表观遗传学意义范文

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2表观遗传学概述每个细胞都具有全套基因，这全能性的基因如何表达出如此多样性的细胞、组织 这一复杂有序表达调控过程被称为表观遗传学[4]。基因的DNA序列只是一个模板 ，高等生 物的每个细胞必须通过表观遗传信息的调控，有序地指令其遗传信息的开启或关闭。使全能 性基因表达出多样性细胞、组织。它不仅对基因的表达、调控、遗传有重要作用，而且在肿 瘤、免疫包括高血压等许多慢性疾病的发生和防治中，也具有十分重要是意义。表观遗传变 量则是联系基因组、环境和疾病的重要环节。表观遗传学的分子机制包括DNA甲基化、组蛋 白修饰、染色质重塑和RNA干扰等，其中最重要的是DNA甲基化和通过组蛋白修饰的染色质重 塑。这些调控机制有二个特征：一是它们可以受后天环境影响，具有可获得性；二是它们可 遗传性。在“全基因组关联研究（GWAS）”发现了一些血压 、高血压的遗传易感位点，但这些位点对人群血压水平影响很小（≤1mmHg）[2]，这 一现象在其它复杂性状疾病GWAS研究中普遍存在，称为：遗传性缺失（missing heritabilit y）[5]。而重视表观遗传学的研究也是对类似高血压这样的复杂性状疾病，呈现环 境和基因相关所致“遗传性缺失”的揭示。

3表观遗传调控与线粒体代谢[6] 表观遗传学可提供环境与核DNA（nDNA）二者之间的相互关系。环境的关键要素是 对机体的能源给予可利用的热量（calories）。通过细胞生物产能系统，经由糖酵介和线粒体 氧化磷酸化（OXPHOS）产生能量。有成千生物能源基因（Bioenergetic genes），弥散越过染色 质和线粒体DNA（mDNA），并需有mDNA顺式（cis）和反式（trans）二者的调节。生物产能系统转化 环境中的热能为ATP，乙酰辅酶A，S_腺苷甲硫氨酸（SAM）以及还原性NAD+。当能源充沛时， AT P和乙酰辅酶A磷酸化和乙酰化染色质，开放nDNA转录和复制。当能源受限时，染色质的磷酸 化和乙酰化丧失，抑制基因表达。经由SAM使DNA甲基化，也可由线粒体功能所修饰。磷酸化 和乙酰化也是调节细胞信号传递的关键。所以，生物能源学提供环境与表观遗传二者相互作 用，最终组成表观遗传调控疾患的临床表型（phenotype）。类似表观遗传疾病的有Angelma n，Rett，Fragile X综合症，和癌症等，常伴有线粒体功能失调。“生物能源学-表观遗传学 ” 的假设，也可更广泛适用于如高血压、糖尿病等一般常见的由环境-基因相互作用的疾病， 用来探索其病因、病理生理和指导其治疗。

4表观遗传与高血压的发生

41DNA甲基化与原发性高血压：高血压的发生和发展与DNA甲基化密切相关。11β_类固 醇脱氢酶_2（11β_hydroxysteroid dehydrogenase_2 11β_HSD_2） 、内皮素转换酶1（endothelin converting enzyme_1，ECE_1）和AT1b等基因发生甲基化和去 甲基化，会影响代谢酶和受体的表达；从而通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活，以及肾 性水钠潴留等途径引起高血压的发生[7]。

411血管紧张素Ⅱ受体1型b（AT1b）：基因可通过甲基化调控，参与高血压的发生和 发展。AT1b受体主要分布于肾上腺、垂体肾脏等部位，有实验在妊娠期的小鼠，喂以低蛋白 饮食，其子代肾上腺AT1b受体基因启动子发生显著去甲基化，AT1b受体基因表达上调；引起 子代对血管紧张素的反应性升高，收缩压、舒张压均高于正常。表明AT1b受体的低甲基化（ 或去甲基化）可能是高血压的潜在病因之一[8]。

41211β_HSD_2：11β_HSD_2活性减低，通过皮质醇作用，导致盐皮质激素受体（mine ralcorticoireceptor MR）过表达，并且有肾脏钠离子的潴留，低钾血症和盐敏感性 高血压。这种情况发生在糖皮质激素治疗，导致11β_HSD_2基因启动子高甲基化，活性降 低，同时伴有尿中THF（四氢皮质醇）/THE（四氢可的松）比率增高[9]。

413甲基化CpG结合蛋白增强自主神经反应性：甲基化CpG结合蛋白_2（MECP_2） 是MECP基因的产物。有报道[10]通过MECP_2致去甲肾上腺素转运体基因沉默。去甲 肾上腺素转运体是一种膜蛋白，通过此转运体可将儿茶酚胺神经介质如去甲肾上腺素和多巴 胺转运回突触前（presynaptic）神经元而释放。在脑力应激下，苯乙醇胺N_甲基转移酶（PNM T）（将去甲肾上腺素转换为肾上腺素，源于肾上腺髓质嗜酪细胞）释放，如同DNA甲基化酶 ，具有MECP_2基因沉默作用；因而可以减少神经元再摄取去甲肾上腺素，而产生突触与周 围儿茶酚胺水平增加，自主神经系统反应增高，引起血压升高和惊恐状态。

414高同型半胱氨酸所致基因组DNA低甲基化与原发性高血压：Kim等[11]对 同型半胱氨酸（Homocystine Hcy）和血压水平调查，二者呈独立正相关。具有高Hcy的高 血压称H型高血压。对高Hcy引发的高血压有多种解释，而Hcy在机体内的功能是比较复杂的 ，机体内Hcy含量主要受遗传和环境营养二种因素调控。环境营养因素主要指代谢辅助因 子：如叶酸，维生素B6、维生素B12等，如果叶酸、维生素B12不足，就会造成获得性Hcy代 谢障 碍。维生素B12是5_甲基四氢叶酸转甲基酶的辅酶，而5_甲基四氢叶酸是体内甲基的间接供 体，二者的缺乏使甲基不能转移，阻碍甲硫氨酸的再生成，同时造成Hcy的蓄积。Hcy水平升 高时，肝脏中S_腺苷同型半胱氨酸（SAH）水平升高；而甲基供体S_腺苷甲硫氨酸（SAM）下降， 导致DNA低甲基化[12]。由高Hcy和高SAH水平所致的基因组低甲基化，容易诱发AT1 b，ECE_1等基因去甲基化，使这些受体和代谢酶基因表达上调，并通过RAS激活和肾性水钠 潴留等途径引起高血压的发生。由此可见不同细胞类型有特殊甲基化模式，反映它们的多样性和特殊性。甲基化模式遗传（M ethylation Pattern Inheritance）可以经过一代至另一代，相应于环境对细胞的发展和功 能的改变。

42组蛋白乙酰化与高血压：染色质的基本单位为核小体，后者是由四种组蛋白（H2A，H 2B，H3，H4）各二个分子构成的八聚体核心，N端尾部为单一的H1。组蛋白乙酰化与基 因活化和DNA复制相关，组蛋白的去乙酰化和基因失活相关。有报道[13]在用C172 NSC系列细胞给予生理剂量褪黑激素（Melatonin MLT）24h 后，显示组蛋白H3乙酰化增加，轴突样伸展，和标志神经干细胞nestin mRNA表达增加；M LT也对不同的其它组蛋白乙酰转移酶亚型表达增加。MLT对富含MLT受体最后区（area postrm a AP）神经元的调控，提供输出至嘴侧延髓腹外侧区（Rostral Ventrolateral Medulla RVML ）血管运动中枢兴奋增加。RVML是脑干交感性输出至血管的主要调节者。因而当RVML功能失 调时，也是人类原发性高血压发生的一种重要机制[14]。

43SiRNA对NADPH氧化酶、氧化应激和RAS（肾素-血管紧张素）的升压抑制作用：20世纪 90年现了小干扰RNA（SiRNA），RNA已成为重要的遗传学信息的决定者和调控基因的表达 。RNA干扰（RNAi）是由双链RNA（dSRNA）使靶基因的mRNA降介或阻止其翻译，最终导致特异性 靶基因表达阻断。SiRNA通常来源于mRNA、转座子、病毒或异染色质DNA。经过Dicer酶切割 形成长20～25bp的小片段，并与靶基因mRNA互补链结合，产生转录后基因沉默（PTGS）。对于 SiRNA已成为近年来在肿瘤及一些复杂性状的慢性疾患研究的热点[15]。有报道 [16]用SiRNA靶向p22phox（sip22phox），使其RNA沉默，抑制NADPH氧化酶_AngⅡ 诱导的 平滑肌细胞收缩反应。RNA沉默，减轻NADPH氧化酶活性和产生氧化应激；并在清醒小鼠给予 AngⅡ的第二周显示减轻其进行性的升压反应。

5展望近年来表观遗传调控高血压、血管重构，以及有关高血压的并发症等，有较多的报道[ 17，18]。成为推动阐明高血压这样一种遗传和环境因素相互作用所导致的复杂性状的疾 病，拓展了新的领域，并引起极大的关注。然而，表观遗传领域的最大难题是清理出致病径 路[19]。例如，表观遗传的DNA修饰能引起疾病，而有些致病因素又能诱发DNA修 饰，或染色体的重构。已知有些表观遗传修饰是后天获得的，有些是遗传的；但它不同于单 基因遗传所致的特殊类型的高血压，可以经过传代后发生血压升高，也可以逆转。要系统地清理表观遗传调控高血压的径路及其发病机制，还需做大量工件。目前表观遗传学 对肿瘤的研究最为活跃，有些已转化为临床应用，取得了可喜的成果。表观遗传被假设为环 境与基因表达二者之间的调节者；而环境对机体最重要的因素是热量的利用以及其调控机制 ；其次是随龄的氧化损伤。这二者与线粒体的代谢密切相关。因此，在清理表观遗传致病径 路，将表观遗传调控与线粒体代谢二者结合探讨，可能更有利于阐明如高血压这类复杂性状 的疾病。表观遗传学在高血压发生中的作用，及其在某种程度上的可逆性，这就为高血压的防治提供 了新的靶点，为个体化药物治疗提供依据。更重要的是能确立高血压是多基因和环境因素参 与的一种复杂性状的病症的概念，将高血压的防治前移[20]，倡导更合理、健康、 优化的营养和生存环境。

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关键词：表观遗传学；染色体失活；DNA甲基化；组蛋白修饰；基因组印记

遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等；而表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如DNA甲基化和染色质构象变化等；表观基因组学则是在基因组水平上对表观遗传学改变的研究。

