表观遗传学现象范文

导语：如何才能写好一篇表观遗传学现象，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

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关键词：遗传性出血性毛细血管扩张症；肝脏；计算机断层扫描；血管造影

遗传性出血性毛细血管扩张症（Hereditary hemorrhagic telangiectasia， HHT），又称Osler-Rendu-Weber病，是一种以出血和血管扩张为主要特征的常染色体显性遗传的血管发育异常性疾病。常见受累器官有皮肤、指（趾）、结膜、口、舌、胃肠道、肺、眼、肝及脑等，最常见的临床表现是鼻衄和胃肠道出血。以往肝脏受累少有报道，约8%～10%的HHT患者可累及肝脏[1]，近年来更多研究指出HHT患者肝脏受累并不少见，有学者报道肝脏受累率可高达41%～78%[2]。然而许多临床和影像医师因缺乏对本病的认识而误诊。为提高对本病的认识，分析我院6例HHT累及肝脏患者的临床及影像资料，探讨其影像学特征，便于及早正确诊断。

1 资料与方法

1.1病例资料 搜集我院2004年6月～2013年6月经HHT的诊断标准确诊为HHT的6例患者。女3例，男3例，年龄10岁～47岁，病程2月～17年不等，2例有家族史。HHT诊断采用2000年HHT基金科学顾问委员会临床诊断标准[3]：（1）反复自发性鼻出血；（2）多个特征性部位受累，如唇、口腔和鼻粘膜、手指等处；（3）内脏受累，如消化道、肺、肝脏、脑等。（4）阳性家族史。具备以上3项者可明确诊断，符合两项为可疑。

1.2检查方法 所有患者彩超及多层螺旋CT检查均在一周内完成。腹部CT检查采用多层螺旋CT（Lightspeed Plus，GE）行螺旋增强扫描。扫描层厚和间隔为5mm，行2.5mm层厚及1.25mm间隔重建；采用300～350mgI/ml非离子型对比剂，总量按1.5ml/kg，注射速度3.5mL/s，动脉期延迟25s，静脉期延迟80s扫描。原始数据传至ADW 4.3工作站，对所得数据行容积再现（volume rendering，VR）、多平面重组（multi-planar reformation， MPR）和最大密度投影（maximum intensity projection，MIP）等多种二维、三维图像处理技术，以充分显示病变血管。其中3例另行胸部和脑部CTA扫描，分别延迟18s、15s扫描，其他扫描条件同腹部。其中3例患者另行肝动脉DSA检查，采用sidinger法插管造影，将导管端置于肝固有动脉和肠系膜上动脉造影。 4例行二维和多普勒超声检查。4例患者另行胃肠镜检查。

2 结果

2.1 临床表现 本组HHT以无明显诱因乏力、腹胀为主，其他表现为鼻衄、贫血、纳差、活动后胸闷、气喘等。实验室检查：RBC（ 0.72～4.80）×1012/L，2例正常，4例表现为不同程度的贫血；血红蛋白（66～146）g/L，3例偏低，3例正常；6例乙肝标志物均阴性，1例HBcAb阳性。

2.2 CT表现 平扫示2例肝脏增大，2例肝脾增大，肝脏密度不均，内可见不规则灶状稍低密度影。动脉期示肝实质强化不均，内散在灶状、小片状强化的血池；4例可见肝静脉及门静脉增粗并提前显影，2例单见门静脉提前显影，肝静脉直径最粗约13.4mm，门静脉最粗约16.6mm；6例均见肝总动脉及其分支迂曲、增粗，肝总动脉直径6.8～12.1mm，肝内分支增粗、迂曲达肝脏边缘。3例患者可见肝脏供血动脉的变异：1例肝左动脉起自增粗的胃左动脉，而肝右叶供血的两支小动脉均直接起自腹腔干；1例肝固有动脉起自肠系膜上动脉；另1例可见起源于右锁骨下动脉的膈下动脉沿纵隔、心包至膈下向肝脏供血；1例并发脾动脉瘤；门静脉期部分病灶持续强化，同时肝实质强化，肝动脉密度减低，门静脉及肝静脉显示更清晰；2例可见肝内胆管轻度扩张。以动脉期VR观察肝动脉总体情况较好；以MIP显示肝动脉扩张及肝内异常强化的血管团最佳；MPR有利于多平面多角度显示病变。胸部CT扫描发现3例患者肺血管畸形，但3例脑部CT均无阳性发现。

2.3 DSA表现 3例均见肝动脉及其分支明显增粗、迂曲，可见变异血管分支向肝内供血。肝实质呈弥漫性团块状染色，肝静脉提前显影。肠系膜上动脉造影显示门静脉期向肝性血流，门脉主干及肝内分支增粗，部分分支早显。

2.4 彩色多普勒超声表现 4例肝大，回声增强，肝动脉迂曲扩张，CDFI：呈五彩镶嵌状彩色血流，流速快，阻力低，呈湍流型频谱。4例肝静脉近心端内径增宽，肝实质内可见团片状较强回声结节。

2.5 胃肠镜表现 4例行胃肠镜检查均示慢性红斑性胃炎，其中2例示陈旧性出血性胃底炎。

3 讨论

HHT是一种血管壁发育异常的常染色体显性遗传病，遗传性、血管畸形和出血素质三联症为其特征。其分子基础与Endoglin、ALK l和Smad 4基因突变有关，上述基因突变造成其编码蛋白在血管内皮细胞上表达的单倍剂量不足，缺乏维持正常结构足够的蛋白，血管壁弹力纤维及平滑肌缺乏，管壁变薄，完整性受损，导致毛细血管扩张、动静脉畸形和动脉瘤。病变血管可因轻微外力发生破裂[4]。据此将其分为3型：HHT 1型通常为Endoglin基因突变所致，HHT 2型和HHT 3型分别为ALK 1和Smad 4基因突变所致[5]。尽管HHT的基因与表型的相关性尚不确定，但研究发现肺受累者多为HHT1型，而肝脏受累多为HHT2型[6]。

文献报道肝脏HHT的典型表现是肝内血管的异常分流，这种异常分流主要是肝动脉-肝静脉分流，而肝动脉-门静脉分流、门静脉-肝静脉分流较为少见[7]。但本组病例肝动脉-门静脉分流更多见，可能与病例数较少有关。

CT表现为肝动脉显影的同时门静脉提前并持续显影，其强化程度与动脉类似。以早动脉期显示为佳。本组4例门静脉和肝静脉均提前显影，提示肝动脉同时向门静脉和肝静脉分流。发生于动脉期的肝脏一过性灌注异常，反映正常肝脏双重供血和动静脉瘘分流的变化，被认为是动静脉瘘的间接征象[8]，表现为边界清晰的呈叶段或亚段分布动脉期短暂强化，门脉期呈等密度。文献报道约13% HHT患者可见肝动脉供血变异[8]，本组3例患者显示异常动脉供血，准确描述肝动脉变异有助于指导肝移植手术方案的制定。本组2例可见轻度胆管扩张，可能由于肝动脉扩张挤压胆管或肝动脉向静脉分流导致胆管缺血、坏死甚至肝坏死。本组病例动脉期肝实质内大小不等的灶状、片状强化较门脉期显示明显，其病理基础可能为小的毛细血管扩张和大的融合的血管团[9]。对于HHT累及肝脏的CT表现，以动脉期显示较佳。 CT血管成像可以多角度观察清晰显示肝内畸形血管，通过MIP、MPR、VR等重建技术可清晰显示病变的大小、位置、数量及其供血动脉、引流静脉等信息，为临床治疗方案的选择提供充分依据 。

彩超可以显示肝内动脉及静脉情况，发现动静脉瘘和血管畸形，能动态观测动静脉和门静脉血流状况，且操作方便、无创、方便，适合筛查及定期复查。但其空间分辨率低和整体显示差，难以提供病变的详细解剖情况及病灶具置，因而应用价值有限。CT血管成像可以多角度观察清晰显示肝内畸形血管，通过MIP、MPR、VR等重建技术可清晰显示病变的大小、位置、数量及其供血动脉、引流静脉等信息，为临床治疗方案的选择提供充分依据。DSA虽为有创检查，但对有症状HHT病人的血流动力学测定、对出血病人行栓塞治疗和肝脏移植术前计划制定仍是有效的手段。本组2例DSA证实了CT血管成像的诊断。

综上所述，肝动脉-肝静脉分流、肝动脉-门静脉分流、上述分流共存、肝实质一过性灌注异常、小的毛细血管扩张、大的血管融合性团块、肝动脉迂曲扩张、肝动脉解剖变异、门静脉高压等是HHT累及肝脏的较特征性CT和DSA表现，结合临床表现及家族史，可对HHT做出正确诊断。

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1 DNA甲基化和组蛋白乙酰化

1.1 DNA甲基化 DNA甲基化是指在DNA复制以后，在DNA甲基化酶的作用下，将S-腺苷甲硫氨酸分子上的甲基转移到DNA分子中胞嘧啶残基的第5位碳原子上，随着甲基向DNA分子的引入，改变了DNA分子的构象，直接或通过序列特异性甲基化蛋白、甲基化结合蛋白间接影响转录因子与基因调控区的结合。目前发现的DNA甲基化酶有两种：一种是维持甲基转移酶；另一种是重新甲基转移酶。

1.2 组蛋白乙酰化 染色质的基本单位为核小体，核小体是由组蛋白八聚体和DNA缠绕而成。组蛋白乙酰化是表观遗传学修饰的另一主要方式，它属于一种可逆的动态过程。

1.3 DNA甲基化与组蛋白乙酰化的关系 由于组蛋白去乙酰化和DNA甲基化一样，可以导致基因沉默，学者们认为两者之间存在串扰现象。

2 表观遗传学修饰与恶性肿瘤耐药

2.1 基因下调导致耐药 在恶性肿瘤中有一些抑癌基因和凋亡信号通路的基因通过表观遗传学修饰的机制下调，并与化疗耐药有关。其中研究比较确切的一个基因是hMLH1，它编码DNA错配修复酶。此外，由于表观遗传学修饰造成下调的基因，均可导致恶性肿瘤耐药。

2.2 基因上调导致耐药 在恶性肿瘤中，表观遗传学修饰的改变也可导致一些基因的上调，包括与细胞增殖和存活相关的基因。上调基因FANCF编码一种相对分子质量为42000的蛋白质，与肿瘤的易感性相关。2003年，Taniguchi等证实在卵巢恶性肿瘤获得耐药的过程中，FANCF基因发生DNA去甲基化和重新表达。另一个上调基因Synuclein-γ与肿瘤转移密切相关。同样，由表观遗传学修饰导致的MDR-1基因的上调也参与卵巢恶性肿瘤耐药的形成。

