基因多态性的概念范文
时间：2023-12-27 17:55:19
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篇1
药物基因组学是伴随人类基因组学研究的迅猛发展而开辟的药物遗传学研究的新领域，主要阐明药物代谢、药物转运和药物靶分子的基因多态性及药物作用包括疗效和毒副作用之间关系的学科。
基因多态性是药物基因组学的研究基础。药物效应基因所编码的酶、受体、离子通道作为药物作用的靶，是药物基因组学研究的关键所在。基因多态性可通过药物代谢动力学和药物效应动力学改变来影响麻醉药物的作用。
基因多态性对药代动力学的影响主要是通过相应编码的药物代谢酶及药物转运蛋白等的改变而影响药物的吸收、分布、转运、代谢和生物转化等方面。与麻醉药物代谢有关的酶有很多，其中对细胞色素-P450家族与丁酰胆碱酯酶的研究较多。基因多态性对药效动力学的影响主要是受体蛋白编码基因的多态性使个体对药物敏感性发生差异。
苯二氮卓类药与基因多态性：咪唑安定由CYP3A代谢，不同个体对咪唑安定的清除率可有五倍的差异。地西泮是由CYP2C19和CYP2D6代谢，基因的差异在临床上可表现为用药后镇静时间的延长。
吸入麻醉药与基因多态性：RYR1基因变异与MH密切相关，现在已知至少有23种不同的RYR1基因多态性与MH有关。氟烷性肝炎可能源于机体对在CYP2E1作用下产生的氟烷代谢产物的一种免疫反应。
神经肌肉阻滞药与基因多态性：丁酰胆碱酯酶是水解琥珀酰胆碱和美维库铵的酶，已发现该酶超过40种的基因多态性，其中最常见的是被称为非典型的（A）变异体，与用药后长时间窒息有关。
镇痛药物与基因多态性：μ-阿片受体是阿片类药的主要作用部位，常见的基因多态性是A118G和G2172T。可待因和曲马多通过CYP2D6代谢。此外，美沙酮的代谢还受CYP3A4的作用。儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)基因与痛觉的产生有关。
局部麻醉药与基因多态性：罗哌卡因主要由CYP1A2和CYP3A4代谢。CYP1A2的基因多态性主要是C734T和G2964A，可能影响药物代谢速度。
一直以来麻醉科医生较其它专业的医疗人员更能意识到不同个体对药物的反应存在差异。麻醉药的药物基因组学研究将不仅更加合理的解释药效与不良反应的个体差异，更重要的是在用药前就可以根据病人的遗传特征选择最有效而副作用最小的药物种类和剂型，达到真正的个体化用药。
能够准确预测病人对麻醉及镇痛药物的反应，一直是广大麻醉科医生追求的目标之一。若能了解药物基因组学的基本原理，掌握用药的个体化原则，就有可能根据病人的不同基因组学特性合理用药，达到提高药效，降低毒性，防止不良反应的目的。本文对药物基因组学的基本概念和常用麻醉药的药物基因组学研究进展进行综述。
一、 概述
二十世纪60年代对临床麻醉过程中应用琥珀酰胆碱后长时间窒息、硫喷妥钠诱发卟啉症及恶性高热等的研究促进了药物遗传学（Pharmacogenetics）的形成和发展，可以说这门学科最早的研究就是从麻醉学开始的。
药物基因组学(Phamacogenomics)是伴随人类基因组学研究的迅猛发展而开辟的药物遗传学研究的新领域，主要阐明药物代谢、药物转运和药物靶分子的基因多态性及药物作用包括疗效和毒副作用之间的关系。它是以提高药物的疗效及安全性为目标，研究影响药物吸收、转运、代谢、消除等个体差异的基因特性，以及基因变异所致的不同病人对药物的不同反应，并由此开发新的药物和用药方法的科学。
1959年Vogel提出了“药物遗传学”，1997年Marshall提出“药物基因组学”。药物基因组学是药物遗传学的延伸和发展，两者的研究方法和范畴有颇多相似之处，都是研究基因的遗传变异与药物反应关系的学科。但药物遗传学主要集中于研究单基因变异，特别是药物代谢酶基因变异对药物作用的影响；而药物基因组学除覆盖药物遗传学研究范畴外，还包括与药物反应有关的所有遗传学标志，药物代谢靶受体或疾病发生链上诸多环节，所以研究领域更为广泛[1，2，3]。
二、基本概念
1．分子生物学基本概念
