表观遗传学的意义范文
时间：2023-12-28 17:50:39
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篇1
>> 成瘾相关记忆的表观遗传学机制 愈肝颗粒对大鼠肝癌的抵制作用及其表观遗传学机制 自身免疫疾病的表观遗传学 表观遗传学的研究进展 表观遗传学与人类健康 表观遗传学研究进展 表观遗传学与食管癌相关性研究进展 表观遗传学调控的研究现状及其存在的问题 表观遗传学在抗肿瘤领域的研究现状及前景 研究生《表观遗传学》课程的教学改革与探索 表观遗传学在中医药研究中的应用 表观遗传学标记在急性白血病微小残留病检测中的临床意义 急性髓细胞白血病表观遗传学的靶向性和个体化治疗策略 浅析表观遗传学在高中生物课程中的教育价值及其实现 神奇的遗传学 遗传学的未来 表观遗传学有助解释妊娠高血压 关于遗传学教学的思考 遗传学中的数学思想 遗传学的概率计算 常见问题解答 当前所在位置：l）。有很多基于亚硫酸氢盐（bisulfite）处理DNA的检测启动子甲基化的方法，其原理是亚硫酸氢盐修饰将去甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，但留下甲基化的胞嘧啶不变。在随后通过聚合酶链反应（PCR）扩增CpG区域时，尿嘧啶被转化到胸腺嘧啶，而从甲基化的胞嘧啶则在此过程之中保持不变。甲基化和去甲基化的胞嘧啶之间的区别可能是胞嘧啶和胸腺嘧啶之间的区别，最初甲基化的程度可以由Pyrosequencing TM技术计算。最近亚硫酸氢盐测序、（定量）甲基化特异性PCR（MSP， methylation-specific PCR）、甲基化敏感单克隆核苷酸引物延伸（Ms-SNuPE，methylation-sensitive single nucleotide primer extension）等技术也普遍用于基因的甲基化测定。另有一些技术可以用于研究全基因组染色质结构的改变。例如利用特异性识别甲基化胞嘧啶的抗体进行免疫沉淀实验，后进行质谱测定；另一方面也利用DNA结合蛋白抗体或组蛋白的特异性修饰抗体，进行染色质免疫沉淀（ChIP，chromatin immunoprecipitation）测定，后进行DNA测序。更新的技术可以结合芯片，进行高通量的实验设定。
迄今为止，有关于神经性疼痛模型的表观遗传学研究数量并不是很多。从以往的研究报道来看，DNA甲基化、组蛋白乙酰化和非编码RNA的调控模式在神经性疼痛的发生、发展及其维持的各个环节都有发生非常明显的改变并发挥着极其重要的作用。在未来的研究中，我们将进一步的探索表观遗传学参与神经性疼痛的调控的分子机制，研究相关的修饰程序是如何带来了持久而长期的痛觉异常和痛觉过敏的，并为以后进一步的深入研究神经慢性病理性疼痛是如何发生、发展与维持打下基础，并为其后续的控制、治疗提供新的作用靶点。
*通讯作者：陈恒玲
参考文献
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篇2
例如，Baylin实验室早在1994年就观察到约60%的肾癌起因于肿瘤抑制基因VHL的失活性突变，同时也观察到在约20%的非VHL突变肾癌样本中，VHL启动子序列的高度甲基化导致该基因的表达被完全抑制。随后，Baylin等又观察到P16也可以由于其启动子被高度甲基化而被抑制，从而导致很多种肿瘤的发生。近期人们还发现，表观遗传和遗传也可以互相配合，抑制抑癌基因从而导致肿瘤的发生。例如，抑癌基因的一个等位基因因突变而失活，另一个等位基因则可能是因为启动子甲基化而被抑制表达。其次，异常的DNA甲基化还会导致某些抑制细胞转移的基因表达被抑制，进而促使肿瘤发生转移。
这些转移相关基因包括钙粘附蛋白（E-cadherin）基因、乙酰肝素硫酸盐合成途径、蛋白酶类组织抑制剂、轴突生长导向分子、血小板反应蛋白（thrombospondins）和层粘连蛋白等。最明显的是E-cadherin基因（CDH1）：某些原发肿瘤呈现E-cadherin超甲基化，但相应转移灶E-cadherin基因却未发生甲基化。这些结果显示，在原发肿瘤中E-cadherin表达缺失，但远端转移灶中E-cadherin表达可恢复。由此可见，转移细胞要正确整合入一个新的正常细胞环境，E-cadherin去甲基化和再表达是必不可少的。此外，基因内含子DNA，如LINE1和Alu重复序列被激活后，可转录或转位至其他基因区域并扰乱基因组。LINE1和Alu元件内较高程度的低甲基化与神经内分泌肿瘤和淋巴结转移相关。还有研究显示，许多具有高侵袭性或具有转移潜能的肿瘤中，某些基因呈现低甲基化，如SNCG和uPA/PLAU。
影响DNA甲基化水平的多种酶，包括DNMT3a、Tet蛋白的突变或失活也被证明与多种白血病有关。例如，急性髓细胞性白血病（acutemyeloidleukemia，AML）和其他几种淋巴细胞白血病中发现MLL-TET1的异常融合。这些证据都提示了DNA甲基化在癌症发生和发展中的关键作用。
组蛋白修饰与肿瘤
8个组蛋白（2XH2A、2XH2B、2XH3、2XH4）和约146bp的DNA组成染色质的最基本单位——核小体。组蛋白上面的很多氨基酸可以通过各种翻译后的可逆的共价键修饰，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等，形成理论上数目繁多的特定的“组蛋白密码”来形成“开放”或“关闭”的局部染色质结构，或是决定何种蛋白结合到特定DNA区域，从而调节多种DNA功能，包括转录、复制以及损伤修复。例如，组蛋白的H3K4、H3K36、H3K79三甲基化、H3K9和H3K14的乙酰化以及H4K20和H2BK5的单甲基化都导致基因激活，而H3K9的单/双甲基化和H3K27的三甲基化会抑制基因表达。更有意思的是，在胚胎干细胞（可能也包括其他细胞）内，“预备状态基因（poisedgenes）”有非常特异的“双调节码——H3K4和K3K27的三甲基化”，使得这些基因很容易被激活。迄今已发现数百种蛋白酶参与组蛋白共价修饰的精细调控。组蛋白修饰异常是肿瘤细胞的一个明显标志，例如，肿瘤细胞有着非常显著降低的H4K20的三甲基化和H4K16的乙酰化。而关于组蛋白修饰酶在肿瘤组织中的突变或表达异常的报道更是层出不穷，现在已知较多的是修饰组蛋白乙酰化和甲基化的酶在多种癌症中的突变，而其他类的酶与癌症的关系则还处于研究初期阶段，例如最近发现癌基因JAK2其实是一个组蛋白激酶。
1组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶
数种组蛋白乙酰化酶基因的移位在许多种血液肿瘤中频繁出现，这些酶包括EP300、CREBBP、NCOA2、MYST3、MYST4等，而腺病毒蛋白E1A和SV40T结合组蛋白乙酰化酶EP300和CREBBP后可异常激活许多基因，导致细胞增殖分裂加快从而在很多组织系统中引发癌变。有研究发现，EP300的突变和另一种组蛋白乙酰化酶KAT5的染色体移位可以大大增加结直肠癌、胃癌、乳腺癌以及胰腺癌的发病率。HDAC类和Sirtuins类两个家族的组蛋白去乙酰化酶都在很多类型的癌症中高表达，抑制他们的活性即可以抑制肿瘤生长。
2组蛋白甲基化酶和去甲基化酶
很多组蛋白甲基化酶和去甲基化酶也被发现与癌症发生发展密切相关。在许多种癌症中都有由于染色质移位、基因扩增或缺失、突变、融合、过表达或表达抑制等多种方式导致的酶表达水平或活性异常。例如，H3K4甲基化酶MLL在大于70%的新生儿白血病和5%~10%的成人AML和淋巴细胞性白血病中发生部分重叠性复制（partialtandemduplication，MLL-PTD）或者基因融合。和MLL异常有关的白血病往往对现有治疗方法不敏感，从而预后很差。已发现的可以和MLL发生融合的基因有80多种，其中一个关键机制是MLL和其他蛋白融合后引起的DOT1L，即一种H3K79甲基化酶，其结合到更多的位点可以导致很多促癌基因异常激活。
另一个H3K4甲基化酶SMYD3高表达于结直肠癌和肝癌中，使细胞繁殖和恶变加强。NSD1是一个H3K36（还可能包括H4K20）甲基化酶，其与白血病、胶质瘤、神经母细胞瘤以及一种非常容易患癌症的Sotos综合征有关。但在这些组蛋白甲基化酶中，与癌症关联证据最多且最复杂的还是H3K27甲基化酶EZH2。EZH2是PRC2复合物的关键成分，通过影响基因表达而在干细胞自我复制、定向分化、器官形成等生命过程中起着非常关键的作用。EZH2起初被发现高表达于前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、皮肤癌和肺癌，其诱发癌症的机制为：EZH2对干细胞特异基因的激活以及对很多抑癌基因如P16、P27和BRCA1的调控等等。
已有研究发现，抑制EZH2活性的确能在小鼠模型中抑制甚至完全阻断肿瘤的生长。在弥散性大B细胞癌中，EZH2的一个等位基因发生突变后和另一个等位基因表达正常的EZH2组合会出现更强的酶活性。而新近的研究却发现EZH2在25%的T细胞白血病中发生失活性突变。因此，根据不同的细胞环境，EZH2既可以是癌基因，也可以是抑癌基因。一方面，关于组蛋白去甲基化酶在癌症中的研究也越来越多。例如，催化双甲基或三甲基化的H3K4去甲基化的JARID1家族的多个蛋白在多种癌症中高表达且很可能是致癌原因。对EZH2起拮抗作用的H3K27去甲基化酶UTX在很多癌症中发生突变。催化单甲基化或双甲基化的H3K4去甲基化的LSD1在乳腺癌中的表达缺失，研究表明，LSD1的表达可以抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移，并且影响转化生长因子（transforminggrowthfactor，TGF）信号传导，这表明LSD1是一个强效的抑癌基因，可能是干预乳腺癌转移的新的分子靶点。
染色质重塑与肿瘤
染色质重塑（chromatinRemodeling）指的是在没有DNA和组蛋白共价修饰变化的情况下，染色质结构发生的变化，包括核小体的解体（DNA和组蛋白的分离）、移位、DNA-组蛋白之间亲和力的变化以及染色质三维结构的变化。染色质重塑通常是由一些能水解ATP产生能量的较大的复合物催化的，这些复合物包括SWI/SNF、ISWI、INO80等，它们通过影响染色质结构而调控转录、复制、DNA损伤修复等等从而在干细胞自我复制、分化发育、器官形成等过程中发挥重要作用。近几年研究发现，这些染色质重塑复合物，尤其是SWI/SNF复合物与多种癌症相关。SWI/SNF复合物在从酵母到人的所有整合细胞中都保守存在，影响基因表达、复制等基本DNA功能。哺乳动物SWI/SNF复合物包含8~12个成分，其组成成分（和具体功能）呈组织特异性以及发育阶段特异性。SWI/SNF复合物的ATP酶可以是BRG1或BRM其中之一，其他成分包括SNF5、BAF155、BAF170、ARID1a和BAF180等等。
编码这些成分的基因在多种癌症中发生突变，其中最早发现与癌症有关且证据最多的成分是SNF5。早在1998年，Versteege等发现，突变基因SNF5反复出现在一种高死亡率的儿科恶性肿瘤——恶性柱状细胞癌（malignantrhabdoidtumors，MRTs）中，而且SNF5突变和MRTs的关系还具有家族性：有单个等位基因SNF5突变的家族容易发生另一个SNF5等位基因失活，从而发生癌变。随后，研究又发现神经鞘瘤（Schwannomatosis）等多种癌症均存在SNF5突变。人为诱导SNF5在这些肿瘤细胞中表达，会导致这些细胞生长抑制。
为直接验证SNF5的抑癌活性，我们构建了条件性SNF5缺失的转基因小鼠，研究发现，SNF5失活会诱发全部小鼠出现恶性癌症，包括与人MRTs组织学和全基因组表达模式非常相似的鼠MRTs以及来源于成熟记忆T细胞的淋巴瘤，且其癌变的潜伏期只有11周，远远快于任何其他抑癌基因失活的小鼠模型（P53失活致癌的潜伏期是20周，P16、P19、Rb等失活后癌变时间则更长）。这些实验证据都表明SNF5是一个非常强的抑癌基因。越来越多的证据表明，其他SWI/SNF成分也和癌症强相关。例如BRG1在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等癌症中缺失或突变；ARID1a在近50%的卵巢癌、胃癌、乳腺癌等多种癌症中突变；BAF180在近半数肾癌中突变等等。
癌症的本质：是遗传病还是表观遗传疾病？
长期以来，人们普遍认为，癌症是一种“遗传性”疾病，即主要是由若干（至少2~3个）基因突变累积导致靶细胞持续增殖、凋亡失控、侵袭能力增强等变化从而癌变。然而，最近几年在以下几方面的研究进展，尤其是癌症基因组测序项目的实施，使得人们开始重新审视这一理论。
首先，人们发现基因被激活或失活，并不一定要通过DNA序列改变，表观遗传调控失常也可和基因突变一样造成致癌后果。例如基因突变可阻断抑癌因子VHL的表达从而造成恶性肾癌，然而即使很多患者没有VHL基因本身的突变，该基因启动子高度甲基化也可以完全一致VHL基因的表达而致癌。又比如很多癌变细胞里P16基因虽然序列正常，但其表达却受表观遗传抑制（例如其启动子高度甲基化或SWI/SNF功能缺失）而不能发挥抑癌功能。此外，很多在发育过程中起重要作用的信号传导通路，包括WNT、Hedgehog、TGF等的关键成分突变亦可导致癌变。最近几年的研究表明这些信号传导通路也可以通过表观遗传的方式调控，例如北京大学医学部尚永丰实验室发现LSD1可以调节TGF信号通路，我们实验室也发现SNF5和Hedgehog信号通路关系密切。这些证据都表明遗传（DNA序列改变）和表观遗传两种方式可以导致同样的结果。这些研究奠定了表观遗传调控失常致癌的理论基础。
其次，最近几年发展起来的测序技术使得人们有可能测定同一种癌症的多个样本的全外显子序列甚至全基因组序列，从而比较全面彻底地发现致癌原因。这个项目除了发现人们熟知的癌基因或抑癌基因外，最令人吃惊的是发现了表观遗传调控基因的突变（包括DNA序列中碱基突变、缺失、移位、融合或多拷贝放大等）所导致的癌症种类数量之多及发生率之高远远大于人们以前的理解。多个表观遗传调控因子被发现在血液系统恶性肿瘤（包括各种白血病）、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、淋巴瘤等多种癌症中以很高的比率出现。例如，SNF5基因在高达98%的MRTs中突变或缺失，而组蛋白甲基化酶MLL2的突变则在高达89%的滤泡性淋巴瘤和近30%的弥散性大B细胞淋巴瘤患者样本中被检测到。
再次，虽然很多癌症患者的癌细胞中都有几十、上百甚至更多的基因发生突变，然而重要的问题是：究竟哪些是真正的致癌因素（drivers），哪些是癌变过程中导致的或根本就是随机的附带突变（passengers），这个问题长久以来没有得到解决。全基因组测序技术的快速进步为回答这个问题提供了强有力的方法——对同一种肿瘤的多个病例进行测序分析，如果有超过一定比例的患者都有某个基因的突变，则这个基因很可能就是这种癌症的致癌基因，而且这种“重复突变（recurrentmutation）”的基因数目越少，这些突变的基因越有可能是真正的致癌因素。这两种方法都为表观遗传在癌症发生发展中的重要作用提供了大量的实验证据。
仍以MRTs为例，这种死亡率极高，发展极快（通常从发病到死亡不到1年）且对现有治疗手段极不敏感的儿童肿瘤，其基因组却很稳定，没有任何染色质片段扩增或缺失，更没有整条染色体的增多或减少。几乎所有的MRTs都有SNF5基因的双等位基因失活性突变或缺失。我们实验室的一系列工作，尤其是近期对数十例MRTs样本的深度测序，发现MRTs除SNF5本身外，只有很少几个甚至没有其他基因发生突变，因此，MRTs可以说是第一个被发现的“表观遗传性”肿瘤。这也说明癌症可以是简单的、纯粹的表观遗传性疾病。又如在膀胱癌中，将近20%的“重复突变”基因的表达产物参与表观遗传调控。Nature杂志也曾报道，和以前的猜想完全相反，视网膜母细胞瘤也是一种“表观遗传肿瘤”：对该肿瘤的全基因组测序发现，除RB基因外，只有很少基因发生突变，但是很多基因却通过表观遗传方式被异常激活，因此，其致癌机制很可能是RB通过和染色质重塑复合物相互作用及影响DNA甲基化而激活SYK等癌基因。此外，儿童成神经管细胞瘤和Wilms’瘤也都呈现较高程度的基因组稳定性而少有基因突变，很可能是“表观遗传肿瘤”。
另一个确定真正致癌因子的方法是在体外或模型动物（最常用的是小鼠）人工诱导同样的基因异变，然后检测是否诱发同样的癌症。最好的例子还是SNF5，SNF5基因突变在98%的儿童MRTs以及其他数种恶性肿瘤中被检测到，而且还具有家族性：在丢失一个SNF5等位基因的家族中，其成员往往容易丢失另一个SNF5的等位基因从而导致MRTs。为了验证SNF5的失活的确是这些恶性肿瘤的癌变原因，我们和其他实验室制备了可诱导的SNF5条件性缺失小鼠。SNF5失活导致100%的小鼠在11周左右死于恶性肿瘤——主要是MRTs（和人的同类肿瘤在组织学和全基因组表达模式上都十分相似）和恶性的TCR依赖的成熟T细胞淋巴瘤。这些实验数据证明，SNF5的确是一个活性非常强的抑癌基因，其活性丧失能直接导致癌变。值得一提的是，SNF5的抑癌活性比任何已知的抑癌基因都强：P53失活致小鼠癌变的时间是20周（是SNF5失活导致癌变时间的2倍），P16等其他抑癌基因缺失导致的癌变则需要更长的潜伏期，而且癌变率并不是100%。其他表观遗传调控因子，如MLL和AF9等基因融合，MOZ-TIF2基因融合的致癌性也在动物实验中得到直接验证。
