表观遗传学研究方法范文

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>> 成瘾相关记忆的表观遗传学机制 愈肝颗粒对大鼠肝癌的抵制作用及其表观遗传学机制 自身免疫疾病的表观遗传学 表观遗传学的研究进展 表观遗传学与人类健康 表观遗传学研究进展 表观遗传学与食管癌相关性研究进展 表观遗传学调控的研究现状及其存在的问题 表观遗传学在抗肿瘤领域的研究现状及前景 研究生《表观遗传学》课程的教学改革与探索 表观遗传学在中医药研究中的应用 表观遗传学标记在急性白血病微小残留病检测中的临床意义 急性髓细胞白血病表观遗传学的靶向性和个体化治疗策略 浅析表观遗传学在高中生物课程中的教育价值及其实现 神奇的遗传学 遗传学的未来 表观遗传学有助解释妊娠高血压 关于遗传学教学的思考 遗传学中的数学思想 遗传学的概率计算 常见问题解答 当前所在位置：l）。有很多基于亚硫酸氢盐（bisulfite）处理DNA的检测启动子甲基化的方法，其原理是亚硫酸氢盐修饰将去甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，但留下甲基化的胞嘧啶不变。在随后通过聚合酶链反应（PCR）扩增CpG区域时，尿嘧啶被转化到胸腺嘧啶，而从甲基化的胞嘧啶则在此过程之中保持不变。甲基化和去甲基化的胞嘧啶之间的区别可能是胞嘧啶和胸腺嘧啶之间的区别，最初甲基化的程度可以由Pyrosequencing TM技术计算。最近亚硫酸氢盐测序、（定量）甲基化特异性PCR（MSP， methylation-specific PCR）、甲基化敏感单克隆核苷酸引物延伸（Ms-SNuPE，methylation-sensitive single nucleotide primer extension）等技术也普遍用于基因的甲基化测定。另有一些技术可以用于研究全基因组染色质结构的改变。例如利用特异性识别甲基化胞嘧啶的抗体进行免疫沉淀实验，后进行质谱测定；另一方面也利用DNA结合蛋白抗体或组蛋白的特异性修饰抗体，进行染色质免疫沉淀（ChIP，chromatin immunoprecipitation）测定，后进行DNA测序。更新的技术可以结合芯片，进行高通量的实验设定。

迄今为止，有关于神经性疼痛模型的表观遗传学研究数量并不是很多。从以往的研究报道来看，DNA甲基化、组蛋白乙酰化和非编码RNA的调控模式在神经性疼痛的发生、发展及其维持的各个环节都有发生非常明显的改变并发挥着极其重要的作用。在未来的研究中，我们将进一步的探索表观遗传学参与神经性疼痛的调控的分子机制，研究相关的修饰程序是如何带来了持久而长期的痛觉异常和痛觉过敏的，并为以后进一步的深入研究神经慢性病理性疼痛是如何发生、发展与维持打下基础，并为其后续的控制、治疗提供新的作用靶点。

*通讯作者：陈恒玲

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基因组印记

基因组印记是一种不遵循传统孟德尔遗传规律的表观遗传现象。这是由于来源于某一亲本的等位基因或其所在的染色体发生了表观遗传修饰，导致不同亲本来源的两个等位基因在子代细胞中表达不同。受印记机制调控而差异表达的基因称之为印记基因（imprintedgene）。目前在植物、昆虫和哺乳动物中均发现了基因组印记现象，而在鸟类、鱼类、爬行类和两栖类动物普遍认为不存在印记现象。1991年Bartolomei等采用基因敲除技术在小鼠中首次确认了类胰岛素生长因子2型受体和非编码RNAH19基因两个母源印记基因及一个类胰岛素生长因子2型父源印记基因。2007年，杜克大学的研究人员用机器学习的人工智能形式发现了156个新的印记基因，并以此为基础创造了第一张人类基因组印记基因图谱。

X染色体失活

X染色体失活是指雌性哺乳类细胞中两条X染色体的其中之一失去活性的现象，X染色体会被包装成异染色质，进而因功能受抑制而沉默化，这种现象也称为X染色体的剂量补偿（dosagecompensation）。X染色体失活的起始和选择发生在胚胎发育的早期，这个过程被X染色体失活中心（X-inactivationcenter，XIC）所控制，是一种反义转录的调控模式。这个失活中心存在着X染色体失活的特异性转录基因，当失活命令下达时，这个基因产生1个17kb不翻译的RNA与X染色体结合，介导DNA甲基化和组蛋白修饰，引发并维持X染色体的失活。X染色体失活中心还有“记数”功能，即保持每个二倍体中仅有1条X染色体有活性，其余全部失活。X染色体的失活状态需要表观遗传修饰来维持，可以通过有丝或减数分裂遗传给后代。

非编码RNA

非编码RNA是指不能翻译为蛋白质的功能性RNA分子，其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、microRNA等多种已知功能的RNA以及未知功能的RNA。按照它们的大小可分为长链非编码RNA和短链非编码RNA，前者在基因簇以至于整个染色体水平发挥顺式调节作用，后者在基因组水平调控基因表达并介导mRNA的降解，诱导染色质结构改变，决定细胞的分化命运，还对外源的核酸序列有降解作用以保护本身的基因组。microRNA是一类内源产生的长度约为22个核苷酸的非编码小RNA分子，广泛存在于真核生物甚至病毒中，通过调节编码蛋白的基因的表达或翻译来发挥调控作用。microRNA的功能十分广泛并且渗入到了生理病理学的各种调控途径中，包括发育周期、细胞增殖和分化、细胞凋亡、新陈代谢、神经调控、肿瘤发生以及病毒和宿主的相互作用等。在法医学应用中，由于降解后的片段长度过小，不能进行有效的PCR扩增，然而microRNA就能满足降解检材的PCR扩增，开始成为关注的热点。

表观遗传学在法医学中的应用

1表观遗传学与亲权鉴定

自1985年英国遗传学家AlecJeffreys教授首次报道DNA指纹图技术应用于法医DNA分析以来，DNA分析技术已经在多起重大的刑事犯罪侦破和民事诉讼中发挥重要的作用。目前主要是以荧光标记STR与SNP等传统遗传标记进行个体识别和亲权鉴定。但在法医学亲子鉴定中，尤其是子代为杂合子或者父（母）和子代为相同的杂合子的单亲鉴定中，亲代的必需等位基因可能无法确定，使基因座的鉴别能力下降。但通过使用亲缘特异性甲基化遗传标记可以直接判定等位基因的亲源，从而确定亲代的必需等位基因。Zhao等应用甲基化特异性PCR对被甲基化标记的母系SNP位点rs220028进行检测证明了这一观点。另外，Poon等报道，采用DNA甲基化标记可有效识别孕妇外周血中的胎儿DNA，这也为产前的亲权鉴定提供了一种非侵入性的检测方法。

2表观遗传学与年龄推断鉴定

个体年龄推断一直是法医学研究的重要内容。目前实际工作中，个体年龄推断主要依据人类学方法，通过测量与年龄相关的骨骼、牙齿标志等，根据相关模型进行推算。近年来，许多研究者发现表观遗传学为个体年龄推断的研究提供了一种新的思路。DNA甲基化随年龄变化的特点为利用甲基化标记进行年龄推断提供了可能。陈培利等利用人胚肺二倍体成纤维细胞（humanembryoniclungdiploidfibroblast，2BS）进行体外培养，发现其p16基因启动子区及外显子Ⅰ处的DNA甲基化水平随个体细胞代龄的增加而降低。Tra等用限制性标记基因组扫描（restrictionlandmarkgenomescanning，RLGS）技术对T淋巴细胞2000个基因座的甲基化年龄变化情况进行了调查，发现29个基因座有变化，其中23个增加，6个降低。由于甲基化标记数目众多，从中可以筛选出一组适合于法医学应用的、年龄变化有规律的座位，应用于微量检材的年龄推断。尹慧等用高效液相色谱（HPLC）法对94个健康个体DNA甲基化水平的检测发现，5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）含量随年龄增加而降低，50岁以上与50岁以下年龄组5mC含量差异具有统计学意义。2010年，Teschendorff等通过对261个绝经后妇女全血样本约14000个基因启动子区超过27000个CpG的甲基化状态进行分析，证实干细胞多梳蛋白家族（polycombgroup，PcG）靶基因比非靶基因更容易随年龄发生甲基化，并且变化不依赖于组织类型、疾病状态和甲基化水平。

Bocklandt等通过分析唾液中的DNA甲基化标记，可以预测一个样本组成员的年龄，结果与实际年龄相差大约在5岁范围内。这项技术如果被确证，可能会成为法医取证方面很有用的一种工具。同时，它还表明了一种可能性：DNA甲基化修饰或许可以提供一种比计算生日更具医学相关性的年龄测定方法。

2010年，NorenHooten等在外周血单核细胞中的800个microRNA标记中筛选出9个与年龄相关的基因，但发现其中5个与疾病有关，该研究表明microRNA可以作为推断年龄以及和年龄相关疾病的诊断指标。

2011年，国内Jin等首次报道了通过体细胞发挥功能的组蛋白修饰基因对衰老这一重要生物学过程的调控作用。这项研究通过生物化学、分子生物学、遗传学和系统生物学相结合的方法，发现组蛋白H3K27me2/3去甲基酶UTX-1/UTX对衰老发挥了重要的调控作用。在秀丽线虫中，该基因的杂合突变体及野生型的RNAi敲降后都能极大地延长线虫寿命，使其抗逆性也大大加强。遗传学分析发现其功能依赖于胰岛素样信号通路。这种通过重新建立组蛋白修饰模式的方式，揭示了细胞的重编程在抑制衰老过程中的重要作用，并提示其作用机制在哺乳动物细胞中同样存在。

3表观遗传学与双生子的鉴别

同卵双生子（monozygotictwins，MZ）是由一个受精卵经过卵裂产生两个单独的细胞，并发育为完全独立的个体，因此同卵双生两个个体的遗传背景完全相同，享有共同的DNA序列。在法医DNA分析领域，现有的DNA分析手段尚不能有效鉴别同卵双生个体。

但是近年来，众多研究都已证实，同卵双生子的表观遗传学水平存在一定的差异。Fraga等对西班牙的40对同卵双生子个体进行研究，发现他们在DNA甲基化、X染色体失活、组蛋白位点特异性乙酰化上存在差异，并且这种差异会随年龄增长而增加。Kaminsky等对114对同卵双生子个体的DNA甲基化的研究显示，血白细胞、口腔黏膜上皮细胞和肠道组织中的甲基化状态均存在差异。

此外，Ollikainen等对新生儿不同组织相关的4个差异甲基化区域的甲基化状态进行了研究，发现甲基化水平存在显著差异。从上述研究成果中可以看出，研究人员已经把目光投入到了法医DNA分析的全新领域，尤其是DNA甲基化在同卵双生子中的研究。这些都为采用DNA甲基化这一表观遗传学标记进行同卵双生子个体甄别的可能性提供了强有力的理论支撑。

4表观遗传学与组织来源鉴定

在常见的法医学案件中，有时需要对生物检材的组织来源进行鉴定。传统的形态和生化方法信息含量少，容易受各种条件的影响，因此常常受到限制。随着分子生物技术的发展，以表观遗传学为基础的组织鉴定方法存在明显优势，越来越为人们所关注。