3 表观遗传学修饰机制在肿瘤治疗中的应用

3.1 DNA甲基化抑制剂 目前了解最深入的甲基化抑制剂是5-氮杂脱氧胞苷（5-aza-dc）。较5-氮杂胞苷（5-aza-C）相比，5-aza-dc首先插入DNA，细胞毒性比较低，并且能够逆转组蛋白八聚体中H3的第9位赖氨酸的甲基化。有关5-aza-dc治疗卵巢恶性肿瘤的体外实验研究结果表明，它能够恢复一些沉默基因的表达，并且可以恢复对顺柏的敏感性，其中最引人注目的是hMLH1基因。有关地西他滨（DAC）治疗的临床试验，研究结果显示，结果显示：DAC是一种有效的治疗耐药性复发性恶性肿瘤的药物。 转贴于

3.2 HDAC抑制剂 由于组蛋白去乙酰化是基因沉默的另一机制，使用HDAC抑制剂（HDACI）是使表观遗传学修饰的基因重新表达的又一策略。根据化学结构，可将HDACI分为短链脂肪酸类、氯肟酸类、环形肽类、苯酸胺类等4类。丁酸苯酯（PB）和丙戊酸（VPA）属短链脂肪酸类。PB是临床前研究最深入的一种HDACI，在包括卵巢恶性肿瘤在内的实体肿瘤（21例）Ⅰ期临床试验中有3例患者分别有4~7个月的肿瘤无进展期，其不良反应是短期记忆缺失、意识障碍、眩晕、呕吐。因此，其临床有效性仍有待于进一步在Ⅰ、Ⅱ期临床试验中确定。在VPA的临床试验中，Kuendgen等在对不同类型血液系统肿瘤中使用VPA进行了Ⅱ期临床试验，结果显示，不同的患者有效率差异甚远。辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）是氯肟酸类中研究较深入的一种HDACI。其研究表明，体内使用安全剂量SAHA时，可有效抑制生物靶点，发挥抗肿瘤活性。大量体外研究结果显示，联合使用DNA甲基化抑制剂和HDACI会起到更明显的协同作用。

3.3 逆转耐药的治疗 Balch等使用甲基化抑制剂—5-aza-dc或zebularine处理卵巢恶性肿瘤顺柏耐药细胞后给予顺柏治疗，发现此细胞对顺柏的敏感性分别增加5、16倍。在临床试验中，Oki等将DAC和伊马替尼（imatinib）联合使用治疗白血病耐药患者，结果说明，应用表观遗传学机制治疗恶性肿瘤确实可以对化疗药物起到增敏作用，并且在一定范围内其疗效与体内表观遗传学的改变呈正比。Kuendgen和Pilatrino等对HDACI和化疗药物的给药顺序进行研究，结果显示，在使用VPA达到一定血清浓度时加用全反式维甲酸可增加复发性髓性白血病和骨髓增生异常综合征患者的临床缓解率，这可能与VPA引起的表观遗传学改变增加患者对药物的敏感性有关。

4 展望

总的来说，应用表观遗传学修饰机制治疗肿瘤具有良好的应用前景，与传统化疗药物联合来逆转耐药，将给攻克恶性肿瘤等疾病带来新的希望。

参 考 文 献

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基因行为有“开关”

基因可以解释部分隔代遗传现象，但不能解释全部。有一种神秘机制，超越基因，在它的作用下，你可能最大限度地与所处环境相适应，但也可能生病、郁闷或二者兼具。如今，越来越多的科学家相信，这一神秘机制“出轨”，正是肥胖症等“生活方式病”席卷全球的原因。这就是所谓的“胚胎计划”现象，即基因与环境积极互动，使生物尽可能存活。

这种化学变化影响基因行为――在不改变脱氧核糖核酸（DNA）序列的情况下，激活和关闭基因行为或使之低调发挥的机制，称作“表观遗传”。每个有生命的生物体都有一个基本的表观基因组，相当于控制基因功能的“使用手册”。在整个生命中，生物体通过与环境互动编辑“使用手册”，不断添加或删除“使用说明”。

环境影响可遗传

生物学家长期以来认为，当遇上卵子，原有的表观遗传信息将被胚胎删除。如今，越来越多的证据表明，在基因本身不发生任何变化的情况下，环境对基因产生的影响可代际遗传。

2006年，美国研究人员发现，怀孕时吸烟的女性，其孙辈可能患哮喘。通过研究瑞典某农村聚居区19世纪90年代以来的资料，研究人员发现，青春期以前营养摄入充足的男性，与在饥饿中长大的男性相比，其孙辈患糖尿病几率高4倍。

上述现象表明，青春期是对外界环境影响最敏感的阶段；而女性的卵子在母体还是胚胎时就已产生。由此推断：原有的表观遗传信息并未在代际传承间遭“抹杀”，胚胎的DNA中仍存有和卵子形成初期对外部环境的部分记忆。

英国剑桥大学桑格研究所斯蒂芬・贝克博士说，只要搞清健康组织中的表观基因组是什么样，就能知道病变组织的表观基因组出了什么问题，“从理论上说，这将为研究所有疾病铺平道路”。

心病来自出生前

最新研究显示，表观遗传因素不仅影响人的身体素质，还能诱发心理疾病。尽管心理疾病具有遗传性，但单纯的基因研究无法做出解释。

心理学家耶胡达20世纪90年代初在美国开办了心理诊所，专门收治纳粹大屠杀幸存者。奇怪的是，病人中数量最多的并非幸存者本人，而是他们的后代。这些人虽未经历大屠杀，却也为心理焦虑和情感障碍所困扰。

2001年“9・11”恐怖袭击给耶胡达的研究提供了机会。直接因“9・11”留下心理创伤的人并没有预计的那样多。于是，她把187名“9・11”时正怀孕的女性作为研究对象。她们当时距离爆炸中心非常近，后来均患上了“创伤后应激障碍”。她们的婴儿出生一年后，压力激素水平显示，其心理处于高度焦虑状态。

也许有人会说，那些母亲因为基因的缘故更容易患上心理疾病，并把这些基因遗传给下一代，但有一种现象让我们相信这是“胚胎计划”所致，即只有“9・11”发生时离预产期少于3个月的母亲，她们的孩子更易产生心理焦虑。”

细胞“失忆”可防病

表观遗传学有助于各种疾病的病因研究取得巨大突破，那么如何预防和治疗疾病呢？英国心理学家汉森说：“如果要改变肥胖症的表观遗传，父母得在分娩甚至受精前就处于健康状态。”汉森建议，从长远来说，更有效的做法并不是把肌肉松弛的成年人骗进健身房，而是在青春期就养成健康的生活习惯。

如何通过修补表观遗传过程预防疾病？汉森和格卢克曼公布的一项实验显示，给按照“设计”一定会发胖的老鼠注射激素，该激素具有欺骗性，会给老鼠身体传递“已经胖得可以”的虚假信息。老鼠们每天吃高热量食品，其中未接受激素注射的老鼠迅速发胖，并患上高血压和糖尿病；接受激素注射的老鼠则依然苗条。这是全球首例胚胎计划可被逆转或干预的证据，在医学界轰动一时。

这并不是说，为预防肥胖症，在孩子刚降生时，父母就要给他们注射激素。但重塑个体、使之与外界环境更协调的可能性的确激动人心。为把可能变成现实，赖克目前把从DNA中删除表观遗传标记列为第一步，之后将试图“‘说服’细胞放弃它们承载的信息，重新成为干细胞”。

上述设想没有一项可能在短期内用于临床，但癌症专家正在研发一种新药，删除基因中的表观遗传改变，激活本不该关闭的基因行为。此种药物可用于白血病等疾病的治疗。

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摘要：乳腺癌是女性常见肿瘤，近年来发病率逐年上升，乳腺癌易感基因1（BRCA1）已经证实与乳腺癌的发生发展有密切关联。新辅助化疗在乳腺癌综合治疗中的作用已得到广泛证实，是对非转移性的肿瘤在局部治疗前进行的全身性的、系统性的细胞毒性药物治疗。可以显著降低乳腺癌患者临床分期，提高患者生存率和生存期限，最常适应于乳腺肿瘤较大或有大量淋巴结转移者，近来新辅助化疗逐渐应用于早期乳腺癌患者。有研究报道乳腺癌患者BRCA1 基因表达水平高低与新辅助化疗敏感性有关，可以解释乳腺癌患者接受新辅助化疗后有无缓解。