最后，验证表观遗传在癌症发生发展中的作用还可以通过改变表观遗传调控活性能否阻断或逆转癌变过程。美国食品药品监督管理局（FoodandDrugAdministration，FDA）批准的针对表观遗传的4个药物都在临床取得了很好的疗效（详述如下）。我们实验室利用转基因小鼠模型，发现了抑制Ezh2或Brg1的表达可以完全阻断Snf5失活所致恶性肿瘤的发生，证实了表观遗传调控因子在恶性肿瘤发生发展中的关键作用，也为这些分子作为潜在药物靶分子提供了直接的证据。
表观遗传致癌的可能机制
越来越多的证据支持表观遗传在癌症发生发展中的关键作用，然而其作用的分子机制还很不清楚，有待进一步深入研究。第一，表观遗传通过影响基因表达，激活癌基因或抑制抑癌基因，例如表观遗传对VHL、P16、Myc等基因的调控。第二，表观遗传调控异常会导致染色质结构不稳定，从而引发染色体数目异常（aneuploidy）、大片段缺失或扩增以及DNA修复机制紊乱。第三，表观遗传可能影响细胞增殖或凋亡，例如Brg1/Brm缺失后，Rb不再诱导细胞凋亡，其他SWI/SNF也和P53有密切关系。第四，表观遗传可能影响重要信号传导通路，如WNT、Hedgehog、TGF、细胞表面受体及许多激素受体等，这些信号通路在个体发育中具有关键作用，在癌变过程也扮演重要角色。尽管这些研究刚刚起步，但已经得出一些证据——SWI/SNF和Hedgehog密切相互作用、影响AR/ER信号、LSD1和TGF相互作用。我们还发现，SNF5缺失后会诱导非常恶性的依赖TCR信号的T细胞淋巴瘤发生。最后，表观遗传也能影响癌症侵袭和转移，例如LSD1可以显著影响乳腺癌的侵袭和转移能力，SWI/SNF也被证明与肿瘤转移有关。
表观遗传在临床中的应用
人们曾经认为癌症是一种遗传性疾病，并花了相当大的人力、物力和时间来寻找合适的基因治疗方法，然而，实践证明，试图将一个突变的DNA序列变回正常是非常困难的，迄今为止尚无一例成功；而表观遗传的改变却是可以调控、可以逆转的，认识到表观遗传在癌症发生发展中的关键作用，将对癌症的临床预防、诊断及治疗产生深远影响。
1预防
很多证据表明在癌变过程中，表观遗传变化先于DNA序列变化，且表观遗传相对容易调控和逆转，这为预防癌症提供了新思路。例如，很多致癌因素，如吸烟、酗酒、高脂饮食都能导致DNA甲基化的变化；慢性炎症和癌症的关系，尤其是消化道慢性炎症导致的食道癌、肝癌、结直肠癌等已为人们熟知，幽门螺杆菌或丙型肝炎病毒都能导致慢性炎症继而发展为癌症，而表观遗传在此过程中就起着重要的作用，包括DNA甲基化异常、表观遗传性的基因表达异常，尤其是一些细胞因子或信号传导蛋白（例如IL-B、TNF、IL-8、TGF等等）的异常。因此，目前研究者们都在思考如何调控DNA甲基化以预防癌症。
2诊断
将表观遗传应用于癌症诊断主要集中在以下4个方面。（1）检测癌细胞，DNA甲基化异常和癌症的相关性已为人们广泛接受，随着近几年测序技术的惊人进步，全基因组的甲基化检测变得容易，人们发现几乎每一种癌症都有其特有的“甲基化基因组模式”。目前的研究重点集中在发现这种癌症特有而正常细胞没有的全基因组水平DNA甲基化标记，并开发出简单、快速、灵敏、可靠的检测试剂盒。（2）针对高危人群（吸烟者、矿工、慢性炎症患者、污染严重地区、有癌症高发家族史等人群）的早期检测，这方面最好的例子是GSTP1基因启动子的甲基化发生在80%~90%的恶性前列腺癌患者血液中，但却与良性前列腺癌无关。（3）对预后的预测，目前癌症治疗中最关键的问题之一是如何对组织学相似的同型癌症患者进行预后分析，以确定治疗策略、选择治疗强度。目前已经发现多种表观遗传调控因子和多种癌症预后相关，例如组蛋白甲基化酶NSD1的活性与神经母细胞瘤、DARK和肺癌、EMPS和脑癌、CDKN2A和直肠癌预后相关等等。（4）对化疗效果的检测和评估，目前也是一个热门领域。
3治疗
比起DNA序列的变化，表观遗传的变化更容易调控和逆转，因此，近年来对表观遗传在癌症发生发展中的关键作用的发现让医学界极为振奋，也为新药研发提供了全新的、前景广阔的一类抗癌靶分子，因而“几乎每一个药物公司都建立了研究开发针对表观遗传调控的抗癌药的部门，或者建立了和表观遗传研究公司的紧密合作”（TheScientist杂志2010年4月刊）。迄今为止，美国FDA批准了4个针对表观遗传调控的药物：其中两个是针对DNA甲基化的DNMT抑制剂Vidaza和Decitabine，它们被用于Myolodysplastic综合征及其并发的急性白血病；另外两个是针对组蛋白去乙酰化HDAC酶的Vorinostat和Romidepsin，主要用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤；这4种药物的不足之处是缺乏特异性，即对所有的DNA甲基化酶或组蛋白去乙酰化酶都有抑制作用，因而毒副作用较大。
目前正在研发其他针对某一个特定表观遗传调控因子，包括DNA甲基化酶、组蛋白修饰（乙酰化、去乙酰化、甲基化、去甲基化、磷酸化、去磷酸化等等）酶的特异性更强的药物，其中，多集中在研发针对组蛋白甲基化酶和去甲基化酶的药物。比起其他调控方式，组蛋白甲基化/去甲基化调控的特点有：（1）调控方式多样而精确，可以发生在多个组蛋白的多个氨基酸位点，已经验证的就有11个位点，而且甲基化状态也有4种——无甲基、单甲基、双甲基和三甲基。（2）特异性强：以上多位点的各种甲基化状态理论上可以有上百万种不同的组合，因而可以预见，在不同的细胞状态、不同的基因位点可以有极其特异的甲基化编码（code）。（3）可逆性：组蛋白甲基化可以通过各种甲基化酶和去甲基化酶来快速调控。（4）基于以上特点，调控组蛋白甲基化的酶种类繁多（目前已发现近百种甲基化酶和数十种去甲基化酶）且有很强的特异性，是非常适于做小分子药物的靶分子（druggabletargets）。
因此，许多药物公司正在积极研发特异性影响某个组蛋白甲基化酶和去甲基化酶（例如EZH2、MLL、DOT1）活性的新一代抗癌药物。
总结与展望
篇3
【关键词】新生儿遗传代谢病；早期诊断和治疗；血标本采集
新生儿遗传病是指先天性甲状腺功能低下症和苯丙酮尿症两种疾病。先天性甲状腺功能低下症是导致儿童体格、智力发育障碍的常见内分泌疾病之一[1]苯丙酮尿症是常染色体隐性遗传病，由于苯丙氨酸羟代酶或其辅酶的缺陷，使苯丙氨酸及其代谢产物蓄积，影响中枢神经的发育，可引起严重的智力落后。我国新生儿发病率为1/11000[2]。新生儿遗传代谢病是影响儿童智力和体格发育的严重疾病，若及早诊断和治疗，患儿身心发育大多可达到正常同龄儿童水平。本筛查是根据《中华人民共和国母婴保健法实施办法》、卫生部《新生儿疾病筛查管理办法》在新生儿健康的先生性、遗传性疾病实行的专项检查，以达到早期诊断，早期治疗的目的。对防止残病，提高出生人口素质有着重大意义。我科是从2008年开展新生儿遗传病筛查，2008年10月-2010年10月共筛查新生儿4808例，其中阳性2例，得到了早期诊断和治疗，现报道如下：
1资料与方法
1.1一般资料:2008年10月至2009年10月我院出生新生儿有2360例，而新生儿遗传病筛查只有1680人，仅占出生率71%，采血标本合格率为95%。
2009年11月至2010年10月出生新生儿2448例，新生儿遗传病筛查2260例，占出生率92%，采血合格率99%，出血率和感染率为0.
1.2方法:加强宣传教育，做好采血的解释工作。由于新生儿遗传病是新开展的技术项目，家长认为这么小的孩子采血会很痛，心痛孩子而拒绝采血，且家长对先天性疾病的危害不了解，因此我们就要采取各种措施，取得家长的配合和理解。
1.2.1采用产前、产后发放资料，床旁介绍，入院介绍，指导母乳喂养过程中介绍，让其头脑中有个粗略概念。
1.2.2医生查房或护士巡视病房时认真解释筛查意义，并告诉他们这是一项操作简单，痛苦很小的操作，不会有并发症的，像平时打针或化验室采指尖血一样，我们在操作中一定会严格无菌操作规程的，会选择采血技术特别好的护士为你的孩子采血，这样才能取得家长配合同意。
1.3采血方法:
1.3.1采血护士必须具有高度的责任感，动作应轻柔，双手应清洁温暖。选择出生3天并充分哺乳后新生儿，认真查对填好卡片，将采血滤纸订于卡片上备用。
1.3.2首先用手触摸孩子足部温度，如不温暖或呈紫斑色应先用热水浸泡，热敷或按摩，最好在沐浴或新生儿游泳后采血最佳。双手握住膝关节以下轻按至足跟，再次按摩至足跟，使局部血液聚集充盈，用75%酒精消毒两次足跟内，外侧5cm以上待干。 1.3.3左手蹦紧采血部位皮肤，右手持一次性采血针快速拔斜刺约45度角，深度8mm，不可在同一部位的血斑上重复滴入血液，手持消毒棉球轻压采血部位使其止血，将血片置于清洁空气中，避免阳光直射，自然晾干，保存于密闭胶袋内，并放置在2-8℃冰箱内保存，在7天内将滤纸干血片选至新生儿疾病筛查中心，并登记新生儿相关信息。
2结果
筛查出阳性患儿2例，其中先天性甲状腺功能低下症及苯丙酮尿症各1例。合格标本4760例，不合格标本48例，一次性采血标本合格率99%。采血过程中，护理人员严格无菌操作技术，出血和感染均为0。
3讨论
3.1提高新生儿遗传代谢病筛查，必须加强宣传力度。通过各种形式加大宣传力度，使全社会广泛认识到疾病的危害性和新生儿遗传代谢病筛查的重要性，及时召回阳性患儿，及时治疗，预防残疾儿的发生，从而提高我县出生人口素质。
3.2 一次性成功采血。新生儿遗传病人筛查血标本采集技术是产科及新生科护理人员应掌握的一项技术，要加强培训，熟练掌握。要选择最佳的穿刺部位，提高采血的成功率，根据解剖特点，针刺足跟内侧的足底内例侧静脉及足跟外侧的小隐静脉分支处血流通畅，可提高一次性采血成功率，减少新生儿痛苦。
3.3 正确的采集血标本是新生儿遗传代谢病筛查主要的环节，检验结果准确与否的关键，必须对采集血标本的护理人员进行严格的培训考核，不断提高相关知识和技术操作水平，增强工作责任感，确保参与血标本采集的护理人员在采血送检等各环节中能严格遵守护理操作规程。
3.4 保证血标本的质量，必须严格血标本的收集管理。血标本的采集和血管理要求非常严格，任何一个环节出差错，都将直接影响检验结果，科室要有严格的管理和质控制度，建立新生儿遗传代谢病筛查信息登记本，由专人负责采血时，严格执行查对制度，防止差错事故的发生。
参考文献
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在Watson和Crick发现DNA双螺旋结构后的50多年里，基因工程药物在治疗人类疾病中逐渐占据一席之地，人类基因组计划的完成为基因治疗开辟了更广阔的空间。近年来随着遗传学的新兴学科——表观遗传学在人类疾病治疗方面获得了越来越多的证据[1]。它从分子水平上揭示复杂的临床现象，为解开生命奥秘及征服疾病带来新希望。
表观遗传学是研究没有DNA序列变化的情况下，生物的表型发生了可遗传改变的一门学科[2]。表观遗传学即可遗传的基因组表观修饰，表观修饰包括：DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、X染色体失活、基因组印记、非编码RNA调控等[3]，任何一方面的异常都可能导致疾病，包括癌症、染色体不稳定综合征和智力迟钝[4]等。表观遗传的改变是可逆的，这就为治疗人类疾病提供了乐观的前景。本文从表观遗传学与人类疾病、环境与表观遗传学的关系以及表观遗传治疗3个方面进行综述。
1 表观遗传学修饰与人类疾病
1.1 DNA甲基化相关疾病
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下，将甲基基团转移到胞嘧啶碱基上的一种修饰方式。它主要发生在富含双核苷酸CpG岛的区域，在人类基因组中有近5万个CpG岛[5]。正常情况下CpG岛是以非甲基化形式(活跃形式)存在的，DNA甲基化可导致基因表达沉默。DNMTs的活性异常与疾病有密切的关系，例如位于染色体上的DNMT3B基因突变可导致ICF综合征。有报道[6]表明，重度女袭性牙周炎的发生与2条X染色体上TMP1基因去甲基化比例增高有关。DNMT基因的过量表达与精神分裂症和情绪障碍等精神疾病的发生也密切相关。风湿性疾病等自身免疫性疾病特别是系统性红斑狼疮(SLE)与DNA甲基化之间关系已经确定[7]，在SLE病人的T细胞发现DNMTs活性降低导致的异常低甲基化。启动子区的CpG岛过度甲基化使抑癌基因沉默，基因组总体甲基化水平降低导致一些在正常情况下受到抑制的基因如癌基因被激活[8]，都会导致细胞癌变。
1.2 组蛋白修饰相关疾病
组蛋白的修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP核糖基化、羰基化等，组成各种组蛋白密码。其中，研究最多的是乙酰化、甲基化。一般来说，组蛋白乙酰化标志着其处于转录活性状态;反之，组蛋白低乙酰化或去乙酰化表明处于非转录活性的常染色质区域或异染色质区域。乙酰化修饰需要乙酰化转移酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)参与。组蛋白修饰酶异常可导致包括癌症在内的各种疾病，例如，H4K20的三甲基化是癌症中的一个普遍现象。甲基化CpG2结合蛋白2(MeCP2)可使组蛋白去乙酰化导致染色质浓缩而失活，其中Rett综合征就是MeCP2的突变所致。
1.3 染色质重塑相关疾病
染色质重塑是DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑复合物的共同作用。它通过影响核小体结构，为其他蛋白提供和DNA的结合位点[9]。其中染色质重塑因子复合物主要包括SWI/SNF复合物和ISW复合物。染色质重塑复合物如果发生突变，可导致染色质不能重塑，影响基因的正常表达，导致人类疾病。如果突变引起抑癌基因出现异常将导致癌症，例如：小儿科癌症中检测到SNF5的丢失。编码SWI/SNF复合物相关的ATP酶的基因ATRX、ERCC6、SMARCAL1的突变可导致B型Cockayne综合征、Schimke综合征甚至肿瘤。ATRX突变可引起DNA甲基化异常，从而导致数种遗传性的智力迟钝疾病如:X连锁α2地中海贫血综合征和SmithFinemanMyers综合征，这些疾病与核小体重新定位的异常引起的基因表达抑制有关[10]。
1.4 X染色体失活相关疾病
哺乳动物雌性个体不论有多少条X染色体，最终只能随机保留一条的活性。X染色体失活由X失活中心(Xic)调控，Xic调控X染色体失活特异性转录基因(Xist)的表达。X染色体的不对称失活可导致多种疾病，例如男性发病率较高的WiskottAldrich综合征是由于WASP基因突变所致。X染色体的PLP基因突变失活常导致PelizaeusMerzbacher病;X染色体的MeCP2基因突变失活导致Rett综合征[11]。在失活的X染色体中，有一部分基因因逃避失活而存在2个有活性的等位基因，使一些抑癌基因丧失功能，这是引发女性癌症的一个重要原因[12]。
1.5 基因组印记相关疾病
基因组印记是指二倍体细胞的一对等位基因(父本和母本)只有一个可以表达，另一个因表观遗传修饰而沉默。已知在人体中有80多种印记基因。印记丢失导致等位基因同时表达或有活性的等位基因突变，均可引起人类疾病。一些环境因素，如食物中的叶酸也会破坏印记。印记丢失不仅影响胚胎发育，并可诱发出生后的发育异常。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活可导致癌症的发生，如IGF2基因印记丢失导致的Wilms瘤[13]。15号染色体的表观遗传异常可导致PraderWilli综合征(PWS)和Angelman综合征(AS)，PWS是由于突变导致父本表达的基因簇沉默，印记基因(如SNURF/SNRPN)在大脑中高表达所致;AS是由于母本表达的UBE3A或ATP10C基因的缺失或受到抑制所致。Beckwithweideman综合征(BWS)是11号染色体表观遗传突变引起印迹控制区域甲基化的丢失，导致基因印记丢失引起[14]。
1.6 非编码RNA介导相关疾病
功能性非编码RNA分为长链非编码RNA和短链非编码RNA。长链RNA对染色质结构的改变起着重要的作用。短链RNA对外源的核酸序列有降解作用以保护自身的基因组。小干涉RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)都属于短链RNA，在人类细胞中小片段的siRNA也可以诱导基因沉默。miRNA能够促使与其序列同源的靶基因mRNA的降解或者抑制翻译，在发育的过程中起着关键性作用。转录的反义RNA可以导致基因的沉寂，引起多种疾病，如使地中海贫血病人的正常球蛋白基因发生甲基化。由于miRNA在肿瘤细胞中的表达显著下调，P53基因可通过调控miRNA34ac的表达治疗肿瘤。在细胞分裂时，短链RNA异常将导致细胞分裂异常，如果干细胞发生这种情况也可能导致癌症。
2 环境表观遗传学
对多基因复杂症状性疾病来说，单一的蛋白质编码基因研究远远不能解释疾病的发生机理，需要环境与外界因素的作用才会发病。疾病是外界因素与遗传因素共同作用的结果。流行病学研究已经证实，人类疾病与环境有明确的关系，高血压、中风、2型糖尿病、骨质疏松症等疾病的发病率与环境有着密切的关系[15]。特别是在发育初期，不利的环境、 营养的缺乏都有可能导致出生低体重、早产、胎儿发育不成熟等[16]。环境与DNA甲基化的关系一旦建立，将为环境射线暴露与癌症发生提供依据[17]。
环境污染等不利因素均有可能增加基因的不稳定性，每个人对环境和饮食的敏感性可因先天遗传不同而不同，环境因素与个体遗传共同作用，决定潜在表观遗传疾病的危险性。有人推测上述因素肯定会在我们基因组上遗留下微量的基因表遗传学痕迹[1]。随着年龄增长，DNA甲基化等化学修饰改变也在长时间中错误积累，这也有助于解释为什么很多疾病总是在人进入老年后才发生。由此可见，如果改变不良生活习惯、减少环境污染，都有可能降低表观遗传疾病的发病率。因此研究环境与表观遗传改变的关系对于预防和治疗人类疾病都有着重要的意义。