例如，富含CpG的Alu重复序列，在体细胞中是甲基化的，在生殖细胞中却是低甲基化的，有一个在进化上比较年轻的Alu亚族在中几乎是完全没有甲基化的。通过对这一Alu亚族甲基化的分析，就可以判断检材是否含有。范光耀应用联合亚硫酸氢盐的限制酶法，调查、常见体液、分泌液和组织的DEAD盒多肽4［DEAD（Asp-Glu-Ala-Asp）boxpolypeptide4，DDX4）］基因启动子甲基化水平，发现中的甲基化水平显著高于非组织。因此，选择一个合适的界值，可以根据DDX4甲基化水平有效地鉴别（斑）的种属来源。

Hanson等运用RT-PCR技术，根据microRNA的细胞组织特异性对血液、、唾液、阴道分泌液和经血进行来源鉴别，并通过与21种人体组织比对验证了各种斑痕microRNA表达的特异性，用于检测RNA的模板量最低可达50pg。Zubakov等运用微阵列和Taqman定量PCR技术确证了一些能运用于法医学实践识别血痕和精斑的稳定的microRNA标记。该项研究不仅将灵敏度提高到相当于单细胞水平的0.1pgRNA模板量，而且在新鲜与陈旧样本的比对中发现其microRNA分子绝对含量未发生明显变化。

5其他

近年来，随着学者们对RNA在法庭科学领域的研究逐渐广泛和深入，发现microRNA在法医学领域的应用价值也日益重要。2007年王芬等发现有6个microRNA分子在H2O2诱导PC12细胞凋亡后表达显著下调，这一结果为法医病理学者研究脑缺血再灌注损伤中神经细胞凋亡的机制提供了理论依据。2010年李文灿等在研究大鼠心肌组织microRNA降解与死亡时间的相关性时发现，其含量在机体死后120h内保持相对稳定的水平，可作为内参指标反映其他生物指标的变化水平。

随着分子生物学技术的飞速发展，法医工作者又面临一项新的挑战，即如何在日常的亲缘鉴定和个体识别工作中有效甄别伪造DNA。用于伪造DNA常使用PCR扩增的方法，因此使用亲缘特异性甲基化遗传标记，可以在进行亲子鉴定和个体识别的同时，检测样本的甲基化状态，从而鉴别样本是否为人工伪造DNA。因此DNA甲基化遗传标记在鉴定DNA是否人工伪造中发挥着重要的作用。

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关键词 硒 表观遗传修饰 表观标志物抑制剂 抗癌药 开发

中图分类号：R979.1 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）03-0075-04

Selenium compounds ― looking forward to be developed as epigenetic targeting selenium-containing anti-tumor drugs*

ZHU Huiqiu1**， HUA Yan1， WANG Mingli2***

（1. Anhui Huaxin Pharmaceutical Co. Ltd.， Hefei 230000， China； 2. Anhui Medical University， HeFei 230032， China）

ABSTRACT Selenium compounds can produce an intervention effect on the abnormality of epigenetic modification and then repress the occurrence and metastasis of tumor. They can be used as the inhibitors of some tumor specific epigenetic markers and expected to be developed as a new type of epigenetic targeting selenium-containing anti-tumor drugs.

KEy WORDS selenium； epigenetic modification； inhibitors of epigenetic markers； anti-cancer drugs； development

硒最重要的生物学功能是抗癌，并以多种机制发挥其抗癌作用。近年来的研究发现，硒又可对表观遗传学调控机制异化产生干预影响，特别是对在肿瘤发生机制中的特异性靶点进行干预，进而阻抑肿瘤的发生及转移。硒化物是某些肿瘤特异性表观标志物有效的抑制剂。硒的这个功能不仅对临床肿瘤诊断、治疗、预防具有现实意义，更为“含硒表观靶向抗癌药物”开发提供了科学依据。“含硒表观靶向抗癌药物”是期待开发的新型抗癌药。现就近些年在这些方面的相关研究作一简要介绍。

1 表观遗传学

什么是表观遗传学？从孟德尔遗传规律讲，亲代（一代）把遗传信息传递给子代（二代），主要由携带遗传信息的脱氧核糖核酸（DNA）分子中碱基的排列顺序（即碱基序列）来决定，并在细胞核内遗传。但人们在研究中发现，在DNA碱基序列以外还有一套调控机制，包括 DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA等，它们在不涉及改变DNA碱基序列的情况下，影响转录活性并调控基因的表达，改变机体的性状，并且是一种可以预和逆转的遗传机制。这种非孟德尔遗传现象，称作表观遗传学[1-2]。

2 硒对表观遗传修饰异常产生干预及逆D作用

肿瘤发生发展的主要生物学原因是原癌基因活化和抑癌基因失活[3]。研究显示，DNA甲基化水平同这些基因的表达密切相关。通常情况下，甲基化水平同基因表达呈负相关，甲基化程度越高，基因表达活性越低，甲基化程度越低，基因表达越活跃[4]。

DNA甲基化主要表现为基因组整体甲基化水平降低和局部CpG岛[在哺乳动物中富含胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸的一段DNA称为CpG岛]甲基化程度的异常升高，人类基因组的甲基化主要发生在CpG岛[5]。

研究表明，实体瘤普遍存在基因组广泛低甲基化现象，低甲基化使原癌基因活化，癌细胞异常增殖；低甲基化还使肿瘤转移增加，例如胃癌的甲基化水平越低，癌细胞浸润、转移的倾向越明显[6]。

CpG岛的甲基化程度异常升高，会导致某些抑癌基因表达沉默，进而参与肿瘤的发生发展。在正常情况下，CpG岛为非甲基化。当肿瘤抑癌基因的启动子区域（CpG岛）过度甲基化，就会使抑癌基因的表达沉默。其间DNA甲基转移酶（DNMT）家族中的DNMT1发挥着重要的调控作用，它的高表达导致抑癌基因在CpG岛失活。所以，CpG岛高甲基化成了多种肿瘤特异性表观标志物，已成为临床多种肿瘤早期诊断的依据和指标[7]。

近年来，作为表观遗传学调控机制之一的组蛋白修饰在肿瘤研究领域受到越来越多的关注。组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）共同调控，而编码HAT或HDAC的基因如果发生染色体易位、扩增等突变会导致某些肿瘤的发生。

可见，DNA甲基化和组蛋白乙酰化等表观遗传修饰异常是肿瘤发生的另外一个机制。而近年研究发现，硒通过靶向干预可逆转甲基化和乙酰化异常的过程，从而抑制肿瘤的发生及转移。硒化物成了潜在的治癌新药物，是亟待开发、临床应用前景可观的“含硒表观靶向抗癌药物”。

2.1 硒对DNA甲基化产生干预作用

研究表明，膳食硒通过干预表观遗传过程显示出其抗癌潜力，膳食缺硒时组织呈现整体低甲基化[8]。Davis等[9]早些时候研究发现，给大鼠喂食缺硒膳食，其肝脏和结肠都出现显著DNA低甲基化，而经硒处理的人结肠癌细胞株Caco-2 DNA甲基化水平显著高于未经硒处理的对照组，据此研究者认为，膳食缺硒会增加肝脏和结肠肿瘤的发生。Remely等[8]研究表明，膳食硒营养缺乏会引起动物组织和人体结肠癌DNA低甲基化。我国学者徐世文等[4]通过实验也发现，饲料硒缺乏可导致鸡肌肉组织 DNA甲基化水平降低。硒对DNMT有抑制作用，缺硒会导致DNMT活性增加，使原癌基因活化，引起结肠癌等多种肿瘤发生。保持硒等营养素均衡摄入，有利于维持DNA甲基化正常水平及抑制DNMT活性[6]。

CpG岛DNMT1的高表达是使抑癌基因失活的重要机制。抑制DNMT1靶酶活性，使失活的抑癌基因复活，是肿瘤治疗中探索的新途径。硒在多种肿瘤中有去甲基化的生物学功能，能诱导失活的抑癌基因重新活化和表达[3]。研究发现，硒可以直接干预DNA甲基化，抑制腺癌细胞株DNMT的高表达[8]。膳食硒干预DNA甲基化的方式之一是通过去甲基化过程来调节DNMT1活性的；研究还证实，亚硒酸钠和苯甲基氰酸硒（BSC）、1，4-苯双（亚甲基）氰酸硒（p-XSC）两种合成硒化物对人大肠癌细胞核提取物中DNMT的活性都有抑制作用[10]。

各方面的研究验证，硒对DNA甲基化产生干预影响，是靶酶DNMT有效的抑制剂。

2.2 硒干预影响组蛋白的乙酰化

近年来，国内外学者研究发现，组蛋白去乙酰化酶与肿瘤的发生密切相关。HDACs家族中的HDAC1高表达可明显增加肿瘤细胞的增殖能力。在食管鳞癌、前列腺癌等多种肿瘤中均发现HDAC的高表达，靶酶HDAC已成为首选的攻击靶点。

目前，人们通过体内、体外的研究鉴定出了硒、丁酸盐、曲古抑菌素A（TSA）等一些HDAC的抑制剂，这些抑制剂可在体外诱导多种肿瘤细胞的生长停滞、分化或凋亡[2]。Somech等[11]通过临床试验表明，HDAC抑制剂对人体白血病及实体瘤进行治疗，表现出明显的抗肿瘤增殖效果，研究者认为，各类HDAC抑制剂是另一类新型抗癌药物、“癌症治疗的新工具”。

Xiang等[12]的研究证明，硒可以通过下调DNMT和抑制HDAC活性，活化人前列腺癌LNCaP细胞系中因高甲基化沉默的基因GSTP1， APC和CSR1。这些基因是具有保护免受氧化损伤的抗癌活性物质、化学致癌物解毒剂或肿瘤抑制剂。

甲基硒酸（MSA）是近年来新研制成的一种人工低分子量有机硒化合物，是很具潜力的抗癌制剂。Kassam等[13]通过对弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系（DLBCL）w外研究首次发现，MSA可以抑制该细胞系HDAC的活性。研究者认为，有关MSA抑制HDAC活性的作用以前从未报道过，从而为人们提供了硒元素一种新的机制，MSA是日后临床试验中可以使用的硒化物。

我国科研人员胡琛霏[2]通过蛋白质免疫印迹的方法，检测到MSA可抑制食管鳞癌细胞系HDAC的活性，降低HDACl和HDAC2的蛋白表达，引起细胞内组蛋白乙酰化水平显著升高；同时，还检测到硒甲硫氨酸（SLM）对食管鳞癌细胞系KYSEl50细胞和MCF7细胞的作用，在SLM处理细胞24 h后，细胞中组蛋白去乙酰化酶的活性也显著降低。