关键词：乳腺癌；新辅助化疗；BRCA1 基因

乳腺癌在全世界范围内是最常见的女性肿瘤之一，占所有肿瘤的23%。每年约有1百万新增病例。美国癌症社会（American Cancer Society）发现，乳腺癌死亡率从1990年来一直在稳定下降，这得益于早期诊断的出现和越来越规范的治疗体系。乳腺癌在中国大陆地区女性常见死亡原因中排名第四。随着乳腺癌的发病率的提高，年轻女性患者也越来越常见，这可能主要与饮食逐渐西化，久坐的生活方式，生育的延迟以及外界环境中化学物质的污染有关。 1新辅助化疗与乳腺癌BRCA1基因甲基化 乳腺癌易感基因（BRCA1）是1990年Hall等发现，与乳腺癌发生有紧密联系的一组基因[1]，是主要的乳腺肿瘤易感基因。BRCAl基因定位于17q2l，长约81 Kb。共有24个外显子，其中第1、4号外显子不编码氨基酸，第11号外显子最长，约3.4 Kb，占整个编码区的61％[2]。BRCA1基因突变的乳腺癌患者有独特的病理学特征和基因表达方式。现在相关研究人员正在对不同人群中乳腺癌患者BRCA1基因突变的范围进行调查，我国台湾地区的调查提示BRCA1基因突变与乳腺癌的发生关联不大[3]。BRCA1基因启动子甲基化被认为是基因表达缺失的机制之一，并且在9~32%的散发性乳腺癌中有表达。Hsu[4]等发现BRCA1基因启动子甲基化在56%的早期散发性乳腺癌患者中存在。大多数BRCA1基因甲基化的肿瘤中BRCA1蛋白表达缺失或明显减少,表明在这些肿瘤中存在表观遗传基因沉默。BRCA1基因启动子甲基化的乳腺癌患者的雌激素受体和基底细胞表型表达下降[5]。 散发性乳腺癌患者虽然未发现体细胞BRCA1基因突变，但也存在其他机制导致BRCA1基因的失活[6]。表观遗传学修饰所致的基因沉默被认为是肿瘤抑制基因失活的重要机制。启动子CpG岛高度甲基化可致BRCA1表达缺失。表观遗传学上BRCA1基因失活和源于BRCA1基因突变者肿瘤中普遍的病理学特征有关。之前有统计证实大约10%的散发性乳腺癌患者中存在BRCA1基因CpG岛区高度甲基化[7]。表观遗传学中BRCA1基因沉默所致的基因变化与BRCA1基因突变肿瘤中观察到的变化相似。这些发现证实了表观遗传学中BRCA1基因失活在散发性乳腺癌发生发展中起到了重要的作用。目前还不是很明确表观遗传学的失活和BRCA1基因转录沉默是否与散发性乳腺癌中的三阴性乳腺癌或基底细胞样乳腺癌特异性相关，一些研究报道的数据提示BRCA1基因表达缺失和三阴性乳腺癌相关，其他亚型则无[8]。 2新辅助化疗与乳腺癌BRCA1基因表达 乳腺癌易感基因1（BRCA1）通过转录伴随核苷酸切除修复在DNA修复中起着重要的作用。有报道散发性乳腺癌患者同时存在BRCA1甲基化和BRCA1的mRNA的表达缺失的情况。散发性乳腺癌患者中躯体BRCA1突变较为少见。然而大约30%的散发性乳腺癌和70%的卵巢癌患者中BRCA1基因存在表观遗传学调控下降的现象[9]。BRCA1表达能调节对化疗的细胞应答。临床乳腺癌研究提示BRCA1在预测对DNA损伤媒介和紫衫类为基础的化疗的应答中起到一定作用。 BRCA1 mRNA表达水平可以作为生存率的最强的预测指标。BRCA1基因在DNA修复中起着至关重要的作用。散发性乳腺癌BRCA1表达降低与基因突变无关，与BRCA1基因启动子获得甲基化及调控BRCA1基因表达的上游通路异常有关[10]。 BRCA1基因编码在S期和G2期表达的细胞周期调控蛋白。在非小细胞肺癌中，患者生存率较低可能与BRCA1基因过度表达相关。在散发性乳腺癌中，BRCA1基因表达下降或缺失与肿瘤等级高，淋巴结分期高，肿瘤较大，侵袭血管，雌激素受体阴性，孕激素受体阴性及结局不好相关。BRCA1基因起着多功能的作用，在很多正常细胞功能中都有涉及。因此，功能性BRCA1基因表达缺失可能对化疗的细胞应答有重要影响，尤其对用DNA损伤介质处理的患者可能有预测价值。 3展望 乳腺癌对新辅助化疗的应答与生存率息息相关。从新辅助化疗获得最大生存获益的患者即对新辅助化疗完全应答。我们使用蒽环类药物治疗后BRCA1 表达水平作为疾病进展时间和总生存率的标记物,研究提示BRCA1 mRNA表达水平较低的散发性乳腺癌患者可能从蒽环类药物为基础的化疗中得到最大获益。一部分散发性乳腺癌患者BRCA1表达较低下，使用以DNA损伤为基础的化疗药物后，BRCA1基因突变携带者与BRCA1基因未突变携带者相比更可能达到病理完全缓解。使用以铂类为基础的化疗药物后，BRCA1 mRNA表达较低的散发性卵巢癌患者较BRCA1 mRNA表达较高患者有更长的生存期。 参考文献： [1]Watanabe Y,Maeda I,Oikawa R,et al.Aberrant DNA methylation status of DNA repair genes in breast cancer treated with neoadjuvant chemotherapy[J].Genes Cells,2013,45（4):89-95. [2]Alili C,Pages E,Curros Doyon F,et al.Correlation between MR imaging-prognosis factors and molecular classification of breast cancers[J].Diagn Interv Imaging,2014,95(2):235-242. [3] Raphael J,Mazouni C,Caron O,et al.Should BRCA2 mutation carriers avoid neoadjuvant chemotherapy[J].Med Oncol,2014，31(3):850-855. [4] Mulligan JM,Hill LA,Deharo S,et al.Identification and validation of an anthracycline/cyclophosphamide-based chemotherapy response assay in breast cancer[J].J Natl Cancer Inst,2014，106(1):335-342. [5]Rovera F,Chiappa C,Coglitore A,et al.Management of breast cancer during pregnancy[J].Int J Surg,2013,11(4):64-68. [6]Badora A,Kaleta B,Nowara E,et al.Multiple primary malignancies in BRCA1 mutation carriers--two clinical cases[J].Ginekol Pol,2013，84(10):892-896. [7] Huszno J,Budryk M,Ko?osza Z,et al.The influence of BRCA1/BRCA2 mutations on toxicity related to chemotherapy and radiotherapy in early breast cancer patients[J].Oncology,2013，85(5):278-282. [8] Ratanaphan A.A DNA Repair BRCA1 Estrogen Receptor and Targeted Therapy in Breast Cancer[J].Int J Mol Sci,2012,13(11):14898-14916. [9] von Minckwitz G, Martin M. Neoadjuvant treatments for triple-negative breast cancer(TNBC)[J].Ann Oncol,2012,32(5):35-39. [10]Sousa B,Cardoso F.Neoadjuvant treatment for HER-2-positive and triple-negative breast cancers[J].Ann Oncol,2012,23(4):237-242.编辑/许言

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关键词：DNA甲基化，DNA甲基转移酶，CpG岛，肿瘤

引言

基因组表观遗传学是相对于传统的遗传学而提出的一个概念，其研究的不是基因序列的改变，而是研究基因组的修饰变化所引起的基因表达改变。这种修饰是可遗传的，可对生物体产生长期效应[1]。DNA甲基化是表观遗传学的一个重要研究内容，是由DNA甲基转移酶催化完成的，主要包括DNMT 1，DNMT 2和DNMT 3。研究表明，DNA甲基转移酶（DNMTs）缺陷而引起的基因表观遗传改变往往伴随着肿瘤的发生和发展。本文综述了近年DNMTs在肿瘤中的研究进展。

1 DNA甲基化现象

DNA甲基化是哺乳动物基因组最常见的修饰方式。它是在DNA甲基转移酶（DNMTs）的催化下，以甲硫氨酸为供体，将甲基转移到胞嘧啶的第五个碳原子上。DNA甲基化是一个可逆的过程，在体内同时存在着主动或被动的去甲基化过程。

2 DNA甲基转移酶（DNMTs）

DNA甲基化修饰是由DNA甲基转移酶催化完成的。目前为止，在哺乳动物体内主要存在三种DNA甲基转移酶，分别命名为DNMT 1，DNMT 2和DNMT 3。其中，DNMT 3又分为DNMT 3A和DNMT 3B两个亚型。DNMT 2，虽然具有与其他的DNMT同源的序列，并且能够甲基化小的tRNAs，但是目前通常认为它不是DNA甲基化酶。

2.1 DNMT 1

DNMT 1是第一个被克隆出来的DNA甲基转移酶。它由N-端的调节区，C-端的催化区组成，该酶的催化能力需要N-端和C-端的相互作用。但也有研究表明，DNMT1的半胱氨酸富集区可与未甲基化的CpG岛作用。这说明除了催化区域外，DNMT1的其他结构域与酶的活性有重要关系。DNMT 1可以维持基因组中的全部甲基化。一般认为，它主要负责在DNA复制的过程中保持原来的DNA甲基化状态。也就是说母链模板上某个位置的胞嘧啶被甲基化，在DNA复制时，DNMT 1就会识别这种半甲基化，催化子链相应位置的胞嘧啶发生甲基化。

2.2 DNMT 3

DNMT 3A和DNMT 3B都是由N-端的调节区，C-端的催化区组成，其C-端不需要与N-端相互作用就可以有催化活性，有很强的重新甲基化能力也具有保持甲基化的能力。最近一项研究发现，小鼠生殖细胞中存在新的DNA甲基转移酶DNMT3C。DNMT3C表现出与DNMT3B的高度一致性，并且专攻新的逆转录转座子的甲基化。除上述对哺乳动物的DNA甲基化必不可少的酶外，DNMT家族还包括另外两个成员，DNMT2和DNMT3L。DNMT3L没有催化活性，起调控作用，以DNMT3L-DNMT3A异四聚体的形式促进胞嘧啶残基甲基化。

2.3 DNMTs在肿瘤中的作用

近年来，DNA甲基化和人类疾病，尤其是和肿瘤之间关系引起研究人员的关注。许多研究发现，DNA甲基化模式的改变导致了肿瘤的发生。在很多肿瘤中都发现DNMTs的表达异常。这说明DNMTs在生物体内发挥着重要的作用。通过研究者对DNMTs损伤病人样本的研究，发现DNMTs的异常与肿瘤发展之间存在一定的关系。DNMTs的异常主要可分为三类：表达异常，突变和缺失。

2.3.1 DNMTs表达异常

在众多研究发现，DNMT表达异常可导致癌症的发生。DNMTs（DNMT1，DNMT3A，DNMT3B）的过表达导致某些基因高度甲基化和致癌因子激活。在实体瘤中，DNMT1过表达导致病人的淋巴结转移和预后不良。在大量的患有肿瘤的病人样本中发现DNMT3A或者DNMT3B高度表达，在肝细胞中，高表达的DNMT3A具有致癌作用[2]。DNMT3B和CTCF高表达对乳腺癌中的 BRCA1 失活至关重要[3]。此外，在某些肿瘤中也出现DNMTs表达降低的现象。如Cao等在胃癌的研究中发现，DNMT3A表达量明显下降。这些研究说明，DNMTs的表达异常和肿瘤密切相关。

2.3.2 DNMTs 突变

体细胞的DNMTs突变是许多肿瘤的显著特征，并且能够导致肿瘤的恶性转化[4]。在癌症基因组中发现，结肠癌中，DNMT1 失活引起的突变导致全基因组的甲基化状态改变[5]。在血液恶性肿瘤中存在DNMT3A突变。急性骨髓白血病（AML）和骨髓异常增生症（MDL）中DNMT3A频繁地突变[6]。此外，DNMT3A突变，特别是催化区域的突变会大幅降低酶活性[6]。这些研究表明突变的DNMTs在破坏基因组甲基化以及在肿瘤的形成中扮演着重要的角色。

2.3.3 DNMTs 缺失

研究发现，在成年小鼠中敲除DNMT3A后，诱发了造血干细胞的扩散[6]。此外DNMT3A缺失导致T细胞淋巴瘤和肺部肿瘤的发展。这些结果暗示DNMT3A可能作为肿瘤的抑制基因。还有研究表明，DNMT1有助于维持甲基化，缺失会导致DNA去甲基化，DNMT1对细胞淋巴瘤预防和维护是至关重要的。因此，DNMTs基因的缺失参与肿瘤的发展。

3 结语

DNA甲基化和DNA甲基转移酶与肿瘤的发生发展密切相关。DNMTs的表达异常，是肿瘤细胞的一个特征。因此DNMTs有望成为研发治疗癌症药物的靶点。另外，基于某些基因在肿瘤的发展进程中的重要作用，这些基因所具有的甲基化的特性则为肿瘤的诊断和治疗提供新的方向。

参考文献（References）

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[2]Zhao Z. Depletion of DNMT3A suppressed cell proliferation and restored PTEN in hepatocellular carcinoma cell

[3]Cai FF. Pyrosequencing quantified methylation level of BRCA1 promoter as prognostic factor for survival in breast cancer patient

[4]Baylin SB. A decade of exploring the cancer epigenome - biological and translational implications

