，但近来有动物实验表明，一些类型的表观遗传基因在一定情况下能够逆转。〔34〕这些研究为不良早期经验的干预和治疗提供了支持。
1.创建安全友好的居住环境
在生命早期，慢性和强烈的恐惧会影响压力反应系统的发展和情绪记忆的处理。早期暴露于极可怕的事件下（如受虐待等），会严重影响大脑的发育。尤其是随着时间的推移不断重复发生的可怕事件，很有可能影响幼儿的学习、问题解决及与他人交流能力的发展。因此，为幼儿提供一个安全友好的居住环境，让幼儿远离暴力和恐怖事件，有助于幼儿大脑的发育和学习能力的发展。
2.关注抚养者的心理健康并为其提供专业指导
抚养者有严重的心理健康问题，对幼儿的负面影响比患有生理疾病的影响更大。有研究表明，母亲的抑郁在胎儿出生前就会影响胎儿的大脑发育。抑郁的母亲在怀孕期间会产生高水平的应激化学物质，减缓胎儿生长并增加流产风险，降低胎儿出生后的免疫功能。〔35〕因此，要更多关注抚养者的心理健康，对已有问题进行及时干预。
3.加强幼儿园教师的培养与管理
教师是除抚养者外幼儿接触最多的人。作为幼儿的主要教育者，教师不仅需要专业技能，还需为幼儿建设积极健康的成长环境，为其脑结构和功能的发展创造条件。因此，关注幼儿园教师的心理健康问题很有必要。幼儿园教师要有健康的心理状态，能够及时觉察自己的消极情绪，如愤怒、抑郁等，并能控制自己的消极情绪，以避免对幼儿造成身体伤害和心理伤害。对有过激行为倾向（如虐待幼儿、打骂或忽视幼儿等）的教师，应及早进行心理干预，杜绝因教师的心理健康问题对幼儿大脑发展可能造成的伤害。
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[关键词] 宫颈癌；DKK-3基因启动子；甲基化；临床意义
[中图分类号] R711.74 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）12（b）-0087-03
宫颈癌的发病机制与基因启动子甲基化等表观遗传学改变密切相关，目前发现越来越多的基因参与了宫颈癌的发病，可作为宫颈癌病情及预后评估的标志物[1-2]。Dickkopf相关蛋白3（Dickkopf-related protein 3，DKK-3）基因具有抑制细胞增殖作用，与肿瘤的发生、发展、转移及预后紧密相关，其基因启动子甲基化在多种肿瘤中可反映病情及预后，成为肿瘤基因水平的标志物[3-4]。本研究比较了宫颈癌患者和健康女性的DKK-3基因启动子甲基化状态，研究DKK-3基因启动子甲基化在宫颈癌中的临床意义，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2009年1月～2012年12月确诊的80例宫颈癌患者为研究对象，均经临床表现、体格检查、影像学检查、细胞学和病理组织学检查确诊，年龄31～80岁，平均（50.9±12.7）岁；病理类型：鳞癌53例，腺癌16例，腺鳞癌11例；根据FIGO 2009分期标准，Ⅰ期16例，Ⅱ期33例，Ⅲ期21例，Ⅳ期10例。另以同期参加健康体检的80例健康女性作为比较对象，年龄30～80岁，平均（51.1±14.6岁）。两组研究对象在年龄等一般资料方面比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 DKK-3基因启动子甲基化检测方法
对所有研究对象宫颈取活检组织或术后病理标本后立即提取基因组DNA，采用甲基化特异性PCR检测DKK-3基因启动子甲基化。将提取的基因组DNA行重硫酸盐转化，转化后的样本进行PCR扩增。引物采用Methprimer设计，序列见表1，反应体系为25 μl，反应条件为95℃预变性12 min，95℃变性1 min，64℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35个循环，最后一轮72℃延伸10 min。扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳后检测。
1.3 统计学方法