3 表观遗传学药物
人类许多疾病都可能具有表观遗传学的改变，表观遗传学治疗研究如火如荼。已经发现许多药物可以通过改变DNA甲基化模式或进行组蛋白的修饰等来治疗疾病。目前，很多药物处于研制阶段，尽管其有效性尚未得到充分证实，但给癌症、精神疾病以及其他复杂的疾病的治疗带来了希望。
3.1 组蛋白去乙酰化酶抑制剂
目前发现的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC Inhibitor)有近百种。其中FK228主要作用机制是抑制肿瘤细胞内组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性，引起乙酰化组蛋白的积聚，从而发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡或分化等作用[18]。FK228单独用药或与其他药物或方法联合应用表现出良好的抗肿瘤作用，同时还可阻碍血管生成，具有抑制肿瘤转移、逆转耐药性、调节免疫力等作用。FK228还具有治疗炎症、免疫性疾病、视网膜新生血管疾病及神经系统等多种疾病的药理学作用。
3.2 DNA甲基转移酶抑制剂
核苷类DNA甲基转移酶抑制剂作用机理是在体内通过代谢形成三磷酸脱氧核苷，在DNA复制过程中代替胞嘧啶，与DNMTs具有很强的结合力。核苷类似物5氮杂胞苷(5azacytidine)是第一个发现的甲基化抑制剂，最初被认为是细胞毒性物质，随后发现它可抑制DNA甲基化和使沉默基因获得转录性，用于治疗高甲基化的骨髓增生异常综合征，低剂量治疗白血病。其他核苷类DNA甲基转移酶抑制剂有5氮2脱氧核苷(5aza2′deoxycytidine)，Zebularine(5azacytidine的衍生物)[19]，5Fluoro2′deoxycytidine，RG108，Procainamide，Psammaplins(4aminobenzoic acid衍生物)，MG98(寡聚核苷酸)等。DNA甲基化抑制剂Procainamide可用于抗心律失常。另外在茶叶和海藻中提取的EGCG也显示具有体外活性。临床中应用反义寡核苷酸对DNA甲基转移酶进行抑制正在进行实验。
3.3 联合治疗
DNA甲基化抑制剂与HDAC抑制剂联合应用治疗疾病可能具有协同作用。进行表观修饰治疗后的细胞可能对于化疗、干扰素、免疫治疗更具有敏感性。在癌症的治疗方面，应当包括遗传治疗和表观遗传治疗两个方面，同时运用两种或两种以上表观修饰的方法对病人进行治疗对人类疾病意义重大。
3.4 其他方法
人胚胎干细胞保留有正常基因印记，这些干细胞可能具有治疗意义[20]。另外，在女性细胞中非活性的X染色体中存在正常的野生型基因，如果选择正确的靶点，就有可能激活这个正常但是未被利用的野生型基因，从而对其进行基因治疗。有报道[21]运用RNAi技术沉默胰岛β细胞相关基因，抑制胰岛淀粉样形成可能用来治疗糖尿病。短链脂肪酸(SCFAs)丙戊酸钠用于抗癫痫，丁酸可用来治疗结肠癌[22]等。siRNA可在外来核酸的诱导下产生，通过RNA干扰(RNAi)清除外来核酸，对预防传染病有重要作用。目前，RNA干扰已大量应用于包括肿瘤在内的疾病研究，为一些重大疾病的治疗带来了新的希望。
4 结 语
从表观遗传学提出到现在，人们对表观遗传学与人类疾病的发生有了更深入的认识。人类表观基因组计划(human epigenome proiect，HEP)已经于2003年开始实施，其目的是要绘制出不同组织类型和疾病状态下的人类基因组甲基化可变位点(methylation variable position ，MVP)图谱。这项计划可以进一步加深研究者对于人类基因组的认识，为表观遗传学方法治疗人类复杂疾病提供蓝图[1]。但是，表观遗传学与人类生物学行为(临床表型)有密切关系，人类对表观遗传学在疾病中的角色研究还处于初级阶段。应更进一步研究表观遗传学机制、基因表达以及与环境变化的关系，有效减少表观遗传疾病的发生风险，努力探索这片造福人类的前沿领域。
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篇5
HIC-1在肿瘤发生中的作用机制肿瘤的发生通常伴随着表观遗传学的改变，包括基因甲基化、组蛋白修饰和非编码小RNA干扰等，这些改变可使基因功能发生变化，从而导致细胞恶变。事实上，异常的表观遗传学修饰是肿瘤形成的必然要素，其已成共识。越来越多的研究证明，HIC-1基因表观遗传学的改变，参与了多种肿瘤的发生。
启动子的甲基化与肿瘤的发生
一般认为，HIC-1是一种肿瘤抑制基因，在多数实体瘤和白血病中表现为表观遗传学沉默，如前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌和肝癌、食管癌、非精原生殖细胞癌、儿童髓母细胞瘤、神经胶质瘤和室管膜瘤。应用甲基化特异性PCR（MSP）和重亚硫酸盐测序发现，人类许多实体瘤和白血病中HIC-1均表现出高甲基化。例如，Yamanaka等在研究前列腺癌的发生与7种基因甲基化的相关性时发现，HIC-1的甲基化率为99%；Eguchi等在非小细胞肺癌标本检测出33%的肿瘤组织和31%非肿瘤组织中有HIC-1启动子的甲基化，且基因的甲基化程度与肿瘤分化程度呈负相关；Fujii等对39例原发性乳腺癌组织研究发现，有26例肿瘤组织（67%）出现HIC-1基因的完全甲基化。一般认为HIC-1启动子区域的高甲基化可抑制HIC-1表达，且整个HIC-1基因的表达水平随肿瘤的发展不断降低。
HIC-1的表观遗传学失活可能促使细胞在肿瘤形成早期调整生存模式和信号通路，或调整一系列特异性转录因子的表达。将HIC-1基因人为导入该基因失活的肿瘤细胞株可明显降低肿瘤细胞的成活率。然而，HIC-1启动子甲基化也被发现存在于儿童正常脑组织、成人脑和前列腺上皮组织中。此外，在已确诊的急性白血病和慢性粒细胞性白血病慢性期的病人中，仅有少数病人出现HIC-1甲基化。但在复发的急性淋巴细胞白血病和急转的慢性粒细胞性白血病病人中，HIC-1均表现出高甲基化。故HIC-1甲基化已被认为是造血系统肿瘤的晚期事件，提示降低HIC-1的表达可能存在其他机制。通过以上例证说明，HIC-1启动子区域的甲基化程度与肿瘤的发生、发展有密切关系。干预肿瘤细胞HIC-1启动子甲基化，有可能对抑制肿瘤的发生、发展具有积极作用。
HIC-1与p53抑癌基因的协同作用
HIC-1识别的一个重要靶点是SIRT1（thesilentmatingtypeinformationregulationhomolog1），该基因编码一种去乙酰酶。SIRT1可使p53去乙酰化，降低p53基因对细胞凋亡和（或）增殖的调节能力。据报道，在正常生理情况下，HIC-1能抑制SIRT1转录，进而抑制p53去乙酰化；但在肿瘤细胞中HIC-1表观遗传学的失活，导致SIRT1水平升高。p53因去乙酰化作用而失活，促使细胞抵抗凋亡而成活。另外，HIC-1的启动子区域存在PRE，意味着HIC-1是p53的直接靶基因，p53能激活HIC-1的转录而不依赖于其甲基化状态。因此，这个p53/HIC-1/SIRT1调节通路是HIC-1作为肿瘤抑制基因发挥作用及其与p53协同作用的重要途径。
HIC-1与p53的双杂合性缺失模型进一步证实了HIC-1以及HIC-1与p53协同作用在肿瘤发生、发展中的意义。Chen等研究发现，HIC-1+/-小鼠在老年时期发生一系列具有性别依赖性的恶性肿瘤，HIC-1+/-p53+/-小鼠骨肉瘤的发生率（35%）较p53+/-小鼠（20%）高，且具有年龄依赖性。在64只HIC-1+/-p53+/-小鼠中发现5例乳腺肿瘤（4例腺鳞癌，1例肌上皮瘤）及7例卵巢肿瘤，在p53+/-小鼠中仅发现1例卵巢血管肉瘤，而在HIC-1+/-小鼠中未发现上述肿瘤。
HIC-1在肿瘤发生中的其他作用机制
最近研究表明，肿瘤细胞中HIC-1的失活能使成纤维细胞生长因子结合蛋白1表达增加，从而导致血管形成或增生。Zhang等发现，HIC-1能调节ephrin-A1(EFNA1)基因的直接转录，从而抑制上皮肿瘤的形成。另外，实验结果表明，HIC-1是一种新的细胞生长调控机制中的核心分子，这种HIC-1介导的信号通路的中断将导致异常细胞增殖和肿瘤形成。Boulay等发现，肿瘤发生过程中HIC-1的缺失通过上调乳腺上皮细胞中β2肾上腺素能受体的表达促使肿瘤转移。此外，HIC-1还是调节细胞生长及凋亡关键基因的中心转录调节因子，在髓母细胞瘤中HIC-1对Hedgehog信号通路具有抑制作用，在干细胞功能中HIC-1能调节Wnt信号通路。
HIC-1在肿瘤治疗中的意义由于HIC-1基因受p53基因调控，而p53基因又是迄今报道人类肿瘤中突变频率最高的基因之一，且目前报道的p53基因突变肿瘤中有75%以上为错义突变，致使p53基因功能丢失，因此，通过活化其下游HIC-1作为靶点，是p53基因突变肿瘤治疗的有效选择；而对于野生型p53肿瘤，若联合HIC-1靶点干预可能效果更佳。在许多实体瘤及白血病中，由于HIC-1启动子甲基化导致HIC-1沉默或低表达，DNA甲基化状态可用DNA甲基化酶抑制剂消除。因此，HIC-1成为DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza-2`-deoxycytidine,Decitabin,5-CdR）的治疗新靶点。Nicoll等研究发现，通过5-CdR恢复HIC-1功能有可能改善乳腺癌病人的预后。另有研究表明，5-CdR的联合应用可增强头颈部鳞状细胞癌的放射治疗效果。另外，Eggers等通过临床研究发现，HIC-1可作为预测肾癌病人无复发生存率的独立因子。因此，深入研究HIC-1基因的功能与作用机制，将有助于应用靶向药物治疗肿瘤。
篇6
[关键词] 胃癌；遗传学；表观遗传学；非编码RNA；DNA甲基化；组蛋白修饰
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（a）-0043-04
胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，在全球肿瘤死亡原因中排名第二，其5年生存率在10%左右[1]。胃癌的发生与发展是多种因素交互作用的结果，包括环境、饮食、遗传、幽门螺杆菌感染、慢性炎症浸润、癌前病变等。随着人们对胃癌研究的不断加深，遗传因素及表观遗传因素已经成为研究中的热点，对于胃癌的发病机制、细胞免疫与防御、细胞分化及预防治疗等方面具有十分重要的意义，本文就其研究进展做一综述。
1 表观遗传学
表观遗传学是研究细胞分裂增殖过程中，不改变相关基因的DNA序列而影响相关基因的表达，这种改变能通过有丝分裂和减数分裂进行遗传的一门学科[2-3]。表观遗传的变化在肿瘤的发生、发展、复发、预测预后的价值已经得到了证实[4-7]。表观遗传学的范畴包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA的改变等。
1.1 DNA甲基化与胃癌
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNMT）的作用下，将甲基由S-腺苷甲硫氨酸转移到胞嘧啶5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶[8]。胃癌中存在很多癌相关基因的甲基化，在胃癌形成的各个阶段都能检测到DNA甲基化的存在[9]。Cooper等[5]对包括220份慢性萎缩性胃炎、196份肠上皮生化、134份胃腺瘤、102份不典型性增生和202份胃癌及其癌旁组织和相应血液标本，采用甲基化特异性聚合酶联反应（methylation-specific PCR，MSP）检测RUNT相关转录因子3（RUNX3）启动子的甲基化状态。结果发现RUNX3的甲基化水平与胃癌的发生发展有关，从萎缩性胃炎（15.9%）到肠上皮生化（36.7%）、胃腺瘤（41.8%）、不典型性增生（54.9%）、胃癌（75.2%），甲基化水平逐渐提高，RUNX3基因甲基化在血清中检测到的水平与胃癌组织中的水平显著一致，表示循环RUNX3基因甲基化可作为标志物检测早期胃癌并有望用于胃癌的筛查。
既然检测DNA甲基化可能用于胃癌的早期诊断，那么甲基化与胃癌的临床病理特征、预后及治疗是否存在某种联系呢？贾安平等[10]应用甲基化特异性PCR（MSP）检测74例胃癌组织p16基因的启动子CpG岛的甲基化状态，发现胃癌组织中p16基因的甲基化阳性率为56.8%，肿瘤分期晚、有淋巴结转移的阳性率更高。Guo等[11]使用MSP的方法检测了92例胃贲门腺癌RASSF1A基因启动子甲基化的情况，其中54例的出现异常甲基化，随着胃癌的进展，其甲基化率也逐渐增高。表明p16基因及RASSF1A基因甲基化可能与胃癌的病期相关。姜蕊等[12]在54例胃癌组织中检测钙黏蛋白（E-cadherin）基因的异常甲基化，发现E-cadherin基因启动子异常甲基化频率为48.1%，显著高于癌旁正常组织中的11.11%，并随疾病进展而进一步提高。E-cadherin异常甲基化状态与患者的性别及年龄均无关，而与胃癌的分化程度、病例类型、浸润深度及淋巴结转移、临床分期有关。提示胃癌组织中E-cadherin基因甲基化状态可帮助判断胃癌分化程度、进展情况，及预测预后。Sugita等[13]又对转移复发性胃癌异常甲基化与化疗疗效相关性进行了研究，分析80例手术治疗后发生转移或复发的患者，使用氟尿嘧啶为基础的化疗。发现存在BNIP3（Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa-interacting protein 3）和DAPK（death-associated protein kinase）基因甲基化的患者总生存期（OS）及无进展生存期（PFS）较短，且对化疗的反应率较低。可见DNA甲基化与胃癌发生、发展和预后之间有着密切的关系，进一步研究DNA甲基化的机制，全面绘制DNA甲基化谱，可能对于胃癌的筛查、早期诊断、疗效预测及预后判断有帮助。
1.2 胃癌与组蛋白修饰
组蛋白是存在于真核生物体细胞染色质中的一组进化上非常保守的碱性蛋白质，含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸较多，是由德国科学家A.柯塞尔于1834年首先发现的。常见的组蛋白修饰方式有乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等。研究发现组蛋白修饰与其他表观遗传学改变共存于胃癌中，现在以乙酰化、甲基化、磷酸化研究最多[14]。
组蛋白磷酸化 组蛋白磷酸化是在组蛋白尾区加入带有负电荷的PO4基团，常发生于真白的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上，并且是可逆性修饰。其在有丝分裂、细胞死亡、DNA损伤修复、DNA复制和重组过程中有着直接的作用[15]。Fehri等[16]发现幽门螺杆菌可以诱导组蛋白H3丝氨酸10（H3S10）磷酸化水平降低，从而调节细胞周期，与幽门螺杆菌诱导胃癌发生相关。
1.2.1 组蛋白甲基化 组蛋白甲基化的位点多位于组蛋白H3和H4的精氨酸及赖氨酸残基上，其甲基化方式有单甲基化、双甲基化、三甲基化。其中H3-K4三甲基化的缺失、H3-K9甲基化和H3-K27三甲基化，这些甲基化改变在肿瘤早期出现并随肿瘤进展变化而改变[17]。这些都与胃癌的发生发展有着密切的关系。
1.2.2 组蛋白乙酰化 组蛋白乙酰化是组蛋白乙酰基转移酶将乙酰辅酶A乙酰基部分转移到核心组蛋白氨基末端特定赖氨酸残基上。一般认为组蛋白乙酰化与基因激活相关，而组蛋白去乙酰化与基因沉默或抑制有关。Mitani等[18]通过对29例胃癌组织标本的分析，发现组蛋白H3去乙酰化可以抑制抑癌基因p21（WAF1/CIP1）的表达，而对乙酰化抑制剂处理后，胃癌细胞组蛋白乙酰化水平升高，从而诱导p21（WAF1/CIP1）的表达上调。
总之，特定的组蛋白修饰与特定的基因激活或抑制相关，组蛋白修饰在基因调控中起着重要作用。进一步研究组蛋白修饰及其与基因调控的关系，有利于肿瘤发病机制研究，开发新的抗肿瘤药物，例如去乙酰化抑制剂等。
1.3 胃癌与非编码RNA
非编码RNA是指参与蛋白质翻译过程，不被翻译成蛋白质的RNA，如tRNA、rRNA、miRNA、snRNA等，而miRNA是目前研究的热点。miRNA（microRNA）属于非编码RNA的一种，是内源性非编码小RNA。miRNA是长约18-26nt的单链RNA分子，起始于pri-miRNA，pri-miRNA在核内被Drosha酶复合体切割为miRNA前体，经转运蛋白expoin5的作用下，从核内运输到胞质，再由Dicer酶进一步切割成miRNA[19]。Wu等[20]应用RT-PCR的方法检测了30例胃癌组织和配对正常组织的60个候选miRNA，从中筛选出5个miRNA（miR-125a-3p， miR-133b， miR-143， miR-195，miR-212），经过ROC分析表明miR-195和miR-212对于预测是否发生淋巴结转移具有较高的敏感性和特异性。Brenner等[21]通过从45例胃癌患者手术标本中提取RNA，再通过QRT-PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction）的方法检测发现，miR-451、miR-199a-3p、miR-195在预后良好及预后不良的患者中，表达存在差异，表达高的患者复发率高、预后差。miR-451、miR-199a-3p、miR-195可以作为胃癌预后的预测因子。Konishi等[22]对胃癌患者的血浆检测发现miR-451和miR-486的浓度在术后分别下降90%和93%，表明miR-451和miR-486可能作为血液学检查的手段用以筛查胃癌。