通俗的讲，表观遗传学是研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时，基因功能的可逆的、可遗传的改变。也指生物发育过程中包含的程序的研究。在这两种情况下，研究的对象都包括在DNA序列中未包含的基因调控信息如何传递到（细胞或生物体的）下一代这个问题。在分子水平上，表观遗传学解释了DNA序列所不能解释的诸多奇怪的现象。如：同一等位基因可因亲源性别不同而产生不同的基因印记疾病，疾病严重程度也可因亲源性别而异。表观遗传的现象很多，主要包括：染色体失活、DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印记等。

1 染色体失活

在哺乳动物中，雌雄性个体X 染色体的数目不同，这类动物需要以一种方式来解决X 染色体剂量的差异。在雌性哺乳动物中，两条X 染色体有一个是失活的，称为X染色体的剂量补偿。人类存在相同的现象，女性有两条X染色体，而男性只有一条X染色体，为了保持平衡，女性的一条X染色体被永久失活。X染色体失活的选择和起始发生在胚胎发育的早期，这个过程被X 失活中心(X - inactivation center) 所控制。这个失活中心存在着X染色体失活特异性转录基因Xist (X - inactive - specifictranscript) ，当失活的命令下达时，这个基因就会产生一个17 kb 不翻译的RNA 与X 染色体结合，引发失活。Xist基因编码Xist RNA，Xist RNA包裹在合成它的X染色体上，引发X染色体失活；随着Xist RNA在X染色体上的扩展，DNA甲基化和组蛋白的修饰马上发生，这对X染色体失活的建立和维持有重要的作用。X 染色体失活是表观遗传学最典型的例子，它可以通过有丝分裂或减数分裂遗传给后代。人们可以通过了解染色体失活的原理来解释遗传规律。

2 DNA 甲基化

所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。它是基因组DNA 的一种主要表观遗传修饰形式，是调节基因组功能的重要手段。CpG常成簇存在，人们将基因组中富含CpG的一段DNA 称为CpG岛，通常长度在1～2 kb 左右。人类基因组中大小为100～1 000 bp左右且富含CpG二核苷酸的CpG岛总是处于未甲基化状态，并且与56%的人类基因组编码基因相关。CpG岛常位于转录调控区附近，在DNA 甲基化过程中胞嘧啶突出于DNA 双螺旋并进入与胞嘧啶甲基转移酶结合部位的裂隙中，该酶将S-腺苷甲硫氨酸(SAM) 的甲基转移到胞嘧啶的5′位，形成5 - 甲基胞嘧啶。由于DNA甲基化与人类发育和肿瘤疾病的密切关系，特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活问题，DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。体内甲基化状态有3种：持续的低甲基化状态、诱导的去甲基化状态和高度甲基化状态。DNA 甲基化主要是通过DNA 甲基转移酶家族来催化。DNA 甲基转移酶分两种：维持甲基化酶和重新甲基化酶。在细胞分化的过程中，基因的甲基化状态将遗传给后代细胞。但在哺乳动物的生殖细胞发育时期和植入前胚胎期，其基因组范围内的甲基化模式通过大规模的去甲基化和接下来的再甲基化过程发生重编程，从而产生具有发育潜能的细胞。

3 组蛋白修饰

组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白，是一类小分子碱性蛋白质。组蛋白有两个活性末端：羧基端和氨基端。染色体的多级折叠过程中，需要DNA 同组蛋白结合在一起。这种常见的组蛋白外在修饰作用包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP 核糖基化、羰基化等，它们都是组蛋白密码的基本元素。与DNA 密码不同的是，组蛋白密码和它的解码机制在动物、植物和真菌类中是不同的。我们从植物细胞保留有发育成整个植株的全能性和去分化的特性中，就可以看出它们在建立和保持表观遗传信息方面与动物是不同的。乙酰化修饰大多在组蛋白H3 的Lys9 、14 、18 、23 和H4 的Lys5 、8、12 、16 等位点。甲基化修饰主要在组蛋白H3 和H4 的赖氨酸和精氨酸两类残基上。研究也显示，在进化过程中组蛋白甲基化和DNA甲基化两者在机能上被联系在一起。在引起基因沉默的过程中，沉默信号(DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重新装配)是如何进行的目前仍处于研究阶段。当DNA量增加时，阻抑作用可消除，转录便开始进行。这说明组蛋白的阻抑作用不是抑制RNA聚合酶，而是组蛋白与DNA相结合后，将DNA束缚住使其不能转录。

4 基因组印记

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【关键词】 目标教学法；初中数学；课堂教学

每一节课都必须有教学目标，在设计教案的时候最初就应该明确一节课的教学目标. 教学中各个环节和内容的设计都应该是围绕着教学目标而进行的. 教学目标是整堂课的出发点，也是课堂的最终归宿点. 有了明确的目标才能更好地保障每节课的课堂效率，让学生们在目标的指引下，真正掌握一节课所要掌握的内容. 现在我将结合自身的教学实践，谈谈在教学的过程中，如何去落实让目标贯穿课堂的每一个环节.

一、明确教学目标，体现出对教学过程的引导

制定教学目标是设计一堂课的开始，教学目标的制定关系着一节课的课堂效率. 总的来说，教学目标的制定要尽量的具体详细. 这样不但可以更加具体地体现一节课的目标，教师在备课的时候也可以根据教学目标来安排更加适当的教学内容. 如果教学目标太笼统，教师则比较难很难组织教学内容，并且要判断学生们是否已经掌握所要学习的内容，是否达成了学习目标也比较难有具体的判断依据. 因此，在制定教学目标的时候，要尽量详细具体.

比如，在学习七年级的数轴这一节课时，大部分老师给的教学目标就是：一、能根据构成数轴的三个要素正确画出数轴；二、学会由数轴上的已知点说出它所表示的数，能将有理数用数轴上的点表示出来. 我认为这节课的教学目标可以这样去具体化，如一、明确什么是数轴；二、数轴的三要素是什么；三、画数轴的方法是什么；四、数轴上的点与有理数之间的关系是什么；这样把课堂目标具体化之后，学生们如果可以回答这几个问题，那么这节课的内容就算是掌握了. 要判断学生们是否达成了课堂的学习目标，就按照这样的依据来检验就可以了. 因此，教师在制定课堂教学目标的时候，要保证目标内容的具体性和目标的可操作性，尽量不要设计一些抽象的，范围笼统的目标.

二、授课的过程应以课程目标为向导

在制定了具体的教学目标之后，课堂的展开就应该是以教学目标为导向和线索，一步步进行教学. 这样不但有利于教学的有序展开，还可以使课堂的逻辑更加合理. 在导入新课之后，教师可以直接把本堂课的教学目标告诉学生，如要让学生们明确本节课要学习的内容是什么，我们要掌握哪几点，哪些内容是重点，哪些内容是难点，不同的内容对学生们的不同要求. 让学生明确这节课要达成的目标有哪些，学习的内容难度有多大. 在这样的明确目标的指引下，无形中就可以促使学生们在目标和任务的驱动下学习. 因为有学习任务和目标的提示和指引，在学习的过程中就可以对学生们形成有利的刺激，让学生们的学习变得有目的，避免学习的盲目性.

学生们在目标的指引下学习，也能更好地理解教师的授课内容安排，可以更加连贯地理解内容之间的衔接和过渡. 现实的教学中，很多教师在上课开始之后，直接就说我们今天学习什么内容，比如说我们今天学习数轴，数轴是这节课的标题，但这一节具体讲了些什么内容，如果教师不先宣布教学目标的话，接下来就开始讲课，可能到下课，也有很多学生不知道这节课的重点是什么，到底要掌握一些什么内容才算过关，这样给学生的感觉是会很笼统的，也会觉得比较盲目. 因此，教师在上课之间要详细说明这节课具体要学习的是哪些内容，那将会大大提高课堂的效率.

三、教学方法要适应目标教学的过程

目标教学的过程是以目标为导向的，但也还需要依赖一定的教学方法. 教学方法并不能随便用，要达到好的教学效果，就要采取适当的教学方法. 教学方法受特定的课程内容所制约的，教学方法是一种引导和调节教学过程的规范体系. 它不但是一种教法，还是一种学法. 在目标教学的引导下，围绕教学目标，教师可以选择讲授的方法，还可以选择让学生们自主学习的方法，目标教学法是一种比较容易选择教学方法的学习方式. 教师可以根据教学目标把每一个知识点讲清楚，学生也可以根据教学目标进行学习和探究性的自主学习. 课堂中教师调配得好，就可以实现讲授和学生探究相结合的理想的授课方式. 不但能把知识传达清楚，还可以培养学生们自学的能力.

比如在学习数轴的时候，因为这节课的内容比较简单，可以让学生们先看书，让他们来回答什么是数轴，数轴的三要素是什么. 也可以教师先讲授什么是数轴，然后让学生们自主学习探究后来回答数轴的三要素. 老师的讲授和学生的自主学习可以很自由地结合. 无论用什么样的方法，都是围绕教学目标而进行的，达到目标就可以说这节课有效率.

四、以课堂目标来检测学生们对知识的掌握程度

上完一节课，学生们对知识的掌握程度一般来说可以通过练习的形式来反馈，但其实也可以用一种更加直接的方式，就是根据教学目标来检测学生们对是否已经掌握本节课所学习的知识. 比如可以通过提问的方式，用教学目标中具体的内容来进行提问，学生们可以答出来的话，那么这节课的目标就算是达成了. 如果有些学生没有很好地完成学习的任务，那么对照着教学目标，他也可以很清楚地知道自己还有哪一点是不明白的，这样也方便学生进行复习或寻求其他同学的帮助. 学生对自己的学习效果和学习情况也可以有个清楚的了解. 这些都是通过教学目标才能体现出来的.

综上所述，让目标贯穿课堂的全部，有了具体的课堂教学目标可以更好地组织上课内容和上课过程. 这样无论是教师还是学生，在教与学的过程中都有了明确的方向，师生们有了共同的目标，课堂也将更加和谐顺利地进行，真正提高课堂的效率.

【参考文献】

[1]康霞.科学合理地设计初中数学课时教学目标，云南教育，2012.5.

