微生物学进展范文
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篇1
论文关键词：微生物作用 地球化学 水力性质 生物修复
论文摘要：综述了地下含水层系统中微生物作用。引用研究实例论述了微生物作用不但可以改变地下水化学组分，而且还可以改变含水层的水力性质。微生物作用对地下水系统的影响程度主要受微生物代谢速度､水文地质条件､含水层岩性等多种因素控制。地下水系统中电子供体与电子受体间的丰度关系是影响微生物代谢速度的主要因素。在未污染的含水层中，电子供体的可用性限制了微生物的新陈代谢，而在人类活动污染的含水层中，微生物的新陈代谢受电子受体的可用性的限制。利用微生物作用可以降解地下水系统中氯代化溶剂､烃类､硝酸盐､有毒金属等多种化学污染物。并对今后的发展方向进行了探讨。
1 引 言
地下水系统具备了微生物生长发育所需的营养､水分､酸碱度､渗透压和温度等条件，为微生物提供了良好的生存场所。微生物(主要指各种细菌菌群，如异养菌､自养菌､好氧菌､厌氧菌等)成为地下水生态系统中主要生命组分，是地下水演化过程的重要影响因子，在地下水系统的能量转换､物质循环､营养输送､信息贮存以及元素形态的转化､聚集和迁移中微生物都起着极其重要的媒介作用。地下水化学性质的演变中微生物的控制和改造是其主要因素之一。
地下水系统是一个复杂综合体，包括了地下水流经的介质，地下水中各种物理化学成分和地表的天然通道等。加之人类对地下水的开发利用活动已经并将继续改变地下水环境，如地下水的污染､过量的开采以及其它流体矿产的开发等都对地下水系统的天然环境产生影响。环境因素的变化相应地也影响了地下水中生物的生存条件，导致微生物的形态､生理､遗传特性的改变，促使各类微生物不断演替。地下水系统中各种环境因素又是制约微生物生长､繁殖的重要因素。
地下水微生物学是地下水科学与微生物学紧密结合而形成的一门新兴学科，它将地下水视为一个有生命的系统加以研究，主要研究与认知微生物生命过程与地下水化学密切相关的科学问题，是研究微生物活动与地下水环境相互关系的科学，也就是探索微生物直接参与地下水化学形成演化过程的微生物地球化学作用，是地下水科学研究的前沿领域。
2 微生物作用改变地下水化学组成
早在1900年人们就发现未受污染时含有高浓度硫酸盐的地下水，受石油污染后却常常缺少溶解性硫酸盐。1917年Rogers首次提出这是硫酸盐还原菌新陈代谢的作用所致。这个假设在从受石油污染的水中分离出硫酸盐还原菌时得到证实。在以后的几十年里，很多学者对地下水化学组成的微生物影响作用进行研究后认为，微生物对地下水化学组成具有重要影响作用(Chapelle 2000)。如，钟佐燊(2001)研究认为，在石油烃污染的地下含水层中，如果发生了生物降解反应，则其水文地球化学标志是：水中溶解氧很微，NO-3和SO2- 4明显降低，Fe2+ 和HCO-3升高，出现HS-或H2S 和CH4。
地下水系统中电子供体与电子受体间的丰度关系是影响微生物代谢速度的主要因素。在未污染的含水层中，电子供体的可用性限制了微生物的新陈代谢，溶解性无机碳沿着含水层流动路径慢慢聚积，可用的电子受体依照溶解氧>硝酸盐>三价铁>硫酸盐>二氧化碳(甲烷生成)的次序不断被消耗。在人类活动污染的含水层中，常存在过剩的可用有机碳，电子受体的可用性限制微生物的新陈代谢。
美国南卡罗莱纳州Black Creek含水层是区域地下水化学类型变化受电子供体限制的很好例子。McMahon等(McMahon 1991a1991b，Chapelle 1990)对该系统进行详细研究后，描述了微生物作用对含水层地下水化学组成的影响。该水文地质单元，水流从补给区向下游150 km到排泄区，溶解性无机碳浓度从不到1 mM/L 增加到超过12 mM/L。由微生物代谢作用产生的溶解性无机碳促进了含水层中碳酸盐的溶解，根据公式：CaCO3 (碳酸盐)+CO2 (微生物)Ca2+ +2HCO-3计算得出，大约一半的溶解性无机碳来自微生物代谢作用(约6 mM)，有研究表明该地区地下水补给大约需要用15万a，由此推出，微生物代谢作用产生溶解性无机碳的速率约为10-4 mM/La。因此，尽管沿地下水流溶解性无机碳浓度增加很大，但微生物代谢速度很低(Chapelle 1990)。其主要原因是，含水层中可代谢的有机碳含量低。McMahon(1992)研究认为，Black Creek含水层中有机碳含量只占沉积物干重的0.1±1.0%。由于低速率的微生物代谢作用，系统中可用电子受体的量(O2､Fe3+､硫酸盐和CO2)相对有机碳来说是丰富的。
当地下水系统中可用有机碳的含量很高时，可用电子受体缺乏会限制微生物代谢作用。电子受体受限的含水层包括泥炭含水层(普遍在北半球)，石油储存地，和由人类活动引起化学污染的含水层。1979年美国明尼苏达州管道爆裂泄漏大约10万加仑的原油到一个冰水沉积含水层。泄漏时，由于与大气快速交换，以及含水层天然有机碳含量低，地下水呈饱和溶解氧状态(约10 mg/L)。随着可代谢碳的突然流入，油积聚在水面，氧被迅速消耗，并形成三价铁还原条件。泄漏后5年，在油透镜体附近含水层中氢氧化铁被耗尽，甲烷生成成为一个重要作用。这个受原油泄漏污染的浅层含水层是电子受体受限含水层最好例证之一(Baedecker 1993)。
由于原油泄漏电子供体过剩，在最接近污染源的Bemidji含水层，其水化学特征主要为甲烷生成环境，其次为硫酸盐还原，铁还原，和低溶解氧环境。该含水层与Black Creek 含水层的情况完全相反，Black Creek 含水层甲烷生成的地方远离补给区。而Bemidji含水层的硫酸盐相对较少，硫酸盐还原不是主要的作用。这种氧化还原作用的次序是电子受体受限的地下水系统的特征，常见于受石油烃污染的地下水系统。
3 微生物作用改变含水层水力性质
微生物作用除影响地下水化学组分以外，也影响地下水系统的物理性质。地质学家很早就知道在非孔隙岩中，次生孔隙能提高含水层的水力性质 ，还可以积聚石油。人们通过大量的同位素和质量平衡研究得出，有机物的去碳酸基和其它无机作用不能解释许多系统中的次生孔隙现象(Lundergard 1986)。由于大多数含水层系统中存在大量具有活性的不同微生物种群，微生物代谢作用引起人们的关注，大量研究表明微生物作用能引起硅酸盐和碳酸盐岩中次生孔隙产生(Bennett 1987，Chapelle 1988)。地下水中硫酸盐在有脱硫细菌参与和有机质存在的条件下发生还原反应而产生H2S(Na2SO4+2H2O+2C2NaHCO3+H2S)，这个反应有溶解硫酸盐的作用，反应产生的H2S 溶于水中也具有溶解碳酸盐等矿物的能力(李义军 2002)。
微生物作用除显著改变了Black Creek 含水层水化学组分外，也改变了这个含水层的水力性质。沿水流路径的岩心资料显示了一个显著的岩性变化。在补给区，不存在次生晶粒间的方解石胶结物。在补给区和排泄区的中间区域，南卡罗莱纳州莱克市常见方解石胶结物。在排泄区附近，南卡罗莱纳州莱克市Myrtle 海滩，50%的厚层含水层被晶粒间的方解石胶结。McMahon等研究了微生物作用引起Black Creek含水层孔隙的填充现象。该研究表明，Black Creek含水层的砂中含有机碳少，而相邻的狭窄的层中含有丰富的有机碳。隔水层有机碳的发酵使有机酸在隔水层孔隙水中积聚。有机酸扩散到Black Creek含水层，进而氧化为二氧化碳，引起大量的碳从隔水层迁移到含水层。二氧化碳同含水层物质反应产生碳酸盐和重碳酸盐。这个作用导致部分含水层次生孔隙产生。然而，当碳酸盐和重碳酸盐在溶液中积聚､运移，地下水的方解石变得过饱和时，就会在含水层的其它部位沉淀下来。由于丰富的晶粒间的方解石胶结物填充了含水层系统的主要孔隙，Black Creek含水层孔隙性减少，透水性降低，以至不能满足当地用水需求。
有实验表明，二氧化碳和有机酸的产物能增加矿物的溶解，引起次生孔隙性和渗透性的发展。而碳酸盐､铁和硫酸盐微生物产物能引起方解石或黄铁矿的沉淀，降低地下水系统的原生孔隙性和渗透性。也就是说，微生物既能破坏(Lundergard 1986)也能提高(Hiebert 199 McMahon 1995)含水层沉积物孔隙性。
4 污染修复中的微生物作用
现代社会产生了大量的化学产品，许多有毒有害的物质被人类有意或无意地投放到地下水系统中，地下水受到严重污染，地下水质量日益恶化。近年来，生物降解技术以其可在污染现场进行修复､可在难以处理的地方进行修复､在生物修复时不影响场地内正常生产､对污染地的干扰或破坏小､处理后的产物无二次污染､降解过程快､费用低等诸多优点受到世界各国环境科学界的广泛关注，激发了人们对污染修复中微生物作用的研究兴趣。
对污染地下水进行原位生物修复时，好氧微生物通过将有机化合物氧化成二氧化碳而获取能量，其中氧为电子受体，当地下存在氧时，好氧微生物可将有机污染物氧化成二氧化碳，从而使污染地下水净化。厌氧微生物也能将有机化合物氧化成二氧化碳，但其作用过程中的电子受体不是氧，而是以硝酸盐､硫酸盐或Fe3+等氧化物作为电子受体。由于许多受污染的地下水环境中缺乏氧，好氧微生物在代谢过程中很快将氧耗尽，此时，好氧微生物将无法对污染物进一步降解。厌氧微生物不同的代谢能力，在污染地下水修复方面显示了巨大的潜力。最新研究表明，厌氧微生物可有效降解地下水中烃类､氯化溶剂､硝酸盐以及铀､铬､锝､钴､硒有毒金属和准金属等污染物。
在1973年，人们首次发现了浅层地下水中的土著微生物对石油的降解能力，不久，生物降解被用于提高汽油污染的含水层的净化。自那以后，人们开始使用生物降解地下水系统中各种常见化学污染物，包括氯代化溶剂。