miRNA的种类很多，对胃癌的作用途径多种多样，表1列举了部分miRNA与胃癌的发生发展、治疗及预后之间的关系。随着对于miRNA作用机制的进一步深入研究，有望使miRNA成为胃癌诊断及预后预测的新的生物学标记，还可能使其成为药物标靶或模拟其进行新药研发，为胃癌治疗提供一种新的手段。
2 遗传学改变
遗传学改变是指基于基因序列改变而导致的基因表达水平的变化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等。其中尤其以单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）最为常见。SNP影响并改变了某些正常的炎症过程、免疫调节、DNA合成及修复等病理生理过程，而这些变化最终导致胃癌的发生。
2.1细胞因子及酶的基因多态性与胃癌
细胞因子是免疫细胞产生的一大类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。主要包括白介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF）、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子（TGF）、基质金属蛋白酶（MMP）、环氧合酶（COX）等。Guo等[29]通过分析中国北方人群胃贲门腺癌患者的转化生长因子-β1（TGF-β1）基因多态性，发现患者中-509T和869C基因型和等位基因分布较健康人群明显升高，与非携带者相比，携带者发生Ⅲ期和Ⅳ期肿瘤的风险增加。有研究发现，IL-10的-1082G等位基因与胃癌高风险相关[30]，Sun等[31]研究发现，IL-10的基因多态性分析中-1082G等位基因使胃癌患者发生恶液质的风险显著增加。宋传贵等[32]对福建地区102例完整随访的胃癌患者进行MMP-1基因多态性的基因型鉴定发现，2G/2G基因型可能是影响福建地区胃癌患者生存的不良预后因子之一，与含1G基因型相比，2G/2G等位基因携带者发生肝脏转移的机会明显增大。殷霞丽等[33]通过对118例胃癌患者的COX-2基因启动子区-1195G>A的多态性研究发现-1195G>A基因型与肿瘤大小及浸润深度明显相关，其中-1195A提示存在肿瘤大、浸润深度深的高风险，同时与COX-2免疫组化表达存在显著相关性。
2.2 DNA修复基因多态性与胃癌
DNA损伤修复是一个非常复杂的过程，维持基因稳定性和细胞正常功能的中心环节主要是DNA修复能力，如果相关修复基因发生突变，就会导致整个基因组DNA修复能力下降，从而引起细胞增殖和分化失控，导致肿瘤发生[34]。Yuan等[35]通过分析160例胃癌患者与其对照组的X射线损伤修复交叉互补基因1（XRCC1）的基因多态性分布，发现携带XRCC1 194Trp基因型的个体患胃癌风险增高，可能是由于该变异影响了XRCC1蛋白的修复功能。
2.3抑癌基因多态性与胃癌
抑癌基因是一类调控细胞生长、抑制肿瘤表型表达的基因，可通过纯合缺失或失活而引起细胞恶性转化。p53基因作为重要的肿瘤抑制基因，在肿瘤的发生、发展中都具有重要作用。Song等[36]通过大规模的病例对照研究发现p53-72Pro.Pro基因型的个体患胃癌的风险增加。而Shirai等[37]的研究也表明该基因型的胃癌化疗效果及预后差、容易发生远处转移。
2.4其他基因多态性与胃癌
除了上述各种遗传基因多态性与胃癌的发生发展及预后密切相关，还有多种胃癌易感基因。在中国人群中研究发现，前列腺干细胞抗原基因（PSCA）的rs2294008T等位基因能显著提高非贲门胃癌的发病风险，并且rs2294008T等位基因和rs2976392A等位基因与非贲门胃癌低分化和高级别有关[38]。而最近的一项荟萃分析通过对9个病例对照研究的分析，表明PCSA的rs2294008T等位基因和rs2976392A等位基因与非贲门或弥漫性胃癌的易感性有关[39]。Xu等[40]通过对929例中国胃癌患者超氧化物歧化酶2（SOD2）和谷胱甘肽巯基转移酶（GSTP1）基因多态性研究发现，SOD2的rs4880 CT+CC基因型与淋巴结转移高度相关，GSTP1的rs1695 GA+GG基因型与肿瘤大小关系密切，表明SOD2的rs4880 CT+CC基因型与GSTP1的rs1695 GA+GG基因型与胃癌的进展及侵袭性相关，而活性氧（ROS）的代谢途径可能成为潜在的治疗靶点。
2.5遗传学改变研究中的一些问题
以上论述只是目前已发现颇具规模的胃癌易感多态性基因中的一小部分，然而只有PSCA等少数几个基因与胃癌易感性的关系较为明确。其主要原因可能为：①目前胃癌关联研究样本普遍都很小[41]；②不同胃癌类型还受到表观遗传学的影响；③不良饮食、生活习惯和环境等外在因素促进甚至导致胃癌发生[42]；④胃癌家系成员生活环境和遗传背景较一致，基于家系的连锁分析是鉴定胃癌相关基因的比较简单的方法，但是胃癌家系样本难以获得，并且通过家系定位的致病基因往往是该家族特异的，应用到群体中具有一定局限性。
因此尽量使病例同质化，采用较大规模的研究样本和不同群体的验证，并在分析时注意不良饮食、生活习惯及环境等外在影响因素，将有利于明确胃癌的易感基因。
3 总结
胃癌的发生是多基因遗传和表遗传共同作用的结果，通过研究遗传和表遗传改变发现了很多与胃癌的发生、发展及预后密切相关的因素，它们对于胃癌的早期诊断及预后判断起着至关重要的作用，而阻断这些遗传和表遗传改变的发生为胃癌的治疗提供了更广阔的研究和发展空间。
近年来的遗传学和表观遗传学研究主要集中在胃癌的早期诊断及预后预测方面，但是其中大多数研究仅针对单个位点或者单个基因多态性的变化上，很少有研究其相互关联的变化对胃癌的影响。而且这些检测运用于临床前，其敏感性及特异性也有待进一步明确。对于那些被发现可能成为潜在治疗靶点的基因位点，需要更多更大的重复性研究来确定它的真实可靠性，而后才是更深入地去发现通过何种手段去阻断及干预。随着研究的不断深化，基因与基因、基因与环境之间的相互作用将被更深入地解析，利用基因分析的方法来评估个体胃癌风险，制定更加个体化的治疗方案是未来研究的方向。
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篇7
关键词 行为遗传学；数量遗传学；分子遗传学：基因：人格
分类号 B845
1 引言
人格是一个人独特精神面貌的整体反映，是需要、动机、兴趣、态度、价值观、气质、性格、能力等多个方面的整合。它的形成和发展与遗传因素息息相关。然而，人格的遗传性究竟如何？到底哪些基因在起作用？它们又是如何起作用的？针对诸如此类的问题，行为遗传学家们试图为我们提供有效的解答，并由此形成了一个重要的研究领域，即人格行为遗传学研究。
人格行为遗传学研究就是运用行为遗传学理论和方法来考察和揭示人格特征（包括人格障碍）和人格差异的遗传基础问题。它强调遗传基因是塑造人格核心特征和造成人格个别差异的主要因素，但并不忽视环境的作用，甚至主张人格特征与人格差异是多种基因、多种环境以及基因与环境动态交互作用的结果。早在19世纪中后期，英国心理学家高尔顿（Galton，F.）就首先利用家谱法和双生子法研究了人格差异的遗传基础。尽管他的研究因未将遗传和环境区分开来而具有诸多局限，但它“为人类行为的变异范围提供了档案证明并且说明了行为变异存在遗传基础”（Plomin，DeFries，McClearn，& McGuffin，2008），是运用行为遗传学方法研究人格差异的先驱性尝试。高尔顿之后的20世纪，人格的行为遗传学研究因行为主义主流范式的盛行而长期遭到“冷遇”。前者强调人格的遗传性，而后者坚持环境论并认为人格由社会化的习惯决定，两者的矛盾在这种势力不均的情势下曾一度不可调和。
但近几十年来，行为主义的逐渐衰落和现代生物学特别是分子生物学的飞速发展分别为人格的行为遗传学研究提供了巨大发展空间和发展动力，并使它由传统的数量遗传学取向发展到分子遗传学取向。分子遗传学取向是发端于20世纪初而到20世纪末才应用于人格研究的一种新取向，它在研究方法和研究理念上都较数量遗传学取向具有革命性突破，目前正以惊人的速度发展着。可以说，人格遗传学研究进入到分子遗传学时代（Johnson，Penke，& Spinath，2011）。不过，两种研究取向在基本思路方面各有特色，在具体研究方面都取得了很多有价值的成果，积极推动了人格行为遗传学研究的复兴和发展。
2 数量遗传学取向
人格的数量遗传学（quantitative genetics）研究取向主张运用双生子研究、收养研究等设计来估计群体中遗传因素对人格表现型方差的贡献率，旨在用数量化的手段从宏观上估计某种人格变异在多大程度上是由遗传效应引起的，并考察遗传通过与环境交互作用或相关影响人格的方式以及这些效应发生的具体情境。
2.1 人格遗传率
数量遗传学衡量人格遗传性大小的核心指标是遗传率（heritability），即在某群体内观测到的人格总变异中能被遗传变异解释的百分比，它既可以揭示遗传是否影响某种人格特征又可以指明这种影响达到何种程度。人格遗传率可以用公式h2=Vg/Vp（其中h2代表人格遗传率，Vg代表遗传导致的人格变异，V。代表观测到的人格总变异）来表示，数值在0～1之间，越接近于0，说明变异越少源于遗传；越接近于1，说明变异越多源于遗传。需要指出的是，遗传率估计具有如下三个特点：第一，它具有群体特异性，仅仅适用于解释样本或群体的人格差异，而不适用于描述个体人格的遗传性；第二，它假定遗传因子和环境因子之间不存在相关或交互作用；第三，它会因测量方法和计算方法不同而有细微差别（郭永玉，2005；Larsen & Buss，2009）。
2.2 数量遗传学设计
为了把基因和环境对人格差异的贡献分离开来，数量遗传学家采用了家族研究、双生子研究和收养研究等多种研究设计。家族研究是最早用于人格研究的行为遗传学方法，但它不能将遗传与共同环境的作用区分开来，因而不能得出准确的遗传率；双生子研究是现代人格行为遗传学研究最常用的一种有效方法，它在一定程度上克服了家族研究的缺陷，但它的等环境假设和代表性也往往令人担忧：收养研究作为一种强有力的自然实验法，是“解开影响家族相似性的遗传和环境源之结的最直接方法”，避免了双生子研究中的等环境假设问题，提供了环境影响人格差异的最佳证据，但它也存在三个争议，即代表性、生前环境影响和选择性安置效应（Plomin et al.，2008）。
鉴于以上三种方法各有其长处和不足，在过去的20多年中，数量遗传学家已经开始利用家族研究、双生子研究和收养研究的组合设计来研究人格。例如，研究分开抚养的同卵双生子就把双生子研究和收养研究各自的优点进行了有效整合，并且分开抚养的同卵双生子在某种人格特质上的相关系数可以直接解释为遗传率的一个指标（Larsen & Buss，2009）。另外，随着离异和再婚现象增多而产生的继亲家庭研究，自然地综合了家族研究与收养研究的优势，也是一种有趣和有效的组合研究设计。对多组比较的组合设计，甚至简单的收养和双生子研究，现代行为遗传学通常采用模型拟合（model fitting）的方法进行统计分析，即建立一个反映各种遗传和环境因素对某种人格特质贡献大小的结构方程模型，并将其与观测到的相关进行比较，从而估计出遗传和环境的影响程度（郭永玉，2005）。
2.3 具体研究与发现
数量遗传学取向的人格研究者利用上述设计主要对人格特质、人格障碍以及态度与偏好的遗传性问题进行了考察。
2.3.1 人格特质
数量遗传学关于人格特质的研究主要涉及人格的五大特征，即外倾性、宜人性、责任心、神经质和经验开放性，其中研究最充分的要数外倾性和神经质。多数数量遗传学研究表明，“大五”人格模型中的所有因素都具有中等大小的遗传率，并且此研究结果在不同年龄段、不同性别以及不同文化背景的样本群体中具有普遍一致性（saudino，1997；Loehlin，McCrae，Costa，& John，1998）。例如，两项以双生子为被试的研究表明，神经质和外倾性的遗传率估计值分别为43%和52-54%（Wray，Birley，Sullivan，Visscher，& Martin，2007；Rettew，Rebollo-Mesa，Hudziak，Willemsen，& Boomsma，2008）。以往数量遗传学对“大五”人格的研究通常都以正常人群为被试，最近许多研究开始关注异常人群“大五”人格的遗传性问题。例如，Kendler，Myers和Reichborn-Kjennerud（2011）的研究表明，边缘型人格障碍与“大五”人格中的神经质维度存在显著的遗传正相关，而与宜人性和责任心维度存在显著的遗传负相关。Hare等人（2012）的研究表明，躁郁症患者人群“大五”人格的遗传率（23%～32%）某种程度上低于正常人群的研究结果（40%～60%）。我们固然可以推测是异常人格影响了“大五”人格遗传率的变化，但要得出确切的因果结论还需依赖未来数量遗传学和分子遗传学更加细致的综合研究。
除“大五”人格外，研究者还对活动水平（activity level）和“精神病”人格特质的个别差异进行了行为遗传学分析。活动水平是气质的一个组成元素，其个别差异出现于生命早期，并随着时间推移在儿童身上表现出稳定性。Spinath，Wolf，Angleitner，Borkenau和Riemann（2002）对300对双生子的研究表明，活动水平存在40%的遗传率。“精神病”人格特质包括权术主义、铁石心肠、冲动性不一致、无所畏惧、责备外化和压力免疫等方面。Blonigen，Carlson，Krueger和Patrick（2003）对353名男性双生子进行了研究，发现所有这些“精神病”人格特质都表现出中等或高等的遗传率。
数量遗传学研究发现，尽管不同研究设计所得出的具体数值会有所不同，但一般的人格特质都具有较高的遗传率估计值（Krueger & Johnson，2008）。
2.3.2 人格障碍
数量遗传学系统研究的人格障碍主要有精神分裂型人格障碍、强迫型人格障碍和边缘型人格障碍。精神分裂型人格障碍具有轻微精神分裂样症状，用个人访谈法和问卷法所做研究表明，它具有非常高的遗传率（Kendler，Myers，Torgersen，Neale，& Reichbom-Kjennerud，2007）。强迫型人格障碍是一种神经精神病状态，以思想、情感、观念以及行为的反复为典型症状，它所包含的五个因素即禁忌、污驰/清洁、疑虑、迷信/仪式和对称/囤积的遗传率位于24%和44%之间（Katerberg etal.，2010）。上述两种人格障碍可能是精神机能障碍遗传连续体的一部分，因为它们分别与精神分裂症和强迫焦虑症之间存在某种程度的遗传重叠（Plomin et al.，2008）。边缘型人格障碍是一种以心境反复无常、自我认同感紊乱、情绪冲动以及行为不稳定等为主要表现的人格障碍，它很大程度上受遗传基因影响。例如，对荷兰、比利时和澳大利亚三个国家5000多名双生子的数量遗传学研究表明，加性遗传效应（additive genetic effect）可以解释42%的边缘型人格障碍变异，而且这一结果具有跨性别和跨国别的一致性（Distel et al.，2008）。最近一项10年的双生子纵向研究发现，边缘型人格障碍特质在14～24岁的各个年龄段都具有中等的遗传率，且遗传率有随年龄增长而轻微上升的趋势，而这些特质的稳定性和变化受遗传因素高度影响，一定程度上也受非共享环境的影响（Bornovalova，Hicks，Iacono，& McGue，2009）。
2.3.3 态度与偏好
稳定的态度和偏好通常被看作人格的一部分，并表现出广泛的个体差异。数量遗传学家对态度和偏好的遗传性进行了饶有趣味的考察。综观多数研究可知，态度的核心特征传统主义具有中等的遗传率。例如，一项明尼苏达的双生子研究表明，传统主义的遗传率为63%；一项对654名收养和非收养儿童的纵向研究表明，遗传对保守态度具有重要影响，并且显著的遗传影响早在12岁时就已产生（Larsen & Buss，2009）。然而，并不是所有态度和信仰都表现出中等水平的遗传率，这要因所研究的态度类型而异。例如，一项对400对双生子的研究表明，对上帝的信仰、对宗教事务的参与以及对种族一体化的态度的遗传率为零（Larsen&Buss，2009）。基因似乎也影响职业兴趣或偏好。一项用修订版的杰克逊职业兴趣量表（JVIS）做的研究表明，34种职业兴趣中有30种的遗传率在37%和61%之间（schermer & Vernon，2008）。这表明，我们绞尽脑汁作出的职业选择很大程度上受到我们从父母那里继承的基因的影响。但值得我们注意的是，为什么有些态度和兴趣具有较高的遗传性，而有些态度和信仰的遗传性不明显甚至为零？或许未来的行为遗传学研究能够给出答案。
3 分子遗传学取向
人格的分子遗传学（molecular genetics）研究取向主张在DNA水平上用基因测定方法研究特定基因对人格表现型的影响效应，旨在超越传统人格数量遗传学研究仅停留在统计学层面考察遗传率的局限，而从微观层面直接鉴别对人格产生重要遗传影响的具体基因或基因组合，以精确揭示人格特征（包括人格障碍）或人格差异的根本遗传机制。
3.1 人格候选基因