采用SPSS 11.5统计学软件对相关数据进行分析，计数资料比较采用χ2检验或Fisher精确概率法计算，以P
2 结果
2.1 宫颈癌患者和健康女性DKK-3基因启动子甲基化的比较
宫颈癌患者中有49例宫颈活检组织检测到DKK-3基因启动子甲基化，甲基化率为61.3%；健康女性中有2例检测到DKK-3基因启动子甲基化，甲基化率为2.5%，宫颈癌患者DKK-3基因启动子甲基化率显著高于健康女性（P
2.2 不同临床病理因素中DKK-3基因启动子甲基化差异的比较
宫颈癌患者宫颈活检组织DKK-3基因启动子甲基化率在年龄、吸烟史、酗酒史和病理类型中差异均无统计学意义（P>0.05），在HPV感染、分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移、远处转移和FIGO分期中的差异均有统计学意义（P
3 讨论
DNA甲基化是表观遗传学最主要的调控基因表达方式，是一种非DNA序列改变的转录前基因调控，甲基化CG位点导致DNA序列致密化，结合甲基结合蛋白后可阻遏转录因子形成转录复合物从而抑制基因表达，目前研究发现DNA甲基化调控主要集中在富含CG位点的基因启动子区域[5]。大量的体内外实验表明基因启动子甲基化导致基因处于表达抑制状态，抑癌基因的表达下降导致正常细胞失去调控而癌变，在众多肿瘤中可检测到抑癌基因启动子的甲基化状态[6-7]。DKK-3属于DKK基因家族成员之一，经典的DKK家族被认为是Wnt信号传导通路的调控因子，但目前对DKK-3的功能尚未完全清楚，大多数研究表明其具有促进细胞凋亡和肿瘤血管产生的作用，在多种肿瘤细胞中表现为低表达状态[8]。目前研究发现，DKK-3基因启动子在消化道肿瘤、呼吸系统肿瘤等众多肿瘤中处于高甲基化状态，且其甲基化与病情及预后紧密相关，可作为这些肿瘤的生物标志物，较传统的蛋白质水平分子标志物具有更高的灵敏度及特异性[9]。本研究提示，宫颈癌患者DKK-3基因启动子甲基化率显著高于健康女性，表明与其他肿瘤基本相似，宫颈癌患者DKK-3基因启动子处于高甲基化抑制状态。
本研究比较了不同临床病理因素下DKK-3基因启动子甲基化率的差异，发现分化程度越低、肿瘤直径越大、有淋巴结转移、远处转移及FIGO分期晚的宫颈癌患者DKK-3基因启动子甲基化率高于分化程度越高、肿瘤直径越小、无淋巴结转移、无远处转移及FIGO分期早的患者，这些证据表明DKK-3基因启动子甲基化与宫颈癌的病情及预后密切相关。因为肿瘤的分化程度和临床分期是目前公认的与宫颈癌病情及预后的指标，DKK-3基因启动子甲基化可作为宫颈癌的生物标志物，可为宫颈癌的诊断、病情与预后评估提供证据，值得一提的是本研究样本数较少，且缺乏远期随访证据，该结论有待进一步研究。
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表观遗传学
恶性肿瘤的发生涉及多种基因功能的异常，导致异常的除了以往我们研究得很多的基因突变、基因缺失等遗传改变外，近年来表观遗传学成为了研究热点。1999年Jones等在Nature上撰文“Cancer epigenetics comes of age”[1],表明肿瘤研究进入了新的时期。表观遗传是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了改变，并且此种变化在发育和细胞增殖过程中能稳定传递[2]。表观遗传学的主要研究方向包括以下几个方面：DNA甲基化修饰；组蛋白修饰(组蛋白的乙酰化、去乙酰化及磷酸化、去磷酸化等)；基因印迹等。和很多传统遗传学改变不同的是，许多表观遗传的改变是可逆的，这便为很多疾病尤其是恶性肿瘤的诊断与治疗开拓了广阔的前景。
DNA甲基化概况