这些年，越来越多的含硒组蛋白去乙酰化酶抑制剂被发现和验证。亚硒酸钠、酮C甲基硒丁酸盐（KMSB）、甲基硒代半胱氨酸（MSC）、甲基硒丙酮酸（MSP）等硒化物都可以抑制HDAC活性，提高组蛋白乙酰化水平，作为潜在的HDAC抑制剂，发挥其抗肿瘤的作用[14]。Fernandes 等[15]介绍，KMSB 和 MSP在体外作为HDAC的竞争性抑制剂发挥抗癌作用；还报道，合成的SAHA含硒类似物（5-苯甲酰戊氰硒）二硒醚和5-苯甲酰戊氰硒对不同肺癌细胞株HDAC抑制效果比SAHA更好。SAHA是氧肟酸类HDAC抑制剂，是目前在临床上以皮肤T淋巴细胞瘤（CTCL）为适应症而广泛应用的表观靶向抗癌药物。这也提示，含硒类抑制剂对靶酶HDAC抑制效果优于无硒类抑制剂。

为何上述各种硒化物都可靶向抑制DNMT和HDAC活性，研究发现不管其结构如何改变，硒都是这些化合物生物活性的中心元素，发挥着关键作用，硒的这一生物学功能对含硒抗癌药物的开发具有重要的指导意义[16]。

2.3 硒对非编码RNA调控机制产生干预效应

表观遗传学的一个重要调控机制是非编码RNA。非编码RNA是指不能翻译为蛋白质的RNA分子。近年来，非编码RNA一族中的微小RNA-200（miR-200）受到人们的高度关注。研究发现，miR-200家族中的成员微小RNA-200a（miR-200a）与肿瘤的发生发展关系密切，miR-200a在肿瘤组织中呈现明显低表达。因此，miR-200a的表达下调是肿瘤发生的重要因素之一，miR-200a也成了肿瘤特异性表观标志物[17]。

胡琛霏[2]通过TaqMan芯片，检测了MSA处理食管鳞癌细胞后细胞中微小RNA（miRNA）的变化情况，发现MSA可以上调细胞中miR-200a 的表达水平，miR-200a 表达升高后，负性调控Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）的表达，使Keap1蛋白水平下降，上调转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）蛋白水平并提高其转录活性（Nrf2活性受其细胞质接头蛋白Keap1的调控），从而活化Keap1-Nrf2信号通路。而Keap1-Nrf2信号通路在抗氧化、预防肿瘤发生等诸多方面有重要作用[18]。

体外研究显示[19] ，人脑膜瘤组织中miR-200a表达明显低于正常组织，β-循环蛋白（β-catenin）和其下游靶基因细胞周期蛋白D1表达显著增高，二者和miR-200a呈现负相关，上调miR-200a可降低β-catenin的表达，进而阻断Wnt/β-catenin信号传导通路来抑制脑膜瘤的生长。胡琛霏课题组前期研究也发现MSA可以抑制食管鳞癌细胞系中β-catenin的表达[2] 。研究已证实，Wnt/β-catenin信号通路的激活和高表达可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及抑制肿瘤细胞的凋亡[20]。

由此可见，MSA可能介导、调控着miR-200a表达及参与复杂的分子调控网络，从而抑制肿瘤发生及转移。

3 展望

加强硒与表观遗传学之间关联的研究，有着重要的生物医学意义。它有可能解释硒化学抗肿瘤的新机制，从理论上证明硒元素可能具有表观遗传学的效应[21] 。综上所述，硒在肿瘤形成中对表观遗传修饰异常产生干预影响，靶向抑制肿瘤特异性表观标志物，逆转表观遗传修饰发生异化过程，使我们认识了硒化学抗癌的新机制、新作用，硒化物是潜在开发的新型靶向抗癌药物。Fernandes 等[15]指出，硒化物都是癌症治疗药。目前，非表观类含硒靶向抗癌药如硒唑呋喃、依布硒啉、乙烷硒啉等早已进入临床研究[16]，展示出很有希望的临床应用前景。而含硒表观靶向抗癌药物是亟待开发的抗癌药“富矿”，加快开发含硒表观靶向抗癌药物，可为临床肿瘤治疗增加一种“新的工具”，为癌症患者战胜病魔增添一份新的希望。人们热切期盼“含硒表观分子靶向抗癌药物”早日问世。

致谢：本课题研究得到华中科技大学徐辉碧、黄开勋两位教授和安徽医科大学张文昌硕士的支持，在此表示衷心感谢。

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篇4

[关键词]　表观遗传学；抑癌基因；DNA甲基化；胃癌

[中图分类号]　R735.2 [文献标识码]　A [文章编号]　1673-9701（2012）36-0012-02

肿瘤的发生发展是一个多因素参与的复杂过程。众所周知，肿瘤发生发展的主要原因为原癌基因的激活和抑癌基因的失活，目前越来越多的证据表明，其发生机制除遗传学改变外，表观遗传学改变也占有非常重要的地位。目前在表观遗传学机制中研究最多的是DNA甲基化。胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病机制与DNA甲基化状态的改变密切相关。

1　表观遗传学与胃癌

表观遗传学（Epigenetics）是指基于非基因序列改变所致的基因表达水平变化，主要包括DNA甲基化、染色质构象改变和组蛋白修饰等[1]。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶5位碳原子上[2]。

肿瘤中的表观遗传学改变是由Feinberg和Vogelstein两位科学家于1983年首次描述的，他们发现在肿瘤中同时存在两个互相矛盾的表观遗传现象，即全基因组低甲基化和局部高甲基化[3]。研究表明，全基因组的低甲基化可以导致ras、c-myc等原癌基因激活，而DNA启动子区CpG岛的高甲基化可以导致p16、APC等抑癌基因失活，两者协同作用，从而促使肿瘤的发生。

胃癌（gastric　cancer，GC）由于其患病率高、预后差、有限的治疗选择等，仍然是全球范围内一个重要的临床挑战。虽然胃癌的发病率逐年下降，但它仍然是癌症死亡的第二大原因和四个最常见的恶性肿瘤之一[4]。研究表明，相比其他类型的癌症（如大肠癌），胃癌中基因突变的频率相对较低，而以DNA甲基化为主的表观遗传改变却发挥了关键作用。

2　抑癌基因甲基化与胃癌

目前，DNA甲基化研究最深入的方向是抑癌基因（tumor　suppressor　genes，TSGs）的异常甲基化。Bird等研究发现DNA启动子区CpG岛甲基化可导致肿瘤细胞抑癌基因失活。从此，表观遗传改变在肿瘤发生和发展中的作用受到了人们的高度重视，并成为了研究的热点[4]。人类基因组中，约有50%基因的启动子区5'端富含CpG，这种区域称为CpG岛（CpG　island），其长度不小于500　bp、GC含量不少于55%。CpG岛在正常情况下一般处于非甲基化状态，当其发生甲基化时，基因的空间结构也随之改变，表达受到抑制。

越来越多的研究证实，胃癌的发生与抑癌基因启动子区CpG岛的异常高甲基化密切相关[5，6]。目前已知胃癌中，包括p16、APC、CDH1、RASSF1A、CHFR、DAPK、PTEN和RUNX3等数十个抑癌基因，均是由于高甲基化而失活的[7]。这些基因参与DNA修复、调节细胞周期、信号转导等多个细胞生理过程，与胃癌的发生发展具有密切关系。以下是几个近年来研究较热门且具有代表性的抑癌基因。

2.1　PTEN基因

PTEN基因定位于人染色体10q23.3，由9个外显子组成，编码由403个氨基酸组成的蛋白质，具有磷酸酯酶的活性。PTEN蛋白可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制肿瘤的发生发展。研究显示，PTEN基因在多系统恶性肿瘤中均表达下降，均与DNA异常高甲基化有关。Liu　S等[8]对56例胃癌标本中PTEN基因mRNA表达及启动子区CpG岛甲基化状态进行检测，结果显示胃癌组织PTEN基因表达较癌旁正常组织明显下降（P　＜　0.01），甲基化率48.2%明显高于癌旁正常组织3.6%（P　＜　0.01），说明PTEN基因甲基化可能是其低表达的原因。

2.2　RASSF1A基因

RASSF1A基因位于人染色体3p21.3区域位点，内含编码340个氨基酸的开放阅读框，编码相对分子质量38　800　Da的蛋白多肽，通过参与抑制Ras/RASSF1/ERK通路的信号转导调控细胞的凋亡、维持微血管稳定性[9]。其表达失活，可以使胃黏膜细胞凋亡受抑，并向恶性细胞转化。研究证实，RASSF1A基因在肺癌、胃癌、乳腺癌等多种实体瘤中均存在甲基化导致的表达失活。林海等[10]检测出RASSF1A基因在62例胃癌标本较56例正常组织中的mRNA表达明显下降（P　＜　0.01），甲基化率分别为66.1%和23.2%，癌组织甲基化率是正常组织的2.80倍，差异有统计学意义（P　＜　0.01），表明RASSF1A基因高甲基化可能是导致其表达降低的原因。

2.3　RUNX3基因

RUNX3基因定位于人染色体1p36区域位点，属于RUNX基因家族，在哺乳动物发育和肿瘤中发挥重要作用，并已被证实与胃上皮细胞稳态和胃癌的发生相关[11]。研究发现，有相当比例的胃癌组织中由于RUNX3基因启动子区CpG岛异常甲基化而不表达RUNX3。何小兵等[12]分别对9种胃癌细胞系和35例胃癌患者手术切除肿瘤组织及其癌旁组织RUNX3基因启动子区域甲基化进行检测，结果显示在7种胃癌细胞系中RUNX3基因启动子区域过度甲基化，RUNX3基因在35例胃癌及其癌旁组织中甲基化率分别为40.0%和8.6%。因此，RUNX3基因启动子区CpG岛甲基化可能是导致基因转录失活及其表达下调的主要原因。

3　CpG岛甲基化表型与胃癌

肿瘤细胞中多个基因或DNA位点甲基化的状态称为CpG岛甲基化表型（CpG　island　methylation　phenotype，CIMP）。如果有3个以上基因CpG岛处于甲基化状态称为甲基化表型阳性（CIMP+），反之则称为甲基化表型阴性（CIMP-）。多项研究表明，胃癌中存在甲基化表型阳性。例如Tahara　T等[13]检测了146例胃癌标本中p14、p16、DAPK、E-cadherin　4个抑癌基因的甲基化状态，结果显示43.2%的病例表型为CIMP+。Kim等[14]检测了40例早期胃癌中hMLH1、TIMP3、THBS1、DAP2K、GSTP1、APC和MINT2的甲基化状态，结果显示40%病例表型为CIMP+。这表明，甲基化表型阳性在胃癌的早期就已经发生，可以作为早期胃癌的诊断指标之一。

此外，有研究表明，CIMP+与胃癌的分期和侵袭转移无关，而与胃癌Borrmamm分型和预后相关。Park等[15]对196例胃癌标本中16个肿瘤相关的CpG岛或位点进行了分析，结果显示CIMP+的胃癌患者预后较差。这表明甲基化表型阳性也可以作为胃癌预后判断的一项指标。

4　抑癌基因甲基化临床应用前景

检测肿瘤抑癌基因的甲基化状态可以用于癌症的筛选、风险的预测和治疗的选择。研究发现，抑癌基因的异常高甲基化在胃癌癌前病变阶段（如慢性胃炎和肠上皮化生）也经常检测到，说明DNA甲基化的发生往往早于各类癌症的肿瘤形成，这使得它尤其适用于癌症风险预测[16]。此外，若干报道指出，癌特异的、甲基化的DNA可以在微量的生物体液中被检出[17]，这表明它可能是一个灵敏的非侵入性诊断的标记物。