已知人类基因具有数万种之多，要想从中找出对人格起作用的特定基因是件困难的事情。况且，复杂的人格或行为特质并不简单地遵循孟德尔的单基因遗传定律，而是同时受作用幅度不完全相同而又相互协同和相互作用的多个基因的影响，这就又大大增加了确定这些基因的难度。因此，研究者不可能对所有基因都进行考察，更多的是考察候选基因与人格的关系。人格候选基因（candidate gene）是被假定与某一人格特质有关的基因，通常人们已了解其生物学功能和序列，它们可能是结构基因、调节基因或在生化代谢途径中影响性状表达的基因。研究者一般通过了解相关生理机制来确定人格的候选基因。例如，用于治疗活动过度的药物常含有多巴胺，因而像多巴胺受体、多巴胺启动子和多巴胺转运体这样与多巴胺有关的基因便成为候选基因研究的目标。我们通常缺乏哪些基因是人格候选基因的强假设，因此试图将那些与具有生理作用的DNA标记有关的基因与人格联系起来的做法是很有道理的（张丽华，宋芳，邹群，2006）。
3.2 研究策略
人格分子遗传学研究者主要采用连锁策略和关联策略来寻找和鉴别对特定人格或行为特质有广泛遗传影响的具体基因。连锁策略（linkagestrategy）采取从行为水平到基因水平的“自上而下”的研究思路，它以携带某种人格特质或障碍的家系为研究对象，对连续几代人的DNA样本进行分析，以确定是否有对该人格特征影响较大的特定基因存在。由于研究者并无假定的候选基因，这种策略对定位单基因遗传特质的强效基因十分有效，但当牵涉若干个作用较小的基因时它便不再那么有效。然而，大多数复杂的人格或行为特质往往牵涉多个微效基因，于是另一种较新的关联策略（association strategy）便成为最常用的确定人格基因的策略。关联策略采取由基因到行为的“自下而上”的研究思路，通过考察拥有某种特定基因（或等位基因）的个体比没有该基因的个体在某种特定人格特质上的得分是高还是低，来确定候选基因与人格或行为特质之间的关联情况，即一种可能的因果关系。关联策略比连锁策略更容易找到只有微弱效应的特定基因，但系统性不够强。
随着人类基因组多态性研究以及SNP分型技术的发展，全基因组扫描（genome-wide scanning）逐渐成为一种标志性的分子遗传学人格研究策略（Strobel & Brocke，2011）。它主要包括对人格表现型的全基因组连锁分析和全基因组关联分析，先将人格表现型的相关位点定位于染色体某个区域，然后再进行候选基因研究或连锁不平衡分析，确定其具体基因位点。例如，一项用全基因组扫描做的研究表明，伤害回避与8p21染色体区域存在显著相关（zohar et al.，2003）。
3.3 具体研究与发现
基因主要是通过大脑中的神经递质系统来影响人格的，因而参与调节神经递质系统的基因便成为主要的候选基因。在Cloninger等人的人格心理生物模型中，新颖性寻求（novelty-seeking）、伤害回避（harm-avoidance）和奖赏依赖（reward-dependence）三种气质维度被假定分别与大脑调节不同类型刺激反应的三种神经递质系统即多巴胺（dopamine）系统、5-羟色胺（serotonin）系统和去甲。肾上腺素（noradrenaline）系统相联系。此类理论假设促使人格分子遗传学研究者们主要从这三种神经递质路径考察了基因多态性与人格之间的关系。
3.3.1 多巴胺系统
多巴胺是脑部负责快乐和兴奋的一种积极化学物质，它的缺乏会促使个体积极寻求有效物质或新异经验以增加多巴胺释放。到目前为止，人格研究中最早且最多关注的DNA标记是位于第11号染色体短臂上的多巴胺D4受体基因（DRD4）。1996年，两个独立研究小组同时在《自然遗传学》上报告了DRD4基因的3号外显子中的48-bp VNTR多态性与新颖性寻求之间存在正相关，标志着人格分子遗传学研究的初步登场（Ebstein & Israel，2009）。其中，Ebstein领导的小组运用三维人格问卷（TPQ）对124名犹太健康志愿者进行了测量，发现长重复段DRD4等位基因对新颖性寻求具有6%的解释效应，而未发现它与另外三个TPQ指标（奖赏依赖、伤害回避和坚持性）有显著关联（Ebstein et al.，1996）；Beniamin领导的小组运用大五人格量表修订版（NEO-PI-R）对315名美国成人和兄弟姐妹进行了预测测量，也发现拥有长重复段DRD4等位基因的个体比拥有短重复段DRD4等位基因的个体新颖性寻求水平显著高，并且发现长重复段DRD4等位基因与NEO-PI-R量表的外倾性和责任心两个维度显著相关，而在其他三个维度即神经质、开放性和宜人性上未见此结果（Benjamin et al.，1996）。对于这两种研究的结果可能的解释是，拥有长重复段DRD4等位基因的个体对多巴胺的相对缺乏反应敏感，需要寻求外界新异经验来增加多巴胺释放，而拥有短重复段DRD4等位基因的个体倾向于对脑中已经存在的多巴胺作出高度反应，无需寻求新异经验便可使多巴胺含量达到适当水平。
此后，一系列研究对DRD4基因与新颖性寻求这种人格特质之间的关联进行了重复验证，但结果并不完全一致。两项分别以德国人和日本人为被试的研究证实DRD4基因与新颖性寻求特质之间的确存在显著关联（strobel，Wehr，Michel，&Brocke，1999；Tomitaka et al.，1999）；Burt等人对明尼苏达137个双生子家庭所做的研究发现，DRD4基因与新颖性寻求测量指标之间不存在任何关联（Bun，McGue，Iacono，Comings，&MacMurray，2002）；Ekelund等人则得出了与1996年研究相反方向的结果，即在新颖性寻求水平较高的群体中，2次和5次重复等位基因而非7次重复等位基因的频率更高（Ekelund，Lichtermann，Jarvelin，& Pelmnen，1999）。除此之外，有些研究还发现DRD4基因与其他人格候选基因存在联合效应。一项关于1岁新生儿对新异事物反应的研究发现，DRD4基因中的48-bp VNTR与5-羟色胺转运体基因（5-HTT）中的一种多态性存在联合效应（Lakatos et al.，2003）。之所以会出现如此多样的研究结果，可能与样本大小、被试特点（年龄、性别和种族文化等）、测量工具、研究设计等因素有关。例如，分组方法不同所得研究结果就会有很大差异（Tsuchimine et al.，2009）。不管怎样，这都有待于进一步研究证实。
除DRD4基因外，研究者还对多巴胺系统中的其他人格候选基因进行了考察，如多巴胺D2受体基因（DRD2）、多巴胺D3受体基因（DRD3）、多巴胺D5受体基因（DRD5）以及多巴胺转运体基因（DATl）等。一项用多种人格测验所做的研究表明，DRD2基因的-141C插入/缺失多态性与卡氏人格量表（KSP）测量的冷漠以及北欧大学人格量表（SSP）测量的自信缺乏之间存在关联（JSnsson et al.，2003，），而利用气质性格量表（TcI）对被试所做的一项研究表明，-141C插入/缺失多态性和DRD2/ANKK1基因的TaqlA多态性与人格特质之间可能并非存在直接强相关，而是在DRD2基因与ANKKl基因的交互作用条件下才对人格产生影响（Tsuchimine et al.，2012）。在一个由862名个体组成的样本中发现DRD3基因与神经质和行为抑制存在关联，而当该样本扩大到1465人时这种关联未得到验证（Henderson et al.，2000）。有研究表明，DRD5基因可能与人格的持续性发展有关（Vanyukov，Moss，Kaplan，Kirillova，&Tarter，2000）。由于发现DAT1基因与具有某些新颖性寻求特征的注意缺陷多动症（ADHD）存在关联（Jorm et al.，2001，），有人用极端分数个体为被试考察了DATl基因与新颖性寻求之间的关联，结果表明这种效应只在女性被试身上有所显现（van Gestel et al.，2002）。
3.3.2 5-羟色胺系统
5-羟色胺作为一种生物胺，对于人类的攻击性、抑郁、焦虑、冲动、幸福感等情绪情感具有重要调控作用。此系统中最经常被研究的人格候选基因是5-羟色胺转运体基因（5-HTT），该基因越长释放和回收5-羟色胺的效率越高，已有许多研究考察了它与伤害回避等焦虑类人格特质之间的关联。5-HTT基因具有两种多态性：5-HTT基因连锁的多态性区域（5-HTTLPR）和5-HTT基因2号内含子中的VNTR多态性，其中人格研究关注最多的是5-HTTLPR。
1996年的一项经典研究发现，短5-HTTLPR等位基因携带者较长5-HTTLPR等位基因携带者在神经质和伤害回避维度上的表现水平更高（Lesch et al.，1996）。功能性磁共振成像表明，携带一个或两个短5-HTTLPR等位基因复本的个体在对恐怖刺激的反应中表现出更强的杏仁核神经元活动（Harid et al.，2002）。这种由遗传导致的杏仁核对情绪刺激的兴奋性差异支持了该结论。不过，也有一些其他研究并未发现此种关联（Flory et al.，1999；Tsai，Hong，& Cheng，2002）。还有一些研究得出了相反结果。例如，使用极端得分个体做的一项研究发现，短5-HTTLPR等位基因在低伤害回避群体中比在高伤害回避群体中出现的频率更高（van Gestel et al.，2002）。2004年的一份元分析指出。这种可重复性的缺乏很大程度上是由于样本量过小以及所使用的量表不同而导致（Sen，Burmeister，& Ghosh，2004）。分析者发现，运用大五人格量表测量的神经质与5-HTTLPR有显著关联，而运用气质性格量表测量的伤害回避与5-HTTLPR不存在任何显著关联。2008年的另一份元分析也得出了类似结论（Munaf6 et al.，2008）。然而，使用NEO-PI-R量表对4000多名被试进行的一项大型研究发现，5-HTTLPR与神经质或其各维度（焦虑，抑郁，愤怒，敌意，自我意识，冲动。易受伤害性）之间不存在任何关联（Terracciano etal.，2009）。近年来，有研究者发现，与其杂合子同伴或短等位基因的纯合子同伴相比，具有长5-HTLPR等位基因的纯合子个体通常更关注积极情感画面，而选择性地回避一同呈现的消极情感画面（Fox，Ridgewell，& Ashwin，2009）。这表明他们通常更加乐观。使用信息加工眼动跟踪评估法进行的另一项研究发现，短5-HTLPR等位基因携带者在视觉上更加偏爱积极场景而回避消极场景，长5-HTLPR等位基因的纯合子个体更加无偏地看待情绪场景（Beevers，Ellis，Wells，& McGeary，2009）。这表明，短5-HTLPR等位基因携带者可能比长等位基因纯合子个体对环境中的情绪信息更加敏感。对于5-HTLPR与人格特质之间关系的这些看似不一致的结论，还有待进一步研究确证。此外，一项最新研究显示，5-HTLPR与Val66Met两种多态性对伤害回避存在显著交互作用（Ariaset al.，2012）。
除5-HTT基因外，研究者还对5-羟色胺系统中的另外两个人格候选基因5-羟色胺2A受体基因（5-HT2A）和5-羟色胺2C受体基因（5-HT2C）进行了考察。有研究者在双极性精神障碍患者和健康控制组群体中检验了5-HT2A的1号外显子中的一种单核苷酸多态性与伤害回避维度之间的关联，但是没有发现任何关联存在（Blairy et al.，2000）。还有研究者以健康日本人为样本对5-HT2A的5种单核苷酸多态性进行了考察，没有发现它们与气质性格量表的任何维度存在关联（Kusumi et al.，2002）。就5-HT2C与人格的关系而言，研究者发现5-HT2C中的一个点突变与三维人格问卷的奖赏依赖维度和坚持性维度存在关联，并且DRD4与5-HT2C对奖赏依赖存在显著交互效应（Ebstein et al.，1997）。然而，后来的一项重复性研究发现，5-HT2C对奖赏依赖不存在主效应，但DRD4与5-HT2C对奖赏依赖确实存在显著交互效应（Kühn et al.，1999）。
3.3.3 去甲肾上腺素系统
在人格的分子遗传学研究中，人们对去甲肾上腺素系统的关注远不及对多巴胺系统和5-羟色胺系统的关注多，但也取得了一些研究成果。有研究以健康被试为样本，考察了去甲肾上腺素转运体（NET）的一种外显子限制性片段长度多态性（RFLP）与气质性格量表中各维度之间的关系，但没有发现任何关联存在（Samochowiec et al.，2001）。不过，另一项以朝鲜人为被试的研究表明，去甲肾上腺素转运体的T-182C基因多态性与气质性格量表的奖赏依赖维度存在显著关联（Ham，Choi，Lee，Kang，& Lee，2005）。有研究表明，在中国人被试中，αla肾上腺素受体基因（ADRAlA）和0c2a肾上腺素受体基因（ADRA2A）的多态性与三维人格问卷各维度之间不存在任何关联（Tsai，Wang，& Hong，2001）。而之前的另一项研究发现，ADRA2A的一种常见单核苷酸多态性与易怒性、敌对性和冲动性诸测量值之间的确存在某些关联（comings et al.，2000）。关于去甲肾上腺素系统的诸候选基因与人格之间关系的研究，有待进一步加强。
4 总结与展望
行为遗传学通过数量遗传学和分子遗传学两条取径对人格遗传性问题进行了不同层次的详细探索，取得了较为丰富的研究成果，推进了我们对人格遗传程度和遗传机制的深刻认识，也有利于促进人格研究的科学化。人格行为遗传学研究的两类取向各具优势和不足。数量遗传学取向借助生态研究设计从宏观上估计遗传变异对人格差异的解释程度，资料获取经济简单、技术要求低，并且结果解释相对容易，但它无法确切地告诉我们究竟哪些基因或多态性导致了人格差异以及具体作用过程如何（Parens，2004），对研究设计和被试取样的依赖性较强，况且面对遗传与环境实际存在相关或交互作用的不争事实，遗传率的解释意义往往遭到质疑（Lerner，2011）。分子遗传学取向摆脱了数量遗传学取向存在的诸多不足，可以从DAN水平精确细微地探知造成人格障碍或差异的特定基因及其作用机制，但研究程序繁琐复杂，对新兴生物技术要求较高，在人格候选基因的选择上带有推测性，迄今为止尚未产生符合最初预期的可重复的实质性人格研究成果（McClellan & King，2010）。除此之外，两类研究取向还存在诸多共同的问题：一是受测量手段限制，对被试自陈报告依赖性高，往往会造成某些人格特质在防卫或伪装心理作用下被隐藏；二是由于研究设计和技术、被试取样、人格和基因自身复杂性以及环境与基因的交互作用等原因，研究结果的可重复性不高（Kim & Kim，2011）；三是受过去百余年消极心理学研究传统的影响，所研究的对象主要是精神分裂症、抑郁症、多动症等病理人群（张文新，王美萍，曹丛，2012），缺乏对健康人群积极人格品质的遗传研究；四是研究成果的现实利用率低，未能把研究所得成果及时有效地转化为现实效益。
鉴于人格行为遗传学研究所存在的诸多问题，未来研究应特别注意以下五个方面：
（1）强调两种研究取向的有机结合，在数量遗传设计中加入对特定基因型的直接测量。这两种研究取向各有优缺，可以相互弥补，况且分子遗传学的许多工作需用传统数量遗传学设计综合考虑环境与遗传因素来完成。未来研究可以在数量遗传设计中加入对特定基因型的直接测量，例如，可以先用数量遗传学方法确定某种人格特征是否具有遗传性以及遗传到什么程度，然后再用分子遗传学方法从根本上细微探究影响人格的具体基因及其作用方式。
（2）注重多学科和多范式的有效整合。人格的行为遗传学研究是一项综合性很高的困难工作，涉及遗传学、心理学、生物学、神经科学、医学和社会学等多门学科，因此需要在更广泛的视野下进行多学科的整合研究。人格的遗传机制相当复杂，靠单一研究工具（如自陈问卷）或研究范式很难获得理想结果，今后应在传统研究范式的基础上综合采用脑成像、诱发电位、前脉冲抑制和计算机博弈模型等一些新的研究范式，从多个角度综合考察和相互印证人格与基因的关系，从而弥补由自陈报告带来的弊端，同时克服可重复性低的问题。
（3）扩大对健康人群积极人格品质的研究。未来人格行为遗传学研究不仅要研究病理人群的消极人格品质，而且更要研究正常人群甚至超常人群的积极人格品质，探究它们的遗传性及分子作用机制，为积极人格品质的培养提供遗传学依据。
篇8
【关键词】 肿瘤抑制基因;DNA甲基化;胃癌
Abstract:Epigenetics is the study of genetic changes in gene expression without the sequence change of DNA， in which DNA methylation is one of the most widely studied epigenetic mechanism. CpG island is the sequence of human genome， located mainly in the promoter as well as the first extron regions. The size of it is nearly 100～1 000 bp and it links with 60% of human coding genes. Methylation of CpG sites in the promoter regions of genes can lead to decreased expression and silence the tumor suppressor genes and contribute to oncogenesis. The research development of DNA methylation in gastric carcinoma was reviewed in this article.