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据介绍，黄瓜源自喜马拉雅山脉南麓，本是印度境内土生土长的植物。野生黄瓜果实和植株都比较矮小，果实极苦，原本在印度被作为草药使用。经过人类的驯化，黄瓜果实和叶片都变大了，果实也失去了苦味，由一种草药变成了品种多样的可口蔬菜，如今在世界范围内广泛种植。在科研上，黄瓜常被用来作为研究植物性别决定、维管束形成的重要模式系统。

科研团队通过对115 个黄瓜品系重测序和1 个野生黄瓜从头（de novo）测序共发现了330多万个单核苷酸多态性位点（SNPs）、33万多个小插入和删除（small insertion and deletions）和594 个获得/缺失变异（PAVs）。基于这些数据，研究人员构建了1 个单核苷酸分辨率的黄瓜遗传变异图谱。

所挑选的115 个黄瓜品系分为印度类群、欧亚类群、东亚类群和西双版纳类群等4大类，其中印度类群主要来自于野生变种，而其余3 个品种均来自栽培变种。通过比较分析发现，印度类群遗传多样性远远超过其它3 个类群。这一结果证实了印度是黄瓜的发源地，也意味着野生资源中尚有很多待挖掘的基因资源。

科研团队还对3 种果蔬（黄瓜、西瓜和番茄）和3 种谷物（大米、玉米和大豆）的驯化过程进行了比较研究，结果发现在驯化过程中，果蔬比谷物的遗传多样性下降趋势更大，这就解释了为何经驯化的黄瓜群体比谷物要小得多。研究人员推断果蔬在进化过程中的“瓶颈期”相对要更窄些。

研究发现，黄瓜基因组中有100多个区域受到了驯化选择，包含2000多个基因。其中7 个区域包括控制叶片和果实大小的基因，果实失去苦味的关键基因已经明确地定位在染色体5上包含67 个基因的一个区域里，为下一步克隆这一重要蔬菜驯化基因打下了基础。

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关键词 硒 表观遗传修饰 表观标志物抑制剂 抗癌药 开发

中图分类号：R979.1 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）03-0075-04

Selenium compounds ― looking forward to be developed as epigenetic targeting selenium-containing anti-tumor drugs*

ZHU Huiqiu1**， HUA Yan1， WANG Mingli2***

（1. Anhui Huaxin Pharmaceutical Co. Ltd.， Hefei 230000， China； 2. Anhui Medical University， HeFei 230032， China）

ABSTRACT Selenium compounds can produce an intervention effect on the abnormality of epigenetic modification and then repress the occurrence and metastasis of tumor. They can be used as the inhibitors of some tumor specific epigenetic markers and expected to be developed as a new type of epigenetic targeting selenium-containing anti-tumor drugs.

KEy WORDS selenium； epigenetic modification； inhibitors of epigenetic markers； anti-cancer drugs； development

硒最重要的生物学功能是抗癌，并以多种机制发挥其抗癌作用。近年来的研究发现，硒又可对表观遗传学调控机制异化产生干预影响，特别是对在肿瘤发生机制中的特异性靶点进行干预，进而阻抑肿瘤的发生及转移。硒化物是某些肿瘤特异性表观标志物有效的抑制剂。硒的这个功能不仅对临床肿瘤诊断、治疗、预防具有现实意义，更为“含硒表观靶向抗癌药物”开发提供了科学依据。“含硒表观靶向抗癌药物”是期待开发的新型抗癌药。现就近些年在这些方面的相关研究作一简要介绍。

1 表观遗传学

什么是表观遗传学？从孟德尔遗传规律讲，亲代（一代）把遗传信息传递给子代（二代），主要由携带遗传信息的脱氧核糖核酸（DNA）分子中碱基的排列顺序（即碱基序列）来决定，并在细胞核内遗传。但人们在研究中发现，在DNA碱基序列以外还有一套调控机制，包括 DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA等，它们在不涉及改变DNA碱基序列的情况下，影响转录活性并调控基因的表达，改变机体的性状，并且是一种可以预和逆转的遗传机制。这种非孟德尔遗传现象，称作表观遗传学[1-2]。

2 硒对表观遗传修饰异常产生干预及逆D作用

肿瘤发生发展的主要生物学原因是原癌基因活化和抑癌基因失活[3]。研究显示，DNA甲基化水平同这些基因的表达密切相关。通常情况下，甲基化水平同基因表达呈负相关，甲基化程度越高，基因表达活性越低，甲基化程度越低，基因表达越活跃[4]。

DNA甲基化主要表现为基因组整体甲基化水平降低和局部CpG岛[在哺乳动物中富含胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸的一段DNA称为CpG岛]甲基化程度的异常升高，人类基因组的甲基化主要发生在CpG岛[5]。

研究表明，实体瘤普遍存在基因组广泛低甲基化现象，低甲基化使原癌基因活化，癌细胞异常增殖；低甲基化还使肿瘤转移增加，例如胃癌的甲基化水平越低，癌细胞浸润、转移的倾向越明显[6]。

CpG岛的甲基化程度异常升高，会导致某些抑癌基因表达沉默，进而参与肿瘤的发生发展。在正常情况下，CpG岛为非甲基化。当肿瘤抑癌基因的启动子区域（CpG岛）过度甲基化，就会使抑癌基因的表达沉默。其间DNA甲基转移酶（DNMT）家族中的DNMT1发挥着重要的调控作用，它的高表达导致抑癌基因在CpG岛失活。所以，CpG岛高甲基化成了多种肿瘤特异性表观标志物，已成为临床多种肿瘤早期诊断的依据和指标[7]。

近年来，作为表观遗传学调控机制之一的组蛋白修饰在肿瘤研究领域受到越来越多的关注。组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）共同调控，而编码HAT或HDAC的基因如果发生染色体易位、扩增等突变会导致某些肿瘤的发生。

可见，DNA甲基化和组蛋白乙酰化等表观遗传修饰异常是肿瘤发生的另外一个机制。而近年研究发现，硒通过靶向干预可逆转甲基化和乙酰化异常的过程，从而抑制肿瘤的发生及转移。硒化物成了潜在的治癌新药物，是亟待开发、临床应用前景可观的“含硒表观靶向抗癌药物”。

2.1 硒对DNA甲基化产生干预作用

研究表明，膳食硒通过干预表观遗传过程显示出其抗癌潜力，膳食缺硒时组织呈现整体低甲基化[8]。Davis等[9]早些时候研究发现，给大鼠喂食缺硒膳食，其肝脏和结肠都出现显著DNA低甲基化，而经硒处理的人结肠癌细胞株Caco-2 DNA甲基化水平显著高于未经硒处理的对照组，据此研究者认为，膳食缺硒会增加肝脏和结肠肿瘤的发生。Remely等[8]研究表明，膳食硒营养缺乏会引起动物组织和人体结肠癌DNA低甲基化。我国学者徐世文等[4]通过实验也发现，饲料硒缺乏可导致鸡肌肉组织 DNA甲基化水平降低。硒对DNMT有抑制作用，缺硒会导致DNMT活性增加，使原癌基因活化，引起结肠癌等多种肿瘤发生。保持硒等营养素均衡摄入，有利于维持DNA甲基化正常水平及抑制DNMT活性[6]。

CpG岛DNMT1的高表达是使抑癌基因失活的重要机制。抑制DNMT1靶酶活性，使失活的抑癌基因复活，是肿瘤治疗中探索的新途径。硒在多种肿瘤中有去甲基化的生物学功能，能诱导失活的抑癌基因重新活化和表达[3]。研究发现，硒可以直接干预DNA甲基化，抑制腺癌细胞株DNMT的高表达[8]。膳食硒干预DNA甲基化的方式之一是通过去甲基化过程来调节DNMT1活性的；研究还证实，亚硒酸钠和苯甲基氰酸硒（BSC）、1，4-苯双（亚甲基）氰酸硒（p-XSC）两种合成硒化物对人大肠癌细胞核提取物中DNMT的活性都有抑制作用[10]。

各方面的研究验证，硒对DNA甲基化产生干预影响，是靶酶DNMT有效的抑制剂。

2.2 硒干预影响组蛋白的乙酰化

近年来，国内外学者研究发现，组蛋白去乙酰化酶与肿瘤的发生密切相关。HDACs家族中的HDAC1高表达可明显增加肿瘤细胞的增殖能力。在食管鳞癌、前列腺癌等多种肿瘤中均发现HDAC的高表达，靶酶HDAC已成为首选的攻击靶点。

目前，人们通过体内、体外的研究鉴定出了硒、丁酸盐、曲古抑菌素A（TSA）等一些HDAC的抑制剂，这些抑制剂可在体外诱导多种肿瘤细胞的生长停滞、分化或凋亡[2]。Somech等[11]通过临床试验表明，HDAC抑制剂对人体白血病及实体瘤进行治疗，表现出明显的抗肿瘤增殖效果，研究者认为，各类HDAC抑制剂是另一类新型抗癌药物、“癌症治疗的新工具”。

Xiang等[12]的研究证明，硒可以通过下调DNMT和抑制HDAC活性，活化人前列腺癌LNCaP细胞系中因高甲基化沉默的基因GSTP1， APC和CSR1。这些基因是具有保护免受氧化损伤的抗癌活性物质、化学致癌物解毒剂或肿瘤抑制剂。

甲基硒酸（MSA）是近年来新研制成的一种人工低分子量有机硒化合物，是很具潜力的抗癌制剂。Kassam等[13]通过对弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系（DLBCL）w外研究首次发现，MSA可以抑制该细胞系HDAC的活性。研究者认为，有关MSA抑制HDAC活性的作用以前从未报道过，从而为人们提供了硒元素一种新的机制，MSA是日后临床试验中可以使用的硒化物。

我国科研人员胡琛霏[2]通过蛋白质免疫印迹的方法，检测到MSA可抑制食管鳞癌细胞系HDAC的活性，降低HDACl和HDAC2的蛋白表达，引起细胞内组蛋白乙酰化水平显著升高；同时，还检测到硒甲硫氨酸（SLM）对食管鳞癌细胞系KYSEl50细胞和MCF7细胞的作用，在SLM处理细胞24 h后，细胞中组蛋白去乙酰化酶的活性也显著降低。

这些年，越来越多的含硒组蛋白去乙酰化酶抑制剂被发现和验证。亚硒酸钠、酮C甲基硒丁酸盐（KMSB）、甲基硒代半胱氨酸（MSC）、甲基硒丙酮酸（MSP）等硒化物都可以抑制HDAC活性，提高组蛋白乙酰化水平，作为潜在的HDAC抑制剂，发挥其抗肿瘤的作用[14]。Fernandes 等[15]介绍，KMSB 和 MSP在体外作为HDAC的竞争性抑制剂发挥抗癌作用；还报道，合成的SAHA含硒类似物（5-苯甲酰戊氰硒）二硒醚和5-苯甲酰戊氰硒对不同肺癌细胞株HDAC抑制效果比SAHA更好。SAHA是氧肟酸类HDAC抑制剂，是目前在临床上以皮肤T淋巴细胞瘤（CTCL）为适应症而广泛应用的表观靶向抗癌药物。这也提示，含硒类抑制剂对靶酶HDAC抑制效果优于无硒类抑制剂。

为何上述各种硒化物都可靶向抑制DNMT和HDAC活性，研究发现不管其结构如何改变，硒都是这些化合物生物活性的中心元素，发挥着关键作用，硒的这一生物学功能对含硒抗癌药物的开发具有重要的指导意义[16]。