[5]Vafadar-Isfahani N. ，Decoupling of DNA methylation and activity of intergenic LINE-1 promoters in colorectal cancer

篇6

关键词　遗传学实验　教学创新　开放式教学　实验管理

中图分类号：G423　文献标识码：A

现代生命科学以及由此衍生出的生物技术和生物工程与基因都发生着丝丝缕缕的联系。遗传学正是研究基因的科学。遗传学基础理论的发展和应用研究，已使工业、农业、林业和医药产业等相关领域发生了巨大变革。随着新技术、新方法的出现，遗传学的研究内容也正发生着深刻的变化，并导致社会对人才的基本素质提出了更高的要求。作为人才培养摇篮的高等教育，怎样适应学科发展的需要，在生命科学领域培养出创新型人才，是高等教育工作者一直在思考的问题。

遗传学实验教学作为理论教学的补充，不仅能验证教材上抽象的理论，辅助学生掌握知识，还可以训练学生动手能力和创新思维，可以有效地调动学生学习积极性。而传统的《遗传学》实验教学中存在着一些共有的问题：经典验证性实验多，探究性实验少，不能满足学生掌握新技术、新方法的要求；实验课和理论课脱节，教学评价体系不合理。0此外，由于遗传学实验自身的特点，部分实验需要持续很长时间，但由于课堂教学时间和教学条件的限制不能开展。因此，如何利用有限的课时安排合理设计遗传学实验教学内容，打破传统的封闭式教学模式，建立科学合理的实验评价体系，是从事遗传学教学实验教师一直都努力试图解决的问题。

基于以上考虑，笔者在开展遗传学教学和实验室管理的过程中，逐步改革教学内容和教学模式，将课堂四十五分钟改为课堂与课外相结合，通过几年的实践总结了一些心得，在此与大家分享。

1　新时期遗传学实验教学的特点

遗传学中学科渗透和交叉现象很普遍，这也体现在遗传学实验中。如果把生命科学的课程体系比喻为一棵大树，遗传学就是这棵大树的主干之一。由于化学、物理学、计算科学等内容的渗入，现代遗传学已经衍生出了发育生物学、分子生物学、基因组学、生物信息学、基因工程等学科。在现代生命科学专业课程设置中，一般都会设置相关课程，这些课程都和遗传学存在联系，也与遗传学教学内容知识点存在交叉。因此，遗传学实验项目的设置极易与其它课程出现“撞车”现象。比如：有丝分裂和减数分裂在细胞生物学实验中也可以开设：植物DNA提取实验在分子生物学实验中也可以开设。一旦“撞车”出现，不仅耽误学生学习，浪费课时，还会让学生在不断地重复中对课程产生厌倦，觉得该课程可有可无，失去学习兴趣。避免与其它课程实验重复，既保证学生在有限的课时学到最多的知识，也能最大程度训练学生的动手能力。

实验持续时间长是遗传学实验教学的另一个特点。与生物学中的其它学科的实验不同，遗传学实验中有很大部分是需要通过长时间培养实验材料，中间过程持续观察才能完成的，比如果蝇杂交实验和生活史观察实验、植物有性杂交实验。与此相矛盾的是，实验教学安排的时间相对分散，每次课时间很短，在教学管理上教务管理部门也要求教师在指定时间完成实验教学，这就限制了一些实验项目的开设。

遗传学是一门飞速发展的学科，不断有新知识、新技术补充到遗传学中。比如，在传统教材中不涉及基因组学的内容，而最近20年，基因组学已经成为遗传学的重要组成部分。除此之外，发育遗传学、行为遗传学、反向遗传学、表观遗传学和生物信息学等分支学科的内容也不断补充到了遗传学教材中。在理论课讲述这些最新知识的同时，实验课怎样保持和理论课一致，怎样为学生提供消化这些知识的动手机会?针对这一特点，要求在开设遗传学实验时，应随时跟踪学科最新进展，设计和更新实验项目，或者发动学生自主设计实验巩固书本知识。

2　遗传学实验开放式教学内容取舍的原则

遗传学实验项目的选择，首先应兼顾理论性与实践性、基础与应用、经典与现代这几对矛盾。遗传学是理论性和实践性都很强的学科，实验安排时应根据本专业培养目标和学生实际情况，合理安排基础性实验与应用性实验，并适当设计一些新的实验。对于重点院校的学生，应加强理论性实验，鼓励学生自主设计实验验证某一结论。而应用型人才培养的学校则应当偏向应用性、实践性实验项目的开设，以满足学生毕业后进入工作岗位后的动手需求。

遗传学实验项目确定应考虑其它实验课程，避免教学内容冲突。在实验项目的选择上，我们对以前安排的实验内容进行了重新编排，比如：“植物DNA提取”、“随机扩增多态性分析”等在《分子生物学》课程里会涉及到的实验内容在遗传学实验里就大胆地放弃，让学生在《分子生物学》实验里完成，而在遗传学实验中则加入RFLP验证孟德尔遗传定律的内容，直接将分子生物学实验结果引入遗传学分析中，既验证了孟德尔遗传定律，也让学生初步认识了分子生物学在遗传学中的应用。对于有丝分裂和减数分裂的观察，《细胞生物学》实验也会涉及到，但两门课观察的重点不同，细胞生物学侧重观察染色体结构，而《遗传学》实验侧重染色体行为及分裂时期的观察，这样的实验在开设时应向学生讲明观察重点，并且与《细胞生物学》实验课协调，将两个内容合并在遗传学实验中开出。

打破时间和空间限制。遗传学实验中有部分实验持续时间长，很难仅靠课堂时间完成实验，也不利于安排实验。以前在安排此类实验时，受多种因素的限制，一般都不予开设。实验室开放对提高学生的实验操作技能、切实开展综合性或设计性试验项目、推动并帮助学生开展科研和毕业设计成效显著，是培养学生实践动手能力和创新精神的有效途径。所以我们在教学中考虑将传统的课堂实验和开放实验相结合。开放性实验适合于周期比较长的实验，比如果蝇大实验中，教师在课堂上以多媒体的形式充分讲解了实验要求及注意事项后，让学生领取果蝇瓶，课外自己收集和培养果蝇，随时可以观察果蝇的生活史。这个过程既培养了学生的观察习惯和动手能力，也使学生对作为遗传学研究重要材料的果蝇的接触更充分，观察更仔细，让学生对遗传学研究材料和方法产生了浓厚的兴趣。

3　遗传学实验开放式教学的实施与实验室管理

验证实验是课堂教学的补充，便于学生理解课堂抽象的知识。然而，由于验证性实验验证的理论、方法、步骤及结果都是已知的，使实验教学过程变成教师照本宣科讲述，学生机械地模拟重复的过程，造成学生实验积极性不高，对实验结果的成败不重视，盲目的承认失败甚至篡改实验数据以求相符。设计性实验可以训练学生的思维能力和动手能力，让学生学会独立开展工作。一些报道强调验证性实验过多，难以提高学生的创新能力，应加大综合性、设计性实验的比例。而宋兴舜等则认为应将验证性实验与设计性实验有机结合。0在以 前的实验教学安排中，设计型实验由于内容分散，管理麻烦，是大家不愿触及的方面。如何在有限的课时里兼顾巩固知识和能力训练，在安排实验内容的时候需要深思熟虑。为适应学科的快速发展，在遗传学实验教学中，必须强化教师的开放式教学理念，强化学生的动手实践和自主创新意识。从课堂教学和课外研究两个方面，通过对实验教学观念开放、教学内容开放、实验室和实验时间开放、教学方法和手段开放等进行分析，探讨开放式教学在遗传学实验中的应用。。

基于以上考虑，笔者在教学过程中逐步安排了一些开放性验证实验和设计性实验，比如植物染色体观察的实验，要求学生独立选材，同学之间选材不能相互重复，做到实验项目的选材开放；实验开始前独立设计方案，方案内容应包括水培获得新生根尖、材料前处理过程、染色方法的选取、压片过程、观察和拍照等步骤，每一步骤都应有详细说明，实验方法的选择上保持开放：方案设计完成经老师同意后，完成一个植物材料的染色体装片制备并提交染色体图，实验过程开放。这些实验过程均要求学生在课堂以外自由安排时间完成。经过几年的实践，结果发现85以上％的学生能独立完成实验，70％以上的学生需要反复多次才能完成任务。在实验过程中，动手能力强的同学还能将这一实验与染色体核型分析实验结合，提交核型分析图。通过该部分设计性实验操作，学生在观察了不同物种具有不同的染色体的同时，学会了查阅文献的方法和工作方案的制订，认识了教材中选取蚕豆或洋葱作为染色体观察材料的原因，认识到要完成一张效果良好的染色体装片的艰难。对实验教师来说，这种发散式的教学方法，也积累了很多植物材料的细胞遗传学操作的知识，为以后改进实验奠定了基础。很多学生反映类似的开放性实验时间可自由安排，实验过程可放开思维，进入实验室操作学会了一些基础的科研技能。此外，还认识到了实验准备的艰辛，更珍惜以后的实验机会了。

在实验教材中将果蝇实验分为果蝇生活史、果蝇杂交和果蝇唾腺染色体制备等几个独立实验。我们改进后的实验则以果蝇为主线，要求学生从野生型果蝇的收集到生活史观察再到唾腺染色体制备融合为一个大实验，要求学生在实验教材所提供知识的基础上，在规定时间内完成实验内容，而将杂交实验和孟德尔遗传定律的验证实验改用其它实验材料来完成。

不可否认的是，将部分遗传学实验从课堂移到课外增加了任课教师和实验室工作人员的工作量，在管理上开放性实验也增加了难度。开放式实验教学要求教师在课外时间也要进入实验室指导，实验室经常处于开放状态，实验仪器设备和药品的使用管理能在一定程度上放开。在实际操作中，我们采用教师网上答疑和在指定时间指导相结合的方式对学生进行辅导。在实验室管理上，试剂方面控制关键药品的使用，常规药品可以适当放开，对一些配制难度较大的溶液统一配制；对显微镜、显微照相系统的使用则采取专人负责制，保证仪器的安全。而水培实验和果蝇饲养实验等内容则允许学生将材料带回宿舍，便于学生随时观察。

4　开放式实验教学的考核指标体系

实验教学考试方法的改革作为实验教学改革的重要内容之一，是当前教学改革中值得深入研究与实践的问题。以前实验考核的方式主要以实验报告为主，针对这样的考核方式，学生常出现相互之间抄袭，作业敷衍的现象，既不能反映学生实验的真实水平，考核指标也比较单一。针对这些问题，结合我们的开发性实验，我们重新制订了实验成绩评价标准，经过我们设计改进后的实验考核主要包括验证性实验考核和开放性实验考核两部分。验证性成绩的记录摈弃了以前单纯看实验报告打分的情况，在实验中对实验结果提出规定要求，课堂上实时检查并记录学生的实验结果，要求学生立即在实验结果栏描述结果并由教师及时确认，防止课后抄袭。对实验原理、实验步骤等内容也杜绝抄袭课本，要求用自己的语言表述。每次实验结束后均布置思考题，启发学生动手之后学会思考，发掘问题。在开放性实验部分，教师将实验设计方案纳入评分范围，实验进行过程中记录平时成绩，对实验结果不做硬性要求，但可作为评分参考。