基因是一个遗传密码单位，由位于一条染色体(即一条长DNA分子和与其相关的蛋白)上特定位置的一段DNA序列组成。等位基因是位于染色体单一基因座位上的、两种或两种以上不同形式基因中的一种。人类基因或等位基因变异最常见的类型是单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，SNP)。目前为止，已经鉴定出13 000 000多种SNPs。突变和多态性常可互换使用，但一般来说，突变是指低于1%的群体发生的变异，而多态性是高于1%的群体发生的变异。
2．基因多态性的命名法：
(1)数字前面的字母代表该基因座上最常见的核苷酸(即野生型)，而数字后的字母则代表突变的核苷酸。例如：μ阿片受体基因A118G指的是在118碱基对上的腺嘌呤核苷酸(A)被鸟嘌呤核苷酸(G)取代，也可写成118A/G或118A>G。
(2)对于单个基因密码子导致氨基酸转换的多态性编码也可以用相互转换的氨基酸的来标记。例如：丁酰胆碱酯酶基因多态性Asp70Gly是指此蛋白质中第70个氨基酸－甘氨酸被天冬氨酸取代。
三、药物基因组学的研究内容
基因多态性是药物基因组学的研究基础。药物效应基因所编码的酶、受体、离子通道及基因本身作为药物作用的靶，是药物基因组学研究的关键所在。这些基因编码蛋白大致可分为三大类:药物代谢酶、药物作用靶点、药物转运蛋白等。其中研究最为深入的是麻醉药物与药物代谢酶CYP45O酶系基因多态性的相关性[1，2，3]。
基因多态性可通过药物代谢动力学和药物效应动力学改变来影响药物作用，对于临床较常用的、治疗剂量范围较窄的、替代药物较少的麻醉药物尤其需引起临床重视。
（一）基因多态性对药物代谢动力学的影响
基因多态性对药物代谢动力学的影响主要是通过相应编码的药物代谢酶及药物转运蛋白等的改变而影响药物的吸收、分布、转运、代谢和生物转化等方面[3，4，5，6]。
1、药物代谢酶
与麻醉药物代谢有关的酶有很多，其中对细胞色素-P450家族与丁酰胆碱酯酶的研究较多。
（1）细胞色素P-450（CYP45O）
麻醉药物绝大部分在肝脏进行生物转化，参与反应的主要酶类是由一个庞大基因家族编码控制的细胞色素P450的氧化酶系统，其主要成分是细胞色素P-450（CYP45O）。CYP45O组成复杂，受基因多态性影响，称为CYP45O基因超家族。1993年Nelson等制定出能反应CYP45O基因超家族内的进化关系的统一命名法：凡CYP45O基因表达的P450酶系的氨基酸同源性大于40%的视为同一家族（Family），以CYP后标阿拉伯数字表示，如CYP2；氨基酸同源性大于55%为同一亚族（Subfamily），在家族表达后面加一大写字母，如CYP2D；每一亚族中的单个变化则在表达式后加上一个阿拉伯数字，如CYP2D6。
（2）丁酰胆碱酯酶
麻醉过程中常用短效肌松剂美维库铵和琥珀酰胆碱，其作用时限依赖于水解速度。血浆中丁酰胆碱酯酶(假性胆碱酯酶)是水解这两种药物的酶，它的基因变异会使肌肉麻痹持续时间在个体间出现显著差异。
2、药物转运蛋白的多态性
转运蛋白控制药物的摄取、分布和排除。P-糖蛋白参与很多药物的能量依赖性跨膜转运，包括一些止吐药、镇痛药和抗心律失常药等。P-糖蛋白由多药耐药基因（MDR1）编码。不同个体间P-糖蛋白的表达差别明显，MDR1基因的数种SNPs已经被证实，但其对临床麻醉的意义还不清楚。
（二）基因多态性对药物效应动力学的影响
麻醉药物的受体（药物靶点）蛋白编码基因的多态性有可能引起个体对许多药物敏感性的差异，产生不同的药物效应和毒性反应[7，8]。
1、蓝尼定受体-1（Ryanodine receptor-1，RYR1）
蓝尼定受体-1是一种骨骼肌的钙离子通道蛋白，参与骨骼肌的收缩过程。恶性高热（malignant hyperthermia，MH）是一种具有家族遗传性的、由于RYR1 基因异常而导致RYR1存在缺陷的亚临床肌肉病，在挥发性吸入麻醉药和琥珀酰胆碱的触发下可以出现骨骼肌异常高代谢状态，以至导致患者死亡。
2、阿片受体
μ-阿片受体由OPRM1基因编码，是临床使用的大部分阿片类药物的主要作用位点。OPRM1基因的多态性在启动子、内含子和编码区均有发生，可引起受体蛋白的改变。吗啡和其它阿片类药物与μ-受体结合而产生镇痛、镇静及呼吸抑制。不同个体之间μ-阿片受体基因的表达水平有差异，对疼痛刺激的反应也有差异，对阿片药物的反应也不同。
3、GABAA 和 NMDA受体