目前研究者认为，DNA甲基化在一定程度上是一个可逆的过程。DNA甲基化需要DNMT的催化，因此应用甲基转移酶抑制剂抑制DNMT的活性后，可使DNA甲基化逆转，称为去甲基化。目前研究较深入的甲基转移酶抑制剂为5-氮杂-2-脱氧胞苷，大量体外研究证实，应用5-氮杂-2-脱氧胞苷处理后，抑癌基因表达缺失的胃癌细胞株均重新表达该基因[18]。故通过去甲基化恢复抑癌基因表达可恢复基因正常功能，有可能达到治疗癌症的目的。

综上所述，抑癌基因甲基化是胃癌发生发展的重要机制之一，多基因甲基化状态的检测及去甲基化药物的研究对胃癌的预防、诊断和治疗均具有长远意义。而如何根据不同患者的实际情况选择进行检测的抑癌基因从而提高早期胃癌检出率，以及去甲基化药物的选择和临床应用还有待进一步的研究。期待更加深入的科学实验为临床诊疗提供日趋完善的理论基础，使得日渐成熟的甲基化检测技术及去甲基化药物早日广泛应用于恶性肿瘤的诊治。

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篇5

[关键词] Beckwith-Wiedemann综合征；表观遗传学；DNA甲基化；印记基因；Wilms肿瘤

[中图分类号] R726.5 [文献标识码] C [文章编号] 1673-9701（2016）26-0155-03

表观遗传学是近年来医学研究的新热点，而Beckwith-Wiedemann 综合征（BWS）是研究表观遗传学的代表性疾病之一。本病是一种罕见的先天性印记基因表达异常综合征，印记基因最具特征的标志是DNA 获得甲基化和去甲基化，其致病基因位于第11 号的染色体短臂15.5 区域，以脐膨出、巨大舌和身体的一侧生长过剩为主要表现，临床上还可见短暂性低血糖、面部鲜红斑痣、内脏肥大、肿瘤等其他表现。本文通过介绍我院收治的1例Beckwith-Wiedemann 综合征患儿情况，以提高临床医生对本病临床表现、诊断、发病机制的认识，现报道如下。

1 病例资料

患儿，女，36+1周早产，于2014年9月25日9：35于我院产科出生，患儿系第1胎第1产，顺产，其母胎膜早破5 h，产前无宫内窘迫，生后Apgar评分1 min、5 min均为10分，出生体重3600 g，羊水、脐带未见异常，胎盘大，生后发现患儿舌大伴吐舌，为进一步治疗转入我科。

母孕史：其母孕期规律产检，孕29周时宫内B超提示胎儿双肾增大，孕34周时宫内B超提示胎儿巨舌症？家族史：父母体健，非近亲结婚，否认家族遗传病病史及中毒、外伤史。

入院查体：体重：3550 g，身长：50 cm，头围：33 cm，神清，精神反应可，眼裂稍小，鼻梁低平，舌大，吐舌，哭声响亮，婉转有调，颜面可见红斑，前囟平软约1.5 cm×1.5 cm，左顶部可触及2 cm×2 cm×3 cm血肿，心音有力，律齐，心前区未闻及杂音，两肺呼吸音清，腹软，腹正中剑突下至脐部可见一条状隆起，哭闹时明显，脐根部粗大，肝肋下2 cm，质软边锐，脾肋下未及，双侧肢体对称，无偏身肥大，四肢肌张力正常。

辅助检查：血尿便常规无异常，血生化无异常，TORCH（-），血胰岛素（空腹）3.35 μIU/L（3.3～19.5 μIU/L），超声心动图：房间隔缺损3 mm，继发孔型。腹部B超：肝脏增大，双肾增大，双侧肾盂分离。

小儿外科：脐疝，腹白线疝。皮肤科：面部鲜红斑痣。口腔科：舌体良性肥大。

诊治经过：入院第2天出现血糖偏低（2.5 mmol/L），经喂养糖水及奶、静脉输入葡萄糖，血糖恢复正常。住院期间每天均在空腹喂奶前有1～2次血糖偏低，经加强喂养后血糖正常。

出院后随访：出生后40 d，混合喂养，血糖监测正常。右侧肢体较左侧偏大（右上肢、下肢较左侧长0.5 cm，右下肢较左侧粗0.5 cm），活动好，肌张力正常，用力时腹中线部位膨隆。血AFP 257.6 ng/mL（

MS-MLPA结果：母源KvDMR去甲基化，母源H19甲基化或父源的单亲二倍体。

2 讨论

2.1 发病率及病因

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【关键词】胃癌；分型；进展

胃癌是消化系统的常见恶性肿瘤，为全世界范围内发病率最高的癌症之一，根据世界卫生组织癌症研究中心2002年的统计，我国胃癌发病率仅次于日本，位于全球第2位。2007年中国肿瘤登记提示：我国胃癌的发病居第二位，仅次于肺癌，死亡据第三位，仅次于肺癌、肝癌。胃癌在演进过程中随着附加的基因突变会产生不同的亚克隆，使其不断异质化导致其侵袭和转移能力不断加强，而这是胃癌治疗困难和致死的主要原因。国内外学者都在寻求能指导临床方案选择及判断预后的胃癌分型，传统的癌症诊断对病理学依赖性较大，有时会因为肿瘤的不典型或临床信息的不完整而造成诊断困难。应用基因分析技术所产生的信息，特别是应用高通量芯片技术所产生的信息可以为胃癌分型提供更多的参考，因此对目前胃癌相关的分型予以综述。

1 胃癌的传统分型

胃癌病理分型是以组织形态结构和细胞生物学特性为基础，不同类型的胃癌，其形态结构和生物学行为各异，流行病学和分子机制亦不同，以致现有的胃癌分型系统众多。目前，常用的是WHO型、Lauren分型，大体分型主要使用Borrmann分型。

1.1 WHO胃癌包括以下常见组织学类型

状腺癌、管状腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌、腺鳞癌、鳞癌、小细胞癌、未分化癌。此外，胃内还可以发生类癌。WHO分型将Lauren分型的肠型、弥漫型纳入腺癌之下。其管状腺癌还可进一步分成高分化、中分化与低分化腺癌。少见类型或特殊类型胃癌有：实体型变异、肉瘤样变异等。

1.2 1923年德国病理学家Borrmann提出的一种胃癌大体形态分型方法，此分型主要根据癌瘤在黏膜面的形态特征和在胃壁内的浸润方式进行分类，将胃癌分为4型：Ⅰ型（结节型），II型（溃疡局限型），III型（浸润溃疡型），是最常见的类型，约占50%。Ⅳ型（弥漫浸润型），由于癌细胞弥漫浸润及纤维组织增生，胃壁呈广泛增厚变硬，称“革囊胃”。Borrmann分型是胃癌经典的分型方法，既能反映胃癌的生物学行为，又简洁实用，国际上广泛采用。

1.3 Lauren分型将胃癌分成两大主要类型，即肠型与弥漫型，当肿瘤内两种类型成分相当时就称为混合型。胃癌发生是一个多步骤的过程，弥漫型和肠型在肿瘤发生各个阶段会产生多种基因及表观遗传学方面的变异。常见的包括抑癌基因的点突变和杂合性丢失，常见的表观遗传学异常包括CPG岛的甲基化引起的肿瘤抑制基因沉默和肿瘤促进基因转录水平的增高。

2 胃癌分型与分子病理学

胃癌分型研究的意义在于探索其是否对判断预后有价值或者对于今后的治疗有指导意义。当前，国内张树华采用组织病理与组织化学和免疫组织化学技术相结合的方法，兼顾宿主的免疫防御反应，把胃癌分为两型：限制生长型和促进生长型。限制生长型预后较促进生长型好。

根据黏蛋白标记的差异，胃癌组织被分为4型：1）胃型：胃型黏蛋白标记的胃癌细胞>10%；2）胃肠型：胃型黏蛋白标记的胃癌细胞> 10%且肠型黏蛋白标记的胃癌细胞>10%；3）肠型：肠型黏蛋白标记的胃癌细胞>10%；4）未分类：胃肠黏蛋白标记的细胃癌细胞

Solcia等对对294例平均随访时间长达150个月的胃癌进行研究显示，如果将胃癌的组织学结构、细胞异型性程度、p53基因突变、18q杂合性缺失、微卫星不稳定性以及有无脉管神经浸润等因素与预后综合分析，可以将胃癌恶性程度分成三级。胃癌I级（预后良好型）包括：大量肿瘤内/旁淋巴样细胞反应型、高分化管状腺癌、黏液结节型和促纤维结缔组织增生性弥漫型胃癌，I级胃癌约占全部胃癌病例的37%。胃癌III级（预后不良型）包括：高度异型性胃癌、浸润型黏液腺癌、肿瘤细胞异型性中等但具有p53基因的第7或第8外显子突变、伴有血管淋巴管浸润以及神经浸润者，III级胃癌占全部胃癌病例的19%。其他胃癌则归属于预后中等的胃癌Ⅱ级，占全部胃癌的44%。这一关于胃癌恶性程度评价体系虽然是不依赖于临床分期的胃癌预后判断新标准，但实际操作中涉及到微卫星不稳定性的分子遗传学检测、p53基因突变检测以及EB病毒原位杂交检测等实验技术，在临床普及以及操作流程标准化控制等方面均有待统一。

3 微卫星不稳定性与胃癌分型

微卫星不稳定性[MSI]是胃癌发生过程中的一个常见事件，反应了肿瘤潜在DNA错配修复缺陷，常常由Hmlh1启动子区甲基化引起，胃癌合并MSI者其临床病理因素特别，预后相对良好，胃肠道肿瘤中MSI的测定是最先被广泛利用的预后分子检测之一。MSI的检测常采用荧光定量多重PCR进行，费用相对低，适用性广。以往的很多观察表明，胃癌中MSI的存在不仅仅是与已知的与组织病理特征强关联的分子分型标志，同时MSI能能区分预后良好好亚组。因此Simpson等建议将MSI作为一个有效的分子分型工具。葡萄牙的一项研究表明，胃癌患者并低度MSI五年生产率为30%相比，而高度MSI者则为70%。韩国的一项大型研究也表明在胃癌分期为II、III期的患者MSI与预后良好有关。

4 胃癌的分子分型

以分子特征为基础的新型分类体系即分子分型。高通量的基因分析可以是DNA水平的基因多态性分析、DNA甲基化分析和基因拷贝数分析.也可以是RNA水平的基因表达谱分析、微小RNA表达谱分析和蛋白表达水平的蛋白芯片分析等。

肿瘤分子分型的基础：目前可以在DNA、RNA和蛋白质水平上进行肿瘤分子分型的研究。在DNA水平，可以依据基因突变、基因组的细胞遗传学改变或甲基化差异进行分型。根据基因表达谱（RNA水平）的差异实施分型，是目前分子分型的研究主体，以表达谱芯片为基础的分子分型研究数据处理分二类：一是，unsupervised analysis；二是，supervised analysis。在蛋白质水平，可以根据蛋白质表达谱的差异，亚细胞结构蛋白组成的不同或蛋白质翻译后修饰的改变来进行分型。