DNA甲基化是目前研究得最多的表观遗传学机制，它是一种常见的DNA修饰，指在DNA甲基转移酶（DNMT）催化下将甲基加到CG二核苷酸的胞嘧啶上，使之变成5′-甲基胞嘧啶（5-mc）的化学修饰过程[3]。CpG二核苷酸在基因组中呈非随机分布，在5′端启动子区CpG位点高度聚集在一起，称为CpG岛。目前已经研究证实有三种与DNA甲基化相关的酶，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b，普遍认为DNMT3a和DNMT3b可以催化新生甲基化形成，而DNMT1主要在DNA复制时维持其甲基化状态。很多研究都表明，肿瘤细胞DNA总体甲基化水平低于正常细胞，但某些CpG岛甲基化程度增高。基因组DNA过低甲基化可促进杂和性丢失（LOH）[4]，导致基因组有害基因转录表达，例如激活原癌基因，使癌基因或相关因子得以表达，胚胎干细胞在缺乏DNMTl时基因组过低甲基化，宿主保护机制削弱，有利于基因组重复子同源性重组，从而导致整个基因组不稳定性增加；此外，在细胞染色体中心粒剧同存在高度密集甲基化区域，如果失去致密的甲基，可导致基因损伤和突变。
人类基因组中约有45000个CpG岛，虽然仅占基因组DNA 的1 %～2 % ，但存在于所有管家基因和少量组织特异基因的5′端调控区。CpG岛在正常组织中处于非甲基化状态，但在细胞发生癌变时某些肿瘤抑制基因启动子区的CpG岛发生甲基化，以致这些基因表达沉默，导致了肿瘤的发生。概括地讲，DNA 甲基化抑制基因表达的机理为[5-6]：① 甲基化CpG岛直接抑制序列特异性转录因子与DNA的结合，从而抑制转录；② 甲基化CpG激活阻遏蛋白因子从而抑制转录；③ 甲基化CpG与甲基化CpG结合蛋白家族成员结合，通过组氨酸去乙酰化酶作用抑制转录；④ 甲基化CpG的甲基化胞嘧啶突入双螺旋主沟，抑制转录因子与DNA的结合。DNA 甲基化能增加基因突变率。5一甲基胞嘧啶可自发或在S_腺苷蛋氨酸作用下引起邻位脱氨而使甲基化CpG变成TpG，这种突变能力较非甲基化的CpG 高12倍[7]。
随着研究的深入，肿瘤发生的经典“二次打击理论”并不能解释某些恶性肿瘤其DNA序列完整，没有突变、缺失，但其肿瘤抑制基因却表达失活；也无法解释MMR（错配修复系统）在没有突变情况下，其相关基因为何失活。DNA甲基化理论很好的解释了上述现象，因此又被称为“肿瘤发生的第三种机制”[8]，由此拓宽了肿瘤研究的视野，CpG岛甲基化对肿瘤抑制基因失活的关键作用越发凸现出来，成为肿瘤研究热点也不足为奇。
CpG岛甲基化与肿瘤
CpG岛甲基化与恶性肿瘤、衰老与某些遗传性疾病[9-10]有关，很多研究表明在乳腺癌、头颈肿瘤、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌等多种恶性肿瘤[11-13]中不同程度的存在一个或多个肿瘤抑制基因CpG岛甲基化。
Esteller等[14]对600 份标本予以甲基化检测,包括12种基因:肿瘤抑制基因 （p16INK4a ,p15INK4b ,p14ARF ,p73 ,APC ,BRCA1) ,DNA修复基因( hMLH1 , GSTP1 ,MGMT) 以及转移、浸润相关基因(CDH1 ,TIMP3 ,DAPK) ]和15 种肿瘤(结肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、肺癌、头颈部肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、膀胱癌、脑瘤、白血病和淋巴瘤) ,从中得出许多重要信息,提出建立某些肿瘤的甲基化图谱的设想,为早期诊断、治疗以及预后判断提供依据。
Fukai等[15]早期及进展期肝癌中都检测到,p16INK4a 基因启动子甲基化而引起其转录失活。Yang等[16]研究51 例肝细胞癌组织中多个相关基因的甲基化状态,结果多基因发生甲基化: SOCS21 ( 65 %) , GSTP ( 54 %) , APC ( 53 %) , Ecadherin(49 %) 及p15 (49 %) ,其中53 %的肝细胞癌有两个以上的抑癌基因甲基化,而在正常组织中为0 %。结果显示,抑癌基因的甲基化是肝细胞癌发生过程中的普遍事件,说明DNA 甲基化与基因转录活性和表达呈负相关,且对肿瘤形成起到重要作用。Corn[17]对31 例食管腺癌的Ecadherin 基因甲基化状态进行研究,84 %的病例发生甲基化,而相应的正常组织大多为非甲基化;同时对4 例正常的食管组织进行研究,发现其正常鳞状细胞上皮没有1 例发生甲基化。