2.3 硒对非编码RNA调控机制产生干预效应

表观遗传学的一个重要调控机制是非编码RNA。非编码RNA是指不能翻译为蛋白质的RNA分子。近年来，非编码RNA一族中的微小RNA-200（miR-200）受到人们的高度关注。研究发现，miR-200家族中的成员微小RNA-200a（miR-200a）与肿瘤的发生发展关系密切，miR-200a在肿瘤组织中呈现明显低表达。因此，miR-200a的表达下调是肿瘤发生的重要因素之一，miR-200a也成了肿瘤特异性表观标志物[17]。

胡琛霏[2]通过TaqMan芯片，检测了MSA处理食管鳞癌细胞后细胞中微小RNA（miRNA）的变化情况，发现MSA可以上调细胞中miR-200a 的表达水平，miR-200a 表达升高后，负性调控Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）的表达，使Keap1蛋白水平下降，上调转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）蛋白水平并提高其转录活性（Nrf2活性受其细胞质接头蛋白Keap1的调控），从而活化Keap1-Nrf2信号通路。而Keap1-Nrf2信号通路在抗氧化、预防肿瘤发生等诸多方面有重要作用[18]。

体外研究显示[19] ，人脑膜瘤组织中miR-200a表达明显低于正常组织，β-循环蛋白（β-catenin）和其下游靶基因细胞周期蛋白D1表达显著增高，二者和miR-200a呈现负相关，上调miR-200a可降低β-catenin的表达，进而阻断Wnt/β-catenin信号传导通路来抑制脑膜瘤的生长。胡琛霏课题组前期研究也发现MSA可以抑制食管鳞癌细胞系中β-catenin的表达[2] 。研究已证实，Wnt/β-catenin信号通路的激活和高表达可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及抑制肿瘤细胞的凋亡[20]。

由此可见，MSA可能介导、调控着miR-200a表达及参与复杂的分子调控网络，从而抑制肿瘤发生及转移。

3 展望

加强硒与表观遗传学之间关联的研究，有着重要的生物医学意义。它有可能解释硒化学抗肿瘤的新机制，从理论上证明硒元素可能具有表观遗传学的效应[21] 。综上所述，硒在肿瘤形成中对表观遗传修饰异常产生干预影响，靶向抑制肿瘤特异性表观标志物，逆转表观遗传修饰发生异化过程，使我们认识了硒化学抗癌的新机制、新作用，硒化物是潜在开发的新型靶向抗癌药物。Fernandes 等[15]指出，硒化物都是癌症治疗药。目前，非表观类含硒靶向抗癌药如硒唑呋喃、依布硒啉、乙烷硒啉等早已进入临床研究[16]，展示出很有希望的临床应用前景。而含硒表观靶向抗癌药物是亟待开发的抗癌药“富矿”，加快开发含硒表观靶向抗癌药物，可为临床肿瘤治疗增加一种“新的工具”，为癌症患者战胜病魔增添一份新的希望。人们热切期盼“含硒表观分子靶向抗癌药物”早日问世。

致谢：本课题研究得到华中科技大学徐辉碧、黄开勋两位教授和安徽医科大学张文昌硕士的支持，在此表示衷心感谢。

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篇6

    心肌缺血时,有氧代谢发生障碍,葡萄糖利用减少,脂肪酸利用增多,使氧利用率下降,心脏供能不足;同时,无氧代谢导致的酸性代谢产物增加,引起细胞内酸中毒。此外,心肌缺血还能引起氧自由基及钙离子超载,诱导心肌细胞凋亡,导致严重的临床症状。因此,改善能量代谢,清除自由基,减轻钙超载,抵抗细胞凋亡,实现心肌保护作用成为改善心肌缺血的重要途径[10]。研究表明,针灸在实现心肌保护方面具有自身的优势。一方面,针灸可通过改善能量代谢,实现心肌保护。心肌缺血时,能量代谢相关酶发生改变,电针能提高心肌组织糖原、琥珀酸脱氢酶和三磷酸腺苷酶的活性,纠正心肌相关酶的异常,增强能量代谢,改善心肌缺血。另一方面,针灸可减少自由基,缓解心肌缺血症状。热休克蛋白(HSP)属应激蛋白,能减少氧自由基释放,减轻心肌缺血损伤,从而保护机体[11]。研究证明电针“内关”穴可以增强缺血心肌细胞HSP90和HSP70mRNA表达,以减少氧自由基的释放,从而缓解家兔心肌缺血症状[12-13];而且,针刺“内关”穴能抑制细胞内Ca2+超载,实现心肌细胞保护,电针“内关”通过上调心肌钙泵和钠泵基因表达,增强钙泵和钠泵活性,降低心肌细胞内Ca2+含量,从而达到抑制钙超载,实现对心肌组织的保护作用,表现为促进心电活动、改善心肌组织形态和超微结构[14]。大量研究表明,针刺可以调控凋亡基因的表达水平,延长细胞周期,减少细胞凋亡,保护缺血心肌细胞。有研究指出电针可以调节诱导细胞凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2在家兔缺血心肌中的表达,即抑制凋亡基因Bax和促进抗凋亡基因Bcl-2的表达,抑制心肌细胞凋亡,从而达到保护心肌细胞的作用[15]。c-fos基因是一种原癌基因,参与调节体内许多过程,如细胞周期、细胞分化、肿瘤转化及细胞凋亡等,正常情况下细胞内c-fos表达呈低水平状态,心肌缺血可激活c-fos基因的表达从而启动心肌细胞凋亡。研究表明,电针可降低c-fos基因表达,改善急性心肌缺血的过程[16-17]。所以不难看出,针灸能通过多种途径实现心肌细胞保护。总之,针灸干预心肌缺血的疗效和机制已初步得到证实和揭示,但尚未完全阐明,在一定程度影响了针灸治疗心肌缺血在临床的应用和推广。因此,需要引进新的理念、新的方法技术进行深入探索。

    2表观遗传调控在针灸治疗心肌缺血的机制研究中的应用

    目前主要涉及的表观遗传调控包括CG辅酶甲基化、组蛋白转录后修饰、RNA干扰等,具体可分为DNA甲基化、蛋白质共价修饰、染色质重塑、微小RNA调控4个方面[18-19]。越来越多的研究表明,表观遗传调控在心肌缺血过程中扮演重要角色,参与了疾病的发生、发展及预后的全部过程,因此,我们探讨从该角度开展针灸治疗心肌缺血机制研究的新方向。2.1表观遗传调控与心肌缺血的相关性以动物和人为载体的研究都表明,心肌缺血与表观遗传调控密切相关。表观遗传标记物在心肌缺血发生发展过程中的变化,反映出DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑及微小RNA是调控心肌缺血的关键因素。大鼠神经甲基化系统在心肌缺血中受到抑制,可导致缺血部位的儿茶酚胺浓度升高,作用于心脏,使心率加快,收缩力增强,心输出量增加;怀孕期间的营养不良会改变DNA甲基化,增加成年后患心血管病的风险,且DNA甲基化在6个特殊位点对产前环境很敏感,可能提高妇女患心肌缺血的风险[20-22]。同时,有研究认为,组蛋白H3赖氨酸4甲基化(H3K4me)转移酶和它们的辅助因子是调控胚胎发育及细胞特异性的重要因素[23];而Smyd2作为一种组蛋白甲基转移酶,介导H3K4甲基化,改变心肌细胞组蛋白甲基化修饰和心肌细胞靶基因的转录调控,促进心肌细胞分化和发育[24-25]。最新研究报道组蛋白H3赖氨酸27去甲基化酶赖氨酸K特异性脱甲基6A(UTX)可以促进心肌细胞生长发育,UTX基因敲除小鼠因心脏发育障碍死于胚胎发育早期[26]。除甲基化之外,组蛋白的乙酰化在心肌缺血中的作用受到广泛关注。发生心肌缺血后,心肌细胞蛋白发生了去乙酰化,抑制去乙酰化则能减少其损伤,组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂通过组蛋白去乙酰化酶Sirt1介导,后者含量增加,能有效促进心肌缺血耐受,诱导心肌保护[27-29]。HDAC-7抑制剂可与缺氧诱导因子(HIF)结合影响基因转录,增强HIF活性,从而促进心脏血管新生[30-31]。同时,HDAC抑制剂曲古柳菌素A可降低缺血心肌凋亡基因Caspase3表达,抑制心肌细胞凋亡,也可促进干细胞向心肌细胞分化,介导心肌细胞再生[32-33]。进一步研究发现,组蛋白H3赖氨酸9乙酰化(H3K9ace)与缺血心肌保护密切相关,通过调节血管再生因子、细胞凋亡因子和HSP基因表达达到抗缺血性损伤效果。其中VEGF、Sirt1与组蛋白赖氨酸乙酰化关系最为密切[34-39]。除组蛋白修饰之外,microRNA上调或下调通过作用于靶基因激活相应的分子信号通路参与心肌保护,调控心肌缺血损伤。染色体重塑也被证明与心肌细胞生长发育相关[40-41]。

    总之,DNA甲基化、组蛋白修饰、微小RNA等表观遗传调控在心肌缺血过程中具有重要意义。2.2表观遗传调控与针灸防治心肌缺血机制研究从上述表观遗传调控与心肌缺血的相关研究成果可知,表观遗传调控介导细胞凋亡、心肌细胞保护和心脏血管再生,在心肌缺血发生发展过程中具有特殊地位,是目前医学研究的热点。从该角度切入进行针灸防治心肌缺血研究,必然是今后研究的一个新方向。同时,结合表观遗传调控自身特性,即强调除了DNA和RNA序列以外,还有许多调控基因信息,虽然本身不改变基因的序列,但其通过基因修饰、蛋白质与蛋白质、DNA和其它分子的相互作用,多层次、多途径影响和调节遗传基因的功能和特性,这些调节同时存在可逆性。这与针灸作用整体性、综合性、双向性、多靶点的特点具有一定的相似性。因此,将表观遗传学的理念和技术引入针灸抗心肌缺血机制研究,乃至整个针灸研究领域,都具有较强的可行性。结合针灸自身优势特点,以及其抗心肌缺血研究现状,融合上述表观遗传调控在心肌缺血发生发展过程的作用特点,我们认为,今后的研究可从两个方面进行,一是针灸对心肌缺血疾病的预防。治未病思想历来是中医理论的核心,早在《黄帝内经》中就强调“不治已病治未病”。现代研究证实,针刺具有提高机体机能的作用,如实施心肌缺血再灌注手术前针灸“内关”穴,能提高心肌细胞耐缺血能力,延长动物生存期,这无疑为心肌缺血患者赢得了宝贵的抢救时间[42]。而表观遗传调控与之密切相关,HDAC直接参与耐缺血,如果以此进行深入研究,一旦得以证实,将为临床进行再通手术前实施针灸干预的应用提供科学依据[43]。另一方面,则是在现有的研究基础上,继续深入探讨针灸抗心脏缺血机制研究。根据心肌缺血的不同阶段,有重点地开展相应研究。如急性期、亚急性期,主要围绕针灸促心肌细胞存活、抑制细胞凋亡,以及改善能量代谢,从而实现心肌细胞保护进行研究。针灸能有效调控心肌组织中Sirt1、HSP70、Caspase3、c-fos、Bcl-2等物质的表达,实现保护心肌目的,但其背后的调控机制如何,尚未得到证明。研究表明,HDAC能有效调控Caspase3表达,H3K9ace能影响HSP70水平等,从这些角度深入揭示针灸促心肌保护机制,将为针灸的更广泛应用提供基础。在慢性期,则主要围绕促进血管新生开展。已有的研究证实针灸能促缺血区域的血管新生,且与VEGF密切相关,但调控VEGF表达发生改变的机制并未得到证明。肿瘤存在大量的新生血管,研究中发现,H3K9ace在此过程中扮演重要角色,我们可以推测,在针灸促VEGF表达,介导血管新生过程中,H3K9ace可能具有重要意义。同时,也可以充分结合针灸抗心肌缺血机制研究成果,着重筛选出相应优势靶点,进行新药开发,或许可能成为新药开发的新靶点。除此之外,还可进行相应的拓展。研究表明,心脏中存在心肌干细胞,在某些影响因素干预下,能不断增殖、分化形成新的心肌干细胞。这个过程中表观遗传调控发挥重要作用[44]。针灸有促体内干细胞增殖、分化的能力,比如促脑内神经发生,实现脑保护[44-45]。那么针灸是否也能促进心脏干细胞增殖、分化,实现心肌保护?从表观遗传学的角度研究,也将成为我们关注的方向。