在平时实验成绩记录之外，还单独设计了期末实验考试。期末实验考核采取开放式考核，拟定考试题目范围，让学生独立设计实验步骤，独立实验，在规定时间内独立完成详尽的实验报告。这些评分方式考查了学生搜集资料，独立开展项目的能力。这样的考试既灵活，也发挥了学生的主观能动性，更训练了学生的科研思维，为以后进入研究岗位奠定基础。

5　结束语

篇7

NATs作用方式

NATs在生理以及病理过程中起重要作用,作用机理包括:基因组印记(genomicimprinting)、选择性剪切、X染色体失活、mRNA稳定性维持、翻译调节、RNA输出、DNA甲基化以及组蛋白修饰等[20]。基因组印记是一种是由亲本来源不同而导致等位基因表达差异的一种表遗传现象。这类印记基因约占基因组基因的1%,是哺乳动物和显花植物的独特现象。大部分印记基因都分布在印记基因簇内,其中包含大量的非编码RNA基因[21]。NATs还参与发育过程调控,对各种应激的适应和对病毒感染的响应[22]。NATs通过直接的反义–正义RNA相互作用,或通过编码与正义RNAs共表达的蛋白来调节正义转录物,从而调控正义RNAs的编码潜能[23]。反义转录物对正义转录物的影响表现在以下两个方面[24]:(1)不一致调节或反馈调节,反义转录物通过负性调节方式沉默或抑制同源正义RNAs或蛋白质;(2)一致调节或正反馈调节,正义和反义转录物共表达,反义转录物增加了正义RNAs水平或相应蛋白质水平[25]。

负反馈调节负反馈调节指反义转录物浓度下降导致正义转录浓度增加(图2)。例如在某些情况下为了刺激新生血管形成[26],通过G蛋白偶联受体CD97靶向其编码的反义配基DDX39最终获得增强的信号[4]。P15(CDKN2B)是一个肿瘤抑制因子,与正常淋巴细胞相比,白血病淋巴细胞含有较高浓度的p15反义转录物,但是p15本身浓度却很低,提示在白血病中p15与其反义转录物水平呈负相关[25]。这些结果提示,NATs的上调也许与肿瘤抑制基因非正常沉默密切相关,NATs可能通过相似方式又影响了其他基因。

正反馈调节正反馈调节方式是指:①单独靶向反义RNA导致正义mRNA下调;或②反义RNA和正义RNA同时下调,从而使常规的正义基因表达被附带或协同下调(图2)。转录因子Nkx2.2在神经干细胞分化成寡树突胶质细胞系中起重要定向作用。研究表明,Nkx2.2的NAT过表达促进Nkx2.2mRNA水平适度增加,并增强了神经干细胞向寡树突胶质细胞系的分化的潜能[27]。参与对低氧分压的适应的缺氧诱导因子(HIF-1)是一个异二聚体转录因子,其亚基HIF-1a在非状透明细胞肾肿瘤中高表达,同时HIF-1a的NAT表达也上调[28]。Wrap53是p53的反义转录RNA,它可以靶向5′非翻译区,从mRNA和蛋白水平上增加内源性p53表达[29]。Liu等[30]发现了几个在早期成骨细胞分化中的NATs,这些NATs增强了干扰素诱导跨膜蛋白5(IFITM5)的表达和成骨细胞分化。鉴于这些正反馈调节,NATs被认为可能是一个潜在的治疗多种疾病的药物靶点。

NATs作用机制

NATs可能通过直接的与正义转录物相互作用,或通过对mRNA转录、突变、运输和翻译等靶点的影响来调节基因表达[20,27]。NATs的调节作用以双链RNAs为基础,其作用机制包括RNA编辑[31]、RNA干扰[32]、RNA封闭[33]和转录干扰[34]等。在某种生理刺激下,NAT的启动子也有一些转录因子结合位点[35],一些NATs和他们相应的正义转录物有可能互相竞争结合相同的转录因子,提示NATs和他们的正义转录物能共表达或成反比表达[36]。此外,DNA甲基化和/或组蛋白修饰也参与了基因表达调节[37]。因此,NATs与DNA甲基化和组蛋白修饰之间可能存在直接的联系。

RNA编辑靶向核编码RNA和病毒RNA双链区域的腺嘌呤脱氨酶(ADARs)是一类RNA编辑酶。这些酶在神经系统中含量丰富,可通过改变mRNA中的密码子,使基因组中编码信息多样化。ADARs在已知底物中的功能提示这些酶通过多种方式微调和优化很多生物通路。

RNA干扰反义RNA能够影响mRNA生物转化的最早期过程,包括调控染色体结构,转录起始和剪切等。在血管平滑肌细胞中,RNA干扰介导的一氧化氮合酶反义mRNA(sONE)的下调增加了内源性一氧化氮合酶(eNOS)的表达。内皮细胞中,过表达的sONE削弱了eNOS表达。结果提示,sONE参与了转录后eNOS的调节[27]。

RNA封闭RNA封闭就是由于反义RNA与正义RNA配对形成双链,封闭了正义转录物(pre-mRNA)的剪切位点,使pre-mRNA发生选择性剪接改变,或抑制了反式作用因子与pre-mRNA结合,最终导致靶mRNA运输、翻译抑制或降解。

转录干扰转录干扰是由于NATs在转录时,正义—反义RNAs双链(dsRNAs)上的两个RNA聚合酶Ⅱ发生聚集碰撞而引起的。在简单的真核生物中,例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),在基因及其调控元件之间由于相互挤压碰撞而产生的转录干扰是不可避免的[34]。

DNA甲基化DNA甲基化发生在CpG岛,并且通过头甲基化酶(DNMTs),例如DNMT3A和DNMT3B来甲基化[38]。Dnmt1以半甲基化DNA为底物来维持DNA甲基化。肿瘤的表观遗传标志物在总体基因组DNA中低甲基化,而在肿瘤抑癌基因中超甲基化[39]。但是,起始和协助DNA甲基化的机制还很不清楚。Imamura等[40]报道鞘氨醇激酶1(Sphk1)的NAT过表达诱导CpG岛去甲基化,而在正义链3′非CpG位点重新甲基化。在遗传性地中海贫血中血红蛋白a2(HBA2)能指导CpG岛甲基化[41]。NAT介导的CG去甲基化和非CG甲基化提示这可能是表观遗传的一个新机制[10]。

组蛋白修饰组蛋白修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、小泛素相关修饰和糖基化。不同修饰方式相结合导致基因活化或基因抑制[42-43]。组蛋白乙酰化和甲基化也许对DNA修复和基因转录有直接的影响。通常,组蛋白乙酰基转移酶(HACs)和组蛋白去乙酰基转移酶(HDACs)介导的组蛋白乙酰化是一个基因活化的标志[39,44]。组蛋白甲基化由组蛋白甲基化转移酶和去甲基化转移酶调节。组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)的单、双和三甲基化与转录活化密切相关,然而组蛋白H3第9位赖氨酸(H3K9)的双和三甲基化与转录抑制密切相关[45]。而且,组蛋白H3第20位赖氨酸甲基化与转录也密切相关[46]。Xist基因与X染色体失活有着密切关系,在启动子区域,Xist基因反义转录物Tsix通过募集组蛋白修饰蛋白复合物可以使Xist失活[47]。在H3K4细胞中P15的反义转录物通过增加H3K9的二甲基化和减少H3K4二甲基化来下调P15。在启动子区,正义和反义转录物之间的双向结构的形成可能直接或间接的促进或抑制组蛋白–修饰蛋白复合物的结合。因此,NATs和组蛋白修饰之间的相互作用也为表观遗传学提供了新的机制。NATs和DNA甲基化,NATs和组蛋白修饰以及DNA甲基化与组蛋白修饰之间的密切关系均已被发现。在基因启动子区CpG岛的超甲基化引起了局部组蛋白的去乙酰化。H3K4的去甲基化与启动子甲基化相关,然而低乙酰化诱导了DNA甲基化[48]。因此,在基因调节过程中,不同种类的表观遗传修饰紧密联系而且协同作用。

NATs与疾病

NATs与肿瘤据报道在肿瘤中,大部分基因组发生了去甲基化,转录噪音增加可能引起反义转录物产生,反义转录物进而影响关键抑癌基因功能,最终导致肿瘤恶性转化。Orfanelli等[49]在黑素瘤TRPM2位点发现一种新型的正义TRPM2-TE和反义转录物TRPM2-AS。在黑素瘤中TRPM2-TE和TRPM2-AS表达上调,而且他们的活化与CpG岛甲基化状态有关。TRPM2-TE敲除和野生型TRPM2一样增加了黑素瘤对凋亡和坏死的易感性。缺氧诱导因子1(HIF-1)的一个反义转录物aHIF已经被证明在正常人组织中广泛表达[50],在肾癌中由于vhl基因突变引起aHIF永久性的过表达[28]。此外,在乳腺癌中aHIF过表达,且aHIF表达水平与肿瘤预后呈负相关[28,51]。在永生化的淋巴细胞系中低氧可以诱导aHIF产生[28],表明HIF-1的反义转录物aHIF与HIF-1a共同参与了代谢调控通路。Survivin是一个新型的凋亡抑制剂,在肿瘤细胞中表达,而在正常成熟组织中不表达,被认为是一种很有潜力的抗肿瘤治疗的靶点。在一种人来源的结肠癌细胞系中,诱导survivin的一个NATs效应细胞蛋白酶受体(EPR-1),导致survivin表达下调,同时引起细胞增殖减慢,凋亡增加,对抗肿瘤制剂敏感性也增加。此外,EPR-1可使皮下肿瘤尺寸显著减小,如果与抗肿瘤药物联合使用这种效应会增强。这些结果提示,通过诱导EPR-1cDNA来调节survivin也许是一种非常有潜力的治疗结肠癌的方法[52]。Ca-paccioli等[53]发现了一个bcl-2/IgH的反义转录物下调了人滤泡淋巴瘤细胞系t(14;18)DOHH2中bcl-2基因表达。