Ecadherin 发生甲基化是其失活的一个重要原因,可能是引起食管腺癌重要原因。所以DNA 甲基化状态改变是抑癌基因失活方式之一,是致癌的一个关键因素。Kang、Waki [18-19]对非肿瘤胃黏膜和胃癌组织进行P16、hMLH1、DAP2kmase、Ecadherin、THBS1 及TIMP2S 等基因检测后发现,相关基因CpG岛高甲基化在胃癌发生过程中可较早出现,并趋向与胃癌发生过程相一致,提示相关基因甲基化可作为诊断早期胃癌的一项较为敏感的指标。
DNA甲基化检测方法
尽管DNA甲基化对细胞的生物活性有重要的影响，但对它的检测要比检测DNA的碱基序列相对困难。这主要是由于甲基化的胞嘧啶并不影响C：G核苷酸的配对，并且在聚合酶链反应(PCR)过程中，胞嘧啶上的甲基通常会被丢失。随着技术的进步，现在检测甲基化的手段也丰富起来，不仅可探测某段DNA序列的甲基化分布，而且还能大通量地了解整个基因组甲基化的程度。本文着重介绍应用普遍、易于开展的两种方法：
(一)亚硫酸氢钠法(Sodium Bisulfite法):亚硫酸氢钠可将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，后者经聚合酶链反应(PCR)扩增克隆变成胸腺嘧啶而产生T:A配对，但对甲基化的胞嘧啶亚硫酸氢钠则没有作用，这样甲基化状态不同的DN段就可转化为有碱基序列差异的2个片段。这种方法对小样本有很好的检测能力，是现在研究的主流方法，细分为以下两种。
（1）甲基化特异性PCR(MS―PCR)：通常在亚硫酸氢钠处理后，分别针对目的片段完全甲基化的情况和完全非甲基化的情况设计引物。这样样本DNA即可根据自身的甲基化状态分别在相应的PCR组中进行扩增，并将结果通过凝胶电泳图像显示出来。根据扩增条带所在的PCR组可判断样本中甲基化的状况。MS―PCR的特异性很高，操作简便，费用和耗时都较小，但只能部分检测DNA甲基化的状态。对MS―PCR进行适当改进后，设计出半巢式PCR 和巢式PCR ；而改进的实时MS―PCR 可对产物进行定量分析。这些方法都可提高MS―PCR的灵敏性。
（2）亚硫酸氢钠法依赖的基因测序法(BSP bisulfite sequence-PCR)：是一种对DNA样本进行亚硫酸氢钠处理和PCR扩增克隆及DNA测序结合的检测方法。然后，根据核苷酸序列中C―T转化情况可判断样本中的甲基化状态，如与原序列比较，发生了C―T的转变，则表示该处未发生甲基化，如没有C―T转变，则发生甲基化。此方法通过测序可获得样本DNA序列中较全面的甲基化信息。
以上两种方法大体过程有很多相似之处，但在引物的设计上有较大差别，BSP引物不包括CpG位点，在CpG位点的上下游，扩增后通过测序检测该位置的甲基化状态(测序如果CG不变则为甲基化，如果CG变为TG则为非甲基化）。MSP是根据修饰后甲基化和非甲基化的引物不同扩增出不同的条带而判断是否为甲基化(只扩增出MSP条带表明为甲基化，如果扩增出USP则表明为非甲基化)。
(二)甲基化敏感的限制性内切酶法: 一些限制性内切酶可识别位点中含有的CpG双核苷酸序列，并结合非甲基化的识别序列，而对发生甲基化的序列则无结合活性。在此基础上，可设计出许多检测甲基化的方法。这些方法分为两大类：一种是检测某个DNA序列或基因甲基化状态的方法。如Southern法，甲基化敏感的限制性图谱(MSRF法)；另一种是检测整个基因组或大通量检测许多基因的方法，如限制性标志物全基因组扫描(RLGS)、差异性甲基化杂交分析(DMH)和甲基化CpG岛扩增子分析(MCA)等。这种方法易进行自动化和大通量基因检测。
治疗和应用前景