地下水中石油烃的污染主要来自汽油及其它石油产品的地下储罐的渗漏。其主要污染组分为苯､甲苯､乙苯和二甲苯。生物降解石油烃的实质是在微生物参于下的氧化还原反应。该反应中电子供体烃给出电子，好氧菌仅利用氧作为电子受体，而厌氧菌则可利用NO-3､Fe3+､SO2-4和CO2 作为电子受体。美国密执按州使用原位生物修复技术，成功修复了由于地下储油罐漏油受到严重污染的包气带及含水层。其方法是：在污染区，首先注入未污染地下水42 d，第43 d开始注入含NO-3的地下水，到第112 d基本清除了污染物。结果表明： 地下水中，苯从0.76 mg/L降至小于0.001 mg/L ，甲苯从4.5 mg/L 降至小于0.001 mg/L；包气带土壤中，苯从0.84 mg/kg降至0.017 mg/kg ，甲苯从33 mg/kg 降至0.103 6 mg/kg(钟佐燊 2001)。
多环芳烃具有毒性，对人类健康造成的危害大，尤其是高分子多环芳烃的致突变与致癌特性。多环芳烃生物降解研究日益受到了人们的重视。近年来人们对微生物降解多环芳烃的作用､机理进行了广泛的研究，研究结果表明，对可降解多环芳烃的微生物有红球菌属( Rhodococ2cus) ､假单胞菌属( Pseudomonas ) ､分枝杆菌( My2cobacterium) ､芽孢杆菌属( Bacill us ) ､黄杆菌属( Flavobacterium) ､气单胞菌属( Aeromonas ) ､拜叶林克氏菌属( Beijernckia ) ､棒状杆菌属( Corynebacterium) ､蓝细菌( Cyanobacteria) ､微球菌属( Micrococcus ) ､诺卡氏菌属( Nocardia) 和弧菌属( V Ibrio)等(温洪宇 2005)。利用微生物去除地下水中的多环芳烃不会造成二次污染，费用低，易操作，是去除多环芳烃的最佳方法。
饮用水中过量的硝酸盐能够引起婴幼狼高铁血红蛋白血症，我国许多地区浅层地下水已普遍受到硝酸盐不同程度的污染。张胜(2005)对地下水硝酸盐污染的微生物修复技术进行了研究。通过两年多的室内和野外原位的大量试验研究，优选出反硝化菌液和增强地下水中微生物反硝化作用的营养碳源乙醇､乙酸钠，利用乙酸钠作为营养碳源在野外试验井进行原位微生物脱氮试验，对地下水中NO-3的去除率可达98%。研究结果得出，利用优选反硝化菌液和乙酸钠营养碳源对地下水硝酸盐污染修复效果好，在大面积土体和地下水污染原位修复技术实施是可行的､有效的，它不仅可以在原位有效地修复土壤､包气带的硝态氮污染，而且还可以增加土壤的肥力及氮肥的利用率，无负面作用，对修复污染､保护地下水资源和农作物增产都具有重要意义。
5 影响微生物作用的地下水环境因素
微生物作用对地下水系统的影响程度主要受微生物代谢速度，水文地质条件，含水层的岩性等多种因素的控制。
张宗祜，任福弘等(2006)为研究氮素的生物化学循环问题，通过对河北正定野外试验场贯穿包气带的18.5 m的钻孔剖面土样的水理性质､地球化学成分､有机质含量的测试和微生物的培养鉴定，发现包气带土体的各类细菌在整个包气带均有分布，但随着岩性､物理化学条件的变化，而显现出不同的细菌含量，特别是在几个层次上出现细菌含量高的活化层。它的出现充分说明了细菌在包气带中分布，不是受深度变化所控制，而是受其环境条件所制约，如含水量､营养元素､土体岩性等。这一研究成果为今后深入研究地下水系统中微生物的作用奠定了良好的基础。
McMahon(2001)研究了含水层和弱透水层交界面上的几个重要生物地球化学反应，包括氧还原､反硝化作用和Fe3+､SO 2-4和 CO2还原(甲烷生成)。研究表明，一些地方，生物地球化学反应发生在交界面的弱透水层面，电子受体从含水层运移到电子供体丰富的弱透水层里。另一些地方，生物地球化学反应发生在交界面的含水层一方，电子供体(有时是电子受体)从弱透水层运移到电子受体或微生物丰富的含水层里。影响含水层/弱透水交界面发生生物地球化学反应范围的因素有，交界面两边电子受体和电子供体的丰度和可溶性，电子受体和电子供体反应和越过界面的速度。
6 展 望
地下水沉积物无菌取样方法的发展完善和微生物综合评价方法的建立，使微生物代谢作用对地下水地球化学的影响被广泛认识。随着当今社会科学技术的不断进步，地下水微生物地球化学的研究技术也日益得到提高和改进。首先，人们可以利用电子显微镜､能普､电子探针､离子探针､质子探针来观察和分析细胞内部的结构､成分。第二，微生物生态学研究的新技术被用于地下水微生物研究中。如，人们在研究污染或未污染含水层生物群落组成研究中开始使用磷脂脂肪酸分析方法(PLFA)，该方法是基于生物化学手段的一种微生物生态学研究新技术，它具有对细胞生理活性没有特殊的要求，对样品保存时间要求不高､不需要进行微生物培养等优点。它能提供微生物群落生物量及其时､空变化､群落结构和功能等多种微生物信息，是一种快捷､可靠的分析方法。.再如，人们通过基因工程，在DNA的分子水平上动手术，使某种细胞结构的基因转到另一种细胞中去，而使之具有新的遗传性状。
随着我国环境科学界对地下水微生物作用研究的日益关注，我国地下水微生物地球化学､微生物工程学､微生物环境工程学将会作为重点发展学科被大力扶持，地下水微生物的基础研究应得到优先发展，尤其是在地下水环境中微生物的种类､形态､分布特征､营养和生长的一般规律，微生物的代谢､演替和调控，微生物的基因及其所携带的遗传信息表达等研究方面，从基础研究中寻找提高地质微生物地球化学作用的研究途径和方法。地下水微生物研究将进一步与地质学､微生物学､环境生态学､环境微生态学､环境地质学､水文地质学､生物化学等基础科学的研究交叉与合作，对基础科学的发展提供动力和应用的验证方法。
参考文献
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篇2
关键词:宏基因组;不可培养微生物;筛选系统
中图分类号:Q75 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-06-0044-3
0 引言
Woese和Pace基于16S rRNA或DNA基因序列分析的先锋研究工作给微生物生态学领域带来了革命性的变化。在此之前,人们完全没有意识到真实存在于自然界和在实验室能培养的微生物数量之间重大的差别。伴随着克隆和测序技术的发展,细菌通用引物对环境中生物群落总DNA的直接PCR扩增,产生了大量的数据并重新定义了原核生物的多样性。近年来一些学者对微生态学和宏基因组进行了研究。以下是近几年报道的关于不可培养的大多数微生物的新的见解和技术。
1 宏基因组的研究
1.1 DNA的分离
环境样品DNA的质量直接关系到宏基因组分析的质量。Tiedjie等发展了从不同类型的土壤中直接分离DNA 的方法,但是这些方法仍然不能确定在所有的具有代表性的高度复杂的生物群落中能够获取全部的总DNA。尽管Coutois等人发现,从土壤中直接提取DNA和先从土壤分离细胞再从中提取DNA所得到的细菌多样性范围并无重大差别,但是Luna等人证实,在检测海水沉淀物时,只用单一的DNA提取方法严重低估了细菌多样性。不同的方法适用不同的环境。比如,Fortin等人发现,在细胞裂解前冲洗被碳氢化合物和重金属严重污染的土壤和海水沉淀能改善DNA的质量。
选择一种DNA提取方法用于宏基因组分析需要分析样品的信息。在预测一个生态环境中不同的微生物群落成员的潜在功能的时候,分辨DNA来自样品来自可培养的微生物还是来自死细胞是很有价值的。Nocker和Camper表明,用ethidium monoazide(EMA)的衍生物分析成熟的生物膜16S rRNA基因指纹图谱,提取处理过的样品和未经处理的样品的DNA有重大的区别。对环境中的活体,很有必要区分DNA来自胞内还是胞外。水沉淀中包含了大量来自胞外的DNA,Corinaldesi等人改进了一种允许同时提取胞内和胞外DNA的方法,这些DNA可能对细菌的新陈代谢起着重要的作用。
1.2 系统发生和宏基因组的分析
DNA提取方法的改进、测序手段的进步和测序成本的降低使我们能够解决以下问题:在一个群落中不连续的单元里共生多少种类的细菌以及环境中是什么因素影响着群落的组成和多样性。Acinas等运用不同的PCR扩增方案建立了两个独立的沿海浮游生物的16S rRNA文库。这两个文库的比较表明了PCR扩增可能会高估文库中独特的rRNA序列。尽管如此,PCR的误差仍然不能说明样品中的所有16S rRNA基因的微小差异(1%的序列差异)。97种已完全测序细菌全基因组比较表明,它们包含242种属于非同源多操纵子的不同16S rRNA基因。序列分析还表明任何基因组中的16S rRNA内部操纵子的差异在1%以内。引入一个修正参数2.5(242个rRNA操纵子和97个基因组相除)到浮游生物样品待测序的序列中,以99%的相似性(1113)为标准,Acinas等预测这些样品中至少包含了446种紧密相关的基因组。因此这些数据间接的表明了这个种群内部包含有大量相似的种类。基因序列也开始用于推断一个群落中各个体的角色和功能,这比仅确定群落中的种类更有意义和更具挑战。
在低度多样性环境中,普通的测序就能得到环境中的微生物信息。比如在一个种群细菌复杂程度不高的酸性矿井排水装置中的生物膜中,可以对单个菌株的代谢途径进行分析。在Tyson等人的研究中,细菌种群只由五种主要的种类组成,而且其中两种几乎存在所有的覆盖面积内。而许多自然环境中种群结构高度复杂,不能采用现在的方法。据估计在一份农场土壤样品中有超过5000种,104-105株的细菌。要得到这些复杂环境中占有最优势地位的细菌种类的八倍的覆盖量,必须产生二十亿到五十亿个碱基对的序列。为了避免对全基因组集合,Tringe等大量使用未集合的序列来读取一定时期内环境中标记基因。基因定量包括对特定生态环境能反映已知环境特点的环境样品的分析。以基因比较为中心对特定环境中基因定位给我们更好地认识和解释环境带来了新的机遇,也提出了新的问题。