NATs与人类其它疾病与目前广泛应用的沉默基因或改造在mRNA剪接方式等方法相比,体内特异性基因的上调是基因治疗的可望而不可及的目标。Modarresi[54]及其同事成功上调脑源性神经营养因子(BDNF)表达。他们通过抑制BDNF的一个NAT来阻断寡核苷酸向小鼠中枢神经系统的运输,从而抑制了BDNF水平,这将是大量神经退行性疾病治疗的一个重要靶点,如果采用小分子或microRNA抑制剂,有可能导致不相干基因活化。亨丁顿舞蹈症(Huntington’sdisease,HD)是一种渐进性的神经退化疾病,是由亨丁顿(HTT)基因外显子的一个CAG重复扩增而引起。Chung等[55]鉴定出HTT反义RNA(HTTAS),即一个在HD重复序列位点的NAT,HTTAS从4个选择性位的起始转录,在HD大脑组织中发现2个HTTAS剪切异构体。几乎所有的人类遗传疾病均是由于个别几个相关基因或调控序列的突变而引起的。Tufarelli等[56]研究发现,在转基因模型小鼠以及分化的干细胞中,RNA反义转录物介导相关CpG岛的沉默和甲基化。这些发现提出了一个人类遗传性疾病发生的新机制。

总结与展望

综上所述,哺乳动物NATs的主要特点如下[24]:(1)NATs比以前假设的种类更多;(2)NATs代表一种基因调节现象;(3)NATs更普遍的是代表非编码RNA;(4)NATs以顺式(与相应正义转录物在相同位点)或反式(与相应正义转录物相隔一段距离)形式出现;(5)只有很少数NATs功能被注释;(6)有一些NAT参与生理或病理功能调节;(7)NAT可能是一类潜在的新兴药物靶点,可以使正义基因和/或转录物上调或下调。NATs是一类调节RNAs,在mRNA和/或蛋白水平上,对正义转录物起重要调节作用[8]。通过正义—反义双向结构的形成,NAT以正反馈或负反馈方式调节正义转录物。在正反馈调节中,通过上调肿瘤抑制基因NATs来再活化异常沉默的肿瘤抑制基因。相反,在正反馈调节中,过度表达的原癌基因可以被下调的NATs沉默。对不能耐受化疗药物毒性的患者来说,NATs可能是另一种新型的治疗方法。而且,在肿瘤组织中NATs的表达水平与正常组中不同。因此,NATs可以作为监测肿瘤发展的分子标志物。表观遗传的改变是可逆的,并且在疾病的发生和发展中逐渐引起了重视。表观遗传治疗也被认为是最有前景的治疗方法之一[57]。最近,两类抑制DNA甲基化或组蛋白乙酰化的表观遗传药物已经被研制,包括DNMT抑制剂(例如,5-氮杂胞苷和地西他滨),HDACs抑制剂(曲古菌素A,异羟肟酸),部分药物已经应用与临床[58-59]。但最近研究表明,一些患者不能耐受药物毒性。因此,探寻其他有前景的药物是必须的。调节RNAs在表观遗传过程中起重要作用,这为药物设计策略提供了新的未来。很多调节RNAs对蛋白编码基因敏感[60]。

篇8

1 资料与方法

1.1 一般资料 426例HBV感染者均为本院门诊及住院患者，男334例，女92例，年龄（42.15±11.87）岁，均为汉族，且无亲缘关系。所有病例诊断符合2005年中华医学会肝病与感染病学分会修订的病毒性肝炎诊断标准，同时排除HIV、TP及其他肝炎病毒感染。样本收集均获患者知情同意。按疫病类型将患者分为四组，其中乙肝病毒携带组98例，男62例，女36例；慢性乙型肝炎组116例，男92例，女24例；乙肝硬化组102例，男86例，女16例；乙肝肝癌组110例，男86例，女24例。

1.2 基因组DNA的提取 采用硅胶柱纯化方式，从700 ?L抗凝血液中提取淋巴细胞基因组DNA。UV计测定DNA浓度及纯度，并将样本稀释至10 ng/?L，分装保存。

1.3 PCR-RFLP 从SNPs数据库下载SNP的标准序列，Primer Premier 6.0软件设计引物：上游：5’-3’CCTTTGCCCAGTGTATC，下游：5’-3’TGTATGCCAAGCCATTTG（上海英潍捷基公司合成），内切酶BclI位点T/GATCA（NEB公司提供）。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，循环次数35次，72 ℃延迟5 min结束PCR反应。产物37 ℃过夜酶切，65 ℃ 30 min，终止反应。2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，送上海英潍捷基公司测序验证。

1.4 统计学处理 SPSS 17.0软件进行数据处理，计算等位基因频率和基因型频率，Hardy-Weinberg平衡检验及各组间比较均采用 字2检验，以P>0.01表示符合H-W平衡，以P<0.05表示各组间比较差异有统计学意义，非条件Logistic回归校正年龄及性别等因素，进行关联分析，计算比值比（Odds Ratios， OR）及其95%可信区间（Confidence Intervals， CI）表示相对危险度。

2 结果

2.1 基因型的判定及测序验证 PCR产物及酶切产物见图1～2。

2.2 H-W平衡判定及各基因型、等位基因的频率分布 诊断明确的乙型肝炎患者总计426例，样本经 字2检验，P=0.85，统计学检验符合Hardy-Weinberg平衡，具有代表性，见表1。GG、CC和GC 3种基因型频率及G、C等位基因频率在样本中的分布比较差异无统计学意义（P=0.113，P=0.104）。乙肝肝癌组GG基因型频[dylw.net提供专业写作论文和服务.]率低于乙肝携带组、乙肝肝硬化组、慢性乙型肝炎组，与前两组比较差异无统计学意义（P=0.086，P=0.285），与慢性乙型肝炎组比较差异均有统计学意义（字2=6.152，P=0.046）；GC、CC基因型频率高于其余三组，仅与慢性乙型肝炎组比较差异有统计学意义（P=0.046）。慢性乙型肝炎组G等位基因频率高于乙肝肝癌组，比较差异有统计学意义（字2=5.605，P=0.018）；C等位基因频率低于其余三组，仅与乙肝肝癌组比较差异有统计学意义（P=0.018）。

根据非条件Logistic回归校正年龄、性别混杂因素，以乙肝肝癌组为病例组分别与其他组比较进行分层分析，HMGB1基因位点1176G/C基因多态性在乙肝肝癌组与乙肝携带者组比较差异有统计学意义（OR=0.301，95%CI：0.092-0.989，P=0.048，Recessive model）；乙肝肝癌组与慢性乙型肝炎组（OR=3.792，95%CI：1.206-11.919，P=0.023，Dominant model）比较差异有统计学意义；肝癌组与轻型肝病组（乙肝病毒携带组+慢性乙型肝炎组）（OR=0.227，95%CI：0.061-0.852，P=0.028，Dominant model；OR=0.225，95%CI：0.058-0.866，P=0.03，Codominant model）比较差异有统计学意义，见表2。

3 讨论

原发性肝癌的发生机制复杂，病因尚未确定，目前主要认为与肝炎病毒、致癌物质、饮水污染、寄生虫病等众多环境因素及遗传因素有关。肝癌有明显的家族聚集现象，其本质是因为遗传因素和肝癌之间存在明显的相关性。通过遗传学和表观遗传学改变引起原癌基因活化和抑癌基因灭活是导致肝癌发生的重要生物学过程。我国学者发现人体内存有导致肝癌的易感基因，此举拉开了研究肝癌相关易感基因的帷幕[20]。

HMGB1基因位于13q12染色体上，编码产物HMGB1已被证实参与了HBV感染后肝癌发生的过程，Yan等[12]指出HMGB1通过激活TLR4和RAGE信号通路，促进肝癌的浸润和转移。Jiang等[13]发现HMGB1 mRNA及蛋白在肝癌组织中表达最高，指出HMGB1的过度表达是肝癌发病的一个重要因素。继Kornblit等[14]人首次报道HMGB1基因总共存在6个SNP和4种基因突变后，其基因多态性与SIRS、同种异体T细胞移植免疫反应、产后脓毒症、MODS等多种疾病的相关性已被陆续报道[15-18]。Deng等[19]在研究HMGB1 1176G/C多态性与HBV感染临床表型的关联性分析中指出GG基因型人群对慢性乙型肝炎、肝硬化、急性乙型肝炎的易感性高于CC、GC基因型人群，G等位基因的HBV感染风险明显高于C等位基因，但与HBV感染后肝癌的关联性未予报道。

本研究结果提示，HMGB1 intron4 1176G/C多态性与HBV感染后HCC的发生有关联。携带GG基因型的人群对HB[dylw.net提供专业写作论文和服务.]V感染后HCC的患病风险度增加，该慢性乙型肝炎人群更易发展成乙肝后肝癌，而携带CC基因型的人群感染HBV后发生HCC的风险较低。G等位基因不仅与HBV感染严重肝病密切相关，而且与HBV感染后肝癌的发生相关。HBV感染后HCC的发生，影响因素繁多，遗传背景尤为复杂。在分析其与HMGB1基因多态性的关联性时，种族和地域的差异、样本量不足、来源局限、等位基因连锁不平衡现象、基因突变特征、其他微效基因的相关影响、环境及宿主因素等诸多因素均可干扰 研究结果，要考证其准确性，仍需要多中心、大样本的临床观察及研究。

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篇9

【关键词】 肿瘤抑制基因;DNA甲基化;胃癌

Abstract:Epigenetics is the study of genetic changes in gene expression without the sequence change of DNA， in which DNA methylation is one of the most widely studied epigenetic mechanism. CpG island is the sequence of human genome， located mainly in the promoter as well as the first extron regions. The size of it is nearly 100～1 000 bp and it links with 60% of human coding genes. Methylation of CpG sites in the promoter regions of genes can lead to decreased expression and silence the tumor suppressor genes and contribute to oncogenesis. The research development of DNA methylation in gastric carcinoma was reviewed in this article.