篇7

【关键词】 辅助生殖技术；妊娠早期；染色体异常

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2017.04.042

近年来， 助生殖技术（assisted reproductive technology， ART）V泛用于治疗不孕问题， 相关研究显示[1]， 发达国家每年有≥3%的辅助生殖技术出生儿， 辅助生殖技术为不孕家庭带来了福音。自然流产是一种人类优胜劣汰的自然选择结果， 发生自然流产的几率为15%， 在全部流产中占75%的比例， 导致自然流产的主要原因是染色体异常（夫妻染色体异常与胚胎染色体异常）。近30年来， 辅助生殖技术得到了高速发展， 但有相关报道指出[2， 3]， 辅助生殖技术致早期妊娠流产率较高， 为此， 本院对400例流产患者进行了绒毛细胞分离和染色体分析， 现做如下报告。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2015年1月～2016年1月本院收治的孕早期流产患者400例， 将其中320例自然妊娠孕早期自然流产患者作为对照组， 80例因辅助生殖技术致妊娠的孕早期自然流产患者作为观察组。观察组患者年龄22～43岁， 平均年龄（33.6±3.3）岁， 孕周7～12周；对照组患者年龄25～44岁， 平均年龄（31.2±5.2）岁， 孕周7～12周。两组患者一般资料比较， 差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。在告知两组患者实验过程及目的后， 均表示愿意参加实验并签署知情同意书， 实验获得了医院伦理委员会批准同意。

1. 2 方法 先提取绒毛细胞， 对流产的患者进行子宫清宫术， 备好负压吸引管， 清宫时严格遵守无菌操作规程， 采用负压吸引管利用负压原理， 吸附绒毛组织5～20 mg。将这5～20 mg绒毛组织作为标本， 放入生理盐水中浸泡， 并立即送入中心实验室备检。标本送达后， 立对绒毛组织标本进行分离培养， 采用双抗清洗法清洗标本， 去污物（血块、蜕膜组织）， 保留典型的绒毛组织约10 mg， 将清洗后的标本放入离心管置入离心机进行离心操作， 离心结束后观察管内分层， 去除上层的液体， 在下层滴入生物酶（胶原酶、胰酶）， 将标本放入保温箱， 仔细观察并记录， 待出现绒毛散开现象时， 立即滴入母牛血清， 采用电子显微镜观察绒毛细胞形态。当视野中出现成片状细胞， 将标本放入新鲜的培养液中并滴入生物碱（秋水仙素）， 再次放置在保温箱内， 放置时间为4 h， 然后去掉上层清夜， 将标本置入水浴箱， 2 h后取出， 将标本放入离心机再次离心， 将离心后的标本去上清液制成悬液， 通过莱卡显微镜进行观察， 选择两名医生同时读标本玻片， 每例计算20个分裂象， 分析2个核型（嵌合体加倍计数）。

1. 3 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P

2 结果

观察组患者中

3 讨论

辅助生殖技术是治疗不孕不育的一种手段， 有体外受精-胚胎移植（IVF-ET）、卵子体外成熟（IVM）、人工受精（AI） 等形式[4]。根据WTO的相关数据显示[5-9]， 我国的不孕症发病率高达15%， 传统的治疗远远不能满足日益增长的不孕不育患者的治疗需要。

自然流产是妊娠过程中常见的并发症， 而染色体异常则是自然流产的主要原因之一， 包括夫妻染色体异常和胚胎染色体异常[10-12]。夫妇染色体异常常见的有平衡易位和罗伯逊易位， 胚胎染色体异常常见的有三倍体、多倍体及染色体平衡易位、嵌合体等。与自然流产相比， 辅助生殖技术妊娠不增加妊娠早期流产率， 但是与流产孕妇的年龄存在着一定的关系。本研究通过对流产的患者进行子宫清宫术， 清宫时采用负压吸引管利用负压原理， 取出绒毛组织5～20 mg作为实验标本， 将其放入生理盐水中浸泡， 然后对绒毛组织标本进行分离培养， 采用双抗清洗法清洗标本， 去除血块及蜕膜组织， 保留典型的绒毛组织， 进行离心操作， 观察标本现象。发现自然妊娠孕早期自然流产患者的绒毛细胞染色体异常率与辅助生殖技术致妊娠早期自然流产患者的绒毛细胞染色体异常率无明显差异（P>0.05）， 但是不同年龄间差异具有统计学意义（P

相关研究显示[2]， 辅助生殖技术能影响表观遗传（印记基因）的调控， 影响胚胎植入和胎儿生长等， 表观遗传学方面的异常能使胚胎停育， 基因印记缺陷会导致早期妊娠的不稳定易发生流产[1]。控制性招促排卵过程中， 大剂量促性腺激素的使用， 可能是引起配子及胚

胎印记异常， 辅助生殖技术实施时间正处于印迹重建的窗口期， 运用于当中的操作会对配子及胚胎的甲基化状态发生一定的影响。

本文研究结果显示， 观察组患者中

综上所述， 辅助生殖技术并不增加妊娠早期流产胚胎染色体异常的发生率， 但绒毛细胞染色体异常与育龄妇女的年龄有明显的关系， 年纪≥40岁的患者采用辅助生殖技术妊娠更容易导致妊娠早期流产。

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篇8

【关键词】 丙戊酸钠 性粒细胞白血病 K562细胞 增殖 凋亡

of sodium valproate（VPA） on the proliferation of chronic myeloid leukemia cell line K562，and to explore possible mechanisms． 【Methods】 K562 cells were treated with VPA． Cell proliferation was determined by CCK-8 assay． Cell apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry （FCM）． 【Results】 VPA inhibited the proliferation of K562 cells in concentration- and time-dependent manners． The apoptosis rate was significantly higher in the cells treated with VPA than in untreated cells［（11．47％±0．25％）vs（4．77％±0．40％）， P ＜ 0．05］． After treatment of VPA， cell cycle was arrested obviously at G0／G1 phase （P ＜ 0．05）． 【Conclusions】 VPA could induce G0／G1 phase arrest， inhibit the proliferation and induce the apoptosis of K562 cells in vitro．

Key words： sodium valproate； chronic myeloid leukemia； K562 cell； proliferation； apoptosis

近年来研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors，HDACI）可诱导多种肿瘤细胞生长阻滞、分化及凋亡［1-3］。丙戊酸钠（sodium valproate，VPA）是一种传统的抗癫痫药物，其在抗癫痫有效治疗浓度时也表现出很强的HDACI活性［4］；慢性粒细胞白血病是临床上一种比较常见的恶性血液病，t（9；22）形成Ph染色体是其特征性细胞遗传学改变，由此形成的Bcr／Abl融合基因是其发病的分子机制和新药物（如格列卫）作用靶点。尽管格列卫取得了极好的疗效，但临床仍然观察到耐药的情况［5］。所以为了克服耐药，临床上迫切需要开发新一代作用于Bcr／Abl融合基因的靶向药物或其他不同机制的抗肿瘤药物。本实验探讨了VPA对慢性粒细胞白血病急变期细胞株K562细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。

1 材料和方法

1．1 主要试剂

VPA购自法国赛诺菲安万特公司。1640培养基为Gibco公司产品，胎牛血清（fetal calf serium， FCS） 购自杭州四季青生物公司。CCK-8试剂盒为碧云天公司产品，AnnexinV-FITC 凋亡和细胞周期分析试剂盒为Becton Dickinson 公司产品。K562细胞株由中山大学肿瘤研究所提供。

1．2 方 法

1．2．1 细胞培养

K562细胞用含100 g／L灭活FCS的RPMI 1640培养液重悬后，置于37 ℃、体积分数5％ CO2饱和湿度培养箱中培养，每2 ～ 3天换液1次。

1．2．2 CCK-8方法分析细胞增殖活性

取对数生长期的K562细胞，调整细胞终密度为1 × 105／mL 接种于96 孔板，分别加入0．5、1、2、5、10 和25 mmol／L的VPA，每孔总体积为200 μL，另设空白孔和对照孔，每个浓度设3个复孔，于加药后72 h检测，每孔避光加入20 ?滋L CCK-8，继续孵育2 h后用酶标仪检测A值，波长450 nm。实验重复3次，取平均值。以药物浓度为横坐标，生长抑制率为纵坐标，绘制浓度-生长抑制率曲线。生长抑制率＝［（A对照－A空白）－（A实验－A空白）］／（A对照－A空白） ×100％。另外，通过上述试验结果计算出IC50值，然后以接近IC50值的浓度的VPA处理K562细胞，分别于加药后0，12，24，36，48，60和72 h检测，并计算出生长抑制率，以分析作用时间对细胞增殖的影响。

1．2．3 流式细胞仪检测细胞周期

取对数生长期的K562细胞以5 × 106／mL种于6孔板中，分为对照组、VPA（2 mmol／L）组，加药48 h后，收集各组细胞，PBS洗2次，离心弃上清，700 mL／L冷乙醇4 ℃固定过夜后。离心弃去固定液，3 mL PBS重悬5 min，400目的筛网过滤1次，离心5 min，弃去PBS。用1 mL PI染液染色，4 ℃避光30 min。上机检测，进行结果分析。