处理复杂环境的另一条途径是将许多种类混合的16S rRNA基因克隆到单一的载体里面。其中,SARST(serial analysis of ribosomal sequence tags)发现了V1或V6高变区。这些位于核糖体小亚基rRNA上的高变区(叫做V1或V6区)长度大约为17-55bp,这些复杂的生物体中的片断可以连接到单个的克隆里面去。用这种方法,单个测序反映能达到的序列标记可达20个。这种方法可以鉴定菌群可达到属的水平。van der Lelie等人报道了一种改变的序列标记方法,用于基因组中短的保守序列,结合限制性内切酶消化产生标记,可以区分亲缘关系很近的菌株。一些细菌的保守基因已经鉴定出来,包括rpoC,uvrB, recA 和16S rRNA 基因。在这些基因中,16S rRNA是差别最大而且可以应用于所有的原核生物种类分析的基因,可以达到属的水平,很大一部分还可以分辩到种的水平。
近年来,以16S rRNA基因为基础的微生物分类阵列已经成为鉴定微生物区系的最有力的方法。这种微生物分类阵列由大量不同门类的细菌的标记探针组成。不同原型的阵列已经发展并开始用于估计环境种群中微生物的多样性。这种以16S rRNA基因为基础的微生物分类阵列将成为监测各种复杂环境中微生物多样性的一个最重要的工具。
复杂环境中微生物区系指纹图谱和宏基因组分析将来可能发展为基因芯片。一个完全的综合芯片到目前为止仍然是一个对未来的展望。Hong等人描述了一种基因芯片的概念,这种芯片通过分离不同种类和数量的细菌或哺乳动物的细胞并裂解提纯DNA或者mRNA来实现。基因芯片的研究对我们认识和监测一定的微生态环境中微生物种群结构的认有着非常重要的意义。
直到今天,宏基因组的研究还只在生物量相对较高的环境中进行。在对细胞、量很少的环境进行宏基因组的分析还需要一种新的文库构建方法。Abulencia等描述了一种多态性扩增严重污染的土壤中有机体基因组的方法。从严重污染和细胞密度极低的地表下土壤样品中提取DNA,￠29DNA聚合酶用于扩增总基因组。通过第一次基因组DNA的扩增,污染的土壤中细菌多样性分析,和细菌基因组文库构建是可能的。尽管存在扩增的偏好现象,在一个微小的细菌样品中扩增宏基因组DNA,仍然可以得到一些以前无法得到的基因组的信息。
1.3 筛选宏基因组表达文库
另外一种方法是通过构建和筛选宏基因组表达文库,或者通过测序和限制性内切酶的方法来筛选。直接筛选宏基因组文库的一种局限就是需要超高通量的筛选系统,或者大量的可用的筛选的阵列。可以通过富集基因的方法来筛选由数百万个基因组成的宏基因组文库中的稀有基因。其中一种富集的方法是底物诱导表达筛选(substrate-induced gene expression screen,SIGEX)。Uchiyama等完善了一种高通量的SIGEX筛选方法,他们将目的基因和绿色荧光蛋白(GFP)连接起来,转到表达载体内,通过检测激发的荧光来检测相应的克隆。宏基因组DNA被克隆到gfp基因序列的上游后,通过FACS方法来排除所构建文库中组成型表达gfp的克隆。再将未表达gfp的克隆转移到含有靶标底物的培养基中,通过诱导gfp基因表达来筛选克隆子。这种筛选体系的机理是:分解代谢相关的基因能够在特定代谢物的作用下被诱导表达。
1.4 通过培养方法获取不可被培养的大多数微生物
要大量精确测序复杂环境中的微生物DNA样品,不是一件很容易的事情,这也说明了全面的获取微生物信息的方法的重要性,可以通过这些信息来理解微生物间及微生物与环境间的相互作用。尽管“环境基因组”能够提供大量的信息,但对生理学,生态学和进化学有重要影响的分类单元中可培养微生物单菌落的会给生态小环境的研究带来深远影响。Proteorhodpsin的发现及它的编码基因存在于Pelagibacter ubique证明了获取可培养单菌落的作用。Proteorhodpsin编码基因是在海水和环境微生物宏基因组的克隆测序过程工程中第一次被发现的,但是我们不能确定不可培养的微生物基因组中包含Proteorhodpsin基因。通过培养Pelagibacter ubique,我们就有可能将Proteorhodpsin与固定的种类联系起来。
许多研究者们正在努力研究与模拟专一的可培养的微生物,并且利用将这些微生物来研究它们环境中所处的地位和发挥的作用。基因组测序已经为我们提供了大量的信息并了解这些微生物在环境中的作用。
经典的微生物培养策略都是一贯地给微生物系统提供过量的营养,从而导致能形成菌落或薄膜的和快速生长的细菌富集。对于依赖稀释培养基或模拟自然环境培养基才能生长的细菌,Ferrari等人描述了一种模拟自然环境条件的用于培养土壤微生物的新颖方法。他们研究组所采用的泥浆膜系统中,一种聚碳酸酯是作为生长培养支持物,土壤提取物作为培养基。研究结果是长出了大量的未被鉴定的微型菌落。Koepke等人将多种不同的培养方法应用到沿海地表下的沉积物,研究发现多数情况下没有一组微生物能够在几种培养方法中都被培养出来。他们的研究肯定了这个观点:没有一种单一的培养方法或者培养基适用于分离专一样本中的多种多样的微生物。同时采用低营养条件富集和分子方法,在冰岛富含中性硫化物的热温泉中得到了具有一种高度差异型的淀粉酶基因。使用热温泉水的微生物富集方法采用低浓度淀粉和长时间温育,最后选育出能够降解淀粉但生长缓慢的微生物。
在培养之前,将样品中的多种特定的微生物选择性地分离出来可以降低微生物群落的复杂性。Miteva和Brenchley的过滤培养,结合长时间温育,使一些新颖而极小的细胞菌落得到富集。这种方法对于研究极端条件下的微生物的代谢特性及长时间存活机制是很有益的。
2 结语
要得到不可培养的大多数微生物的信息,还有很漫长的路要走。在不久的将来,使用更便宜更快捷的测序方法,环境工程测序技术将会产生更加多样的数据和信息。然而,测序并非我们认识环境微生物的唯一方法。我们需要一种新技术,它能够针对直接分析和估量环境和培养条件下的微生物细胞,并且尽可能地和自然界真实的状况接近。对于单个微生物细胞进行完全的特征分析也是一项很有意义的工作。虽然在当今的条件下还没能实现,但是关于单细胞微生物学已是一个很明显的趋势,能让我们解决更多悬而未决未的环境微生物的问题。总之,在工程学,生物地球化学,生物化学,生物信息学,生理学和生态学等多种学科快速发展的基础上,宏基因组学的研究将会使我们进一步加强对于环境对微生物多样性分析的理解和对微生物环境功能的认识。
参考文献
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篇3
英文名称：Journal of Microbiology
主管单位：辽宁省科技厅
主办单位：辽宁省微生物学会;辽宁省微生物学会;辽宁省微生物科学研究院
出版周期：双月刊
出版地址：辽宁省朝阳市
语
种：中文
开
本：大16开
国际刊号：1005-7021
国内刊号：21-1186/Q
邮发代号：8-142
发行范围：国内外统一发行
创刊时间：1978
期刊收录：
CA 化学文摘(美)(2009)
CBST 科学技术文献速报(日)(2009)
中国科学引文数据库(CSCD―2008)
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篇4
关键词：教学改革 环境微生物学
一、环境微生物学课程定位
环境微生物学是微生物学的知识和原理在环境工程方面应用的一门新兴的边缘学科，同时又是环境工程专业重要的专业基础课之一。它涉及面广，发展迅速，是一门具有很强实验性和应用性的学科。环境微生物学实验教学在理论联系实际，培养学生的观察能力、自学能力、探究和解决问题的能力，培养高素质的应用型人才方面具有重要作用。现阶段如何加强环境微生物教学，如何提高教学质量及把握改革的方向是摆在我们面前的严峻问题。笔者结合我校实际及教学经历，对该门课程的教学改革进行了初步设想。
二、教学过程存在的主要问题
1. 内容抽象、不易理解。
微生物学不像其它课程那样，其在学生头脑中没有直观的印象，微生物个体比较微小，看不见摸不着，在日常生活中也没有直观的印象。细菌个体微小，肉眼只能看到群体的菌落特征，很难把个体拿出来在实验室课堂上演示，只能借助工具来观察，操作性难度大。由于细菌个体微生物较小，用显微镜要放大很多倍才能看到，所以有时候很难区别一些相似的菌种(如各种霉菌)，对于辨认其形态结构也比较困难，不易理解。
2. 课程内容繁琐、知识点多，教学课时不足。
环境微生物学的内容主要微生物学基本原理、微生物生态、环境工程中微生物的作用和微生物学实验等部分组成。当前，我国很多高校为了培养创新型人才，大力压缩基础课课时，增开热门的应用课程。我校环境微生物总学时数56学时，其中理论学时数40学时，实验学时16学时。教学内容过于集中在微生物形态、生长代谢等基础内容，使得人工生态系统等介绍篇幅压缩，微生物在卫生检测及污染治理方面的应用等内容不够学时介绍，只能一带而过。因此要使学生对该门课有深刻理解和掌握，并能熟练地将理论应用于实践，按照现有的课时数，难度是比较大的。
3.学生基础知识薄弱，理论联系实际能力差。
当前，我国的中等教育正由应试教育转向素质教育，但转变过程又必须紧跟高考的指挥棒。这就造成环境工程专业的学生在接触环境微生物学课程之前，微生物学知识非常少，有些学生高中根本就没接触过微生物学。而越来越激烈的就业竞争和压力使得学生对基础课学习的兴趣下降，越专业越实用，则越感兴趣，这样，教与学之间的互动显得尤为重要。
4.实验室条件不足。
实验室条件不足是当前存在的一个主要问题之一。目前我院环境工程专业实验室面积较小，微生物教学器材偏少，灭菌锅和生物显微镜都只有2台，很难满足正常实验需要。
三、课程教学方法的改革和途径
1.开好头，激发学生的兴趣。
在绪论的讲授中，授课教师须讲明本课程在学科领域中的地位，特别是在社会经济发展中的地位与作用，尤其是目前环境微生物学在环境保护污染治理、资源利用、友好材料、清洁生产等领域的应用及研究热点、难点，指出近期科学工作者在环境微生物学研究的贡献，激发学生为科学献身的精神。
2.提高教师的自身素质，丰富教学内容。