Key words：tumor suppressor genes; DNA methylation;gastric carcinoma

胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一，发病率高，据统计，其死亡率居全球恶性肿瘤死亡率的第二位，严重的危害着人类的健康和生命。胃癌发生的机制目前仍不是很清楚，研究表明，细胞无限增殖及分化受阻是肿瘤发生的基本过程，随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展，人们逐渐深化了对肿瘤发生学的认识。近年研究结果显示肿瘤的发生是多基因异常共同作用的结果，包括癌基因活化和肿瘤抑制基因失活，有关表遗传学研究显示[1]，表遗传学异常参与了肿瘤发生过程，而且在某种肿瘤的发生中起重要作用，其中DNA异常甲基化可致基因表达减弱或基因沉默，是导致肿瘤抑制基因失活的重要机制之一。本文就胃癌的发生发展过程中一些肿瘤抑制基因DNA异常甲基化研究进展作一综述。

1 DNA甲基化及其作用

表遗传学(epigenetics)是1939年由waddington首先提出的。表遗传学是研究在DNA序列没有改变的情况下，所发生的可遗传性基因表达的改变[1]168-174。其中包括DNA甲基化、基因组印记、染色体组蛋白修饰、隔离蛋白以及非编码RNA调控等方式，这种模式传递给子代细胞是不依赖DNA序列的。其中DNA甲基化是研究最多、最深入的一种表遗传学表达机制。

DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases DNMTS)的介导下，二核苷酸中胞嘧啶(C)的第5位原子上的H被S—腺苷甲硫氨酸提供的甲基取代，使之变成5—甲基胞嘧啶(5-methy1cytosine，m5C)[2]的化学修饰过程。甲基化酶包括维持甲基化转移酶(DNMT 1) 和重新甲基化酶(DNMT 3a，DNMT 3b)。维持甲基化酶的作用是识别子代DNA 双链中亲代单链上已甲基化的CpG 位点，催化互补单链的胞嘧啶(C) 发生甲基化;重新甲基化酶的作用是使非甲基化的双链DNA 发生甲基化的过程[3] 。DNA的甲基化修饰反应主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶，CpG 位点以两种形式存在，一种为分散于DNA中，正常情况下这些 CpG二核苷酸甲基化可作为一种宿主基因的保护机制，它会抑制重复子转录以及重复子同源性重组，还可以抑制“寄生”DNA序列(如逆转录病毒片段)的侵入;另一种是CpG 结构高度聚集在一起，即CpG 岛(CpG island)。CpG岛在基因组内呈不连续分布，通常位于基因的启动子区域(promoter region)，也可位于第一外显子区域， 故又称5′-CpG 岛[4]。在正常细胞中，CpG 岛通常不发生甲基化修饰，而肿瘤组织常发生其相关基因启动子区域的异常甲基化。DNA 甲基化异常可分为甲基化增强、甲基化减弱和甲基化转移酶水平增高三种情况，其中抑癌基因甲基化增强在肿瘤中最常见。可通过改变基因的构型或与核内甲基化CG序列结合蛋白结合，阻止转录因子与基因形成转录复合物，从而导致其表达沉默，使肿瘤抑制活性丧失，被认为是肿瘤抑制基因失活的重要途径。另外，DNA 的甲基化还可促进肿瘤相关基因突变，因5-甲基胞嘧啶可自发性或在SAM 作用下引起邻位脱氨转变为胸腺嘧啶，使甲基化的CpG 突变为TpG，因此其也是甲基化促进恶变的机制之一。

CpG岛甲基化是一种基因外修饰，在正常细胞中基因的甲基化大多发生在其启动子CpG 岛之外，而在肿瘤细胞中某些抑癌基因的CpG岛甲基化则导致该基因转录失活，故在肿瘤研究中检测基因启动子区CpG 岛甲基化状态，对于阐明肿瘤发生、发展的机制及建立早期诊断方法均具重要意义。目前DNA甲基化的检测方法比较多，其中广泛应用的技术是甲基化特异性的PCR技术(MSP)和甲基化敏感的单碱基延伸技术(Ms-SNuPE)，这些技术的敏感性高，特异性强，适用于微量DNA或石蜡包埋DNA。在MSP技术的基础上，又先后发展了基于荧光检测方法的实时定量PCR(MethyLight)和依赖于限制性核酸内切酶的甲基化分析方法(COBRA)，这些技术提高了检测的敏感性，实现了高通量和高特异性。此外，有人将MSP技术与变性高效液相色谱法(DNPLC)相结合，来测定整个CpG位点的甲基化。近年，中国科学院化学研究所与清华大学的研究人员合作，发展了基于水溶性阳离子型共轭聚合物的新DNA甲基化分析方法。通过荧光共振能量转移技术(FRET)研究了质粒和人肿瘤细胞p16基因启动子区特异CpG位点的甲基化状态该技术具有较高的灵敏度和特异性。引物无需荧光标记，检测在均相溶液中进行，无需分离、纯化等手段，而且与高通量分析兼容，在癌症临床诊断上具有潜在的应用价值[5]。

2 胃癌相关基因的甲基化

近年研究结果显示，多种基因的异常甲基化在胃癌发生发展中起着重要的作用。有研究[6]表明，DNA的甲基化率在胃癌前病变转化为癌的过程会发生改变。Kang等[7] 对非肿瘤胃黏膜和胃肿瘤进行p16、hMLH1、DAP—kmase、THBS1、及TIMP-3等5种基因检测，发现除DAP—kmase甲基化的频率相近之外，其他基因从慢性胃炎到肠化生及从腺瘤到腺癌甲基化频率都有不同程度的增高。因此认为，这些基因的高甲基化在胃癌变发生过程中的较早阶段就已出现，这为胃癌的早期诊断提供了新思路。

2.1 p16基因甲基化

p16基因又称多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor，MTS)，定位于9p21 位点，由2个内含子和3 个外显子组成。该基因编码的蛋白是一种重要的细胞周期负调控蛋白，可与D型细胞周期蛋白(cyclinD)竞争性结合细胞周期蛋白依赖激酶CDK4 和CDK6而抑制蛋白激酶活性，使肿瘤细胞周期调节中抑癌基因Rb的表达产物(PRb)不能磷酸化而保持活化状态，抑制转录因子EF解离，使细胞周期进展最关键的G 1/S转换停滞，对细胞周期起负调控作用。因此，p16 基因的变异或其蛋白的失活会导致cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F调节途径的失控，而使细胞过度增殖，导致肿瘤发生。目前研究表明p16基因的纯合缺失和点突变异常多种肿瘤的发生有关。在胃癌中p16基因异常甲基化主要发生在外显子1和启动子区域，且基因启动子的高度甲基化更为常见。Lee等[8]最早报道了p16 甲基化与胃癌的关系，他们用甲基化敏感性限制性内切酶研究了9 个胃癌细胞株，发现2个细胞株有甲基化，而且不表达p16mRNA;体外以去甲基化剂5-deoxy-ezecytidine对胃癌细胞系处理后，因CpG岛异常甲基化而封闭的基因又重新表达。Ficorella 等[9]发现原发性胃癌中p16 基因启动子区域高甲基化是导致其转录失活的重要原因。Bai等[10]利用诱发Wistar 大鼠胃癌模型研究发现，在大鼠胃黏膜向胃癌演变过程中，p16 基因甲基化是在胃癌发生过程的较早阶段出现，其甲基化的频率在正常胃上皮中为2.7%， 在慢性萎缩性胃炎中为16.7%，在肠上皮化生中为37.5%，在胃腺瘤中为64.7%，在胃癌中则高达82.5%。Abbaszadegan 等[11]通过MSP 和免疫组化等方法同时对52 例胃癌患者组织和血清中p16基因甲基化及蛋白表达情况分析后，认为p16 启动子区高甲基化在胃癌发生中起重要作用，并且与胃癌恶性程度相关。同时提出血清中DNA 甲基化水平的检测可能是胃癌早期检查的一个重要的生物学指标。

2.2 DNA错配修复基因(MMR)、CpG甲基化表型(CIMP)与胃癌

研究发现，在胃癌的发生中存在微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)和 CpG甲基化表型(CpG island methylator phenohype，CIMP)两种分子途径。在DNA MMR中起主要作用的是基因hMLH1 和hMSH2。MMR通过修复DNA碱基错配、降低自发性突变，而增强DNA的保真性和维持基因组的稳定性。Herman等[12]最早报告了在结直肠癌中MMR hMLH1失活与DNA甲基化有关，后来发现胃癌中同样存在微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)亚型，但还没有胃癌中有关DNA MMR发生突变的报道。Fleisher 等[13]检测了65 例胃癌组织的hMLH1甲基化情况发现，随着胃癌中MSI频率的降低hMLH1基因的甲基化率也随之降低。由此推测，hMLH1基因启动子区域甲基化与MSI有关，有可能是该基因失活的一种普遍机制。Poplawski等[14]通过甲基化敏感限制性内切酶PCR(MSRE-PCR)对比分析27例胃癌患者与25 例健康人后认为，hMLH1 甲基化对胃癌形成有促进作用。由此可见，hMLH1启动子的甲基化与胃癌的发生有关，可能是胃癌发生机制中的早期分子事件。

CpG甲基化表型(CIMP)是指一些病例同时存在多个基因甲基化的现象。CIMP已在大肠癌、肝癌、肝内外胆管癌、胰腺癌、卵巢癌、急性髓性白血病、膀胱癌等恶性肿瘤中得到证实。由于胃癌的发生是一个多步骤、多因素相互作用的结果，也涉及许多相关基因的异常表达，因此多基因的启动子甲基化的研究也就自然得到了研究人员的青睐，而且越来越多的研究发现CIMP与胃癌有着密切的关系。Kim等[15] 通过检测40例早期胃癌组织中hMLH1、TIMP3、THBS1、DAP—K、GSTP1、APC和MINT2的甲基化状况发现，除了2 例基因甲基化阴性外，CIMP尽然高达40%。可见，启动子甲基化在早期胃癌中是一种普遍现象。同时研究还发现，在肿瘤发生的不同阶段、不同基因的启动子甲基化表达状况是不同的，有的基因随胃癌的进展其甲基化发生率有不断升高的趋势，而在健康青年人标本及胎盘中未发DNA甲基化。可见CIMP在胃癌的发生中是一早发事件，可以利用此特征作为胃癌的早期诊断指标，同时对建立胃癌相关基因的甲基化谱也具有积极的作用。

APC 基因是一种抑癌基因，编码的APC蛋白可以抑制上皮细胞增殖而抑制肿瘤的发生。早期研究证实该基因是结直肠癌的管家基因，近来研究发现该基因在胃癌的发生发展中也起重要作用。曾有学者用免疫组化方法分析了120 例胃癌病人的APC基因的表达情况，结果发现，APC缺失率为78%，因此认为APC 基因缺失可能与胃癌的发生有关。近年来大量的研究显示APC基因启动子1A部位甲基化与胃癌发生关系密切。Hosoya等[16]研究发现APC基因启动子1A蛋白表达率与甲基化率在正常胃粘膜和非癌粘膜中保持一致，在癌粘膜中甲基化率增高。而1B均未发现有甲基化。由此可见，ACP启动子甲基化主要发生在1A部位，且ACP启动子1A部位的甲基化可能是胃癌发生的一个中间环节，而不是胃癌发生的始动因素。3 结 语

通过对胃癌相关基因甲基化分析发现，多种相关基因甲基化是胃癌形成的重要机制之一。DNA甲基化异常不仅可在手术标本中检测到，还可从各种体液如外周血清中检测到，为临床应用带来极大便利，因此肿瘤相关基因启动子甲基化状态是一种非常有前途的生物标记物，可作为肿瘤的敏感性生物标志物。检测胃癌相关基因启动子异常甲基化不仅可用于高危人群监测、肿瘤风险评估、胃癌早期诊断，还可用于判断肿瘤迁移情况，预测胃癌手术、放化疗疗效等。由于DNA甲基化是一个可逆的过程，故通过恢复仅被抑制而未发生突变或丢失的生长调控基因表达.来恢复细胞正常生长调控功能，并且已有这方面的动物模型研究证实了这一想法。故DNA的去甲基化将为癌症的治疗提供新思路。由于一些病原体的感染可以诱发肿瘤相关基因甲基化从而导致胃癌的发生，故预防感染和及时的根除这些病原体会对预防胃癌的发生有重要的意义。

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篇10

[关键词] 三细胞；早期分裂；囊胚形成；预测

[中图分类号] R714.8 [文献标识码] B [文章编号] 1673-7210（2014）10（a）-0069-03

Prediction research on blastocyst formation for early division in vitro based on three-cell embryo

HUANG Cuiyu DONG Yunqiao CHEN Chuangqi SHI Zhe

Department of Reproductive Health and Fertility， Guangdong Maternal and Child Health Care Hospital， Guangdong Province， Guangzhou 511400， China

[Abstract] Objective To develop a prediction method of blastocyst formation in vitro by observation the three-cell embryo stage in specific time window of fertilization embryo post intracytoplasmic sperm injection （ICSI）. Methods Human immature oocytes were further cultured until maturity before ICSI was performed. Continuous observation of three-cell stage after ICSI of 33.9-42.9 h were preformed per hour， and the blastocysts rate were recorded post ICSI for 6 d. Results The blastocysts rate of fertilization embryo， which underwent the three-cell stage （76.67%） were higher than those without three-cell stage （4.17%）， and difference between the two groups was significant （P < 0.05）. Furthermore， the highest blastocysts rate was identified in fertilization embryo which three-cell stage observed 39.9 h post ICSI. Conclusion The three-cell embryo stage can be used as a potential reference to estimate blastocysts rate of fertilization embryo.