分子分型的研究方法主要有：基因表达谱芯片技术：它可以同时观察成千上万个基因在不同个体、不同组织、不同发育阶段的表达状况。它的原理是在已建立的cDNA或寡核苷酸组成的芯片或微陈列上，用不同颜色荧光标记的cDNA制备的探针与之杂交，扫描及计算机处理所得的信号就代表了样品中基因的转录表达情况。基因芯片技术在肿瘤的分子分型、基因功能、信号通路及代谢与调控途径研究等方面有显著的优势；比较基因组杂交（CGH）技术：是在染色体荧光原位杂交基础上发展起来的一种新的分子细胞遗传学研究技术。它主要是用不同的荧光体系来标记肿瘤组织DNA和正常对照DNA，与正常中期分裂象染色体进行竞争性抑制杂交，荧光信号摄取及软件分析所得的比值可判断染色体区段的扩增、缺失还是正常。它仅需少量肿瘤组织DNA即可在整个基因组水平研究不同基因组间DNA拷贝数差异，并将这些异常定位在染色体上。CGH与微芯片技术结合的芯片CGH，以cDNA作为杂交靶，可使得基因组水平遗传物质异常的分辨率达到几十个kb，并可对关键基因改变进行精细定位；蛋白芯片技术：基因突变和基因表达差异不一定导致相应的蛋白表达，而且蛋白质还存在磷酸化，乙酰化等复杂的翻译后修饰过程，这些改变在转录水平上是无法检测的。以高通量结合生物信息学为特点的蛋白质组学分析技术可以从细胞整体水平上检测到这种变化，为肿瘤分子分型以及治疗标志物的筛选带来巨大的便利与可能。蛋白芯片技术主要包括双向凝胶电泳技术、质谱技术以及生物信息学技术。

篇7

【关键词】组合数学 教学方法 生物医学 生物信息学

【中图分类号】G64 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2015）09-0132-02

伴随着信息时代的来临，特别是生物医学科学研究的迅猛发展，尤其是生物信息学这门科学的出现使得原来的生物医学研究向低通量的临床数据转向高通量分子生物学数据。组合数学作为一门应用性较强的数学分支，在生物医学中的应用广泛，面对多因素高通量的生物医学问题，增加高等学校，特别是生物信息学专业学生的组合数学知识，培养他们运用组合数学方法分析和解决生物医药科学问题的能力已经成为必要。如何在教学过程中提高学生学习组合数学的兴趣，建立组合数学的逻辑思维用于解决医学问题是我们教育工作者需要思考的问题。

一、高等学校组合数学的特点及教学现状

组合数学是一门研究离散对象的科学，在计算机科学、信息科学中具有重要的地位，是理科及工科院校的一门必修课，随着现代生物医学的日益发展，组合数学的重要性也日渐凸显。组合数学对于生物医学专业基础课有着直接的衍射作用。目前，部分开设组合数学课程的生物高等学校的主要面向生物信息学、统计学等等专业开设，讲授学时30到60学时。在大部分生物高等学校并没有该类课程的设置，也是导致高等学校组合数学教师队伍的匮乏的主要原因。而且目前组合数学授课考核形式也比较单一。组合数学主要是以理论授课形式为主的教学方式，考试成绩是考核学生的唯一标准，忽视了学生在学习过程中的考核。信息时代学科的交叉发展体现在组合数学在各个学科中不可替代的作用，因此提高生物高等学校学生的组合数学学习兴趣，培养他们运用组合数学的能力是目前迫切需要解决的问题。

二、改进组合数学教学措施，提高学生兴趣

（一）更新教学内容，改进教学方法

目前的组合数学内容主要有： 鸽巢原理、排列与组合、容斥原理、递推关系、生成函数等基本的组合数学知识及其在数学中的应用。为了让学生在有限的学时内学完必要的知识，更新和精选教学内容显得尤为必要，将以组合数学内容为主导的教学模式改进成以生物医学问题为导向的教学模式。由于面向医学专业的特殊性，从内容上应着重选择与医学知识联系紧密的内容，采取精讲和略讲相结合的方式。根据不同专业背景更新组合数学的教学内容往往能够起到事半功倍的效果。以下是我们在讲解排列与组合一章时的一个教学实例：“生物遗传信息是由DNA分子中4个碱基核苷酸就像电报密码似的以不同的排列顺序记录下来，它载着人类的全部基因或全部遗传信息，人的DNA约有30亿（3×109） 碱基对，按照排列的思想可知人类基因组可能的排列方式有N=4■=（4■）■≈（1.52）■种，然而人类仅从这无穷多的方式中选了一种作为全人类共同的遗传密码，可见我们的基因组是祖先们留给人类的最宝贵的财富！”。这样的实例教学不仅可以让学生熟悉课堂知识，还能让学生对所学的知识进行综合的运用，更重要的与生物医学问题的结合提高了学生的学习兴趣。通过兴趣小组讨论学习提高学生自主学习的主动性，变被动学习为主动学习，充分调动学生学习组合数学的兴趣，从而充分发挥学生学习的主观能动性。

（二）加强多媒体辅助教学，提高学生学习兴趣

组合数学传统的授课方式是在黑板上将定义、定理的内容进行逐步严密的推导证明，这在一定程度上让学生紧跟授课教师的思维和建立学生的逻辑思考能力。然而随着多媒体技术的不断进步，利用多媒体和板书相结合的策略成为下一阶段组合数学教学模式的主要教学手段。对于繁琐的定理公式例如容斥原理避免推导证明，结合多媒体的几何图形使学生更加直观的理解和应用。以我们在教授容斥原理时的一个实例，容斥原理的根本思想是将难的问题分解成若干简单问题，通过间接计数来解决直接计数不容易解决的问题，我们用多媒体幻灯片分别展示两集合和三集合的容斥原理（图1A和B），并按照容斥原理的逻辑顺序利用多媒体动画技术控制每一部分的出现顺序，不仅避免了大量繁重枯燥的板书推导，最重要的是图形式教学可以帮助学生对容斥原理建立更直观的理解。可见在组合数学的教学过程多媒体的充分利用可以起到事半功倍的效果。

图1 多媒体在组合数学教学中的应用――容斥原理实例

（三）增设组合数学实验课，培养学生创新性思维

组合数学除了基本理论课之外还应该开设适当的实验课，在实验课上让学生自己动手解决一些与生物医学有关的实际问题。通过让学生自己编程实现排列组合的算法，不仅可以增进学生对排列与组合的深入认识，也能够培养学生利用排列组合思想解决实际问题的能力。以下是我们的一个实验教学实例：“任选一种排列生成算法，编程实现自动生成n个（如n=6）不同元素中取r个元素的排列，并输出指定任意n和r的所有排列。”，不仅让学生掌握了课堂上讲解的排列原理，还锻炼了编程能力，初步体验了科研的乐趣，由消极的被动学习升级为积极的主动学习。可见通过组合数学实验课更能培养学生自己动手自己学习的能力，进一步激发学生的创新性思维。

（四）精挑细选课后练习，培养学生独立解决问题的能力

组合数学作为一门应用性较强的数学课，需要学生掌握其在生物医学领域的应用，这就必须加强组合数学课堂后练习。因此习题是组合数学课程重要的教学环节，也是理论教学必不可少的补充。然而习题课并不意味着单纯地大量做题，教师应根据课堂内容，精挑细选出质量比较高的少量题目，供学生课余时间认真研究，要在习题中体现组合数学的知识点，激发学生独立给出解决问题的新观点和新方法。设置习题时，应以问题为导向，即给定一个实际的有兴趣的问题，让学生利用所学的组合数学理论进行解决，进一步加强学生对知识细节的理解和掌握，并让学生举一反三熟练掌握所学内容，使学生的理解更加深刻。如我们在教学过程中的一个课后习题实例：“一位国际象棋大师有11周的时间备战一场锦标赛，他决定每天至少下一盘棋，但是为了使自己不过分疲劳他还决定在每周不能下棋超过12盘。证明存在连续若干天，期间这位大师恰好下了21盘棋。”，该实例引起了学生在课余时间学习组合数学的一个热潮。

总之，面对高等学校生物信息学学生的专业特点，传统的单一的纯理论的组合数学教学方法已经不再适用。应该考虑改进教学内容和方法，发挥学生学习的主观能动性，使学生在快乐进取的氛围里学习组合数学，具体的教学内容和教学方法的改进仍有待教学工作者进一步探讨和研究。

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作者简介：

刘洪波（1983-），男，汉族，山东德州人，博士，讲师，主要研究方向：生物信息学，计算表观遗传学。

王芳（1982-），女，汉族，吉林松原人，博士，副教授，主要研究方向：生物信息学，计算表观遗传学。

篇8

[关键词] DNA甲基化；5'-Aza-CdR；HT-29；LoVo；Wif-1基因

[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）08（b）-0016-06

Effect of 5-Aza-dC on mRNA expression， protein expression and methylation of Wif-1 gene status in HT-29 and LoVo Colorectal cancer

GE Chang XU Chunwei WANG Luping FANG Yuan ZHANG Yuping

Department of Pathology， the Military General Hospital of Beijing PLA， Beijing 100700， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine （5-Aza-dC）， a methylation inhibitor， on the mRNA expression， protein expression of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines. Methods HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines was treated with different dosages of 5-Aza-dC. Wif-1 gene DNA， mRNA and protein were determined by Methylight， SYBR Green PCR and Western blot respectively. HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines were treated with different dosages of 5-Aza-dC （0.5， 1.0， 1.5 μmol/L）. Wif-1 gene DNA， mRNA and protein were determined by Methylight， SYBR Green PCR and Western blot respectively. Results Methylight detection showed that the Wif-1 gene methylation had effectively been reverserd by 5-Aza-dC. Moreover， the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-dC increased respectively in HT-29 Colorectal cell line[（1.000±0.000）， （1.207±0.052）， （1.790±0.033）， （2.016±0.123）]， and the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-Dc increased respectively in LoVo Colorectal cell line [（1.000±0.000）， （1.294±0.048）， （1.893±0.061）， （2.204±0.041）]. Western blot indicated that 5-Aza-dC could recover the Wif-1 protein expression respectively in HT-29 Colorectal cell line [（0.456±0.040）， （0.511±0.025）， （0.857±0.031）， （0.934±0.047）]， and the protein expression was （0.842±0.032）， （0.844±0.044）， （0.854±0.037）， （0.856±0.034）， respectively in LoVo Colorectal cell line. The Wif-1 gene mRNA effects within certain extent dose and time dependent with statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line （F=144.823， P=0.000） and LoVo Colorectal cancer line （F=476.195， P=0.000）， and the Wif-1 protein effects within certain extent dose and time dependent with statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line （F=129.674， P=0.000）， but without statistical significance in LoVo Colorectal cancer line （F=0.117， P=0.948）. Conclusion The methylation of promoter region is a main cause for transcriptional inactivation of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines. 5-Aza-dC may effectively reactivate the gene transcription through a demethylation role.