Key words：tumor suppressor genes; DNA methylation;gastric carcinoma
胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一，发病率高，据统计，其死亡率居全球恶性肿瘤死亡率的第二位，严重的危害着人类的健康和生命。胃癌发生的机制目前仍不是很清楚，研究表明，细胞无限增殖及分化受阻是肿瘤发生的基本过程，随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展，人们逐渐深化了对肿瘤发生学的认识。近年研究结果显示肿瘤的发生是多基因异常共同作用的结果，包括癌基因活化和肿瘤抑制基因失活，有关表遗传学研究显示[1]，表遗传学异常参与了肿瘤发生过程，而且在某种肿瘤的发生中起重要作用，其中DNA异常甲基化可致基因表达减弱或基因沉默，是导致肿瘤抑制基因失活的重要机制之一。本文就胃癌的发生发展过程中一些肿瘤抑制基因DNA异常甲基化研究进展作一综述。
1 DNA甲基化及其作用
表遗传学(epigenetics)是1939年由waddington首先提出的。表遗传学是研究在DNA序列没有改变的情况下，所发生的可遗传性基因表达的改变[1]168-174。其中包括DNA甲基化、基因组印记、染色体组蛋白修饰、隔离蛋白以及非编码RNA调控等方式，这种模式传递给子代细胞是不依赖DNA序列的。其中DNA甲基化是研究最多、最深入的一种表遗传学表达机制。
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases DNMTS)的介导下，二核苷酸中胞嘧啶(C)的第5位原子上的H被S—腺苷甲硫氨酸提供的甲基取代，使之变成5—甲基胞嘧啶(5-methy1cytosine，m5C)[2]的化学修饰过程。甲基化酶包括维持甲基化转移酶(DNMT 1) 和重新甲基化酶(DNMT 3a，DNMT 3b)。维持甲基化酶的作用是识别子代DNA 双链中亲代单链上已甲基化的CpG 位点，催化互补单链的胞嘧啶(C) 发生甲基化;重新甲基化酶的作用是使非甲基化的双链DNA 发生甲基化的过程[3] 。DNA的甲基化修饰反应主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶，CpG 位点以两种形式存在，一种为分散于DNA中，正常情况下这些 CpG二核苷酸甲基化可作为一种宿主基因的保护机制，它会抑制重复子转录以及重复子同源性重组，还可以抑制“寄生”DNA序列(如逆转录病毒片段)的侵入;另一种是CpG 结构高度聚集在一起，即CpG 岛(CpG island)。CpG岛在基因组内呈不连续分布，通常位于基因的启动子区域(promoter region)，也可位于第一外显子区域， 故又称5′-CpG 岛[4]。在正常细胞中，CpG 岛通常不发生甲基化修饰，而肿瘤组织常发生其相关基因启动子区域的异常甲基化。DNA 甲基化异常可分为甲基化增强、甲基化减弱和甲基化转移酶水平增高三种情况，其中抑癌基因甲基化增强在肿瘤中最常见。可通过改变基因的构型或与核内甲基化CG序列结合蛋白结合，阻止转录因子与基因形成转录复合物，从而导致其表达沉默，使肿瘤抑制活性丧失，被认为是肿瘤抑制基因失活的重要途径。另外，DNA 的甲基化还可促进肿瘤相关基因突变，因5-甲基胞嘧啶可自发性或在SAM 作用下引起邻位脱氨转变为胸腺嘧啶，使甲基化的CpG 突变为TpG，因此其也是甲基化促进恶变的机制之一。
CpG岛甲基化是一种基因外修饰，在正常细胞中基因的甲基化大多发生在其启动子CpG 岛之外，而在肿瘤细胞中某些抑癌基因的CpG岛甲基化则导致该基因转录失活，故在肿瘤研究中检测基因启动子区CpG 岛甲基化状态，对于阐明肿瘤发生、发展的机制及建立早期诊断方法均具重要意义。目前DNA甲基化的检测方法比较多，其中广泛应用的技术是甲基化特异性的PCR技术(MSP)和甲基化敏感的单碱基延伸技术(Ms-SNuPE)，这些技术的敏感性高，特异性强，适用于微量DNA或石蜡包埋DNA。在MSP技术的基础上，又先后发展了基于荧光检测方法的实时定量PCR(MethyLight)和依赖于限制性核酸内切酶的甲基化分析方法(COBRA)，这些技术提高了检测的敏感性，实现了高通量和高特异性。此外，有人将MSP技术与变性高效液相色谱法(DNPLC)相结合，来测定整个CpG位点的甲基化。近年，中国科学院化学研究所与清华大学的研究人员合作，发展了基于水溶性阳离子型共轭聚合物的新DNA甲基化分析方法。通过荧光共振能量转移技术(FRET)研究了质粒和人肿瘤细胞p16基因启动子区特异CpG位点的甲基化状态该技术具有较高的灵敏度和特异性。引物无需荧光标记，检测在均相溶液中进行，无需分离、纯化等手段，而且与高通量分析兼容，在癌症临床诊断上具有潜在的应用价值[5]。
2 胃癌相关基因的甲基化
近年研究结果显示，多种基因的异常甲基化在胃癌发生发展中起着重要的作用。有研究[6]表明，DNA的甲基化率在胃癌前病变转化为癌的过程会发生改变。Kang等[7] 对非肿瘤胃黏膜和胃肿瘤进行p16、hMLH1、DAP—kmase、THBS1、及TIMP-3等5种基因检测，发现除DAP—kmase甲基化的频率相近之外，其他基因从慢性胃炎到肠化生及从腺瘤到腺癌甲基化频率都有不同程度的增高。因此认为，这些基因的高甲基化在胃癌变发生过程中的较早阶段就已出现，这为胃癌的早期诊断提供了新思路。
2.1 p16基因甲基化
p16基因又称多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor，MTS)，定位于9p21 位点，由2个内含子和3 个外显子组成。该基因编码的蛋白是一种重要的细胞周期负调控蛋白，可与D型细胞周期蛋白(cyclinD)竞争性结合细胞周期蛋白依赖激酶CDK4 和CDK6而抑制蛋白激酶活性，使肿瘤细胞周期调节中抑癌基因Rb的表达产物(PRb)不能磷酸化而保持活化状态，抑制转录因子EF解离，使细胞周期进展最关键的G 1/S转换停滞，对细胞周期起负调控作用。因此，p16 基因的变异或其蛋白的失活会导致cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F调节途径的失控，而使细胞过度增殖，导致肿瘤发生。目前研究表明p16基因的纯合缺失和点突变异常多种肿瘤的发生有关。在胃癌中p16基因异常甲基化主要发生在外显子1和启动子区域，且基因启动子的高度甲基化更为常见。Lee等[8]最早报道了p16 甲基化与胃癌的关系，他们用甲基化敏感性限制性内切酶研究了9 个胃癌细胞株，发现2个细胞株有甲基化，而且不表达p16mRNA;体外以去甲基化剂5-deoxy-ezecytidine对胃癌细胞系处理后，因CpG岛异常甲基化而封闭的基因又重新表达。Ficorella 等[9]发现原发性胃癌中p16 基因启动子区域高甲基化是导致其转录失活的重要原因。Bai等[10]利用诱发Wistar 大鼠胃癌模型研究发现，在大鼠胃黏膜向胃癌演变过程中，p16 基因甲基化是在胃癌发生过程的较早阶段出现，其甲基化的频率在正常胃上皮中为2.7%， 在慢性萎缩性胃炎中为16.7%，在肠上皮化生中为37.5%，在胃腺瘤中为64.7%，在胃癌中则高达82.5%。Abbaszadegan 等[11]通过MSP 和免疫组化等方法同时对52 例胃癌患者组织和血清中p16基因甲基化及蛋白表达情况分析后，认为p16 启动子区高甲基化在胃癌发生中起重要作用，并且与胃癌恶性程度相关。同时提出血清中DNA 甲基化水平的检测可能是胃癌早期检查的一个重要的生物学指标。
2.2 DNA错配修复基因(MMR)、CpG甲基化表型(CIMP)与胃癌
研究发现，在胃癌的发生中存在微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)和 CpG甲基化表型(CpG island methylator phenohype，CIMP)两种分子途径。在DNA MMR中起主要作用的是基因hMLH1 和hMSH2。MMR通过修复DNA碱基错配、降低自发性突变，而增强DNA的保真性和维持基因组的稳定性。Herman等[12]最早报告了在结直肠癌中MMR hMLH1失活与DNA甲基化有关，后来发现胃癌中同样存在微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)亚型，但还没有胃癌中有关DNA MMR发生突变的报道。Fleisher 等[13]检测了65 例胃癌组织的hMLH1甲基化情况发现，随着胃癌中MSI频率的降低hMLH1基因的甲基化率也随之降低。由此推测，hMLH1基因启动子区域甲基化与MSI有关，有可能是该基因失活的一种普遍机制。Poplawski等[14]通过甲基化敏感限制性内切酶PCR(MSRE-PCR)对比分析27例胃癌患者与25 例健康人后认为，hMLH1 甲基化对胃癌形成有促进作用。由此可见，hMLH1启动子的甲基化与胃癌的发生有关，可能是胃癌发生机制中的早期分子事件。
CpG甲基化表型(CIMP)是指一些病例同时存在多个基因甲基化的现象。CIMP已在大肠癌、肝癌、肝内外胆管癌、胰腺癌、卵巢癌、急性髓性白血病、膀胱癌等恶性肿瘤中得到证实。由于胃癌的发生是一个多步骤、多因素相互作用的结果，也涉及许多相关基因的异常表达，因此多基因的启动子甲基化的研究也就自然得到了研究人员的青睐，而且越来越多的研究发现CIMP与胃癌有着密切的关系。Kim等[15] 通过检测40例早期胃癌组织中hMLH1、TIMP3、THBS1、DAP—K、GSTP1、APC和MINT2的甲基化状况发现，除了2 例基因甲基化阴性外，CIMP尽然高达40%。可见，启动子甲基化在早期胃癌中是一种普遍现象。同时研究还发现，在肿瘤发生的不同阶段、不同基因的启动子甲基化表达状况是不同的，有的基因随胃癌的进展其甲基化发生率有不断升高的趋势，而在健康青年人标本及胎盘中未发DNA甲基化。可见CIMP在胃癌的发生中是一早发事件，可以利用此特征作为胃癌的早期诊断指标，同时对建立胃癌相关基因的甲基化谱也具有积极的作用。
APC 基因是一种抑癌基因，编码的APC蛋白可以抑制上皮细胞增殖而抑制肿瘤的发生。早期研究证实该基因是结直肠癌的管家基因，近来研究发现该基因在胃癌的发生发展中也起重要作用。曾有学者用免疫组化方法分析了120 例胃癌病人的APC基因的表达情况，结果发现，APC缺失率为78%，因此认为APC 基因缺失可能与胃癌的发生有关。近年来大量的研究显示APC基因启动子1A部位甲基化与胃癌发生关系密切。Hosoya等[16]研究发现APC基因启动子1A蛋白表达率与甲基化率在正常胃粘膜和非癌粘膜中保持一致，在癌粘膜中甲基化率增高。而1B均未发现有甲基化。由此可见，ACP启动子甲基化主要发生在1A部位，且ACP启动子1A部位的甲基化可能是胃癌发生的一个中间环节，而不是胃癌发生的始动因素。3 结 语
通过对胃癌相关基因甲基化分析发现，多种相关基因甲基化是胃癌形成的重要机制之一。DNA甲基化异常不仅可在手术标本中检测到，还可从各种体液如外周血清中检测到，为临床应用带来极大便利，因此肿瘤相关基因启动子甲基化状态是一种非常有前途的生物标记物，可作为肿瘤的敏感性生物标志物。检测胃癌相关基因启动子异常甲基化不仅可用于高危人群监测、肿瘤风险评估、胃癌早期诊断，还可用于判断肿瘤迁移情况，预测胃癌手术、放化疗疗效等。由于DNA甲基化是一个可逆的过程，故通过恢复仅被抑制而未发生突变或丢失的生长调控基因表达.来恢复细胞正常生长调控功能，并且已有这方面的动物模型研究证实了这一想法。故DNA的去甲基化将为癌症的治疗提供新思路。由于一些病原体的感染可以诱发肿瘤相关基因甲基化从而导致胃癌的发生，故预防感染和及时的根除这些病原体会对预防胃癌的发生有重要的意义。
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同时，学生难以通过自身的自主学习与实践获取知识，更难有机会对课程的内容和问题发表基于自己理解的看法与意见。教与学的双方对这一现象都颇有微词。教师觉得学生学得太被动，没有主动思考; 而学生则抱怨老师教学不够精彩，提不起兴趣。为了改善这一状况，提高教学效果，自2012 年始至2014 年的三个教学周期里，本教学团队在原有教学体系的基础上，尝试进行了教学方法的改革，采用探究式教学模式，改变教师的教学方法和学生的学习方式。强调教师的作用不单是传道、授业和解惑，还要尽可能地激发学生学习的兴趣，提高学习效率，同时培养学生的科学精神和科学态度，形成一定的创新意识品质和实践能力，以期为农科其他专业课的教学改革研究与实践提供可借鉴的范例。
一、构建基于问题的探究式教学模式
通过设计问题情景，激发学生好奇心和求知欲是探究式教学模式的本质特征，其关键在于挑起学生在认识上的矛盾，形成认知冲突，并提出问题。怎样才能在教学过程中制造出认知冲突呢? 最有效的方法就是创设悬念法。悬念是一种学习心理机制，是由学生对所学对象感到疑惑不解而又想解决时所产生的一种心理状态。它能激发学生的学习动机和兴趣，使思维活跃、想象丰富，在解决所提出问题的同时还培养了学生克服困难的意志力。探究式教学的基本框架与模式或步骤如下: ( 1) 设置情景。( 2) 提出问题( 包含问题) 。( 3) 提出猜想或假设。( 4) 搜集资料和事实。( 5) 验证假设。( 6) 交流评价与得出结论。( 7) 整合、建构、迁移、应用。
( 一) 课堂理论教学方面
课堂理论教学是课程教学过程最重要的方式，在教学过程中，随着生命科学、信息技术和工程技术的迅猛发展，我们一直不断将新理论和新技术补充到园艺植物育种学课程的教学内容之中，如离体培养育种、分子育种等近年来取得的研究新成果都在课堂上余小林等基于问题的园艺植物育种学探究式教学模式研究得到了及时的反映。同时，在课程讲授中，以育种途径为主线，重点介绍园艺植物种质资源调查( 查) 、引种驯化( 引) 、选择育种( 选) ，以及在现有资源基础上，通过人工创造变异，选择获得新的品种类型的创造变异育种( 育) 途径，以及采用这些途径选育新品种的理论、方法、技术等内容。
根据探究式教学模式的要求，我们将部分章节的课程内容进行了问题化，把定论形式陈述的材料转化成引导学生探究的问题形式。为此，本教学团队经过多次讨论，设计了10 个情景问题: ( 1) 如何协调栽培品种遗传背景越来越窄与种质资源亟需保护间的矛盾? ( 2) 为什么在明末清初时我国的人口有个剧增的高峰( 主要得益于红薯、玉米和马铃薯等重要农作物种质资源的引进) ? ( 3) 如何制定园艺植物的育种目标? ( 4)如何在育种过程中避免遗传累赘，实现优良性状的定向重组? ( 5) 航天育种是未来的发展方向吗? ( 6) 杂种优势的分子遗传机制是什么? ( 7) 芽变的遗传机理及其在育种中的应用。( 8) 转基因作物的是天使还是魔鬼? ( 9) 基因组测序及分子设计育种的现在与将来。( 10) 表观遗传在育种中的作用。在上述精心设计的情景问题中，有些是本学科相关研究领域的研究前沿问题，如杂种优势的分子遗传机制、表观遗传在育种中的作用和消除遗传累赘实现定向重组是迄今为止植物育种领域的研究瓶颈和未解之谜; 有些是业内和社会当前的热点关注问题，如分子设计育种、芽变的遗传机理、航天育种和转基因作物的取舍等; 有些则是影响社会发展进程的重大问题，如种质资源的保护和人口社会发展问题等。但所有情景问题都是动态和开放的，没有唯一的标准答案，需要学生通过查询大量的文献资料，进行认真分析和整理，才能形成自己的观点或假设，并通过大量论证来支撑自己的观点或假设。