[Key words] Three-cell embryo； Early division； Blastocyst formation； Prediction

囊胚培养是目前体外培养过程中挑选最具发育潜能胚胎的有效方法[1-2]。但是，囊胚培养体系还不够完善，通过体外受精（IVF）获得的胚胎有50%～70%不能发育为囊胚[3]，因此辅助生殖过程中因无囊胚形成是导致周期取消率升高的主要原因。此外，囊胚培养不可避免地延长了胚胎在体外的生长时间，无疑会导致胚胎基因组及表观遗传的变化。这就需要寻求一种无创且早期预测胚胎发育潜能的指标。在胚胎分裂早期通过观察分裂特性，对体外培养的胚胎的发育做出预测，从而既可早期选择具有发育至囊胚阶段的胚胎，又避免了胚胎在体外的延长培养。本研究以体外成熟的卵母细胞显微授精后的胚胎为研究对象，通过观察早期分裂的三细胞阶段胚胎与囊胚形成之间的关系，并探索最佳的观察时间窗，为建立有效的、无创的早期预测胚胎发育潜能的指标奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1材料

不成熟卵子来自在广东省妇幼保健院（以下简称“我院”）生殖健康与不孕症科进行的卵胞浆内单注射周期中剩余的MI或GV期卵母细胞。本研究获得了我院伦理委员会批准，征得了患者的同意，并签署了知情同意书。

1.2 耗材和试剂

细胞培养皿：美国Falcon公司；显微注射针：购自美国COOK公司。试剂：受精培养液（G-IVF）、卵裂期胚胎培养液（G-1）、囊胚期培养液（G-2）、取卵胚胎处理液（G-MOPS）、人血清白蛋白（HSA）、石蜡油（OVOIL）、透明质酸酶、显微操作液，均购自瑞典Vitrolife公司；重组促卵泡生长激素（FSH，Gonal-F）、β-人绒毛膜促性腺激素（HCG，Profasi），均购自瑞士雪兰诺公司。

1.3 仪器与设备

SZX2-1LLB体式显微镜：日本Olympus公司；RI显微操作系统、IVF工作站L126MP，均购自丹麦K-SYSTEM公司；5804离心机：德国Ependorff公司；TE2000-U倒置显微镜：日本Nikon公司；三气培养箱：美国Forma公司。

1.4 卵母细胞体外成熟

将冻存收集的做卵泡浆内单注射的患者脱颗粒细胞后的未成熟卵母细胞采用卵母细胞体外成熟培养基（IVM-培养基）进行体外成熟培养。

1.5 实验分组与观察记录方法

将体外成熟的卵母细胞进行ICSI授精，选择受精卵150个，将其分为两组，第1组为有三细胞阶段胚胎组，第2组为无三细胞阶段胚胎组，于授精后33.9 h后开始，于显微镜下观察记录三细胞胚胎的形成情况，统计有三细胞阶段胚胎的比率，之后每小时观察记录1次，直至授精后42.9 h，于授精后6 d统计观察到和未观察到三细胞阶段的囊胚形成率，比较两组间差异。

1.6 三细胞胚胎观察时间窗的确立

根据文献报道从受精卵到早期分裂为两细胞胚胎需要25～27 h[4]，在此时间窗内观察到两细胞胚胎并记录。从第1次卵裂结束到第2次有丝分裂开始需要（11.1±2.2）h，从第2次有丝分裂开始到第3次有丝分裂开始需要（1.0±1.6）h，因此拟定的观察三细胞胚胎的时间窗为33.9 h[（25+11.1-2.2）h]～42.9 h[（27+11.1+2.2+1.6+1）h]。将在授精后33.9～42.9 h内9 h分为3个时间窗，即W1：33.9～36.9 h，W2：>36.9～39.9 h，W3：>39.9～42.9 h，然后分别统计3个时间窗内三细胞胚胎出现的情况，追踪三细胞胚胎到授精后6 d，然后于授精后6 d统计3个时间窗观察到三细胞阶段胚胎的囊胚形成率。

1.7囊胚评分

参照Gardner评分系统，采用人类囊胚分级系统对囊胚评分。

1.8 统计学方法

采用SPSS 13.0进行统计学分析。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1经历三细胞阶段胚胎与囊胚形成率之间的联系

结果显示，150个受精卵授精后至42.9 h，有30个观察到三细胞阶段胚胎，这部分胚胎所对应的囊胚形成数为23个，即囊胚形成率为76.67%。120个未观察到三细胞阶段，无三细胞阶段胚胎所对应的囊胚形成率为4.17%。两者比较，具有三细胞阶段的囊胚形成率显著高于无三细胞阶段胚胎所对应的囊胚形成率，差异有统计学意义（χ2=5.89，P < 0.05）。见表1。

表1 有三细胞阶段胚胎与无三细胞阶段胚胎的囊胚形成率比较[n（%）]

2.2三细胞胚胎观察时间的确定

结果显示，W1、W2时间窗内具有三细胞阶段的囊胚形成率显著高于W3，差异有统计学意义（χ2=11.91，P < 0.05）。因此在授精后33.9～39.9 h内观察统计到的具有三细胞阶段胚胎的囊胚形成率较高，该时间段可以作为三细胞胚胎的适宜观察时间。见表2。

表2 三细胞胚胎观察时间与囊胚形成率比较[n（%）]

3 讨论

近年来，全世界已有近500万的试管婴儿借助体外受精-胚胎移植（IVF-ET）及其衍生技术诞生[5]。胚胎着床是试管婴儿成功的关键和起始环节。而大规模的统计研究显示，近二十年来IVF-ET的着床率始终徘徊在30%左右，这就意味着大多数胚胎无法种植在子宫内膜上，相当一部分患者需要经历多次胚胎移植。目前，精确的胚胎选择的方法有评估卵裂球的非整倍体和测试胚胎培养液微滴中的代谢改变等，尽管精细、科学，却由于价格昂贵、费时费力等原因不能直接用于临床。在没有找到一种最有效的选择方法之前，临床上多采用简便快捷的早期胚胎形态学评分法来选择用于移植的胚胎。目前国内外用于评价胚胎质量的常用方法主要有原核评价法和卵裂期胚胎评价法。原核评价法主要是对原核的形态、核仁前体的数量和分布进行评价，从而预测胚胎的发育潜能。原核评分不一定能完全反映胚胎的后期发育情况[6]。卵裂期胚胎评分法其评价指标主要是根据卵裂球的数目、均匀程度以及无核碎片的比例等参数来判断胚胎的质量。实践证明，仅根据授精后第3天胚胎质量标准选择胚胎移植，尽管考虑到目前已知的卵裂阶段胚胎的所有形态参数，仍然很难预测胚胎的发育潜能，即使是优质胚胎，也有相当数量的移植胚胎不能着床[7]。而且，形态学无异常表现的胚胎有存在遗传或表观遗传缺陷的可能，导致胚胎停孕及流产。虽可选择胚胎植入前遗传学诊断技术选择染色体正常的胚胎，但该项技术本身尚存在很多问题，如活检或诊断技术的失败而导致误诊或不能诊断、胚胎存在嵌合现象等。因此，需要寻找一种新的、无创的评价胚胎发育潜能的方法，以提高种植率并避免多胎妊娠的发生。囊胚培养是目前在体外挑选最具发育潜能的胚胎的方法。囊胚形成在形态上经历了细胞融合、囊胚腔出现和囊胚腔扩张的过程，基因调控经历了从母体调节向胚胎调节的转换[8-9]，发育潜能差及染色体异常的胚胎在未发育至囊胚时即发育停止，只有质量好的胚胎才有发育至囊胚的潜能[10]。因此，囊胚培养可以有效地对胚胎进行筛选，从而提高着床率。但是，目前囊胚培养体系还不够完善，通过IVF获得的胚胎体外有50%～70%不能发育到囊胚[11]。可能因未能获得囊胚或囊胚质量差，导致周期取消率升高。另外囊胚培养延长了胚胎在体外的生长时间，可能会导致基因组及表观遗传的变化。这就需要寻求一种无创且早期预测胚胎发育潜能的指标。在胚胎分裂早期通过观察分裂特性，对体外培养的胚胎做出预测，从而既可早期选择具有发育至囊胚阶段的胚胎，又避免了胚胎在体外的延迟培养。

2010年10月Nature biotechnology报道了通过实时成像显微镜观察100个IVF受精卵到四细胞胚胎的发育过程，根据胚胎发育动力学，从众多的参数中最终确定了3个发育阶段的时间窗作为预测胚胎是否具有发育到囊胚潜能的指标：①第1次有丝分裂时程为（14.3±6）min；②第1次有丝分裂完成至第2次有丝分裂开始的时间间隔为（11.1±2.2）h；③第2次有丝分裂开始至第3次有丝分裂开始的时间间隔为（1.0±1.6）h。上述胚胎发育时间窗对预测囊胚形成的敏感性和特异性为93%以上[12]。另外该研究结果还表明胚胎发育过程中卵裂球的分化是不同步的，在上述时间窗内受精卵经过前两次有丝分裂形成三细胞胚胎而不是经过两次卵裂形成四细胞胚胎。这表明三细胞胚胎是在早期胚胎发育过程特定时间内一个不可逾越的阶段，具有效预测胚胎发育的潜在价值。

本研究的结果也表明在体外成熟卵母细胞中观察到经历三细胞阶段的胚胎也有很高的囊胚形成率，但是低于文献报道的数值，推测可能与所选的卵母细胞为体外成熟的有关。

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