[Key words] DNA methylation； 5-Aza-dC； HT-29； LoVo； Wif-1 gene

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）作为最常见恶性肿瘤之一，其发病率仅位于肺癌和前列腺癌（女性为乳腺癌）之后，居第3位，而每年CRC病死率约占全部恶性肿瘤死亡总人数的8%，在恶性肿瘤死因中居第4位[1]。CRC的发生与发展与癌基因和抑癌基因的缺失、扩增或突变有关。有些基因在染色质水平上发生表型遗传修饰改变也会导致表达下调。表型遗传修饰最多见的是CpG岛（CpG island）的甲基化改变。Wif-1基因（Wnt inhibitory factor-1）定位于人类染色体12q14.3上，由10个外显子组成，全长约200 kb。Wnt/β-catenin信号传导通路是调控细胞生长增殖的重要途径之一，其异常激活已发现与多种人类肿瘤密切相关[2]。Wif-1基因是这条通路的下游区基因也是这条通路的拮抗基因。Wif-1基因的高甲基化在多种肿瘤中都已证实是存在的，它作为一种肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene，TSG），其启动子的高甲基化参与了肿瘤的发生发展。本实验通过研究5'-氮杂-2'-脱氧胞苷（5'-Aza-CdR）对HT-29和LoVo细胞株作用后Wif-1基因的DNA层面、mRNA层面和蛋白层面的改变，探讨肿瘤发生发展过程中Wif-1基因失活的甲基化机制及药物恢复Wif-1基因表达的可能性，以期寻找CRC的肿瘤标志物及新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

结直肠癌细胞株HT-29和LoVo（北京大学医学部107实验室）；DNA提取试剂盒（德国QIAGEN公司）；核酸蛋白质浓度测量仪B-500（上海创萌生物科技有限公司），DNA甲基化修饰试剂盒及甲基化阳性/阴性对照（美国ZYMO公司）；qPCR反应试剂ROX（TaKaRa公司）；Mix（上海辉睿生物科技有限公司）；Mx3000P定量PCR扩增仪（美国Stratagene公司）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；5'-Aza-CdR（美国Sigma公司），以DMSO溶剂充分溶解后配制成0.1 μmol/L的母液，分装后-80℃保存；Wif-1和内参β-actin（美国Santa Cruz公司），Western blot相关试剂（北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 细胞培养和干预

结直肠癌细胞株HT-29和LoVo置于10%胎牛血清和100 μ/mL青霉素、链霉素的RPMI1640的培养基中常规培养，胰酶消化传代。取贴壁生长良好的细胞以RPMI1640调整细胞密度至2×106/mL，接种于六孔培养板。干预的LoVo和HT-29细胞分别加入0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR混合培养液，每24小时更换新鲜培养基，连续作用72 h；以HT-29和LoVo分别加入等量DMSO溶剂培养作为对照（0 μmol/L）。

1.3 Methylight方法

取对数生长期的HT-29和LoVo细胞株，胰酶消化后抽提DNA。抽提DNA按DNA提取试剂盒（德国QIAGEN公司）说明提取上述两种细胞不同浓度梯度的细胞DNA，用紫外分光光度仪（上海创萌生物科技有限公司）测DNA浓度，以DNA浓度在25 ng/μL为最低浓度，使用DNA修饰试剂盒进行亚硫酸氢盐修饰，按照试剂盒说明书操作，Wif-1基因甲基化引物和探针设计：Wif-1基因序列参照GenBank。甲基化引物和探针由Beacon Designer 7.9软件设计，其引物序列上游引物：5'-TAAACGGGAATAGTTTTGGTTGAGG-3'；下游引物：5'- TACTACTCAAAACCTCCTCCTCGCTAC-3'；探针：FAM 5'- CTCCTCGTACCGCACCTACGCAACCTA-3' BHQ1，内参β-actin基因甲基化按文献[3]设计，上游引物：5'-TGGTCATC CAGGTTTAGTAACT-3'，下游引物：5'-AACCAATAAAC CTACTCCTCCCTTAA-3'，探针：FAM 5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3'BHQ1。PCR反应总体系为20 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL；修饰后的DNA模板2 μL；上、下游引物各1 μL（10 pmol）；探针FAM 0.4 μL（10 pmol）；ROX 0.3 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，共50个循环；72℃延伸5 min，4℃冷却5 min。经亚硫酸氢盐修饰的Human Methylated & Non-methylated DNA Set作为阳性、阴性对照，水为空白对照。

1.4 实时荧光定量PCR分析结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因mRNA的表达情况

取对数生长期的HT-29和LoVo细胞，胰酶消化后抽提细胞总RNA，逆转录合成cDNA，行实时荧光定量PCR。Wif-1引物由Primer Premier 5.0软件设计，上游引物：5'- GTTCCACGGACCTCACT-3'，下游引物：5'-ATGTCGGAGTTCACCAGA-3'；内参基因GAPDH上游引物：5'-GGCTGCTTTTAACTCTGG-3'，下游引物：5'-GGAGGGATCTCGCTCC-3'。20 Μl PCR反应体系含10 μL SYBR Premix Ex TaqTM（2×）、上、下游引物（10 μmol/L）各1、0.3 μL ROX Reference Dye（50×）、4.0 μL DNA模板、3.7 μL dH2O。反应条件为95℃预变性5 min；95℃ 10 s，55℃ 40 s，72℃ 45 s，共40个循环；72℃延伸1 min，70℃延伸30 s，95℃延伸30 s。实验重复3次，取均值。扩增完毕后分析熔解曲线，采用2-ΔΔCt法分析Wif-1 mRNA表达。ΔΔCt=（Ct处理组目的基因-Ct处理组内参基因）-（Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因）。

1.5 Western blot分析结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1蛋白的表达情况

取对数生长期的HT-29和LoVo细胞，在上述两种细胞株各个浓度梯度的每管细胞中加入80 μL蛋白裂解和1 μL蛋白酶抑制剂PMSF液于冰上裂解30 min。15 000 r/min 37℃离心，10 min后取上清液提取总蛋白，BCA法蛋白定量。总蛋白100℃变性5 min后，配制浓度为12%的SDS-PAGE凝胶，进行蛋白质电泳，蛋白电泳分离后经电转移槽转移至PVDF膜。BSA室温封闭2 h后，PVDF膜置于1∶200稀释的Wif-1单克隆抗体稀释液中4℃冰箱内培养过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，再置于1∶20 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG稀释液中37℃培养2 h，TBST洗膜4次，每次10 min，然后加入ECL发光液显影，采集并分析处理图像。凝胶成像系统摄像并分析各条带吸光度值，以0.5 μmol/L 5'-Aza-CdR条带吸光度值（A）/β-actin条带吸光度值（A）为基准，设置为1。以目的基因条带吸光度值（A）/β-actin条带吸光度值（A）作为Wif-1蛋白的相对表达强度。实验重复3次，取其平均值。

1.6 MethyLight结果判断标准

同时扩增目的基因（Wif-1）和内参基因（β-actin），根据标准曲线得到两者的原始拷贝数，计算标准甲基化指数（the normalized index of methylation，NIM）。其定义为：NIM=[（Wif-1 sample/Wif-1 positive）/（β-actin sample/β-actin positive）]×100，其中Wif-1 sample指样本中甲基化Wif-1基因的拷贝数，Wif-1 positive指阳性对照中甲基化Wif-1基因的拷贝数，β-actin sample指样本中甲基化Wif-1基因的拷贝数，β-actin positve指阳性对照中甲基化Wif-1基因的拷贝数。NIM≥4为甲基化，NIM

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），行配对t检验，并设定P值为双侧分布，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因甲基化状况

将阳性对照按10的倍数稀释成1×100～1×10-6 7个浓度梯度制作标准曲线（其拷贝数为103～109/mL）。各浓度梯度反应均做复孔。MethyLight的线性范围为104～108拷贝/mL，R2为0.907。实时荧光定量PCR得出数据按MethyLight结果判断标准，在DMSO对照组、0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR中HT-29和LoVo细胞株中Wif-1基因甲基化状态分别为甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化。见表1、图1。

表1 HT-29和LoVo细胞株中Wif-1基因甲基化状况

2.2 结直肠癌细胞株LoVo和HT-29中Wif-1基因mRNA表达状况

实时荧光定量PCR得出的数据检验扩增效率（E）通过公式E=2-1/斜率-1计算，Wif-1基因mRNA为0.945，GAPDH基因mRNA为0.977，两个基因的扩增效率相差

表2 HT-29和LoVo细胞株中Wif-1基因mRNA表达状况（x±s）

注：与DMSO对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01

2.3结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1蛋白表达状况

Western blot结果运用Image J软件进行条带图像分析，获得HT-29和LoVo细胞株各条带光密度值，并计算出两种细胞在各组中的平均光密度比值，进行半定量分析及统计学分析，并以各实验分组为横坐标，将测出相应的平均光密度比值为纵坐标，绘出柱状图后发现0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29细胞株中Wif-1蛋白表达水平较DMSO对照组上调，并且有药物浓度依赖性（F=129.674，P=0.000），与DMSO对照组比较，1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组比较，差异均有统计学意义（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo细胞株中Wif-1基因的蛋白表达水平较DMSO对照组略微上调，并且有药物浓度依赖性但差异无统计学意义（F=0.117，P=0.948），与DMSO对照组比较，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组差异均有高度统计学意义（t = 19.414，P = 0.003；t = 30.468，P = 0.001；t = 102.233，P = 0.000）。见表3、图3。

表3 HT-29和LoVo细胞株中Wif-1蛋白表达状况（x±s）

注：与DMSO对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01

A：DMSO对照组，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组中HT-29细胞株Wif-1蛋白Westernblot条带图；B：DMSO对照组，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组中HT-29细胞株Wif-1蛋白柱状图；C：DMSO对照组，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组中LoVo细胞株Wif-1蛋白Westernblot条带图；D：DMSO对照组，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组中LoVo细胞株Wif-1蛋白柱状图

图3 各组HT-29细胞株及LoVo细胞株Wif-1蛋白表达

3讨论

CRC是最常见的消化道恶性肿瘤之一，每年全球新发病例达123万，病死率约为发病率的1/2。我国CRC发病率虽低于西方发达国家，但近20年来CRC的发病率仍在逐渐上升，同时，其发病年龄有增高趋势。近年研究表明CRC的发病是多因素、多阶段、多基因连续累积发生的过程，除遗传学改变外，表观遗传学改变亦参与CRC的发生、发展过程。表观遗传学是指不涉及DNA序列改变，但基因表达却发生可遗传的改变，DNA甲基化、组蛋白修饰、MicroRNA等是表观遗传学的主要形式。与肿瘤发生关系最密切的是DNA甲基化修饰异常，其中包括基因组去甲基化及部分区域高度甲基化两种形式。DNA甲基化可以导致癌相关基因沉默，病变迅速进展为癌。CRC有若干高度甲基化基因，若能认识CRC中基因异常DNA甲基化，将可能获得CRC诊断的肿瘤标志物及新的治疗靶点[5-7]。