教师对教学的态度、业务水平、敬业精神、教学方法和手段都会影响着教学效果。一方面，教师需要不断充实教学内容，联系当前社会热点问题，应用到课堂教学。例如在讲病毒时，补充讲SARS病毒、艾滋病毒及疯牛病毒的结构。另一方面，在学校的各项工作中，教学是基础，科研是主导，任何教师决不能脱离科学研究而单纯地搞教学工作。只有长期参加科研实践的教师，才能使自己讲课的内容更加具有前沿性、独创性和启发性。教师应多参与工程实际，找到理论与实践的结合点，并在教学中用工程中生动的例子讲述概念，例如在讲细胞工程和微生物在环境工程中应用时，教师结合自己的科研和工程实例进行讲解，这样贴近实际，通俗易懂，可大大激发学生的学习兴趣，培养学生解决实际问题的能力。
3.运用多媒体技术，增强教学效果。
多媒体技术是20世纪末发展起来的主要的电化教育手段，是未来微生物学课堂教学的主要方向。与其它生物相比，微生物有着看不见、摸不着的独特之处。如果教学方法不好，常常会造成很多错觉。传统的微生物教学手段可视化差，对微观世界的动态变化显得无能为力，众多的图表、照片无法展示，缺少生动形象的直观教学效果，教学信息量小。而在环境微生物教学中，借助多媒体进行教学，可以向学生们展示许多精美的微生物图片和微生物工程应用。例如，在讲噬菌体侵染细菌时，采用多媒体技术，用动画描述噬菌体吸附、入侵、复制、释放过程；在讲污泥膨胀时，运用多媒体技术，比较膨胀污泥与正常污泥的形态结构，增加认识；也可以通过网络收集的信息，向学生们介绍微生物某方面应用的最新进展，激发学生们对环境微生物的兴趣。
4.开展启发式教学，培养学生创新能力。
环境微生物学作为一门新兴的边缘学科，它的发展应随着生物学、微生物学及环境科学的发展而不断呈现出新的内容。以往那种以教师为中心，学生上课记笔记、考前背笔记的教学模式及学习方式已不能适应对该学科的学习要求。教师在授课时，应注重提高信息的密度和质量，尽量使之图象化、表格化，这样可将原来多而杂的信息整理为少而精的信息，使之相互联系紧密、主线突出、层次清晰，成为学生易懂、易记的新信息。在教学方法上，要改变单一的注入式教学方法，采取讲解式、提问式、启发式、自学式等多种多样的教学方法。对于基础性知识，以讲解式为主，并在讲课时启发学生思维；课前准备一些问题，讲课过程中随时向先生提问，在提高学生听课精神的同时，激发学生思维，活跃课题气氛；在讲课过程中，经常联系最新研究进展，以作业的形式，让学生通过网络了解信息，培养学生的科技创新思想和能力，为今后的科研打下基础。
5.改革实验教学，调动学生积极性。
实验教学在微生物理论教学中占很大比重，它可以培养学生独立分析、解决问题的能力和动手能力。为此，要求学生每次实验前必须预习，并写出预习报告，上课时指导教师要检查预习报告，了解预习情况，做到有的放矢，实验课上注意基本操作技能的训练，根据各实验的具体要求，严格把关，认真指导。严格要求，规范操作，强化基本操作训练，发现问题，耐心引导，力争使学生自己找出问题并加以改正；课后适当增加开放性实验，通过这些措施，端正学生的实验态度。规范操作，写好实验报告，练好基本功，实验报告中的分析与讨论是很重要的内容，通过对实验问题和结果的分析、讨论，可加强学生对理论知识的理解，大大提高学生分析问题和解决问题的能力。
环境微生物实验目前有16学时，归并到环境工程专业实验A中，由于实验学时和实验条件的限制，我们目前只安排了培养基的配制与灭菌、细菌的分离与无菌操作技术、光学显微镜的使用、细菌形态观察和细菌数量的测定五个实验，每个实验前后关联，连续性强。实验安排上尽量依据实验室现有条件，少量多次安排实验。在目前操作性和验证性实验的基础上，我们计划开出环境工程专业综合性实验，计划学时10学时，拟利用现有氧化沟设备对污水生物降解，综合环境微生物、环境监测和水污染控制工程实验内容。形式安排上，采用开放实验形式，该实验所需时间较长，于是实验室全天对学生开放，学生们都是自己安排时间，在课余时间来实验室做实验，实验指导教师随时进行指导。通过“综合大实验”，学生不仅可以掌握各个实验的方法，也巩固了以前所学的基本操作技术，更重要的是提高了学生的主动性、自觉性和实验动手能力，把所学各门知识系统地贯穿起来用于实际工作中。
四、结语
环境微生物学在环境工程领域的应用越来越广泛，对其教学的改革也是一个长期的、艰巨的任务。而社会对人才的要求越来越注重独立工作能力、综合能力以及创新精神，因此，环境微生物教学必须按照这一要求，不断寻找适合的内容，培养出综合型、设计型、高素质的人才，实现教学改革的目标。
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篇5
关键词：α-L-鼠李糖苷酶；基因克隆；基因表达；晶体结构
中图分类号：Q71；Q786 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）01-0068-07
ProgressesonMolecularBiologyandStructuralBiologyofα-L-rhamnosidasefromMicrobialSources
ZHANGXia1，LILi-jun1*，NIHui1.2’3，CA1Hui-nong1.2，3，SUWen-jin1，2，3
（1.CollegeofBioengineering，JimeiUniversity，Xiamen361021，Fujian，China；2.ResearchCenterofFoodMicrobiologyandEnzymeEngineeringTechnology，Xiamen361021，Fujian，China.，3.ResearchCenterofFoodBiotechnologyofXiamenCity，Xiamen361021，Fujian，China）
Abstract：a-L-rhamnosidase（EC3.2.1.40）cleavesterminalα-L-r
hamnosespecificallyfromalargenumberofglycosides.Theenzymeisabiotechnologicallyimportanthydrolyticenzymeduetoitsapplicationsinthefoodandbeverageprocessingindustryandpharmaceuticalindustry.Basedonprimarysequencesimilarities，α-L-rhamnosidasesareclassifiedwithintheCarbohydrate―activeenzymes（CAZy）databaseintofourglycosidehydrolase（GH）families（GH13，GH28，GH78andGH106family），andthreeα-L-rhamnosidasesofGH78haveatypical（α/α）6-barrelstructure.Propertiesandapplicationsofα-L-r
hamnosidasefromdifferentmicrobialsourceshavebeenintroduced.Inaddition，therecentdevelopmentsoncloning，expressionofoiLi.hamnosidasegeneandthecrystalstructureoftheenzymeweresummarized.
Keywords：α-L-rhamnosidase；genecloning；geneexpression；crystalstructure
（LifeScienceResearch，2015，19（1）：068?074）
α-L-鼠李糖昔酶（α-L-rhamnosidase（EC3.2.1.40））属于转化糖苷水解酶类，能够专一、高效地水解许多糖苷类物质如柚皮苷（naringin）、芦丁（rutin）、橙皮苷（hesperidin）等末端的α-L-鼠李糖基[1]。α-L-鼠李糖苷酶的来源广泛，在动物组织、植物和微生物中均发现了α-L-鼠李糖秆酶。目前关于动物组织[2]和植物来源的α-L-鼠李糖苷酶的报道相对较少，主要是通过细菌（如芽孢杆菌属、拟杆菌属、乳杆菌属及单胞菌属等）和真菌（如曲霉属、青霉属、木霉属、犁头霉属及裂殖菌属等）发酵来获取α-L-鼠李糖苷酶。
不同微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶酶学性质存在差异。细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶最适pH呈中性或碱性，而真菌分泌的α-L-鼠李糖苷酶的最适pH一般在酸性范围内，主要在4.0～7.0[3-5]之间。微生物中的α-L-鼠李糖秆酶的最适反应温度一般是45?60℃[4、6]。近年来也有发现耐热、嗜低温及耐碱性的α-L-鼠李糖苷酶，如白曲霉MBRC4308[6]分泌的α-L-鼠李糖苷酶，在60℃保温1h后酶活仍有初始酶活的80%；ThermophilicbacteriumPRI-1686[7]产生的α-L-鼠李糖苷酶最适温度为70℃，在60℃处理24h后酶活为处理前的20%；而亚南极环境中的单胞菌属细菌[8]中的α-L-鼠李糖苷酶在-1-8℃具有活性。Rojas[9]等从白黄笋顶孢霉菌（Acrostalagmus luteo albus）分离到一种新型碱性α-L-鼠李糖苷酶，以对硝基苯酚-α-I-鼠李糖苷（pNPR）为底物测得酶反应的最适pH值为8.0，它可以在碱性条件下水解橙皮苷、柚皮苷以及槲皮苷等糖苷物质，扩大了α-L-鼠李糖苷酶的应用范围。