具体做法为: 将全班同学分成67 个小组( 5 人/小组) ，每小组负责一个题目。当授课到相应章节，在讲授完基本概念和理论知识以后，就由某一小组接受本章的探究式情景问题的任务，通过小组讨论，一般在四周后选择合适的时间，由本小组代表通过PPT 形式在全班进行交流，并由授课教师和各小组组长对其探究式教学成效进行考核，同时，各小组还要递交以学术论文格式撰写的总结报告。探究式教学讨论部分占总成绩的20%30%。为了促进小组之间的生生交流，防止产生能者多劳的现象，采用临时抽签的方式产生小组交流的代表，其他组员可以在后面的答疑阶段进行必要的补充。
正是这一小小操作上的改进，大大增加了小组内学生的交流和讨论时间。只有每个组员都熟悉本小组的探究问题和PPT 内容，才能在全班交流时取得好成绩，因为上台前谁也不知道谁会上台主讲，谁也不想因自己而拖全小组的后腿。
( 二) 实验教学方面
实验是培养学生独立思考、分析和解决问题能力的一个重要教学环节，是进一步掌握和理解理论知识的钥匙，也为学生后续实习及毕业后的工作提供专业基本操作技能的训练。在传统的实验课教学中，大多偏重于对相关理论的验证，且过于强调程序性，老师讲得多，学生参与少。学生完全按照教师所讲或教材所示的步骤，机械性地操作实验，缺少对研究原理与方法、实验过程和技巧的深入思考，甚至互相抄袭实验报告，导致学生过分依赖教师及教材，缺乏学习的主动性与积极性，不利于创新性人才的培养。针
对这一现实问题，结合本课程实验内容理论基础要求高、操作性强和实验周期长等特点，我们对部分自主设计性实验开展了探究式教学方法的改革。在上一次实验课结束的时候我们就布置下次实验的任务，让学生自主设计实验，使其全程参与前期实验方案的制定、实验材料的准备和试剂的配制等各个环节。以园艺植物花粉生活力测定实验为例，目前测定植物花粉生活力的方法主要有: 形态检验法、发芽法、授粉法和染色法，其中染色法有I - KI 法、氯化三笨四氮唑法( TTC) 、联苯胺- 萘酚法和亚历山大染色法等。
对此我们提出下面两个问题: 这些方法对所有植物的花粉都适用吗? 哪些方法适合哪些植物? 同时，老师在课前仅对各种检测方法进行介绍和指导，具体实验材料和方法均由每组自行选择。在随后制定实验方案时，学生选择最多的是形态检验法和染色法，发芽法和授粉法由于需要的时间太长而很少有人问津。
实验的结果也同样让人感到欣喜，结果表明，上述四种染色法对十字花科植物( 白菜、油菜、萝卜和二月兰等) 的花粉均得到比较满意的结果，TTC 法和联苯胺- 萘酚法对桃花和梨花的花粉有较好的染色效果，而结香和白玉兰的花粉仅对亚历山大染色法较为敏感。在比较了多种植物的花粉和染色法以后，通过一系列的置疑、判断、比较、选择以及相应的分析、综合、概括等过程，由发散到收敛，学生得到了不同植物的花粉对上述不同方法的检测效果各异的结论。学生普遍反映，这样得到的知识比老师在课堂上强调10 遍的效果还要好很多。通过自主设计实验、自主完成实验和自主管理实验，大大激发了学生创新思维和创新意识，让学生逐渐掌握思考和解决问题的方法，提高了学生创新实践的能力。
随后，我们对园艺植物开花习性调查和有性繁殖园艺植物的常规品种育种计划制定等两个设计性和综合性的实验也实行了类似的探究式教学改革，也同样取得了较好的教学效果。
二、探究式教学模式提高了教学效果
学生的学习效果是检验教师教学效果的标尺。探究式教学模式是对传统的授予式教学模式的一种改革与补充，它以学生的自主探究为基础，使学生掌握自主学习的基本方法，形成运用所学知识解决实际问题的能力，并逐步广泛的迁移到一切学习和生活领域之中，弥补知识转化为能力的裂隙，培养学生的创新能力，这与前人的研究结果基本一致。经过2012-2014 年三个学年度的教学改革实践，园艺植物育种学课程教与学的方式得到了根本性的改变，教师的责任由教逐渐过渡到导，引导学生积极思考，拓宽了学生思维，激发学生的学习兴趣，培养学生的个人寻找问题和解决问题的能力与团队协作能力。学生的学也由主动代替了以往的被动，由以前的要我学变成我要学。真正体现了学生的主体地位老师和学生的平等关系，拉近了师生之间的距离。针对不同的情景问题，学生通过不同的途径查询文献资料，通过小组讨论和课堂讨论，有效地提高了学生总结归纳和口头表达能力，整个教学过程培养和锻炼了学生获取知识和运用知识的能力。在近3 年的教学改革实践中，我们还设计了一套问卷调查来检测探究式教学模式的教学效果，
现将结果小结与分析如下。
( 一) 学生对探究式教学改革整体表示满意根据对近3 年的调查问卷进行统计分析结果显示，2012 年非常满意的比例是76%，基本满意的比例是19%; 2013 非常满意的比例是81%，基本满意的比例是15%; 2014 年非常满意的比例是82%，基本满意的是比例14%。说明同学们对基于问题的探究式教学改革整体表示满意，而且，随着实施经验的进一步丰富和对问题做相应的调整，非常满意的比例呈逐年上升的趋势。
( 二) 学生认可所凝练的十个情景问题统计分析结果显示，对课程所提出的讨论主题的平均满意度高达92% 以上，说明学生对所凝练的十个情景问题表示相当的认可。出现这一结果的原因是上述情景问题都是据本课程的理论和实验的教学内容，结合最新的研究热点和前沿，以及身边耳熟能详的现象和事件而设计，因此，获得高度认可也在情理之中。另外，学生普遍认为讨论主题的意义是影响探究式教学成效的最关键环节，从重要性的排序为:讨论主题的意义 文献阅读师生讨论生生讨论，说明我们在实施探究式教学方法的时候必须十分重视情景问题的凝练，同时，增加学生的文献阅读量，加强师生和生生之间的讨论也是影响探究式教学的重要环节。鉴于此，我们拟建立一个情景问题库，将根据学科发展的情况以及学生的实际情况实行动态筛选和匹配，挑选最适宜的讨论主题供学生选择。
( 三) 抽签产生主讲人的小改革极大地促进了学生小组内的讨论
根据参加小组讨论的情况，以及对近3 年的问卷调查进行统计分析结果显示，小组领到讨论题目以后，一般由23 个骨干分子领衔查阅文献和整理研讨报告，学生小组讨论的方式主要是QQ 群、课间和卧谈会等时间开展交流，但面对面的长时间深入讨论的机会较少。2012 年问卷调查中选择交流很多和交流一般的有65%，而选择交流很少和不交流的比例高达35%; 2013 年选择交流很多和交流一般的有88%，而选择交流很少和不交流的比例骤降到12%; 2014 年选择交流很多和交流一般的有91%，而选择交流很少和不交流的比例仅9%。2013 和2014 年小组讨论时间大幅增加的原因可能是由于小组主讲代表由临时抽签产生而造成的，说明教学改革过程中适时适当地做些细小的程序改正也能显著提高课程的教学效果，有着四两拨千斤之功效。
( 四) 学生对探究式教学所需时间有所顾虑对调查问卷进行统计分析的结果显示，有23%的同学认为探究式教学占用了太多的时间，认为占用时间有点多的比例是39%，选择一般的有33%，仅有5%的人选择根本不。上述结果显示，认为需要较多时间的同学约占2 /3，说明我们所设计的情景问题的难易度稍偏难。如何把握设计情景问题的难易程度是目前摆在我们面前的一个现实问题，所讨论的主题既要涉及学科的前沿，又要难易适中，其标准就是让学生跳一跳能够得着就好。通过对本课程的学习，学生全面、系统掌握园艺植物育种学的基本理论和基本方法，并能应用于分析和解决生产中的有关问题。同时，学生在科学的态度、严谨的研究方法方面也得到了训练，取得了良好的教学效果。学生对教师的教学评价连续3 年都在4. 5 分( 5 分制) 以上。
三、问题与展望
改变传统的教学观念和教学方法对教师和学生而言都是一个严重的挑战，因为教学双方都要花时间和精力进行磨合以适应新的教学模式。众所周知，近年来，随着宽口径、厚基础、重素质教改方向的确立，一些专业课程的课时缩减了很多，园艺植物育种学课程也由原来的84 课时缩减到现在的58 课时，要在有限的时间内把更多的知识教授给学生，必须改变原有的教学方式和教学观念。通过20122014 三个年度的教学改革实践，园艺植物育种学课程教学效果有了明显的提高，但也存在着一些问题和不足，需要在今后的课程教学过程中加以不断地改正和完善。
( 一) 坚持有所为、有所不为的原则开展探究式教学改革
研究表明，不是所有的课程和教学内容都适合探究式教学模式。在本课程的教学过程中，一些基础育种理论和育种方法还是采用授予式的教学方式，让学生先具备一定的专业理论知识和技能才能更好地开展探究式的学习和工作。虽然采用授予式教学，但在课上也要适当注意师生的互动，积极调动学生的学习兴趣。
在理论学习方面，如绪论、育种途径、引种驯化和选择育种等内容是植物育种学的基本概念和基础知识，这些内容适宜采用传统的教学方式进行授课，重组育种和杂交优势育种中的后部分内容可以开展探究式教学，而诱变育种、离体育种和分子育种则完全应用探究式教学模式开展教学。在实验教学部分，基础性实验和验证性实验一般不适于探究式教学，而综合性和自主设计性实验是开展探究式教学模式的主要对象。在课时允许的前提下，今后我们将尝试将更多的教学内容引入探究式教学模式，从而提高其教学效果。
( 二) 鼓励学生在课堂上积极提问
和国外学生一有问题就举手提问的习惯相比，我们的学生在课堂上提问的意愿非常低，不愿意在课堂上主动展示自己的观点，只有在教师点名的情况下才会回答问题。对调查数据进行统计分析的结果显示，产生这一现象的主要原因有: 学生认为打断教师不礼貌( 22%) 、怕耽误大家的时间( 20%) 、怕别人笑话自己问题太简单( 12%) 、以上都是( 46%) 。因此，在课程教学开始，我们首先要培养学生的提问意识，不断向他们灌输上课打断老师讲课是认真听课的体现的思想，打消他们不敢提问的顾虑，实现课堂上更好的师生互动，从而不断提高课堂的教学效果。
( 三) 需更加合理地安排小组间的交流与班级研讨时间
篇10
线粒体DNA非编码区由两个tRNA基因分离，D-loop区域就处在这个非编码区中[2]。在线粒体DNA中，D-loop区是重链和轻链的复制起点，也称之为“控制区ControlRegion”，其进化压力较小，是线粒体DNA基因组序列和长度变异最大的区域，Horai等[3]发现该区域的基因变化速度比细胞核DNA和其他细胞器的基因快5倍，同时也是进化最快的部分。因此，选择D-loop区作为鉴定种群遗传状况的分子标记直接有效。利用D-loop的序列在群体遗传学上进行分析的工作在20世纪70年代就已经展开了，那时候仅仅用于分析区域内种间的亲缘关系。现今，D-loop区已经广泛被用作非常高效的工具来推断不同区域内种间或种内的亲缘关系和遗传状况。D-loop区中仍然细分为3个部分，中央保守区、终止序列区和保守序列区。其中终止序列区包含了线粒体DNA终止复制的相关序列，是变异最大的部分[4]，最具研究和分析价值。在进行数据结果分析时，由D-loop序列分析得到的单倍型多样性指数和核苷酸多样性是两个评价群体遗传资源或者群遗传多样性的重要指标。
1.1野生群体遗传多样性分析
1.1.1D-loop部分序列分析D-loop序列分析中，由于并不是整个D-loop序列都发生碱基的插入或者替换，可以采取对保守序列区或者终止序列区的部分区域进行扩增。由于这两个部分的进化比中央保守区迅速得多，只对这一区段的序列进行分析也能代表物种的遗传多样性和进化过程。张仁意等[5]对青海4个不同湖水采集的155尾裸鲤（Gymnocyprisprzewalskii）个体的线粒体DNA的D-loop区中部分序列进行扩增，得到754bp的序列长度，分析发现155个样本中有34个单倍型，但4个群体中可鲁克湖群体的单倍型多样性和核苷酸多样性远低于其他种群；进一步的遗传分化系数的分析表明，该地区已经产生一定的遗传分化，但由于地理隔离的原因，系统发育树结果还没有发展出明显的单枝，加之该区域群体的遗传多样性偏低，需要进行重点保护。
郑真真等[6]对全球大青鲨（Prionaceglauca）进行了D-loop区中694bp扩增分析，采集了来自中东太平洋、中西太平洋、中东大西洋、西南大西洋和印度洋5个海域的165尾个体，分析发现145个单倍型，变异程度非常大。进一步分析后发现5个区域的大青鲨种群的单倍型和核苷酸都处于较高水平，种质资源较好；但是遗传分化指数显示5个区域存在强烈的基因交流，种群遗传分化水平较低。邹芝英等[7]采集了8尾长鳍鲤（Cyprinuscarpiovar.longfin），扩增得到600bp的部分序列，找到了与终止区域相关的6个特征序列；对这些特定的区域分析得到6个单倍型，13个变异位点，显示了较好的种质资源状况，核苷酸多样性数值与其他鱼类接近，遗传状况中等，由于该物种稀有且仅存在偏远地区，保护珍惜水产动物资源已经迫在眉睫。向燕等[8]为了了解3种鲟鱼：达氏鲟（Acipenserdabryanus）、中华鲟（A.sinensi）和史氏鲟（A.schrencki）亲鱼的遗传状况和遗传背景，对线粒体D-loop区部分序列进行分析，扩增得到400bp的序列，49尾亲鱼个体一共得到仅18个单倍型，并且对于单倍型系统发育树分析后，发现集中在6个单倍型中，说明这些群体很有可能来自同一母亲；不过各单倍型遗传距离较远，说明父本来自不同的个体；其结果提示，在生产中仍要采用不同单倍型进行人工繁育，以避免近亲而导致种质退化。
Kumazawa等[9]研究发现，D-loop的5＇端和3＇端有串联重复序列，这段的变异速率较快。Abinash等[10]在北美不同区域采集淡水扁头鲶（Pylodictisolivaris），对35bp的串联重复区进行分析检测，从美国35个水系采集了330尾样本，分析结果发现，在东南墨西哥湾的70%样本出现串联重复的变异，而采自密西西比河95％的样本和墨西哥湾西南沿岸的扁头鲶没有出现这个区域的变异；系统发育的计算结果表明，在70万年和205万年左右出现群体分流；从地理位置上看，密西西比河的支流进入墨西哥湾西南沿岸流域，而东南墨西哥湾为另一条流域；该结果表明种群的遗传结构受到地域特殊性的影响。D-loop区部分序列的结果分析能满足一定程度的遗传多样性和遗传状况分析，可以得到可靠的结果数据帮助人们进行资源保护和简单的育种工作。随着科技进步和测序水平的改善，进行全序列的测序渐渐进入研究者的视野，全长序列将获得更加完整和正确的结果。
1.1.2D-loop全序列分析D-loop的多态性一种是来源于碱基的突变、插入和替换形成的不同单倍型，不仅种间有差异，种内个体间也存在差异，只是重复的差异小于种间的差异。而且在个体中D-loop一旦发生差异，线粒体DNA会稳定地将这种差异遗传下去，这种差异在个体间表现为线粒体DNA分子的长度变异，因此对D-loop全长进行分析研究更能体现整体的变异程度。肖明松等[11]在淮河淮滨段、凤台段、蚌埠段、洪泽湖段采集84尾野生乌鳢（Ophicephalusargus）进行种群资源的研究，分析发现33个单倍型，检测了单倍型多样性（h）、核苷酸多样性（Pi）、遗传分化指数（Fst）、遗传距离以及中性检验、错配分析和NJ树，发现其h和Pi较高，表明种群平均多态性相对较好；但在遗传距离的分析中发现所有群体的差异都较小，这可能是由于在淮河流域中不同支流的种流程度较高造成的，所以变异发生在种内，而种群之间的分化较少。董志国等[12]对大连、东营、连云港、舟山、湛江和漳州6个地区的野生三疣梭子蟹（Portunustritubercatus）进行D-loop全基因组区的遗传多样性及群体遗传结构的分析，选择单倍型多样性和核苷酸多样性作为重要指标，并加入了群体遗传分化指数的分析，进行Tajima’sD中性检验和单倍型间的分子变异分析，发现不同地区梭子蟹的遗传多样性很高，产生一定的遗传分化；不过在系统发育关系分析中，地理距离对遗传距离没有显著的关系，原因仍需要进一步研究。赵良杰等[13]在千岛湖汾口、富文、临岐3个大眼华鳊（Sinibramamacrops）主要繁殖区域采集了115尾个体，对样品进行了形态学和D-loop序列测定后，分析形态主成分和各个基因遗传学分析指标，发现千岛湖各地的大眼华鳊之间有丰富的基因交流，并没有形成容易灭绝的小种群，表明各个地理群体仍然有丰富的遗传多样性，面对一定的灾害时有一定的弹性，不过这样的良好状况仍然需要政府和渔民对该区域的种质资源进行保护。高志远等[14]对海南松涛水库南丰镇、番加乡、白沙群体的长臀鮠（Cranoglanisbouderius）的D-loop序列全场进行分析，44尾个体中发现11个单倍型，但在分析中发现单倍型较高，而核苷酸多样性较低，认为是由于海南岛偏僻的地理位置难与大陆长臀鮠进行基因交流，推断在历史中可能出现过严重的瓶颈效应；中性检测也表明没有任何整体或局部的种群扩张，数据皆表明该地域长臀鮠正处在较危险的境地，需要进行种群的保护措施。