经典Wnt/β-catenin信号通路发现迄今已数十年，作为一条高度保守的信号通路在动物胚胎的器官发育各个阶段均发挥异常重要的作用。Wif-1基因是Wnt/β-catenin信号传导通路的拮抗基因之一，属SFRP拮抗家族，在种族间高度保守，最早在人类视网膜中发现[8]。它主要通过捆绑Wnt信号蛋白，阻止其与Frizzled受体相互作用，从而抑制通路的异常激活。Nosho等[9]的研究发现，在早期CRC中伴有Wif-1表达的下调，可能通过引起经典Wnt/β-catenin信号通路的激活，导致通路下游靶基因的过度表达，伴随细胞过度的增殖和失控的分化从而引起肿瘤的发生。表观遗传学改变如基因5′端CpG岛甲基化是Wif-1基因失活的重要机制。已有一系列研究证实在各系统肿瘤中，启动子区甲基化可引起Wif-1基因失活[10-12]。在CRC中，Taniguchi等[13]和Lee等[14]的研究显示，Wif-1启动子区的甲基化率都很高，分别为82.0%和74%。齐健等[15]的研究结果与国外基本一致，Wif-1甲基化率为84.7%。Wif-1基因的启动子中存在T细胞相关因子（T cell factor，TCF）的反应元件[11]，而TCF是目前已知的Wnt通路中重要的核内靶因子，Wnt信号活化可使β-catenin在胞浆内累积并进入核内识别淋巴结增强因子/T细胞相关因子（lymphoid enhancer factor/T cell factor，LEF/TCF）等转录因子，激活Wnt信号的靶基因，控制胚胎发育及细胞生长、分化及凋亡等。Kansara等[16]和Chung等[17]的研究结果显示，Wnt拮抗物的高甲基化可以增加β-catenin在细胞质中的积聚及经典Wnt/β-catenin信号通路的激活。

本实验研究中笔者采用去甲基化药物5'-Aza-CdR处理两个结直肠癌细胞株：MSS细胞株HT-29和MSI细胞株LoVo后通过实时荧光定量PCR检测，笔者发现DNA层面上DMSO对照组，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-Aza-dCR中HT-29细胞株中Wif-1基因甲基化状态分别为甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化，LoVo细胞株中Wif-1基因甲基化状态都为未甲基化，说明去甲基化药物5′-Aza-CdR能够逆转Wif-1基因甲基化状态，同时在mRNA层面上笔者发现在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29细胞株中Wif-1基因的mRNA表达水平较DMSO对照组上调，并且有时间、药物浓度依赖性（F=144.823，P=0.000），与DMSO对照组比较，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差异均有统计学意义（t=6.945，P=0.020；t=41.629，P=0.001；t=14.262，P=0.005）；LoVo细胞株中Wif-1基因的mRNA表达水平较DMSO对照组上调，并且有时间、药物浓度依赖性（F=476.195，P=0.000），与DMSO对照组比较，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差异均有高度统计学意义（t=10.656，P=0.009；t=25.486，P=0.002；t=51.323，P=0.000）。最后通过Western blot在蛋白层面上发现在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29细胞株中Wif-1蛋白表达水平较DMSO对照组上调，并且有时间、药物浓度依赖性（F=129.674，P=0.000），与DMSO对照组比较，1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组比较，差异均有统计学意义（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo细胞株中Wif-1基因的蛋白表达水平较DMSO对照组略微上调，并且有药物浓度依赖性但差异无统计学意义（F=0.117，P=0.948），与DMSO对照组比较，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组差异均有高度统计学意义（t=19.414，P=0.003；t=30.468，P=0.001；t=102.233，P=0.000）。

本实验研究显示甲基化酶抑制剂5′-aza-dC可通过启动子甲基化而失活的Wif-1基因的异常甲基化状态得到逆转，而使该抑癌基因恢复其转录活性，以使该基因在肿瘤的发生发展中发挥可能的抑制肿瘤的作用。肿瘤的发生发展涉及多种途径和多种基因的改变，其中表观遗传学的变化逐渐受到医学研究的重视。异常甲基化是表观遗传学研究的一个重要内容，往往是导致抑癌基因失活的主要原因。本研究希望能通过对异常甲基化的进一步研究，来寻求结直肠肿瘤诊断的新标志物和治疗的新靶点。

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篇9

宋慧慧，鲍文，陆祖宏

【摘要】 目的：研究p16基因在K562/A02细胞株的表达情况及其与耐药的关系。方法：用PCR法对慢性髓系白血病细胞株K562及其耐药细胞株K562/A02进行p16基因缺失检测。结果：K562及K562/A02细胞株经PCR扩增后，均未扩出相应条带。结论：K562/A02细胞株与K562细胞株一样，均表现为p16基因缺失。

【关键词】 p16基因； K562细胞株； K562/A02细胞株； 表达； 缺失

肿瘤的发生、发展是一个多步骤的过程，其中抑癌基因的失活扮演了重要角色。抑癌基因的失活可以通过多种途径，如缺失、突变、启动子区域的异常甲基化等。p16基因是1994年由Kamb等［1］发现的多种肿瘤抑制基因（multiple tumor suppressor gene，MTS1），在细胞增殖周期调控中发挥重要的作用。p16的失活与多种血液系统恶性疾病有着密切的关系，失活的主要方式包括基因缺失、点突变、甲基化、基因重排等。Quesnel等［2］报道了p16基因在K562细胞株中是缺失的，而p16基因在K562的耐药细胞株K562/A02中的表达情况目前尚未见报道。本试验拟研究p16基因在K562/A02细胞株的表达情况及其与耐药的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

K562细胞株购自上海细胞生物研究所，用RPMI1640培养基（Gibco公司产品）加10％胎牛血清(杭州四季青公司产品)，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养，48h传代1次，培养中的细胞均保持在(0.1～0.5)×106 ml-1的密度。K562／A02细胞株系K562细胞株经阿霉素(ADM)逐步诱导形成，由中国医学科学院血液学研究所提供，培养及传代过程同K562细胞株。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 实验用细胞为对数生长期细胞，用酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，TE溶解，经紫外分光光度计定量，-20℃保存备用。

1.2.2 PCR引物 根据p16基因的核酸序列自行设计，由上海生工生物工程公司合成。引物序列:上游5′-AAAGAGGAGGGGTTGGTTGGTTATTA-3′，下游5′-TACCTGATTCCAATTCCCCTGCAAACT-3′，β-Globin基因扩增产物为664bp。若扩增出内参照片段而无目的片段，则判为基因缺失。扩增条件:反应体系30μl，其中含10倍PCR缓冲液3μl，Mg2+1.6 mmol·L-1，dNTPs 200μmol· L-1，引物各 1μmol·L-1，模板DNA1μl，Taq DNA 聚合酶 2U。PCR在Gene Amp2400PCR 系统上进行:于95℃预变性5min;95℃变性60s，62℃退火60s，72℃延伸30s，共30 个循环。

1.2.3 电泳观察 PCR扩增结束后取5μl PCR产物与1μl电泳上样缓冲液混合后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，条件为200V电泳15min，在凝胶成像系统(Syngene，Gene Genius)观察PCR结果。

2 结

果

如图1，从左往右（1～4）依次为对照组（正常人外周血DNA）、Marker、K562细胞株DNA、K562/A02细胞株DNA。显示对照组可扩出内参条带（664bp）及p16基因条带（320bp），K562细胞株和K562/A02细胞株均扩出内参条带而无p16基因条带，证实K562与 K562/A02细胞株均为p16基因表达缺失。

3 讨

论

p16基因位于人染色体9P21区，全长8.5kb，编码1个含156个氨基酸残基、相对分子质量为15800的蛋白产物，即P16蛋白，它是细胞周期依赖性激酶(CDK)的抑制蛋白。正常情况下P16蛋白与细胞周期蛋白D（Cyclin D）竞争结合CDK4、CDK6，抑制两者的活化，未活化的CDK4、CDK6不能解除视网膜母细胞瘤蛋白(pRB)对转录因子的抑制，从而阻止细胞从G1期进入S期，抑制DNA的合成和细胞增殖。当P16蛋白丢失时，Cyclin D和CDK4、CDK6结合就会增多，使肿瘤细胞逃避负性调控，成为恶性生长的重要环节［3］ 。

p16抑癌基因是细胞周期调节RB途径中重要的成分，也是该途径受到损害时最易发生遗传学改变的基因之一。在血液系统肿瘤中，p16基因主要在淋巴系统肿瘤中发生改变，在急性淋巴细胞白血病(ALL)特别是儿童ALL中p16基因的缺失可达26％～75％，在急性髓系白血病（AML）中缺失率很低，在慢性髓细胞白血病原始细胞危象期特别是原始淋巴细胞危象期时缺失率可达35％［4］。

目前血液系统恶性疾病的治疗以化疗为主，但是原发性或获得性耐药仍然是影响化疗效果的重要因素。近年来越来越多的证据证明，肿瘤的耐药不仅与肿瘤基因的扩增、易位、缺失、突变有关，而且与表观遗传学改变也有着密切的关系。表观遗传学最常见的改变就是启动子区域的CpG岛甲基化状态的改变，很多抑癌基因启动子的异常甲基化所致的基因沉默亦可以导致耐药的产生。此外一些促进药物外排基因的甲基化异常也可以诱导产生耐药。

转贴于

多药耐药（multidrug resistance，MDR）是化疗失败的主要原因之一，7号染色体上MDR1编码的P-糖蛋白表达增强是MDR的主要机制之一。MDR1基因启动子区域因富含胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G），故根据Gardiner-Garden 的定义属于CpG岛。1997年Kusaba等［5］率先提出甲基化可能是调控MDR1基因表达的开关，他们将携带有人MDR1基因的酵母人工染色体转染至小鼠细胞中，用长春新碱诱导成耐药株，与敏感株比较，耐药株的MDR1基因选择性表达增高，同时该基因的5′端呈现低甲基化状态，推测用化疗药物后MDR1基因编码的P-糖蛋白表达增高可能与该基因的5′启动子区或其它区域的去甲基化状态有关。

一些药物转运相关基因启动子的甲基化可以阻碍化疗药物在肿瘤细胞中聚集，从而降低肿瘤细胞中的药物浓度。如编码还原型叶酸转运体基因启动子的甲基化可以阻碍乳腺癌细胞对氨甲喋呤(MTX)的聚集［6］。Nakayama等［7］对AML的MDR1基因甲基化进行研究，发现MDR1基因表达和启动子5′末端甲基化状态间存在负相关。朱燕等［8］发现ALL及多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓MDR1基因表达水平与基因转录起始点上游-110和150处两个CCGG位点的甲基化程度呈负相关。

Lu等［9］在对206名卵巢癌患者MDR1表达的研究中发现，MDR1的表达与p16有着密切的关系。有文献表明，p53基因突变后肿瘤细胞凋亡受阻，导致对化疗药物敏感性减低［10］。

本试验采用PCR法检测到K562阿霉素耐药株K562/A02的p16基因表达缺失，同时检测了K562细胞株p16基因表达情况，证实了其p16基因也表达缺失，与文献报道［11］一致。K562和K562/A02细胞株p16基因缺失是否与其过度甲基化有关，与耐药又是否存在关联，值得进一步试验和探讨。

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篇10

[关键词] 细胞外基质；间质毛细血管；肾纤维化；巨噬细胞；成纤维细胞

[中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）03（a）-0045-04

The cellular and molecular basis of renal fibrosis

XIAO Chengcheng ZHANG Jie

Department of Urology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] The destruction of normal kidney parenchyma caused by fibrosis is a common cause of chronic kidney disease. Understanding the pathogenesis of renal interstitial fibrosis can provide a better treatment option for chronic kidney disease. Although complex， it can be mainly summarized as the following four aspects： ①Interstitial inflammatory reaction， which participates in the pathogenesis and repair process. ②Myofibroblast mainly derived from the renal interstitial cells （fibroblasts） forms a unique cell mass， which participates in the formation of extracellular matrix （ECM） and interstitial scars. ③Renal tubular epithelial cells participate in early kidney injury， and in the late kidney injury， they become the victim of fibrosis for the loss of the regenerative ability. ④The damaged integrity of interstitial capillaries results in the disruption of oxygen transport， and the incidence of a malignant cascade of hypoxia and oxidative stress aggravates renal injury and fibrosis. Due to the lack of sufficient blood vessel formation， the healthy capillary network can not be maintained. The importance of genetic and epigenetic factors has also been paid more attention. The incidence and development of cardiac syndrome is closely related to the high morbidity and mortality of renal fibrosis.