与基因突变不同,肿瘤发生中DNA甲基化等表观遗传学事件的发生是可以逆转的。因此,在恶性肿瘤和癌前病变中通过去甲基化处理可以恢复某些关键性抑癌基因的功能而起到预防和治疗肿瘤的作用。由甲基化引起基因沉默而出现的肿瘤,可通过DNA甲基转移酶非竞争性或竞争性抑制剂抑制甲基化的发生,活化沉默的抑癌基因,从而达到治疗肿瘤的目的。去甲基化药物: 5-氮胞苷(5-azacytidine)和5-氮- 2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′- deoxycytidine)及其衍生物可以抑制甲基转移酶活性,在一些难治性肿瘤,特别是在白血病治疗方面已取得了一定的疗效[22]。应用反义寡核苷酸,针对DNMT1mRNA 的反义寡核苷酸能降低DNMT1蛋白水平,诱导去甲基化和肿瘤抑制基因p16 的再表达,也能抑制小鼠模型肿瘤的生长。这种疗法已进入临床一期试验,显示一定抗肿瘤活性。章扬培[20]等从1987 年始,先后进行了20 株中国人肿瘤细胞系甲基转移酶(MGMT) 活性与对烷化剂亚硝脲耐药性的研究,分析患者MGMT 水平,此为依据对MGMT水平调节,可对患者实施不同的烷化剂治疗方案。
由于DNA甲基化对基因抑制是多种肿瘤都有的特性，且肿瘤的发生常常涉及多个抑癌基因的失活，各种肿瘤都有各自不同的抑癌基因失活，而去甲基化药物针对的是整个基因组而不是特定的基因，可同时恢复多个抑癌基因的表达。但同时这也使得肿瘤中的很多致癌基因由于去甲基化而甲基化程度更低，导致了他们的表达增加，相反又促进了肿瘤的发生，所以一些临床试验用去甲基化药物治疗实体肿瘤的效果还不是很理想[21],应用前景受到了限制。因此理想的药物应该是特异性的甲基化剂而不是非选择性的去甲基化剂，这需要我们更深一步的研究和探讨。
参考文献
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篇10
【关键词】组合数学 教学方法 生物医学 生物信息学
【中图分类号】G64 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2015）09-0132-02
伴随着信息时代的来临，特别是生物医学科学研究的迅猛发展，尤其是生物信息学这门科学的出现使得原来的生物医学研究向低通量的临床数据转向高通量分子生物学数据。组合数学作为一门应用性较强的数学分支，在生物医学中的应用广泛，面对多因素高通量的生物医学问题，增加高等学校，特别是生物信息学专业学生的组合数学知识，培养他们运用组合数学方法分析和解决生物医药科学问题的能力已经成为必要。如何在教学过程中提高学生学习组合数学的兴趣，建立组合数学的逻辑思维用于解决医学问题是我们教育工作者需要思考的问题。
一、高等学校组合数学的特点及教学现状
组合数学是一门研究离散对象的科学，在计算机科学、信息科学中具有重要的地位，是理科及工科院校的一门必修课，随着现代生物医学的日益发展，组合数学的重要性也日渐凸显。组合数学对于生物医学专业基础课有着直接的衍射作用。目前，部分开设组合数学课程的生物高等学校的主要面向生物信息学、统计学等等专业开设，讲授学时30到60学时。在大部分生物高等学校并没有该类课程的设置，也是导致高等学校组合数学教师队伍的匮乏的主要原因。而且目前组合数学授课考核形式也比较单一。组合数学主要是以理论授课形式为主的教学方式，考试成绩是考核学生的唯一标准，忽视了学生在学习过程中的考核。信息时代学科的交叉发展体现在组合数学在各个学科中不可替代的作用，因此提高生物高等学校学生的组合数学学习兴趣，培养他们运用组合数学的能力是目前迫切需要解决的问题。
二、改进组合数学教学措施，提高学生兴趣
（一）更新教学内容，改进教学方法
目前的组合数学内容主要有： 鸽巢原理、排列与组合、容斥原理、递推关系、生成函数等基本的组合数学知识及其在数学中的应用。为了让学生在有限的学时内学完必要的知识，更新和精选教学内容显得尤为必要，将以组合数学内容为主导的教学模式改进成以生物医学问题为导向的教学模式。由于面向医学专业的特殊性，从内容上应着重选择与医学知识联系紧密的内容，采取精讲和略讲相结合的方式。根据不同专业背景更新组合数学的教学内容往往能够起到事半功倍的效果。以下是我们在讲解排列与组合一章时的一个教学实例：“生物遗传信息是由DNA分子中4个碱基核苷酸就像电报密码似的以不同的排列顺序记录下来，它载着人类的全部基因或全部遗传信息，人的DNA约有30亿（3×109） 碱基对，按照排列的思想可知人类基因组可能的排列方式有N=4■=（4■）■≈（1.52）■种，然而人类仅从这无穷多的方式中选了一种作为全人类共同的遗传密码，可见我们的基因组是祖先们留给人类的最宝贵的财富！”。这样的实例教学不仅可以让学生熟悉课堂知识，还能让学生对所学的知识进行综合的运用，更重要的与生物医学问题的结合提高了学生的学习兴趣。通过兴趣小组讨论学习提高学生自主学习的主动性，变被动学习为主动学习，充分调动学生学习组合数学的兴趣，从而充分发挥学生学习的主观能动性。