1.2养殖群体遗传多样性分析目前，国内对水产动物养殖过程中出现的生长不良与病害频繁大多归结于饲料与环境的问题。诚然，营养和免疫是养殖的关键，但是由于人工育种和繁育杂交造成的种质资源下降也是重要因素之一。养殖户往往在育种过程中，没有考虑到育种群体的遗传状况，导致近亲杂交，子代产生各种问题。徐钢春等[15]对灌江纳苗养殖刀鲚（Coilianasus）的子三代品种与在淡水生活环境下湖鲚（C.nasustaihuensis）两个群体的遗传多样性进行了比较和分析，进行单倍型和核苷酸分析后，发现养殖刀鲚的遗传多样性要优于湖鲚，这可能是由于刀鲚仅是子三代，还未经历大量的人工繁殖和育种，保留了较好的遗传状况；而湖鲚由于其陆封型的特点，导致其种质资源渐渐下降，需要进行放流等活动保证种质资源。姚茜等[16]对来自浙江湖州某公司的养殖群体、缅甸引进的群体和两者杂交的“南太湖1号”群体的罗氏沼虾（Macrobrachiumrosenbergii）的D-loop区进行分析，共16尾群体分析得到14个单倍型，结果表明缅甸引进的群体核苷酸多样性最高，浙江湖州人工养殖群体的多样性最低，说明人工育种对遗传多样性有较大的影响。通过遗传距离和遗传分化指数分析发现，杂交群体更加偏向本地种群。在今后的育种工作中，可在杂交代中选取优秀性状的沼虾，与缅甸种群杂交，以获得更优秀的品种，为今后的人工繁育打下基础。李胜杰等[17]将珠江水产研究所养殖品种大口黑鲈（Micropterussalmoides）与北方和佛罗里达两个野生群体进行D-loop区的遗传分析，在23尾采集的样品中，5尾个体含有两种单倍型，北方11尾个体发现9种单倍型，而佛罗里达仅有1种单倍型。在遗传距离分析上发现，珠江水产研究所的养殖群体与北方群体更加接近。对于单倍型多样性和核苷酸多样性分析，结果表明养殖群体与国外种群相比，其遗传多样性处于较低水平，需要开展种质的保护工作，应引入国外品种进行杂交，改善国内养殖群体的遗传结构，提高遗传多样性，丰富大口黑鲈的种质资源。
1.3亲缘与起源分析D-loop区串联重复的现象虽然丰富，但是不同动物的重复位置不一致，重复的序列和重复的单元也不一致，所以相近物种之间对比分析有助于明确不同物种的关系。郝君等[18]对乌克兰鳞鲤（Cyprinuscarpio）、鲫（Carassisauratus）、鲢（Hypophthalmichthysmolitrix）、鳙（Aristichthysnobilis）、草鱼（Ctenopharyngodonidellus）和乌苏里拟鲿（Pseudobagrusussuriensis）6种不同鱼的线粒体D-loop区进行测序，分析了种内、种间遗传结构差异，发现作为分子标记对系统分化效果的差异，6种不同鱼的碱基含量、碱基差异、遗传距离和系统发育都有显著的差异，构建的D-loop序列的NJ系统树展示了6种鱼的分类地位，肯定了D-loop区比邻近区段的tRNA和12sRNA在鱼类识别、分类、种类鉴定和遗传多样性分析上更加可靠。侯新远等[19]对5种虾虎鱼类进行了系统进化关系的研究，分析了河川沙塘鳢（Odontobutispotamophila）、鸭绿沙塘鳢（O.yaluensis）、中华沙塘鳢（O.sinensis）、葛氏鲈塘鳢（Perccottusglenii）及尖头塘鳢（Eleotrisoxycephala）这6种虾虎鱼类同源长度约为830bp的D-loop序列，通过系统发育树和遗传距离分析，得到6种鱼类的亲缘关系即河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢、中华沙塘鳢、平头沙塘鳢聚为一支，尖头塘鳢、葛氏鲈塘鳢和褐塘鳢等聚为另一支，为鱼类资源的分类和利用提供了基础。马波等[20]在额尔齐斯河采集了两种类型的银鲫（C.auratusgibelio），对几种鲫鱼的可量性状和D-loop区进行分析，得到了优势种群的生长性状，确定了它们的遗传学特征和分类学地位，同时通过D-loop区的单倍型共享率研究了两种鲫的起源和遗传特征，这些结果对我国将来进行银鲫育种有很大帮助。Klaus等[21]利用D-loop序列对欧洲鲤鱼（C.carpio）137的起源进行研究。在此之前对于欧洲鲤鱼也有过很多关于起源的研究：Zhou等[22]发现一些欧洲养殖的鲤鱼起源可能在德国和欧洲，而俄罗斯主要养殖的鲤鱼起源在亚洲。Zhou等[23]在德国镜鲤和伏尔加河的野生鲫鱼利用D-loop区全序列获得独特的3种单倍型；而Mabuchi等[24]在日本鲤鱼中发现有两个D-loop区单倍型与Zhou等报道的欧洲发现的单倍型非常相似。Klaus等[21]的研究结果指出欧洲和中亚所有的鲤鱼品种有一个共同的祖先，而且有可能是在后冰河时期传播到中亚或者欧洲。对于这种现象，可能是由于在育种过程中，没有进行规范的养殖记录，导致各种群出现杂交现象。而且，养殖户挑选具有优势性状的品种进行，容易导致其他稀有单倍型的消失，从而使得种质资源慢慢下降。
1.4个体内异质性分析同一个体内存在多种重复序列数目不同从而表现为异质。高祥刚等[25]采用克隆技术，在我国海域随机采集了3头斑海豹（Phocalargha），每尾个体任选14个克隆菌，对它们的线粒体DNAD-loop区的终止序列区进行扩增测序，发现其个体内存在多种不同的串联重复单位，即存在异质现象，说明我国的斑海豹种质资源保护较好，进化状态比较积极。张四明等[26]在野生的中华鲟种群种间和个体体内检测线粒体DNA的长度变异情况，发现中华鲟有较多个体的异质性，表现出良好的遗传多样性。由此可见，个体的异质存在是导致线粒体DNA中控制区D-loop长度变化的主要原因，而个体的线粒体DNA长度异质性是直接推动动物物种遗传多样性的重要途径。综上所述，可以发现线粒体D-loop区的序列分析已经在水产行业取得大量进展，D-loop区基因的插入、突变和替换都是影响多样性的关键，而个体内的异质和串联重复的高频率变化不仅存在于水产动物个体中，也存在于种群内，甚至在不同物种之间都对野生水产动物的起源、亲缘关系、遗传多样性、遗传结构和动物进化程度起着重要的作用。在养殖群体中，D-loop区的分析正在渐渐起到重要的作用，若结合微卫星、RFLP等其他分子标记技术，将来对人工育种和对亲鱼、亲虾的选育工作有重大意义。
2细胞色素b序列（cytb）
线粒体DNA中编码蛋白质的基因有还原型辅酶I的亚基、ATP合成酶的亚基、细胞色素c氧化酶的3个亚基和细胞色素b[27]。Zardoya等[28]研究认为，cytb的进化速度适中，适合进行种内和种间的遗传分析。现今利用cytb序列多数用于种内和种间的遗传分化分析、遗传图谱建立和遗传多样性调查，并辅以其他标记技术进行组合分析。王晓梅等[29]获取中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)cytb序列的PCR产物后，利用DGGE技术分析了温州、仪征、江都、南京、盘锦和合浦地区的中华绒螯蟹的遗传多样性，并与合浦绒螯蟹(E.japonicahepuensis)对比，发现中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹遗传距离较大，在亲缘关系上具有显著的差异，但是仍有部分遗传标记相同，说明存在一定的基因交流。
黄小彧等[30]利用cytb序列检测了长江支流贵定与干流合江和宜都的中华倒刺鲃(Spinibarbussinensis)群体的遗传多样性，分析群体的遗传距离，结合地理因素分析了该物种的种质资源现状，发现合江的遗传多样性最好，而支流群体与干流群体的遗传分化较大，地理隔离使同一物种的基因交流程度降低。夏月恒等[31]利用cytb序列对中国近海3个地区的鮸鱼（Miichthysmiiuy）的遗传多样性进行分析，通过对地理环境和历史因素的解释，认为中国鮸鱼基因型的单倍型多样性高和核苷酸多样性低可能是因为种群在某个时期突然扩张，使单倍型突变大量产生，但这段时间对于提高核苷酸多样性时间不足，所以产生了如此差别；且Fst结果极低，说明该地区遗传分化程度很低，加上不同地理的单倍型网络图交错呈现，有可能是因为种群由于扩张之后还未达到平衡，需要对该地区进行保护。钟立强等[32]调查了长江中下游5个湖泊的黄颡鱼，利用cytb序列分析了不同地区遗传多样性和遗传分化的程度，60尾个体检测出37个单倍型，Fst分析显示这5个种群的变异大部分都来自群体内，说明各个种群间有一定的基因交流，系统树显示它们没有分化成谱系。司从利等[33]从长江贵定和乐山两个群体的泉水鱼cytb序列分析其遗传状况、结构和多样性程度，发现这两个群体由于三峡大坝的地理因素，已明显受到严重的影响，出现高度的遗传分化，建议对该物种进行分区保护，提高遗传多样性，丰富种质资源。
司从利等[34]在广东、广西等地基于cytb序列分析了华南居氏银鱼（Salanxcuvieri）的遗传现状，从邻接树上可发现有一定的分支，认为地理因素正在逐渐影响遗传结构，推测琼州海峡的地理位置可能影响广东、广西种群间的遗传交流；中性检测结果表明在更新世晚期发生扩增，地球当时的气候影响了该种群的遗传多样性；根据现状，建议分地区对该种群进行人为保护，避免出现种质退化。李伟文等[35]两年中在7个远洋捕捞点采集了黄鳍金枪鱼（Thunnusalbacares），扩增了cytb部分序列得到663bp，108尾个体仅有24个单倍型，且单倍型多样性和核苷酸多样性都处于较低水平，群体的遗传多样性较差；Fst分析得到变异大多发生在群体内部，表明其遗传分化程度较低，并且基因交流非常强烈，种质资源正在衰退，这与人类破坏环境和大面积捕杀有密切关系。谢楠等[36]利用cytb对鲂属（Megalobrama）4种鱼类及长春鳊（Parabramispekinensis）进行了系统分类。但在结果分析过程中仅靠cytb的信息难以准确将不同品种进行区分，仍需要配合其他标记进一步研究。
3其他标记与组合分析
16SrRNA序列、12SrRNA序列和COI序列在线粒体基因组中变异速度较慢，保守性较高，因此很难由其单独作为验证工具来进行遗传分析，往往需要结合其他的基因片段，才能同时作为鉴定种内亲缘关系和物种遗传多样性程度的工具。刘萍等[37]选取了山东青岛中华虎头蟹（Orithyiasinica）野生群体的16SrRNA和COI基因片段研究其遗传多样性，但是发现16SrRNA变异程度较小，效果不佳；在遗传距离和系统进化研究中，两种技术检测了不同蟹之间的亲缘关系以及它们的进化分化时间，利用NJ系统进化树发现中华虎头蟹与梭子蟹类的亲缘关系最近，并采用“分子钟”对4个蟹类的分化时间进行计算。吴玲等[38]对沿海6个群体的白氏文昌鱼（Branchiostomabelcheri）和日本文昌鱼（B.japonicum）分别进行COI和16SrRNA序列的研究，发现两种鱼种内遗传多样性较高，但还没有明显的遗传分化；其中茂名群体和威海群体具有最高的核苷酸多样性，很有可能为这两类鱼的祖先。
翁朝红等[39]对近江蛏（Sinonovacularivularis）、缢蛏（S.constricta）、小刀蛏（Cultellusattenuatus）、尖刀蛏（C.scalprum）和大竹蛏（Solengrandis）的COI和16SrRNA部分序列进行测序和分析，在进行遗传距离和系统演化分析后，结果表明近江蛏已进化至独立为一个种，并且通过聚类分析推断近江蛏应归属于竹蛏超科，解决了这几种蛏分类归属。郁建锋等[40]结合12SrRNA和16SrRNA的序列为太湖流域河川沙塘鳢的分类提供了重要的帮助，发现了大量的变异位点和简约位点，而且在两种标记的验证下，比较得出太湖流域河川沙塘鳢与福建流域河川沙塘鳢已经存在一定的遗传差异。同时，系统发育树分析表明，太湖流域河川沙塘鳢与其他鳢已存在遗传分化差异。王庆容等[41]对长江中上游舞阳河、乌江、雅砻江、岷江和金沙江5个野生鲇(Silurusasotus)群体的亲缘关系和遗传差异进行了分析，对比了核苷酸和单倍型多样性，发现舞阳群体与其他群体的亲缘关系较远。杨慧荣等[42]同时利用D-loop和cytb的序列对长江水系的赤眼鳟（Squoliobarbuscurriculus）进行了遗传多样性的分析，通过遗传变异率、单倍型多样性等指标发现长江赤眼鳟遗传多样性较高，种质状况较好；同时，根据Fst和分子变异等级差异分析发现，不同水系的群体存在明显的遗传分化；系统发育树证明了珠江水系赤眼鳟与长江水系赤眼鳟正在逐渐分化为两类群体，并提出cytb序列在变异显著的群体间更能发挥作用。
孙希福等[43]利用cytb序列和D-loop序列分析了江豚（Neophocaenaphocaenoides）在鼠豚类及一角鲸类的分类地位，系统发育树表明，江豚的遗传距离与一角鲸科较为接近，并确定棘鳍鼠海豚、太平洋鼠海豚及黑眶鼠海豚3种群有较近的亲缘关系，否定了之前仅凭借形态学的分类方式。毕潇潇等[44]在某一水产品公司采集了来自美国与荷兰的狭鳕（Theragrachalcogramma）、太平洋鳕（Gadusmacrocephalus）、蓝鳕（Micromesistiuspoutassou）和远东宽突鳕（Eleginusgracilis）4种不同属的鳕鱼，利用16SrRNA、cytb和COI序列比较了它们的序列结构，根据核苷酸分歧速率以及NJ系统发育树，将太平洋鳕、狭鳕和宽突鳕归为一支，也显示了它们较接近的遗传距离，给分类学提供了非常重要的理论基础。
4展望
线粒体分子标记技术主要用于物种的遗传多样性分析、亲缘、亲权分析和物种进化程度分析。该基因组功能重要且能稳定遗传，是物种个体基因组中变化速度较快且保留较好的部分。对D-loop区的序列进行测序、比对、计算和分析后能得到物种的种属分类、遗传结构、历史发育情况和遗传多样性状态。而且，D-loop区稳定的母系遗传，使得分析起源有较好可靠性，聚类分析结果准确。同时，细胞色素b和16SrRNA等序列虽然进化速度较慢，但其稳定性的特征可以得到较好保留，获得的插入、替换和缺失等突变可以持续遗传，以作为数据分析的可靠依据。在进行不同情况的分析时，可以结合一到两种分子标记技术，作为重要的辅助参考标记。
综上，在水产行业的遗传分析中，野生群体的遗传多样性是将来进行育种和引进的关键，通过线粒体分子标记技术对野生经济水产动物的遗传结构和遗传多样性分析是高效、准确和可靠的。其中单倍型多样性和核苷酸多样性表现了分子结构的变异程度，体现了野生群体种质资源的现状；遗传分化特征能表现群体的基因交流状况，表明了群体间自由的自由度；分子变异等级分析可以让我们了解不同地域群体突变的来源，表现了群体遗传结构的差异；中性检测等分析从分子层面揭示了鱼类的系统发育状况。