[Key words] Extracellular matrix； Interstitial capillaries； Renal fibrosis； Macrophages； Fibroblasts

慢性肾脏病的高发病率给社会和患者家庭带来了沉重的经济负担。普遍认为纤维化造成的正常肾实质破坏是导致慢性肾脏病渐进性损伤的常见致病因素。尽管大量研究已发现导致纤维化的关键细胞和分子介质，但尚未得到临床验证[1-4]。目前13%～16%的慢性肾脏病患者需行血液透析治疗，远期他们可能需进行肾移植治疗，而慢性肾脏病所致的心血管疾病高患病风险更使患者生存率明显降低[5]。基础科学研究的快速发展为研究新的治疗方法提供了平台。参与纤维化主要介质的发现，更为靶向治疗的发展打下基础。本文对肾纤维化的细胞和分子基础进行综述，为基础研究及临床工作提供参考。

1 肾纤维化的细胞与分子介质

1.1 炎性细胞

慢性肾疾病的共同特点是巨噬细胞参与的间质浸润，其密度与移植肾存活率呈负相关[1]。在不同环境下，巨噬细胞可合成和分泌多种产物，包括生长因子和细胞因子[转化生长因子β（TGF-β）、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子-α、γ-干扰素、肝细胞生长因子]，酶及其抑制剂（血管紧张素转换酶、纤溶酶原激活因子、纤溶酶原激活物抑制物-1、胶原酶、基质金属蛋白酶组织抑制剂），基质蛋白（胶原蛋白、纤连蛋白、凝血酶敏感蛋白）和许多其他产物（补体蛋白、凝血因子、生物活性脂质、活性氧、一氧化氮、内皮素等）[6]。已有实验表明减少间质中巨噬细胞的数量可减轻肾纤维化程度[7]。

多功能巨噬细胞与组织潜在损伤的关系已被公认，其分子基础在过去十年的重要科学进展中已被阐明[8]。经典活化的M1型巨噬细胞与替代激活的M2型巨噬细胞来源于局部刺激下暴露的单核细胞。诱导M1型巨噬细胞形成的主要是γ-干扰素、脂多糖、肿瘤坏死因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，主要与组织损伤相关；而白细胞介素（IL）-4、IL-13、糖皮质激素、维生素D、巨噬细胞集落刺激因子和TGF-β诱导M2型巨噬细胞形成，其可能促进组织损伤的修复。当务之急是确定两者之间的微妙联系。这依赖于基因、蛋白质和代谢分析研究。例如Ⅰ型甘露糖受体，精氨酸酶-1的出现将抑制M2细胞。在可逆性肝损伤模型中，巨噬细胞的功能已被阐明。损伤诱导期抑制巨噬细胞可减轻纤维化[9]。纤维化是伤口愈合的重要组成部分，但还需要进一步研究M2型巨噬细胞应答后修复形成的正常肾实质与导致慢性肾脏病的不良瘢痕的关系。这突出了体外介导巨噬细胞修复肾组织的治疗潜力，有待动物实验进一步证实[10]。

1.2 肌成纤维细胞

肌成纤维细胞是最开始出现在纤维化肾间质中的细胞群[2]，其出现是瘢痕形成必不可少的条件，已有研究表明，其数量与预后密切相关，其特征为由具有成纤维细胞形态特征的间质细胞所分泌的α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）。有研究证实肌成纤维细胞是瘢痕中基质蛋白的主要来源，这表明肌成纤维细胞的存在是纤维化必不可少的条件。肌成纤维细胞的来源已在动物模型中被广泛研究，但仍未达成共识。谱系追踪研究采用了遗传工程策略和不同的细胞追踪方法，最终出现了相悖的结果[2，11-13]。αSMA本身可能不是促进纤维化的蛋白，据报道，αSMA遗传缺陷的小鼠会发生更严重的肾纤维化[14]。最近的研究发现细胞亚群表达的甘露糖受体-2可降解细胞外基质[15]。不同细胞起源的肌成纤维细胞存在的功能异质性还有待探索。

大部分肌成纤维细胞来源于内源性肾细胞的迁移、增殖和转化。肾成纤维细胞和微血管管周细胞是原始肌纤维母细胞的主要来源[16]。当少量基质产生时，成纤维细胞也可来源于髓质细胞，然而在肾脏严重损害时，肾小管上皮细胞、内皮细胞也可以转分化为肌成纤维细胞，其总体数量较小，并持续存在至病程后期[17]。

1.3 肾小管上皮细胞

在慢性肾损伤诱导期，肾小管上皮细胞通过产生合成产物（活性氧、炎症介质等）主动参与损伤过程。多种来源于血浆或肾小球异常过滤的尿蛋白参与损害肾小管上皮细胞[3]。尿蛋白可以通过结合其相关受体激活特定的细胞反应。替代激活途径可被生化修饰或共轭尿白蛋白激活，包括近端小管受体介导蛋白的内吞作用和激活其受体具体信号的反应[18]。后一种途径与刺激炎症趋化因子（由正常T细胞表达和分泌所调节的单核细胞趋化蛋白-1、IL-8、趋化因子、TGF-β、内皮素）的合成有关。在何种程度上尿蛋白会激活肾小管上皮的细胞反应尚不清楚，但这可解释蛋白尿的程度与慢性炎症及纤维化密切相关这一无可争议的事实。

随着纤维化的进展，肾小管上皮细胞会加速凋亡和衰老，这使其失去再生能力。这一转变可能涉及细胞周期的多种具体因素，例如自噬失败、内质网应激、氧化应激和信号缺失等[19-21]。肾小管上皮细胞死亡是肾实质损害的重要特征，非功能性肾小管和肾小球的出现会导致严重的后果。肾小管上皮细胞的组织学指标与肾功能密切相关[22]。保护并再生功能性上皮细胞，维持肾单位的完整性和功能性是有效治疗慢性肾疾病不可或缺的组成部分。新一代测序技术已经揭示导致人类肾性营养不良的基因突变，如无翅型MMTV整合家族成员4，其为肾功能的再生研究奠定了坚实基础[23]。

1.4 间质毛细血管

肾脏代谢活动是高耗氧过程，已有研究对渐进性纤维化与缺氧所致的慢性肾脏病进行比较[4]。慢性肾损伤的早期，间质微血管通透性增加[24]。因此，当血浆蛋白如纤维蛋白原和白蛋白结合物漏入间质（肾毛细血管渗漏综合征）时，会发生炎症和纤维化反应。在慢性肾疾病中，致病的关键血浆蛋白尚未被确定，最可能是纤维蛋白，因为当肾间质中纤维蛋白减少时，αSMA含量会相应降低[25]。虽然许多慢性疾病的特点是血管过度增生，但慢性肾脏病却发生相反的变化――血管生成受阻，有效间质毛细血管数量显著下降。这使研究人员考虑使用血管生成因子或阻滞抗血管生成因子治疗慢性肾脏病，但在进行性肾瘢痕形成过程中，其作用被证实为无益的[26]。

缺氧-氧化应激与肾纤维化紧密相关。肾小管细胞氧化应激是慢性肾脏损伤的普遍特征，这可能是由于活性氧过度生成和抗氧化能力不足的后果。活性氧的特异性分子靶点对肾纤维化的作用还有待被探索，在将来我们可能会对其有更多的了解，因为代谢组学研究可以确定正常及纤维化肾脏中糖、核苷酸、氨基酸和脂类的具体分布。氧作为细胞信号分子的作用已被证实，也已证实其与纤维化途径有关[27]。高通量筛选技术的出现使通过改善受损肾脏氧化还原能力的治疗药物出现成为可能。最近有实验表明半胱胺具有抗肾纤维化的作用，其作用机制可能与减轻氧化应激反应有关[28]。

2 纤维化反应的遗传和表观遗传学调控

同类原发性肾脏病患者的长期预后存在高度差异性是公认的。毫无疑问，遗传学起着重要的作用，最好的例子是肾脏病结局与种族的相关差异性。非裔美国人载脂蛋白L1基因型（G1和G2的风险等位基因）与肾脏病预后密切相关，这是基因影响肾纤维化严重程度的最新例证[29]。

通过全基因组研究，探索慢性肾脏病的风险与严重程度的关系，尽管无法确定其因果关系，并且基因的多态性未必导致蛋白功能改变，但人类慢性肾脏病全基因组关联研究提供了鉴别新目标人群的无偏方法，其潜在作用值得进一步研究。在最近的几项人全基因组关联研究中，尿调节素（UMOD）被确定为慢性肾脏病的风险及严重程度的重要决定因素[30]。UMOD基因编码一N蛋白质，在亨利髓袢升支和早期远端小管特异表达。尽管目前UMOD的基本功能未知，但其在正常人尿液中含量很高，蛋白编码基因突变是以慢性肾小管间质肾炎为特点的家族性肾脏病的已知诱因。随着人类遗传研究水平的提高，我们可以预见，在慢性肾脏病遗传学领域将有重大突破。

非蛋白编码基因序列的改变也可能影响纤维化过程，其机制可能包括DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA活动等。这些机制都有改变肾纤维化进程的潜能，例如，在肾纤维化的实验模型中，使用去甲基化剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和抗miRNA-21治疗后，间质的肌成纤维细胞数目显著减少。此外，已有研究证据表明在一些患病动物和人类组织样本中，microRNA-21出现失调控[31-34]。反应性纤维化的表观遗传学调控为我们研究环境对基因调控通路的影响提供了新思路。

3 心肾综合征

大多数慢性肾脏病患者没有达到需要肾脏替代治疗维持生命的地步，但他们中很多却早卒于心血管疾病。慢性I脏病风险的上升与心功能衰竭的发生几乎呈指数级关系。在DuBose等[5]的一项研究中，eGFR60 mL/（min・1.73 m2）的人群高17倍。内皮细胞功能障碍、炎症、平滑肌细胞增殖、氧化应激、血管钙化等多种因素都可促进心肾综合征的发生。在减轻肾纤维化、高血压和/或蛋白尿的同时，也应减少心血管疾病的发生率和严重程度，提高患者的生存率。

在过去的20年中，基础科学研究提高了我们对纤维化细胞和分子基础的理解，使我们了解到正常结构和功能的肾通过纤维化逐渐转变为功能恶化的肾的过程。

尽管许多问题还有待解答，但我们必须从现在做起，将已有的研究成果转变成有效预防、治疗甚至治愈人类慢性肾疾病的策略。

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