（二）加强多媒体辅助教学，提高学生学习兴趣
组合数学传统的授课方式是在黑板上将定义、定理的内容进行逐步严密的推导证明，这在一定程度上让学生紧跟授课教师的思维和建立学生的逻辑思考能力。然而随着多媒体技术的不断进步，利用多媒体和板书相结合的策略成为下一阶段组合数学教学模式的主要教学手段。对于繁琐的定理公式例如容斥原理避免推导证明，结合多媒体的几何图形使学生更加直观的理解和应用。以我们在教授容斥原理时的一个实例，容斥原理的根本思想是将难的问题分解成若干简单问题，通过间接计数来解决直接计数不容易解决的问题，我们用多媒体幻灯片分别展示两集合和三集合的容斥原理（图1A和B），并按照容斥原理的逻辑顺序利用多媒体动画技术控制每一部分的出现顺序，不仅避免了大量繁重枯燥的板书推导，最重要的是图形式教学可以帮助学生对容斥原理建立更直观的理解。可见在组合数学的教学过程多媒体的充分利用可以起到事半功倍的效果。
图1 多媒体在组合数学教学中的应用――容斥原理实例
（三）增设组合数学实验课，培养学生创新性思维
组合数学除了基本理论课之外还应该开设适当的实验课，在实验课上让学生自己动手解决一些与生物医学有关的实际问题。通过让学生自己编程实现排列组合的算法，不仅可以增进学生对排列与组合的深入认识，也能够培养学生利用排列组合思想解决实际问题的能力。以下是我们的一个实验教学实例：“任选一种排列生成算法，编程实现自动生成n个（如n=6）不同元素中取r个元素的排列，并输出指定任意n和r的所有排列。”，不仅让学生掌握了课堂上讲解的排列原理，还锻炼了编程能力，初步体验了科研的乐趣，由消极的被动学习升级为积极的主动学习。可见通过组合数学实验课更能培养学生自己动手自己学习的能力，进一步激发学生的创新性思维。
（四）精挑细选课后练习，培养学生独立解决问题的能力
组合数学作为一门应用性较强的数学课，需要学生掌握其在生物医学领域的应用，这就必须加强组合数学课堂后练习。因此习题是组合数学课程重要的教学环节，也是理论教学必不可少的补充。然而习题课并不意味着单纯地大量做题，教师应根据课堂内容，精挑细选出质量比较高的少量题目，供学生课余时间认真研究，要在习题中体现组合数学的知识点，激发学生独立给出解决问题的新观点和新方法。设置习题时，应以问题为导向，即给定一个实际的有兴趣的问题，让学生利用所学的组合数学理论进行解决，进一步加强学生对知识细节的理解和掌握，并让学生举一反三熟练掌握所学内容，使学生的理解更加深刻。如我们在教学过程中的一个课后习题实例：“一位国际象棋大师有11周的时间备战一场锦标赛，他决定每天至少下一盘棋，但是为了使自己不过分疲劳他还决定在每周不能下棋超过12盘。证明存在连续若干天，期间这位大师恰好下了21盘棋。”，该实例引起了学生在课余时间学习组合数学的一个热潮。
总之，面对高等学校生物信息学学生的专业特点，传统的单一的纯理论的组合数学教学方法已经不再适用。应该考虑改进教学内容和方法，发挥学生学习的主观能动性，使学生在快乐进取的氛围里学习组合数学，具体的教学内容和教学方法的改进仍有待教学工作者进一步探讨和研究。
参考文献：
[1]卢开澄，卢华明.组合数学[M].北京：清华大学出版社，2002.
[2]苏建忠，张岩，刘洪波，王芳，崔颖.组合数学在生物信息学教学中的应用[J]. 科技创新导报，2012，6，142-143.
作者简介：
刘洪波（1983-），男，汉族，山东德州人，博士，讲师，主要研究方向：生物信息学，计算表观遗传学。
王芳（1982-），女，汉族，吉林松原人，博士，副教授，主要研究方向：生物信息学，计算表观遗传学。