1．2．4 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期的K562细胞以5 × 106／mL种于6孔板中，分为对照组、VPA（2 mmol／L）组，加药48 h后，收集各组细胞，PBS洗2次，离心弃上清，悬溶于结合缓冲液中，调整细胞浓度为1 × 106个／mL。加10 μL异硫氰酸荧光素（ FTIC） 标记的连接素（Annexin） 和10 μL的20 mg／ L的普匹碘氨（ PI） ，混匀，避光室温孵育10 min。用结合缓冲液洗1次后用Coulter Elite 流式细胞仪（Coulter 公司） 进行分析。Annexin V（－） PI （－） 为活细胞，Annexin V（－） PI （＋） 为机械损伤细胞， Annexin V（＋） PI（－） 为早期凋亡细胞， Annexin V（＋） PI （＋） 为晚期凋亡细胞， 实验中以Annexin V（＋） 作为凋亡细胞。

1．2．5 统计分析

用SPSS 11．5统计软件包进行统计分析，结果用x±s表示，多组间比较进行单因素方差分析，两组间均数比较采用t检验，P ＜ 0．05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2．1 VPA对K562细胞的增殖抑制作用

不同浓度（0．5 ～ 25 mmol／L）的VPA均可抑制K562细胞生长，差异有统计学意义（F＝15．32， P ＜ 0．05）；并且VPA对K562细胞生长的抑制作用在一定浓度范围内呈浓度依赖性（图1）。用接近IC50浓度（2 mmol／L）的VPA处理K562细胞不同时间后，结果显示随着孵育时间延长其生长抑制作用明显增强，差异有统计学意义（F＝103．77， P ＜ 0．05）。这反映VPA对K562细胞生长的抑制作用在一定时间内也具有时间依赖性（图2）。

2．2 流式细胞仪检测K562细胞凋亡

用2 mmol／L的VPA处理K562细胞在48 h后，以Annexin V／PI双标记后通过流式细胞仪检测，结果显示VPA处理组细胞凋亡率高于未处理对照组，差异有统计学意义（t ＝ 24．375， P ＜ 0．05， 表1）。

2．3 流式细胞仪分析K562细胞周期

用2 mmol／L的VPA作用K562细胞48 h后，细胞周期进程被阻滞，G0／G1期细胞明显较未处理组增加（t ＝ 7．561，P ＝ 0．002），而S期细胞较未处理组明显减少（t ＝ 8．70， P ＝ 0．001），差异均有统计学意义（表1， 图3）。

3 讨 论

表观遗传学修饰是基因表达的主要调节方式，包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化和RNA干扰等。表观遗传在转录调控上起着极为重要的作用，组蛋白高乙酰化和DNA启动子序列低甲基化可促进基因表达，而组蛋白去乙酰化和DNA启动子序列高甲基化可抑制基因的表达，这两种机制相互协调，共同实现对基因表达的精细调控［6］。近年来研究表明，表观遗传学改变在肿瘤发生中扮演一个重要角色。肿瘤发生的主要表观遗传学改变是抑制肿瘤生长的基因发生DNA启动子序列过甲基化和染色质中的组蛋白去乙酰化修饰。恶性肿瘤的发生、发展过程中常涉及组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase， HDAC）的异常聚集，引起在细胞发育、分化、凋亡过程中起重要作用的基因表达受抑，导致肿瘤的发生［7］。HDACI可以通过抑制HDAC活性，诱导组蛋白高乙酰化，调节基因表达，从而发挥抗肿瘤效应［8］。目前已有多种HDACI 进入了Ⅰ／Ⅱ期临床试验。VPA是一种传统的抗癫痫药物，毒副作用轻微，长期使用患者耐受性好，其在抗癫痫有效治疗浓度时也表现出很强的HDACI活性，可通过诱导细胞周期停滞、凋亡和分化而抑制肿瘤细胞的生长增殖［4，9］；对肿瘤细胞有选择性细胞毒性，而对正常造血细胞无严重毒性，且与多种化疗药物有协同作用［10］。HDACI的应用标志着一种全新的肿瘤治疗途径，因此研究HDACI 是通过何种机制来发挥抗肿瘤作用有着积极的实际意义。

慢性粒细胞白血病是临床上一种比较常见的恶性血液病，尽管近几年来以Bcr／Abl融合基因的产物P210蛋白作为靶点的新药——伊马替尼（格列卫）取得了极好的临床效果，但是在加速期和急变期患者中仍然观察到了原发性和继发性耐药的现象［5］。所以临床上需要开发新一代作用于P210融合蛋白的靶向药物或其他不同机制的抗肿瘤药物。

本实验结果证实了传统的抗癫痫药物同时也是一种HDACI的VPA对K562细胞的生长具有剂量－时间依赖性的抑制作用；同时2 mmol／L的VPA作用48 h后K562细胞凋亡较对照组增加。这说明VPA可能是通过诱导细胞凋亡来抑制K562细胞增殖的。VPA引起细胞凋亡的具体分子机制现在尚未完全阐明。Caspase-3是凋亡效应分子之一，其可以被多种内外源性凋亡诱导因子激活从而引起细胞发生凋亡。有研究发现VPA可引起多种白血病细胞株发生caspase-3依赖性的凋亡，同时它还可以通过不依赖caspase-3活化的途径引起细胞凋亡［11］。所以我们推测其引起K562细胞凋亡的分子机制也有可能比较复杂，需要进一步研究。

此外，现在发现HDACI对肿瘤细胞具有阻滞周期进程的作用。Sakura等［12］将VPA和SAHA（suberoylanilide hydroxamic acid）这两种HDACI作用于14种淋巴系统肿瘤细胞株后，细胞发生了G1或G2／M阻滞及凋亡，并且与细胞周期调节有关的p53、p21和p27基因出现表达上调。本实验中VPA处理后G0／G1期细胞比例增加，同时S期细胞比例下降。这说明VPA可以使K562细胞周期进程受到阻滞。其分子机制也可能是上调p21WAF1等细胞周期调节基因的表达，而增多的p21WAF1与CDK结合，抑制CDK活性，从而引起细胞周期停滞，最终可能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。

本实验结果表明，VPA能够抑制慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞的生长，并可诱导其凋亡和细胞周期阻滞，这为慢性粒细胞白血病患者的治疗提供了新的途径及一定的理论依据。

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篇9

1.1方法

1.1.1细胞培养及药物处理：MKN1细胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养、传代。实验用对数生长期细胞。细胞培养至60%汇合度时，分别加入2μmol/L或10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR处理液，对照组使用不含5⁃Aza⁃CdR的普通完全培养液。每隔24h换液1次，培养72h后处理细胞用于后续的相关检测。

1.1.2亚硫酸氢盐修饰DNA和BSP反应：采用Blood＆CellCultureDNAMiniKit试剂盒，按说明书步骤提取各组细胞基因组DNA。取500ngDNA按照试剂盒说明进行亚硫酸氢盐修饰及纯化。使未甲基化的胞嘧啶（C）转化成胸腺嘧啶（T），而甲基化的Cm不变。以修饰后基因组DNA为模板，用GoT⁃aqDNA聚合酶进行BNIP3基因启动子扩增。用MethPrimer软件设计甲基化引物，上游：5′⁃TTAAAGTGTTGAGATGAAAGATATG⁃3′，下游：5′⁃AATCCAAATCCAAATATCAAAATAC⁃3′，产物长度为288bp。反应条件为95℃10min，95℃30s、56℃30s、72℃30s进行35个循环，然后72℃延伸10min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，应用胶回收试剂盒回收，纯化目的片段，连接pGEM⁃T载体，4℃孵育过夜。取6μL连接产物转化JM109感受态大肠杆菌，蓝白筛选阳性克隆，送菌液测序。

1.1.3RT⁃PCR检测BNIP3基因表达：采用Axy⁃PrepTotalRNAMiniprepKit试剂盒提取各组细胞总RNA，逆转成cDNA后进行PCR实验，BNIP3引物序列：上游：5′⁃CCACCTCGCTCGCAGACACCAC⁃3′，下游：5′⁃GAGAGCAGCAGAGATGGAAGGAAAAC⁃3′，长度为317bp。作为内参的人β⁃actin引物序列：上游：5′⁃CCAGATCATGTTTGAGACCT⁃3′；下游：5′⁃TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT⁃3′，长度为480bp。扩增反应条件：95℃5min变性，95℃复性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃暂时保存。实验重复3次。产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统（Tanon⁃2500R）拍照及分析表达情况。

1.1.4染色质免疫沉淀：采用ChIP试剂盒按说明书进行如下操作：用1%甲醛PBS交联固定蛋白质－DNA复合物，加入交联终止液5min，2500r/min、4℃离心10min，PBS洗脱2次；加裂解液冰上裂解5min，酶法消化切割至200~1000bp的染色质小片段；之后，染色质与DNMT1特异性抗体及DNA/Pro⁃teinGAgorose4℃颠转过夜，洗脱蛋白/DNA复合物，纯化回收DNA。针对BNIP3启动子区的引物序列：上游：5′⁃CCGCGCCGCCTCCTCCGCCTCAC⁃3′；下游：5′⁃GCTCCGACCTCCGCTTTCCCACCGCC⁃3′。PCR扩增条件：95℃5min，95℃30s，59℃30s，72℃30s，72℃10min，30个循环。产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统（Tanon⁃2500R）拍照及分析表达情况。

1.2统计学分析数据用x±s表示，采用SPSS13.0统计软件，组间比较采用t检验，甲基化率比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1MKN1细胞中BNIP3基因启动子区的甲基化状态

2.1.1BNIP3基因启动子区CpG岛序列分析：在ENSEMBLE上找到BNIP3基因启动子区的原始序列，利用MethPrimer分析，按照“长度超过200bp，GC含量大于50%，CpG出现率（观察值／预测值比例）≥0.6”的参数定义［8］，可以找到BNIP3基因启动子区自转录起始点上游966bp至下游86bp之间长度为1052bp的CpG岛。图1为BSP法拟分析其中长288bp、含14个CpG位点的DN段。

2.1.2BSP结果：以亚硫酸氢盐修饰后的DNA为模板行PCR，将PCR扩增产物连接T载体，转化增菌，PCR扩增鉴定阳性克隆。图2为随机挑取的5个克隆的菌液PCR鉴定结果，在约288bp处可见理想的目的条带。

2.1.3测序结果分析：阳性克隆进一步测序，将亚硫酸氢盐修饰后的序列与原序列进行对比，发现非CpG位点的“C”全部转化为“T”，证明亚硫酸氢盐修饰效果可信。扩增的BNIP3启动子区片段包含有14个CpG位点，与原始BNIP3基因序列比对，各CpG位点甲基化概率分别为100%、80%、100%、100%、80%、100%、100%、100%、80%、100%、100%、80%、100%、100%。见图3及图4。