α-L-鼠李糖苷酶是柚苷酶及橙皮背酶的主要活性成分，是去除柑梧类果汁苦味的有效物质[1]。果汁中的苦味物质柚皮苷被柚苻酶水解的过程共有两步反应，首先在α-L-鼠李糖苷酶的作用下水解柚皮背生成普鲁宁，接着在β-D-葡萄糖苷酶的作用下，生成柚皮素。在果汁酶法脱苦过程中，α-L-鼠李糖苷酶参与的第一步反应是脱苦的关键，Chien[10]等用HPLC法证明仅有柚苷酶的另一组份β-D-葡萄糖背酶存在时，苦味物质抽皮苷是不能被水解的。有研究报道，对葫溪蜜柚果汁进行脱苦时，在α-L-鼠李糖苷酶加量为10U/mL的条件下40℃处理60min，苦味就能降低到阈值以下[11]。除了在饮料行业中用来去除柑橘类果汁的苦味[3、12]，在其他行业也具有很多潜在的应用价值，如通过水解柚皮苷生产L-鼠李糖[1]和普鲁宁降低黄酮类化合物的生产成本；增加酿造酒的香味[14、15]，改善葡萄汁和饮料的香气成分；切除一些糖苷类药物原料末端的L-鼠李糖等[16]。由于α-L-鼠李糖苷酶的重要应用价值，越来越多的国内外学者致力于该酶的研究开发。本文分别对微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达以及该酶的晶体结构研究进展进行了阐述。
1α-L-鼠李糖苷酶的分子生物学研究
微生物分泌的α-L-鼠李糖苷酶是一种诱导酶，需要诱导物柚皮苷、橙皮苷、鼠李糖等存在时才能合成α-L-鼠李糖苷酶，而且微生物中α-L-鼠李糖苷酶的诱导受到碳源代谢调节，给微生物发酵产α-L-鼠李糖苷酶造成阻碍。同时随着α-L-鼠李糖苷酶的应用越来越广泛，传统发酵的生产方式不能满足日益增长的需求，也很难达到很高的纯度。因此，选择现代生物技术来研究α-L-鼠李糖苷酶是一种必然趋势
1.1α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆
早期对a-L-鼠李糖苷酶的研究主要是该酶的分离纯化及酶学性质，2000年后对α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的研究日渐增多，表1列举了2000年以来微生物中GH78家族和近两年其他家族已克隆的α-L-鼠李糖苷酶基因目前，从微生物中克隆α-L-鼠李糖苷酶基因主要采用PCR和构建文库的方法。据PuriM等报道，采用构建文库的方法克隆α-L-鼠李糖苷酶基因可以通过以下两种方法筛选阳性克隆；一种是利用pNPR作为底物筛选含有α-L-鼠李糖苷酶活性的阳性克隆；另外一种是采用多克隆抗体筛选产鼠李糖苷酶的阳性克隆。
细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆研究比真菌稍早，在2000年[18]就有学者报道对Clostridium.stercorarium菌株中鼠李糖苷酶基因ramA的克隆。有些细菌中存在多个编码α-L-鼠李糖苷酶的基因，且它们的序列存在差异，在Bacillussp.GLl[31]中克隆到rhaA和rlmB两个编码α-L-鼠李糖苷酶的基因，它们分别编码两个不同的α-L-鼠李糖苷酶。来自植物乳酸杆菌（Latto-bacillusplantarum）[23]的rhaB1和rhaB2都是编码α-L-鼠李糖苷酶的基因，它们的序列相似性仅为26%。不同细菌中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因序列各异，Bacillussp.GLl[31]中rhaA和rhaB与Clostridiumstercorarium中ramA序列相似性分别为41%和23%。植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum）[23]中的α-L-鼠李糖酶KhaB1和RhaB2与Bacillussp.GLl[31]中该蛋质（登录号：BAB62315）的氨基酸序列相似性均为23%，与ThermomicrobiaPRI-1686[7]中的RhaB（登录号：AAR96047）相似性分别为22%和23%。而少动鞘氛醇单胞菌FP2001（Sphingornonaspaucimobilis）[21]中克隆的α-L-鼠李糖苷酶基因rhaM，共有3354个核苷酸，同源性比对发现它与其他属于糖基水解酶（GH）家族78的α-L-鼠李糖苷酶基因没有显著的同源性。
国外关于真菌中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆研究主要集中在来源于曲霉属的α-L-鼠李糖苷酶目前，曲霉属中的棘孢曲霉[19]、白曲霉[6]和构巢曲霉[29]等已有克隆α-L-鼠李糖苷酶基因的研究报道。对目前已知的α-L-鼠李糖苷酶基因序列的分析发现，不同来源的α-L-鼠李糖苷酶基因序列差异较大。从棘孢曲霉[19]中克隆的两种编码α-L-鼠李糖苷酶的基因rhaA和rlmB的核苷酸序列几乎没有相似性，二者氨基酸序列相似性为60%，而它们与Clostridiumstercorarium中该酶的氨基酸序列[18]的一致性仅有11%。白曲霉中[6]α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列与棘孢曲霉[19]中rhaA和rhaB的氨基酸序列相似性分别为75%和67%，与细菌[7、18、20、21]来源的α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列一致性低于30%。有些真菌中存在着多个编码α-L-鼠李糖苷酶的基因，如在棘孢曲霉[19]中分离到两种α-L-鼠李糖苷酶，并克隆了它们对应的基因：有研究者对构巢曲霉[29]的基因组信息进行分析发现，至少存在8个可能具有α-L-鼠李糖苷酶功能的基因，而目前已克隆到rhaA和rhaE两种：我国学者对α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的研究相对较晚，主要是对犁头霉属[32-34]的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆，已成功克隆出芦丁-α-鼠李糖苷酶基因cDN段[32]和人参皂甙-α-鼠李糖苷酶基因[33、34]。近年有研究者从黑曲霉DLFCC-90菌株[26]中克隆到α-L-鼠李糖苷酶基因，该序列和α-淀粉酶的序列有较高的同源性，被归类到糖苷水解家族GH13。此外，笔者巳经从黑曲霉JMU-TS528（集美大学生物工程学院发酵工程研究室保藏的菌株）中克隆到α-L-鼠李糖苷酶基因，共编码655个氨基酸，序列已上传至NCBI数据库（登录号：KC750908.1），经同源性比对发现，它与白曲霉[6]（AB374267.1）中的α-L-鼠李糖苷酶基因的相似性高于90%。
虽然对微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的报道越来越多，但对该基因在转录水平上的调控研究并不多。目前，仅指出α-L-鼠李糖苷酶基因的表达量受诱导碳源的影响，葡萄糖在转录水平抑制该基因的表达。因此，笔者认为今后的研究可在克隆α-L-鼠李糖苷酶基因的基础上进一步鉴定与该基因跨膜转移或翻译直接相关的基因和蛋白，阐明葡萄糖抑制基因与α-L-鼠李糖苷酶基因相互作用的关系，从而明确碳源代谢调控α-L-鼠李糖苷酶基因的机制。
1.2α-L-鼠李糖苷酶基因的表达
通过α-L-鼠李糖苛酶水解柚皮苷生产普鲁宁可以降低普鲁宁的生产成本，但目前报道的α-L-鼠李糖苷酶大多数是以柚苷酶的形式存在，而在柚苷酶水解柚皮苷的过程中，普鲁宁作为一种中间产物，会进一步被分解成柚皮素，不能大量积累普鲁宁。所以表达出只具α-L-鼠李糖苷酶活性的蛋白质具有重要的应用价值。近几年有人对α-L-鼠李糖苷酶基因的表达进行了研究，表2列出了具有代表性的微生物中α-L-鼠李糖苷酶基因表达出的具有活性的蛋白。
在研究α-L-鼠李糖苷酶基因表达时，大肠杆菌是研究者常用的表达宿主。虽然采用原核表达系统来表达真核微生物中的基因容易出现没有活性的产物，目前已有不少研究者将微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶基因，通过大肠杆菌表达出有活性的蛋白。如Jules[22]等将植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantaram.）和嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）中克隆得到的鼠李糖苷酶基因ram1Lp、ram2Lp和ramALa，在E.coli中表达出活性蛋白Ram1Lp、Ram2Lphe RamALa，其中RamALa酶活最大，达到8.5mU/μg。不同的α-L-鼠李糖苷酶基因表达后产物的水解底物不同，乳酸片球菌[24]中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因ram和ram2，采用E.coli表达系统成功表达出活性蛋白Ram和Ram2，但Ram只能有效地水解合成底物pNPR，而Ram2能特异性水解橙皮苷和芦丁糖，两种酶均不能水解柚皮苷，以pNPR为底物测得Ram和Ram2的酶活分别为8.7U/mg和0.036U/mg。植物乳酸杆菌NCC2451231中rhaB1和rhaB2基因表达的RhaBl和RhaB2能特异性地水解α-1，6糖苷键，但不能水解柚皮苷中的a-1，2糖苷键，RhaB1和RhaB2的最适底物是橙皮苷和芦丁。有研究者发现有些细菌中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因表达后的产物是二聚体，例如Clostridium stercorarium[18]中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因ramA成功在（PWS1261）细胞中表达出的蛋白Ram78A包含两个相同的亚基，Lactobacillusplantatum[23]中rhaB1和rhaB2基因采用E.coli表达出的α-L-鼠李糖苷酶以二聚体形式存在。