2.25⁃Aza⁃CdR对MKN1细胞中BNIP3表达的影响采用不同浓度5⁃Aza⁃CdR处理MKN1细胞，作用72h后，对照组、2μmol/L5⁃Aza⁃CdR处理组和10μmol/L5⁃Aza⁃CdR组的BNIP3mRNA相对表达量分别为0.389±0.018，0.515±0.024，0.839±0.014。10μmol/L5⁃Aza⁃CdR组的BNIP3mRNA表达量较对照组明显增加，差异有统计学意义（P<0.05），见图5。

2.35⁃Aza⁃CdR对MKN1细胞中BNIP3基因启动子甲基化的影响10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR处理细胞72h后，BNIP3基因启动子甲基化状态有所逆转（图6），启动子区CpG位点甲基化率（74.2%±9.37%）与对照组（图4）甲基化率（94.3%±19.80%）比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4BNIP3启动子与DNMT1蛋白的结合用ChIP实验检测MKN1细胞中DNMT1与BNIP3启动子区DNA的结合。结果显示，在对照组可以检测到DNMT1与BNIP3启动子区DNA的结合，而10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR处理组与对照组相比DNMT1与BNIP3启动子区DNA的结合明显减少。见图7。

3讨论

DNA甲基化是表观遗传学修饰的重要作用方式之一，指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共价键结合一个甲基基团。越来越多的研究表明，DNA甲基化在癌症的发生机制中扮演重要角色。正常生理条件下，人类基因组中位于启动子区、富含CpG二核苷酸的CpG岛处于非甲基化状态，抑癌基因启动子区CpG岛过度甲基化可诱导基因转录失活、表达沉默。BNIP3是Bcl⁃2家族中BH3⁃only亚家族的成员，具有BH3结构域和跨膜区，属于促凋亡蛋白，通过促进线粒体通透性、转运开放和线粒体的损伤诱导凋亡。Murai等［3］在66%的结直肠癌和49%的胃癌中检测到BNIP3表达缺失。Abe等发现在几乎所有的胰腺癌组织和50%的胰腺癌细胞系中未检测到BNIP3的表达，其失活机制和DNA启动子区高度甲基化相关。

目前，国内关于BNIP3基因的甲基化研究基本都局限于甲基化特异PCR法，此方法的特点是灵敏度高，但只能对引物序列中少量CpG位点进行分析，具有一定的局限性。所以关于肿瘤细胞中BNIP3基因启动子区甲基化的具点还不清楚。BSP克隆测序法具有能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态的优势，是公认的DNA甲基化分析的金标准［7］。本研究利用MethPrimer软件分析了MKN1细胞中BNIP3基因CpG位点分布情况。结果显示，BNIP3基因启动子区自转录起始点上游966bp至下游86bp之间CpG位点分布密集，存在长度为1052bp的CpG岛。本研究中利用BSP克隆测序法对BNIP3基因启动子区中（+21bp~-267bp）长288bp、包含14个CpG位点的DN段进行甲基化水平的检测，甲基化率为80%~100%。因此，首次明确了胃癌MKN1细胞中BNIP3基因启动子区的甲基化位点，并检测到这些CpG位点呈现高度的甲基化。

我们进一步用去甲基化药物处理MKN1细胞，以明确启动子甲基化与BNIP3基因表达的关系。5⁃Aza⁃CdR是一种高效的DNMT抑制剂，它可与DNMT不可逆性结合，具有较强去甲基化作用，使表观遗传学沉默的基因去甲基化，逆转其恶性表型。本研究发现，对照组MKN1细胞中BNIP3表达缺失，10μmol/L的5⁃Aza⁃CdR可诱导BNIP3mRNA表达明显增加，BNIP3基因的启动子区CpG位点甲基化概率较对照组明显下降，提示胃癌MKN1细胞中BNIP3基因表达缺失与启动子区高甲基化关系密切，该区域的CpG位点甲基化在调控基因转录中发挥重要作用。

DNA甲基化是由DNMT催化完成的。DNMT1催化甲基基团与胞嘧啶环的结合，维持DNA复制过程中的甲基化模式，在表观遗传修饰中发挥重要作用，其活性及表达水平与肿瘤发生密切相关。近年研究报道，DNMT1通过与靶基因启动子DNA序列结合，介导DNA甲基化，调节基因表达［12，13］。我们推测DNMT1是否参与介导BNIP3发生DNA甲基化的机制。我们利用ChIP技术检测DNMT1与BNIP3启动子区DNA的结合状态。结果显示，MKN1细胞中DNMT1能与BNIP3启动子区DNA结合。5⁃Aza⁃CdR能够明显抑制DNMT1与BNIP3启动子的结合。提示5⁃Aza⁃CdR降低DNMT1与BNIP3启动子区结合能力，部分逆转BNIP3的甲基化状态，是导致MKN1细胞中BNIP3表达上调的重要原因。

篇10

[关键词]桔梗；同源四倍体；DNA甲基化；MSAP

[Abstract]In order to investigate the epigenetic variations between diploid and autotetraploid of Platycodon grandiflorus.the diploid buds of P. grandiflorus were soaked in the mixture of different concentration colchicines and 0.002 g・mL-1 dimethyl sulphoxide （DMSO）.The identification of autotetraploid plants were based on morphological characteristics，chromosome number and flow cytometry. And then the level and pattern of DNA methylation explored by using the technology of methylation sensitive amplified polymorphism （MSAP）.The result demonstrated that the buds soaked in 0.2% colchicines and 0.002 g・mL-1 DMSO solution for 12 h was ideal conditions to induce autotetraploid of P. grandiflorus，with induction rate of 32.0%.The diploid and tetraploid plants existed distinctly differences in morphological indexes.Totally，1 586 bands were amplified by 20 pairs of selective primers，of which 764 and 822 bands were detected in diploid and autotetraploid respectively.The total methylation ratio，full methylation ratio and hemimethylated ratio were 91.25%，61.25% and 30.65% in diploid of P. grandiflorus，respectively.However，the total methylation ratio，full methylation ratio and hemimethylated ratio of autotetraploid of P. grandiflorus were 86.13%，54.38% and 31.75%， respectively. Compared with diploid，the genomic DNA total methylate ratio and full methylation ratio of autotetration plants decreased by 6.02% and 7.14%.But the hemimethylated ratio of autotetraploid was higher than that of diploid，which more than 1.6%.All this results indicated that DNA methylation patterns have adjusted during the polyploidy process.

[Key words]Platycodon grandiflorus； autotetraploid； DNA methylation； MSAP

多倍体是指含有3套或3套以上完整染色体组的生物体[1]。由于多倍体将1个或多个整套染色体累加到基因组上，对生物体的基因组产生了一定冲击，这种“基因组冲击”使生物体的新陈代谢和基因调控等发生改变，从而使植株的形态器官、生理指标、遗传特性等产生变异[2-5]，这些变异会增强植株的生态适应性和环境的抗逆性，降低蒸腾作用，提高光合效率等，对植株的生物量和某些次生代谢产物含量及品质有促进作用[6]。因此多倍体植物具有更大的生存潜能和更强的选择优势。研究表明，多倍化不仅能导致植物的基因组结构改变、碱基序列消除、转座子激活等，还能影响表观遗传调控模式[7-8]。表观遗传变异是指不改变DNA碱基序的一种可遗传的基因表达变化，包括DNA甲基化修饰、组蛋白的各种修饰等[9]，其中DNA甲基化修饰是研究多倍体表观遗传变异的最佳途径之一[10]。DNA甲基化能在分子水平上对基因的表达进行调控，保护基因组结构的完整性，并控制冗余基因的表达，保持多倍体植物基因组的稳定性 [11-12]。多倍化能够诱导DNA甲基化的改变，而DNA甲基化又在基因组调控和基因表达上起到一个枢纽的作用，因而用甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）研究不同倍性植株基因组DNA甲基化的表达水平及模式变化，在一定程度上对解释多倍体植株出现的新的表型具有重要的意义。

目前多倍体方面的研究主要集中于异源多倍体的物种[13-16]，而对同源多倍体化后所产生的一系列变化方面的相关文章较少，这是因为异源多倍体化后较同源多倍体化后引起的变化更为明显[17-18]。但是，异源多倍体带来的杂交效应将混淆于倍性引起的后果[19]，因此，仅依赖于倍性调控变化方面的研究应通过同源多倍体来体现，揭示仅由基因组加倍而不涉及杂交等其他因素所造成的基因组冲击以及随后多个基因组趋于稳定的内在机制也需通过同源多倍体的研究来阐明。

桔梗为常用大宗药材，具有开宣肺气，祛痰排脓的功效[20]，在我国南北各地大面积栽培。但长期以来只种不选，导致品种退化，药材产量和品质下降[21]。本研究在采用生物技术离体诱导并鉴定获得桔梗同源四倍体的基础上，采用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术对二倍体和四倍体基因组DNA的甲基化变化情况进行分析，一方面为桔梗的品种选育提供材料，另一方面从表观遗传学的角度探讨桔梗四倍体表型变化的分子机制，为多倍体育种提供一定的理论依据。

1材料

挑选籽粒饱满的桔梗种子，经流水冲洗40 min后置于超净工作台，用75%乙醇消毒30 s后转入0.1%升汞（HgCl2）中灭菌6 min，无菌水清洗3～5次，接入MS培养基，25～30 d后获得桔梗无菌系。

2方法

2.1桔梗无菌快繁体系的建立和优化

以桔梗幼芽为材料，接种到增殖和生根培养基上，增殖培养基以MS为基本培养基，分别添加不同浓度6-BA（6-苄氨基嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）和2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）；生根培养基以1/2MS为基本培养基，并添加不同浓度NAA（α-萘乙酸）和IBA（吲哚丁酸）进行生根培养，试验设计见表1，2。每个处理15个幼芽，5瓶重复，培养30 d后分别统计增殖系数和生根率。

2.2桔梗同源四倍体的离体诱导及鉴定

2.2.1桔梗同源四倍体的离体诱导具体方法参照王红娟等[22]，并作适当调整。质量分数为0.05%，0.1%，0.2%的秋水仙素（加0.02 g・mL-1二甲亚砜）混合液经20 mL的注射器和0.22 μm的水系滤头抽滤灭菌后将桔梗不定芽浸泡在其中，置于震动摇床内处理12，24，36，48，60 h，然后用无菌水冲洗3次后接种到MS培养基中进行培养。以清水浸泡作为对照，共15个处理，每个处理15个幼芽，做5次重复。

2.2.2桔梗同源四倍体的鉴定采用形态鉴别、流式细胞仪分析和根尖染色体鉴定相结合的方法来确定倍性株系。先将形态变异明显的植株进行流式细胞仪分析，具体方法参照张俊娥等[23]，称取0.5 g组培苗叶片，用滤纸吸干水分后置于干净培养皿中，加入2 mL预冷的组织解离液（80 mmol・L-1KCl，20 mmol・L-1NaCl，15 mmol・L-1Tris-HCl，20 mmol・L-1Na2EDTA，0.1% TritonX-100，2.0% PVP-K30，pH 7.5），用刀片一次性快速切碎叶片，过滤后于4 ℃环境下2 000 r・min-1离心5 min，漂洗2～3次，加入2 mL DAPI染液室温下反应1 h后即可上样测定。流式细胞仪鉴定的株系进一步采用根尖压片法确定植株染色体数目。具体方法参照张振超等[24]，早上9：00～11：00点取幼苗根尖（0.5～1 cm），在0.002 mol・L-1的八羟基喹啉预处理2～3 h，于4 ℃冰箱中卡诺固定液（乙醇-冰醋酸 3∶1）处理24 h，在60 ℃的1 mol・L-1 HCL中解离8 min，卡宝品红染色10 min，然后制片、镜检。

2.3总DNA提取

称取0.5 g二倍体和四倍体桔梗试管苗幼叶，采用改良的CTAB法进行DNA提取，具体方法参照陈昆松等[25]，提取的DNA经紫外-可见分光光度计测定浓度和纯度后用并1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，总DNA 置于-20 ℃冰箱待用。

2.4MSAP分析及聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.4.1酶切、链接反应MSAP试验步骤参照Portis等[26]方法，用双切酶组合EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoR Ⅰ/ MspⅠ对基因组DNA进行酶切，在酶切片段的两端加上人工设计的与EcoRⅠ和Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ酶切位点互补的人工接头，然后用AFLP扩增体系进行扩增，接头和引物序列见表3。引物由北京博友顺生物科技有限公司合成。

2.4.2预扩增、选择性扩增和电脉预扩增反应体系为20 μL，其中含有10 mmol・L-1 dNTPs 0.4 μL，10×Buffer 2 μL，5 U・μL-1Taq酶0.2 μL，10 μmol・L-1 E00-primer 0.5 μL，10 μmol・L-1 M00-primer 0.5 μL，其余用水补齐。反应条件为：94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，26个循环，72 ℃延伸10 min。预扩增产物稀释20倍，供选择扩增用。

选择扩增体系同预扩增体系，条件为：94 ℃ 30 s，65 ℃至56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，13个循环，每个循环降0.7 ℃进行降式PCR 扩增；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，23个循环，72 ℃延伸10 min。

选择性扩增完成后在扩增PCR产物中加入上样缓冲液，94 ℃变性10 min 后然后立即转移到冰上冷却防止复性，取5 μL变性产物于6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，银染后观察。

2.5条带统计与数据处理

由于甲基敏感扩增多态性技术中分别用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ双切酶对基因组DNA进行酶切。因此每个样品同时拥有2条泳道：第1条泳带采用EcoRⅠ/HpaⅡ进行酶切，记为H，第2条泳带采用EcoRⅠ/ MspⅠ进行酶切，记为M。同一位点有条带的记为“1”，无带的记为“0”。

3结果与分析

3.1增殖及生根培养基优化

将长1.5～2 cm的桔梗不定芽接到7种增殖培养基中，经30 d培养后均出现不定芽增殖的现象，具体结果见表4，在4号培养基中，分化的芽数最多，增殖系数平均达9.3±0.24，且出芽整齐，生长健壮，叶色浓绿。因此，桔梗无菌苗增殖的最适培养基为MS+6-BA 1.5 mg・L-1+ NAA 0.3 mg・L-1。

生根培养基优化结果见表5，不同浓度的NAA和IBA对桔梗试管苗生根率、根生长状况均有影响，随着NAA和IBA浓度的增大，生根率逐渐降低，且出根不整齐，根细短。当培养基蔗糖含量为28 g・L-1，NAA质量浓度为0.6 mg・L-1时，平均生根率高达82.6±3.8，且根粗壮，整齐。由此可见，桔梗的最佳生根培养基为1/2MS+NAA 0.6 mg・L-1。

3.2桔梗同源四倍体的诱导结果

将桔梗不定芽用抽滤灭菌的秋水仙素（加0.02 g・mL-1二甲亚砜）混合液浸泡处理后，成功得到了桔梗同源四倍体植株。诱导结果见表6，不同的质量浓度和处理时间对不定芽的诱导效果不同，低浓度和短时间处理下诱导率低，但成活率高，随着质量浓度和处理时间的增加，诱导率逐渐提高，但不定芽成活率降低。根据四倍体植株的诱导率和成活率，筛选出最佳处理浓度和时间，即用0.1%的秋水仙素溶液处理48 h或0.2%的秋水仙素溶液处理12 h为桔梗同源四倍体诱导的最佳条件。

3.3桔梗同源四倍体的鉴定

一般而言，四倍体植株具有巨型化特征，将形态变异明显的植株先经流式细胞仪分析后，再用根尖压片法鉴定，见图1。结果表明，桔梗二倍体植株根尖染色体数为2n=2x=18，DNA相对含量在100处有1个单峰；同源四倍体植株染色体数为2n=4x=36，DNA相对含量在200处有1个单峰，见图2。

3.4桔梗二倍体和同源四倍体基因组DNA甲基化水平差异

MSAP技术中同裂酶HpaⅡ和MspⅠ都能识别并切割CCGG序列，但二者识别甲基化的位点不同，HpaⅡ能切割无甲基化和单链甲基化位点而不能切割双链甲基化位点；MspⅠ能切割无甲基化和内甲基化位点而不能切割外甲基化位点，因此经HpaⅡ和MspⅠ切割后在聚丙烯酰胺凝胶电泳分析胶上能检测出4种条带类型，即：Ⅰ型，H，M都有带，说明CCGG位点无甲基化；Ⅱ型，H有带，M无带，说明CCGG位点发生单链外甲基化，即半甲基化；Ⅲ，H无带，M有带，说明CCGG位点发生双链内甲基化，即全甲基化；Ⅳ，H，M都无带，说明CCGG位点有双链内外侧甲基化、双链外甲基化或无CCGG序列[16]。桔梗二倍体和同源四倍体DNA经MSAP扩增的条带数及甲基化水平见表7，用20对引物组合共扩增后共有1 586条条带，其中二倍体764条，四倍体822条。二倍体总甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分别为92.15%，61.52%，30.65%，而四倍体的为86.13%，54.38%，31.75%，与桔梗二倍体相比，其同源四倍体总甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，而半甲基化率升高1.6%，这说明染色体加倍后其DNA甲基化水平发生了变化。

3.5桔梗二倍体和同源四倍体基因组DNA甲基化类型

二倍体和同源四倍体桔梗基因组DNA甲基化类型见表8，二倍体和四倍体共有15种条带，见图3。其中A型为单态性位点，包括3个亚类，表示二倍体与四倍体甲基化状态相同；B型为去甲基化位点，包括5个亚类，说明在该位点二倍体存在甲基化，而四倍体发生了去甲基化；C型为过或超甲基化类型，也有5个亚类，即与二倍体相比，四倍体甲基化升高；D型为次甲基类型，有2个亚类，表示相比于二倍体来说，四倍体甲基化降低，但仍有甲基化现象[17]。与二倍体相比，桔梗试管苗染色体加倍后，其基因组DNA有23.54%发生了去甲基化现象，29.07%发生了过或超甲基化现象，2.97%发生了次甲基化现象，只有44.42%的基因组DNA未发生任何改变。

4讨论与结论

4.1桔梗同源四倍体的离体诱导及鉴定

本研究中采0.2%抽滤灭菌的秋水仙素溶液浸P11～P20.其中的10对引物，每对引物下有4条泳道，从左往右依次为2H，2M，4H，4M；2H和4H分别表示二倍体和四倍体桔梗EcoR Ⅰ/Hpa Ⅱ酶切的扩增结果；2M和4M表示二倍体和四倍体桔梗EcoR Ⅰ/Msp Ⅱ酶切的扩增结果。

泡桔梗顶芽12 h，获得了诱导率为32.0%的四倍体植株。高山林等[27]采用培养基中添加40 mg・L-1秋水仙素的方法诱导桔梗四倍体，诱导率达到37.5%；王小华等[28]采用0.1%秋水仙素处理桔梗嫩茎40 h，诱导率达到50%。前人诱导率较高的原因可能是在鉴定过程中仅用形态学和细胞学的方法鉴定倍性，并没有排除嵌合体的干扰，从而将嵌合率也计算到诱导率中，出现诱导率较高的现象，本研究采用了形态鉴别、流式细胞仪分析和根尖染色体鉴定相结合的方法进行倍性鉴定，排除了嵌合体的干扰，提高了结果的可靠性，为进一步研究桔梗同源四倍体的遗传稳定性和农艺性状评价提供可靠的材料。

4.2桔梗二倍体与四倍体基因组DNA甲基化水平差异及模式变化

多倍体植物具有器官巨大、活性成分含量高、抗逆性强等优点，这可能是多倍化后植物体内基因组结构和表观遗传修饰发生了广泛变化[3]，进而导致植物出现新的性状。但在对拟南芥[5]、水稻[29]、白菜[18]的同源多倍体及二倍体的比较研究中发现这些植物同源多倍化后基因组结构并没有发生明显改变，且多倍化后多倍体的基因表达谱也与二倍体十分相似。表明同源多倍化后基因组并没有同异源多倍化一样发生大规模的基因组结构调整事件。本研究中，从图1可以明显看出桔梗同源四倍体比二倍体植株粗大，叶片增厚增大，叶柄叶脉粗大等现象，同源多倍体桔梗新出现的区别于亲本的性状则可能与表观遗传调控密切相关。

甲基化是一种常见的表观遗传修饰形式，在基因表达中起着重要的调节作用，同源多倍化过程中，DNA甲基化会参与多倍体的适应性调整，并发生特异性的变化以调控基因表达和转座子的活性等，所以不同倍性材料中DNA甲基化水平会发生一定程度的改变[29]。杨岚等[30]采用MSAP技术对甜叶菊同源四倍体与二倍体的表观遗传进行研究后发现四倍体基因组DNA的总甲基化率和全甲基化率略有所降低，甲基化模式主要以过和超甲基化为主；长春花[31]多倍化后基因组CCGG位点的 DNA的总甲基化率、全甲基化率和半甲基化率较二倍体植株均有所提高，甲基化类型以C型即过或超甲基化类型最多。本研究中，桔梗同源四倍化后基因组DNA的总甲基化率和全甲基化率有所降低，其中总甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，且甲基化模式主要以过或超甲基化类型（C型）为主，占29.07%，其次是去甲基化（B型），占23.54%，最少的是次甲基化（D型），占2.97%。由此可推测同源四倍体出现新的表型与DNA甲基化模式的重新调整尤其是大量过或超甲基化变异有关，过或超甲基化就可能导致相应位点所在基因表达的关闭或抑制，进而维持四倍体植株这自身基因组的稳定性。有关染色体加倍后DNA甲基化模式调整的程度对多倍体性状和表型改变的机制还有待进一步的研究。

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