由于原核表达系统本身存在的一些缺陷，有时表达出的α-L-鼠李糖秆酶不具有活性[36]，所以有研究者采用真核表达系统来表达α-L-鼠李糖苷酶基因。目前对α-L-鼠李糖苷酶基因的真核表达的报道并不多，我国研究者已在酵母中成功表达了芦丁鼠李糖苷酶基因[36]、人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因[33]以及黑曲霉中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因[26]。其中黑曲霉中的α-L-鼠李糖苷酶基因序列与α-淀粉酶基因序列相似性较高，通过酵母表达后的产物具有水解芦丁、柚皮苷及橙皮苷的功能。米用酵母细胞表面展示技术将Alternaria sp.L1[28]中rhal1编码的α-L-鼠李糖苷酶固定在酿酒酵母细胞表面，该细胞能特异性地水解葡萄柚果汁中的柚皮苷达到果汁脱苦的作用。RhaL1固定在酿酒酵母细胞表面后，该酶在70℃环境中活性很高，在60℃处理2h后酶活达到处理前的95%，扩大了该酶在工业生产中的应用范围。目前对黑曲霉来源的α-L-鼠李糖苷酶基因的异源表达研究较少，笔者正在研究从黑曲霉jMU-TS528菌株中克隆到的α-L-鼠李糖苷酶基因的真核表达。国外的研究者报道了土曲霉[25]、构巢曲霉[29]和棘孢曲霉[35]中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因在酵母中的成功表达。鼠李糖能够诱导构巢曲霉[29]中rhaE的表达，葡萄糖对该基因的表达产生抑制作用，rhaE在酿酒酵母中表达的产物，能够水解底物pNPR，酶活达到1.4U/mL。通过系统发育树分析发现，在真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶基因中，rhaE是首个与细菌中α-L-鼠李糖苷酶基因亲缘关系比其他真菌中的α-L-鼠李糖苷酶基因更近的基因。土曲霉中α-L-鼠李糖苷酶基因采用酵母表达系统得到的产物和天然发酵的α-L-鼠李糖苷酶一样，都可以水解芦丁，重组酶酶活力高达9U/mL，比天然酶高出3倍，而且大大缩短了天然发酵获取α-L-鼠李糖苷酶的时间，同时酶的产量比天然发酵的α-L-鼠李糖苷酶提高了4倍。尽管近年来，利用基因工程技术来构建产α-L-鼠李糖苷酶的工程菌的研究逐渐增多，并取得了一定的进展，但酶活水平始终未能达到工业化应用的要求；目前国际上对α-L-鼠李糖苷酶分泌机制的研究也不多，因此如何进一步提高该酶的胞外分泌水平，是该酶能否得到推广应用的关键：
2α-L-鼠李糖苷酶的结构生物学
蛋内质需要形成一定的空间结构才能有活性，近年来，虽然对α-L-鼠李糖苷酶基因克隆和表达的报道很多，佴对它的结构方面的研究报道还比较少：2000年Zverlov成功克隆Clostridiumstercorarium[18]中编码α-L-鼠李糖苷酶基因ramA后，首次通过圆二色谱法测得该酶二级结构包含27%的α-螺旋和50%的β-折叠结构。
CAZy（http：///）数据库依据氨基酸序列相似性对糖苷水解酶类进行了分类，微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶包含在GH13、GH28、GH78和GH106糖苷水解酶家族中。目前，由PDB数据库可以搜到3个鼠李糖苷酶的晶体结构，分别是来自Bacteroides thetaiutaomicronVPI-5482菌中的α-L-鼠李糖苷酶（PDBcode：3CIH）、Bacillus sp.GLI（PDBcode：20KX）和Streptoinycesavermitilis（PDBcode：3W5M、3W5N）菌株中α-L-鼠李糖苷酶。Cui[31]等于2007年解析了α-L-鼠李糖苷酶（RhaB）的晶体结构，该酶由N、D1、D2、C和A5个结构域组成；结构域A包含其（α/α）6的桶状结构，Asp567、Glu572、Asp579和Glu841在该酶的催化作用和底物结合方面起到了关键作用，它们与鼠李糖相互作用，将其突变后，α-L-鼠李糖苷酶（RhaB）酶活大幅度降低；并认为RhaB的空间结构与Lactobacillusbrevis菌株的麦芽糖磷酸化酶MalP和Vibrioproteolyti-cus菌株的壳二糖磷酸化酶ChBP的结构相似。来自Streptmnyces avermitilis[37]菌株的α-L-鼠李糖苷酶（SaRha78A）的晶体结构有两种，一种是原蛋白形式，另外一种是包含L-鼠李糖的晶体结构，这两种形式的结构变化很小，RMSD值仅为0.21A，它们均由1个α和5个β结构域组成，分别是N、D、E、F、A和C；结构域A包含（α/α）6的桶状结构，与Cui[31]等报道的RhaB的催化域相似；SaRha78CM由13个α-螺旋组成，结构域N包含10个β-折叠，结构域D的11个β-折叠和E的13个β-折叠展现出一个β-卷心折叠，结构域F由16个β-折叠组成两个平行的β-折叠片；L-鼠李糖分别结合在结构域A和D中，结构域A中的L-鼠李糖结合在该酶的活性口袋的芳香基氨基酸TrP747和TrP640之间，与周围的氨基酸形成12个氢键，结合后的船型构象被认为是GH78家族α-L-鼠李糖苷酶水解聚糖的过渡态构象；结构域D中的L-鼠李糖结合在β-折叠间，L-鼠李糖的O2、O3和O4原子分别和α-L-鼠李糖苷酶的Trp203、Asnl80和AsP179形成氢键，L-鼠李糖的O3、O4位置与一个正二价钙离子形成配位共价键，同时钙离子与该酶通过Aspl79、ASnl80、Asn228和Pro233氨基酸产生相互作用：Glu636和Glu895是在该α-L-鼠李糖苷酶的催化作用中的关键氨基酸，Glu636在催化过程中提供质子，将其突变后，该酶酶活下降了40倍。通过对α-L-鼠李糖苷酶的晶体结构的分析发现，该酶有4个结构域高度保守（RhaB：A、C、D2、D1；SaRha78A：A、C、E、F），GH78家族α-L-鼠李糖苷酶的催化域是一个（α/α）6的桶状结构，鼠李糖结合在该桶状结构的深沟里[31]。此外，在streptomyces awermitilis[37]菌株的α-L-鼠李糖苷酶中还发现了一个新的非催化碳水化合物结合域（non-catalyticcarbohydratebindingmodule，SaCBM67），SaCBM67位于结构域D，通过钙依赖的方式与L-鼠李糖结合，在用EDTA螯合钙之后，SaCBM67失去与L-鼠李糖结合的功能。通过对179和180位置的氨基酸的突变实验发现，突变后该酶水解阿拉伯树胶的活性大大降低，而对水解芳香基鼠李糖苷的活性影响不大，研究者认为SaCBM67对该菌株中的α-L-鼠李糖苷酶酶活有着一定的影响。
3展望
微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶具有很多潜在的应用价值，近年来，对该酶的研究越来越受到学者的关注，从不同水平对α-L-鼠李糖苷酶进行了研究。首先，在α-L-鼠李糖苷酶产酶菌株的筛选、发酵条件的优化以及酶的分离纯化和性质研究日趋成熟，为产业生产α-L-鼠李糖苷酶酶制剂及α-L-鼠李糖苷酶在食品医药加工工业中的应用提供了一定的参考价值；其次，在分子生物学方面，对不同来源的α-L-鼠李糖苷酶基因进行了克隆，并通过生物信息学分析、基因的表达以及晶体结构的研究，使得对α-L-鼠李糖苷酶的了解进一步深入。这些研究为构建工程菌生产α-L-鼠李糖苷酶，提高α-L-鼠李糖苷酶的酶产量，降低目前生产α-L-鼠李糖苷酶的成本提供了理论指导。但目前对不同来源的α-L-鼠李糖苷酶的合成途径、诱导机制和催化机制研究较少，因此，可进一步通过利用分子生物学、结构生物学和计算生物化学等技术，对α-L-鼠李糖苷酶进行更深层次的研究。从分子水平上来研究α-L-鼠李糖苷酶的催化机理，结合定点突变等技术来提高α-L-鼠李糖苷酶的催化活性。同时，通过计算模拟等手段研究α-L-鼠李糖苷酶的底物结合特异性，扩大α-L-鼠李糖苷酶在各生产工艺中的应用范围因为自然分离纯化的酶难以满足苛刻的工业生产过程，所以酶的改造成为一种非常有效的替代途径，依照α-L-鼠李糖苷酶的晶体结构信息，加深对其结构和功能的认识，为α-L-鼠李糖苷酶定向进化和改造奠定理论基础：
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篇6
关键词：葡萄酒微生物学;实验;教学改革
葡萄酒微生物学是研究葡萄酒微生物的理论、应用与控制方法的学科，是葡萄与葡萄酒专业的基础选修课程之一。其主要内容包括：葡萄酒微生物的代谢、葡萄酒微生物生态学、葡萄酒微生物的败坏以及菌种的选育和发酵剂的生产，除了理论知识外，各章节还与实际应用――葡萄酒的酿造相联系。本门课程的主要目的和任务是通过本课程的学习，使学生进一步掌握葡萄酒微生物的分类、资源、生态、选种和育种，有效进行有益微生物的利用和有害微生物的控制，更好地为葡萄酒生产服务。可是以往的葡萄酒微生物学中并没有涉及实验环节，使学生没有机会接触实际实验操作的锻炼，缺乏相应的知识与技能储备，学生学习主观能动性差。为了解决上述问题，我们发现必须对葡萄酒微生物学实验课程进行改革。
1 改革葡萄酒微生物学课程设置，提高学生主观能动性
改革中新的培养方案中加设实验课程16学时，针对课程设置和行业需求，安排设计性实验2个，要求学生熟练掌握酵母及乳酸菌的筛选和鉴定技术，从自然发酵的葡萄酒中筛选酵母及乳酸菌，并鉴定出其中的酿酒酵母和乳酸菌。课程设置内容范围专业性强，目的就在于提高学生的主观能动性。通过该课程的学习，使学生了解该领域国内外进展与发展趋势;熟悉相关的基本内容与关键知识点;掌握酵母菌及乳酸菌的主要操作技能并能在实际工作中应用。最终使学生具有葡萄酒微生物分类的能力;葡萄酒微生物代谢分析的能力以及葡萄酒微生物菌种选育的能力。使学生初步具有葡萄酒微生物学科研工作者的素质和以微生物的视角分析葡萄酒工艺的素质。
2 接触葡萄酒微生物学前端科研，增强挑战意识
在借鉴国外葡萄酒微生物学先进教学经验的基础上，结合理论教学进行整体设计，保证基本实验技能训练和基础实验，减少演示性、验证性实验和单一实验，联系生产实践和生产实习，结合教师的科研项目，把一些验证性、基础性的实验内容改变、提升或拓展，改革为综合性、设计性实验。以学生为本，由浅入深，考核淡化结果，注重过程，使学生从整体上学习和掌握进行葡萄与葡萄酒工程专业科学研究的思路和方法。即形成“以训练基本实验技能为基础，以系统综合实验为核心，以学生实验设计和过程为重要考核内容”的综合性、设计性实验教学体系，突出对学生创新能力的培养，增强学生挑战意识。我们把葡萄酒微生物学前端科研介绍给他们，增强其挑战意识。根据以上情况，设计两个设计性实验，旨在使学生学生在进行葡萄酒微生物学实验的同时，参与了学院一些科研成果的验证，转化自己的实验成果，提出解决实际问题的办法。在学生的实验能力得到进一步提高的同时，激发了学生主动思考，勇于创新的学习方式，增强其挑战意识。
3 制定合理的授课方式
学生在学习该门课程时，可采取“问题学习法”，授课教师提前把实验内容和要求布置给学生，让学生提前预习该课程的理论部分和自己准备试验方案，以便学生在上课时注意力集中，目标明确。然后课堂教学要力求创新。
在课堂教学创新方面包括：
①课堂研讨法，教师将问题带入课堂，与学生共同探讨，不求一致结果，只求分析方法与分析过程的科学性;
②案例教学法，葡萄酒微生物的许多内容操作性很强，只是在课堂上给学生讲解一些基础概念与基本方法是远远不够的，因此，教师尽可能将实际工作中的案例带入课堂，以案例分析为切入点，让学生通过对现实案例的分析了解和掌握专业理论与方法;
③课堂答辩法，为了鼓励学生积极发挥主观能动性，本课程组教师利用课堂时间或课余时间，事先准备一些专题，让学生了解和搜集资料，然后，在课堂上就学生所不清楚的地方进行现场回答和辩论。这样，一方面调动了学生积极思维、探讨专业理论的积极性，另一方面也促使教师在答辩中提高自己的教学水平。
葡萄酒微生物实验课改革对葡萄与葡萄酒工程专业的发展具有重要意义，对学生动手操作能的提高及视野的开阔具有很大的帮助。文章中探讨性地提出切实可行的改进意见，希望能进一步提高葡萄酒微生物学的教学效果。
参考文献：
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篇7
乙型肝炎病毒DNA聚合酶研究进展 林旭，闻玉梅
狂犬病病毒基因重组载体的构建及其在重组疫苗研究中的应用 黄薇，张辉，严家新
柯萨奇病毒的感染--Ⅰ型糖尿病发病的重要环境因素 魏强，李凡
抗体抗病毒作用的新认识 王立新，熊思东
流式细胞技术在抗生素敏感性试验中的应用 夏晓华，陆淼泉
敬告读者
链球菌属分类的研究进展 卢洪洲，翁心华
幽门螺杆菌VacA和CagA的研究进展 龙敏，别平华，俞守义，凌贤龙，房殿春
都柏林念珠菌的表型和基因型特征 谢辉，陈希平，欧炯光，杨保秀
下期要目预告
解脲脲原体分子生物学分群和分型 周向昭，马燕燕，朱学骏
结核病疫苗的研究进展及存在问题 余传霖
美国微生物学会会讯摘要 闻玉梅
抗结核病药物的开发 谢建平，王洪海
064一种对乙型肝炎病毒快速基因分型的聚合酶链反应 吴忆贫
065绿色荧光蛋白报告系统用于单纯疱疹病毒感染的快速诊断和定量 李晓霞
066 IL-8/RANTES作为DNA疫苗佐剂可增强对单纯疱疹病毒2型的特异性细胞免疫 马柯
067朊病毒蛋白的信号转导作用 吴益民
068重组葡萄球菌株诱生白喉抗毒素 叶巍
069人工接种棒状杆菌消除定植鼻腔的金黄色葡萄球菌 何洕
070幽门螺杆菌产物调节细胞因子反应 袁建平
071幽门螺杆菌细胞空泡毒素在小鼠感染模型中的作用 王洪涛
072荚膜组织胞浆菌的致病性和钙依赖性 王清
抗微生物治疗研究进展 翁心华
长模板聚合酶链反应技术在病毒学研究中的应用 胡芸文，袁正宏
病毒编码的细胞周期蛋白 任维，曹亚
丙型肝炎病毒细胞感染模型的研究进展 徐晓刚，季育华，陆志檬
EB病毒编码的蛋白质在癌变过程中的作用 黎明，曹亚
登革病毒E蛋白受体研究进展 杨春雨，江丽芳
细菌生物膜及其相关疾病 刘振桐，王承敏，张卓然
本刊启事
革兰阴性杆菌中超广谱β-内酰胺酶的检测 熊自忠，妹
肺炎链球菌分型方法的研究进展 张颖华，郭奕芳
铜绿假单胞菌耐药机制的研究进展 陈军，张雅萍，肖光夏
肺炎衣原体抗原研究进展 张光明，饶贤才，胡福泉
查菲埃立克体的抗原分子 方玉强，温博海
美国微生物学会会讯摘要 闻玉梅
细胞异常信号转导:丙型肝炎病毒致病新模式 赵兰娟，戚中田
当前医院感染领域中的几个热点问题 胡必杰
呼吸道合胞病毒G蛋白的相关研究 阳隽，徐军，钟南山
TT病毒分子生物学研究进展 吴新刚，王晓燕，陆淼泉
单纯疱疹病毒包膜糖蛋白的结构与功能研究进展 王战勇，王志玉
人腺病毒E4转录区ORF4蛋白与细胞凋亡 卜鹏莉，陈虹，黄秉仁
人类免疫缺陷病毒感染与特异性细胞毒性T淋巴细胞反应 蒋卫民，潘孝彰，康来仪
树突细胞、病原体与免疫应答 郭晓奎，童善庆
大肠埃希菌O157：H7毒力的分子生物学研究进展 张瑾，杨正时
铜绿假单胞菌分型研究进展 康梅，韩琳琳，贾文祥
幽门螺杆菌毒素及相关疾病的研究进展 聂华超，童砚，洪汝涛
结核分枝杆菌早期分泌蛋白ESAT-6家族的研究进展 骆旭东，朱道银
体外扩增技术检测结核分枝杆菌的新进展 孙薇，李君文
发酵支原体M161Ag的研究进展 何攀文，刘先洲
美国微生物学会会讯摘要 闻玉梅
小干扰RNA与RNA干扰 任浩，戚中田
乙型肝炎病毒基因分型方法及其分子流行病学研究进展 许红梅，任红
汉坦病毒结构蛋白抗原表位的研究进展 潘蕾，白雪帆
抑制差减杂交技术在细菌基因差异表达研究中的应用 张丽娟，阚飙，高守一
抗微生物肽——颗粒溶解素的研究进展 张海峰，李柏青
细菌外膜泡与致病性的关系 吴淑燕，黄瑞，林发榕
大肠埃希菌对喹诺酮类药物的多重耐药机制 赵瑞华，舒明星
沙门菌侵染机制及减毒菌株传递DNA疫苗的研究进展 刘明秋，严维耀，郑兆鑫
百日咳鲍特菌外膜蛋白的致病性与免疫原性 夏肖萍，严杰
幽门螺杆菌耐药机制研究进展 田拥军，叶嗣颖
嗜肺军团菌毒力基因、致病性及实验诊断研究进展 胡朝晖，朱庆义
非结核性分枝杆菌耐药机制的研究进展 沙巍，翁心华
红色毛癣菌的研究进展 李乔，杨国玲，刘维达
烟曲霉毒力因子的研究进展 杜晨，李若瑜
美国微生物学会会讯摘要 闻玉梅
人类免疫缺陷病毒1型耐药基因的监测 卢洪洲，翁心华
胞内菌与细胞骨架 李婷，李明远
金黄色葡萄球菌的侵袭和侵袭后过程 刘挺，管远志
口腔链球菌遗传型和表型的研究进展 聂敏，边专，樊明文
幽门螺杆菌感染时宿主免疫应答的特征 袁建平，童善庆
幽门螺杆菌粘附机制的研究进展 白杨，陈烨，张亚历，张兆山
动弯杆菌的研究进展 袁春雷，陈群，曾忠铭
外阴阴道念珠菌病的病原学研究进展 朱晓芳，王家俊
白念珠菌粘附上皮细胞的机制 刘为国，黄敏，牟希亚
肺炎衣原体与动脉粥样硬化和冠心病的关系 吴向辉，倪安平
篇8
教学内容的设置
目前，各个学校编写了不少环境微生物学的教材。其中，周群英和王士芬编著的《环境工程微生物学（第三版）》为广大高校的环境科学与工程专业所采用，它基本可以满足一般工科类院校的教学要求。但是，在使用的同时，各学校还应根据自身的专业特色，对其中各章节的内容进行取舍，并针对各自的专业适当增加内容，比如土壤微生物、海洋微生物等，以体现学科的优势研究领域。在“环境工程微生物学”的教学过程中，把握好基础微生物学和微生物在污染控制中的作用两部分的关系十分重要。前者是后者的理论基础，后者则是前者的工程应用，重点则是环境工程实践中的微生物学原理。如果对微生物的结构、营养、代谢等内容介绍过多，课程容易演变为细胞生物学、微生物生理学或生物化学等；而对污染控制的具体工艺过程涉及过多，又容易重复污染控制工程的课程内容。因此，在课程教学时，应合理安排这两部分的比例。
另一方面，“环境工程微生物学”的教学还应处理好与其他相关课程的相互关系。北京林业大学开设的“植物学”“环境生物学”等课程与“环境工程微生物学”之间存在一定的联系，3门课程在如细胞结构、生理代谢、遗传变异等知识内容上均有一定的论述，但课程核心和重点内容各不相同。在讲解“环境工程微生物学”时，应注重强调微生物细胞、生理、遗传方面的独特性，并对这些特性在环境工程领域的应用展开详细介绍。也就是说，在教学过程中需要注意知识单元的逻辑衔接，注重课程体系的统一性，要明确课程的侧重点，避免重复。基于当前环境科学与工程学科的飞速发展，“环境工程微生物学”的课程教学还应紧密结合当前环境污染控制和生态修复相关领域的新进展，而不能只停留在传统污染处理工艺的微生物学原理上。教师通过对最新污染控制工程理论和技术的微生物学原理进行解析，可以激发学生学习的兴趣、专业的热情，树立投身环境保护事业的志向，课程的教学效果也会随之提高。例如，在废水生物处理的微生物学原理部分，笔者介绍了这几年比较受关注的利用好氧颗粒污泥处理高负荷、强毒性有机废水的新工艺，解析了活性污泥微生物胞外聚合物在好氧颗粒污泥形成中的作用以及生物处理系统由于污泥浓度大幅增加而带来的高效性，来强调通过利用微生物的生理生化特性进行废水处理技术的革新。学生对这些新内容的反馈很活跃，也引发了很多讨论。
教学方法的改革和创新
随着计算机技术的迅猛发展和现代社会的快速信息化，传统的、单一的灌输式教学方法难以取得满意的教学效果，也无法满足当前创新型人才的培养要求。大学课堂的教学必须与时俱进，应借助多媒体、网络以及最新的科研成果和成功的工程实例，来丰富教学的内容和形式，提高教学效率和效果［2］。根据实验心理学的原理，对于同样的信息，图像比文字容易被信息接受者所记忆，这就是所谓的“图象优势定律”［3］。在传授以叙述性为主的知识内容时，合理使用形象思维方法，可以帮助学生提高记忆力；而信息的几何形状、色彩、字符对形象思维的建立起着相当大的作用。环境工程微生物学的研究对象是肉眼看不见的微小生物，在教学中通过展现大量生动形象的微生物照片，可以使学生容易认识和区分种类繁多的微生物，印象深刻，易于激发学习兴趣。例如，在比较G＋和G－细菌的结构时，通过对细胞图片的详细讲解可以清楚地说明二者的区别：G－细胞由胞外到胞内依次为外膜、细胞壁、周质空间及原生质膜，而G＋则为细胞壁、原生质膜；同时，G－细菌的细胞壁上仅有一层很薄的肽聚糖，但脂肪层较厚，相反G＋细菌的细胞壁含有多层肽聚糖，而脂肪却相对较少。这样，学生对G＋和G－细菌细胞壁差别的认识就会十分深刻，为此后顺利开展革兰氏染色实验提供了理论基础。在介绍微生物代谢、遗传等较为抽象的知识内容时，教师可以合理采用示意图、动画等形式来进行讲解，将有效提高学生对知识的理解和掌握水平。例如，在微生物的遗传和变异一章中，笔者采用Flas演示了微生物遗传的经典转化实验即肺炎链双球菌感染小白鼠实验，使原本抽象难懂的概念和理论变为生动的画面，教学效果明显改善。事实上，国内外一些著名高校、环境微生物实验室的网站上和国外优秀原版微生物教材中有许多高质量的微生物图片、教学课件和研究成果，教师可以将其作为本课程的教学素材来加以使用，丰富教学内容，开阔学生视野。
大学阶段的人才培养正日益与科学技术和社会生产的发展紧密联系，这就要求“环境工程微生物学”的教学要注重结合科学研究和工程实践，不断地加入新的科研成果和工程实例来说明课程的基本知识和基础理论。同时教师也不能脱离科学研究和工程实践而单纯地搞教学工作。只有长期参加科研实践的教师，才能使自已的教学内容更加具有前沿性、独创性和启发性，在丰富自己的教学内容的同时加深学生对知识的理解；也只有将教学与工程实践有机结合起来，才能更有效地激发学生的学习兴趣，培养学生解决实际问题的能力［4］。例如，笔者在教学过程中选取了微生物燃料电池研究中最新发现的细菌鞭毛充当“纳米导线”的现象作为背景材料，展开讨论，分析了细胞鞭毛的电子传递功能在物质转化和能量代谢中发挥的作用。这个例子在介绍微生物学知识的同时，很好地诠释了如何恰当地利用微生物的特性来解决环境问题和实现可持续发展。又如，通过介绍实际工程项目———煤气废水生物处理系统中活性污泥的驯化过程，说明了微生物遗传和变异的特性对于有毒有害工业废水处理的重要意义。
在当前大学教学中，课时的有限性与知识的增长性之间的矛盾日益突出，“环境工程微生物学”这门新兴的交叉学科尤为如此。所以，教师在授课时，应更加注重所介绍内容的质和量，将多而杂的信息进行疏理与归纳，并以更加灵活的方式传达给学生。这就要求教师在教学模式上进行变革，改变以往单一的注入式教学方法，采用多种方法有机结合的教学模式，将教师的主导作用和学生的主体地位相结合，从而在传授知识的同时提高学生的创新能力和综合素质。研究表明，提问、引入和讨论等启发式教学方法比起传统的注入式教学模式更为吸引人，更能收到事半功倍的效果。一方面，启发式教学可以促进师生之间的互动，活跃课堂气氛，激发学生浓厚的学习兴趣；另一方面，启发式教学可以培养学生将书本知识应用于实际的思考和分析等综合能力。总体来讲，一些基础性知识的教学，可以以教师讲解为主，但讲解的内容要少而精，留一部分内容让学生自己去消化吸收。对于理解性的知识内容，教师要启发学生积极思考，有些问题要引而不发，导而不讲，让学生自己通过分析和总结来深化认识。此外，还应注意到高年级本科学生已经具有一定的自学能力，对于一些比较浅显的、多门环境类课程反复涉及的章节内容或非核心知识单元，完全可以安排由学生自学来完成。例如，在讲解微生物在氮素循环中的作用时，笔者详细介绍了硝化作用、反硝化作用等生化反应过程及其影响因素，所以在讲解废水微生物的脱氮原理时，采取了“学生自学为主，教师组织讨论和总结”的教学方式。这种教学方式既节省了课时，同时又锻炼了学生的自学能力、认识能力和分析能力，为以后的科研创新打下基础。#p#分页标题#e#
实验项目和实验内容的挑选和设置
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关键词：高师 微生物学 教学改革
中图分类号：G64 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）02（b）-0205-01
微生物学是我国高等学校生物学科学生必修的一门基础课程，它的主要任务是要给予学生基础的、系统的微生物学基础知识、基本理论和实践操作技能。随着现代生命科学的迅速发展，微生物学的基本理论和应用研究变得异常活跃。与生产实践及日常生活的关系也变得日益密切，这必然对微生物学教学提出了更高的要求。高师生物教育专业，在教学内容和教学方法上，因其专业的特殊性而显示出与其他院校生物类专业不同的教学特色，本研究者结合近几年的教学经验，对生物教育专业微生物学教学进行了初步的改革和探索，现总结如下。
1 紧扣专业培养目标，构建课程内容体系
高师院校的培养目标是从事教学和教学研究的教师人才。作为教师，要成功完成教学任务，首先要精通所教学科的知识，还要掌握该学科的最新进展情况，尽量成为该学科的专家。因此本课程的教学本着突出重点、突破难点、理论与实际相结合的教学指导原则，以研究微生物的基本生命活动规律为目的，教学内容的安排以形态结构、生理代谢遗传变异、生态分布和分类进化五大生物学规律为主线[1]。在微生物形态结构中强调微生物的结构特点、分子组成和功能，突出结构与功能的统一，为以后各章节中介绍微生物的营养、代谢、生长、遗传变异、免疫等生物学规律做好铺垫，而在后继内容的讲授中又时时与微生物结构的特点、功能相联系。通过这条主线，加强了学生对所学知识的前后联系，加深了学生对课程内容全面系统的理解和掌握。与此同时我们密切关注本学科在各行业中的发展应用，关注与之有关的各种新闻报道，适当地增加一些当前的新技术、新问题、新知识，如“超级细菌”、“甲流”病毒，细菌可利用“毛发”清除铀污染等，这些内容在以往的通编教材上都没有，需要及时给学生传达，使学生了解学科知识的最前沿。
2 明确实验教学目标，改革实验教学
高师大部分毕业生将来都要走上中小学教育岗位，所以在实验课程体系的建设及实验教学的组织安排上应密切联系中小学生物教育实际，体现师范性和自身特色，在实验课程的设置上，首先应扩大实验课时所占比例，确保学生有更多的时间探究问题，锻炼实验操作技能，为毕业生尽快胜任以后的中小学教师实验教学工作做好准备。因此我们改变了以往安排实验学时占总学时的25%增加到占总学时的50%。以安排较多时间进行实验，并力求在实验内容上进一步加强微生物学独特的实验操作技术的训练。其次，在实验教学中，教师应该明确把握实验教学目标，（1）加强基本实验技能的训练，教师在讲课时只需讲明该实验的技术要点、注意事项。力求少而精，多设疑、启发、引导，让学生有更多的空间去主动思考、探讨和发挥，对于实验演示，教师需要在实验之前进行，学生在周围观看，可能造成少部分学生看不清教师演示或记不住等的情况，因此，在实验过程中出现操作不规范甚至错误的现象，如果得不到教师的及时纠正，容易养成不好的实验习惯，所以指导教师经常给予学生耐心细致的指导，从而保证实验教学效果。使学生技术娴熟，动作规范，体现出师范性；（2）新课改倡导在教学过程中，应与学生积极互动、共同发展，要处理好传授知识与培养能力的关系，注重培养学生的独立性和自主性，引导学生质疑、调查、探究，在实践中学习，促进学生在教师指导下主动地、富有个性地学习。因此高师微生物学实验的改革把学生设计实验能力、结果的处理和分析能力作为日常实验教学的重中之重，提高每一位准教师的生物科学素养。为学生今后走向工作岗位打下坚实的基础。
3 传统教学手段与多媒体技术相结合进行教学
传统的板书、话音、挂图和实物，黑板加粉笔的教学方法固然有其弊端，但对于基础知识的掌握还是有其不可替代的优势，多媒体课程教学的优势在于：能将枯燥的文字信息转化成图形、图像，辅助以动画、视频、音频等信息，以声图并茂的信息传播方式把知识内容生动形象地展示给学生，让学生更加容易理解和掌握，增加信息量和信息密度、提高授课的效率[2]，在同样的课堂，可以拓展课外知识和丰富学生的知识面。但完全依赖多媒体教学，又会出现容量大，难以吸收等弊端，因此，我们把多媒体教学与传统教学方式结合在一起，达到“优势互补”，既发挥多媒体教学的优势，又发挥教师的主导作用。更加有利于课堂教学，提高教学质量和教学效果。
4 建立健全学生的评价机制
过去的微生物学仅进行理论课考试，对实验操作能力没有很好的进行评价，为满足教学改革的需要，对考试内容、考试方式和评价方式进行了一系列改革。考试内容由单一的理论考试改为理论加操作，考试增加操作技能考核部分的权重，有利于全方面考核学生学习效果。其次，微生物学课程建立了试题库，实行考教分离，因此在课程开始进行之初就给学生明确说明考核制度，使学生从一开始就养成好好学习、认真操作的好习惯，对改变一些懒惰、投机取巧学生的学习态度具有较好的效果。
综上所述，在高师微生物学教学过程中，教师应结合高师的培养目标采用多媒体与传统教学相结合的教学手段和方法，充分发挥学生学习的主体性，促进学生基础知识和实际操作技能的培养，提高每一位准教师的生物科学素养。
参考文献
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>> 食品微生物安全的风险评估 食品中微生物安全及检验的质量控制研究 食品微生物检验的质量控制研究 食品微生物检测中的质量控制 食品加工过程中如何控制微生物 食品微生物检测技术进展及研究 食品微生物检测技术的进展及研究 食品中微生物菌落总数的研究 冷冻食品微生物危害现状及预防措施分析 食品中微生物的检测 食品微生物之水产品中的微生物检验方法研究进展 工业循环冷却水中微生物的危害及控制浅析 微生物定量风险评估第2版 饮用水处理中活性炭池微生物风险评估 我国肉类食品微生物安全现状及控制检测技术 水果罐头加工过程中的微生物危害研究 食品微生物检验质量控制 食品微生物检验的质量控制 食品微生物检测的质量控制管理 论食品微生物检验中培养基的质量控制措施 常见问题解答 当前所在位置：.
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