γ-氨基丁酸A型（GABAA）受体是递质门控离子通道，能够调节多种麻醉药物的效应。GABAA受体的亚单位（α、β、γ、δ、ε和θ）的编码基因存在多态性（尤其α和β），可能与孤独症、酒精依赖、癫痫及精神分裂症有关，但尚未见与麻醉药物敏感性有关的报道。N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体的多态性也有报道，但尚未发现与之相关的疾病。
（三）基因多态性对其它调节因子的影响
有些蛋白既不是药物作用的直接靶点，也不影响药代和药效动力学，但其编码基因的多态性在某些特定情况下会改变个体对药物的反应。例如，载脂蛋白E基因的遗传多态性可以影响羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂（他汀类药物）的治疗反应。鲜红色头发的出现几乎都是黑皮质素-1受体（MC1R）基因突变的结果。MC1R基因敲除的老鼠对麻醉药的需求量增加。先天红发妇女对地氟醚的需要量增加，热痛敏上升而局麻效力减弱。
四、苯二氮卓类药与基因多态性
大多数苯二氮卓类药经肝脏CYP45O代谢形成极性代谢物，由胆汁或尿液排出。常用的苯二氮卓类药物咪唑安定就是由CYP3A代谢，其代谢产物主要是1-羟基咪唑安定，其次是4-羟基咪唑安定。在体实验显示不同个体咪唑安定的清除率可有五倍的差异。
地西泮是另一种常用的苯二氮卓类镇静药，由CYP2C19和CYP2D6代谢。细胞色素CYP 2C19的G681A多态性中A等位基因纯合子个体与正常等位基因G纯合子个体相比，地西泮的半衰期延长4倍，可能是CYP2C19的代谢活性明显降低的原因。A等位基因杂合子个体对地西泮代谢的半衰期介于两者之间。这些基因的差异在临床上表现为地西泮用药后镇静或意识消失的时间延长[9，10]。
五、吸入麻醉药与基因多态性
到目前为止，吸入麻醉药的药物基因组学研究主要集中于寻找引起药物副反应的遗传方面的原因，其中研究最多的是MH。药物基因组学研究发现RYR1基因变异与MH密切相关，现在已知至少有23种不同的RYR1基因多态性与MH有关。
与MH不同，氟烷性肝炎可能源于机体对在CYP2E1作用下产生的氟烷代谢产物的一种免疫反应，但其发生机制还不十分清楚 [7，11]。
六、神经肌肉阻滞药与基因多态性
神经肌肉阻滞药如琥珀酰胆碱和美维库铵的作用与遗传因素密切相关。血浆中丁酰胆碱酯酶(假性胆碱酯酶)是一种水解这两种药物的酶，已发现该酶超过40种的基因多态性，其中最常见的是被称为非典型的（A）变异体，其第70位发生点突变而导致一个氨基酸的改变，与应用肌松剂后长时间窒息有关。如果丁酰胆碱酯酶Asp70Gly多态性杂合子(单个等位基因)表达，会导致胆碱酯酶活性降低，药物作用时间通常会延长3～8倍；而丁酰胆碱酯酶Asp70Gly多态性的纯合子(2个等位基因)表达则更加延长其恢复时间，比正常人增加60倍。法国的一项研究表明，应用多聚酶链反应（PCR）方法，16例发生过窒息延长的病人中13例被检测为A变异体阳性。预先了解丁酰胆碱酯酶基因型的改变，避免这些药物的应用可以缩短术后恢复时间和降低医疗费用[6，12]。
七、镇痛药物与基因多态性
μ-阿片受体是临床应用的阿片类药的主要作用部位。5%～10%的高加索人存在两种常见μ-阿片受体基因变异，即A118G和G2172T。A118G变异型使阿片药物的镇痛效力减弱。另一种阿片相关效应—瞳孔缩小，在118G携带者明显减弱。多态性还可影响阿片类药物的代谢。
阿片类药物的重要的代谢酶是CYP2D6。可待因通过CYP2D6转化为它的活性代谢产物－吗啡，从而发挥镇痛作用。对33名曾使用过曲马多的死者进行尸检发现，CYP2D6等位基因表达的数量与曲马多和O－和N－去甲基曲马多的血浆浓度比值密切相关，说明其代谢速度受CYP2D6多态性的影响。除CYP2D6外，美沙酮的代谢还受CYP3A4的作用。已证实CYP3A4在其它阿片类药如芬太尼、阿芬太尼和苏芬太尼的代谢方面也发挥重要作用。
有报道显示儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)基因与痛觉的产生有关。COMT是儿茶酚胺代谢的重要介质，也是痛觉传导通路上肾上腺素能和多巴胺能神经的调控因子。研究证实Val158Met COMT基因多态性可以使该酶的活性下降3～4倍。Zubieta等报道，G1947A多态性个体对实验性疼痛的耐受性较差，μ-阿片受体密度增加，内源性脑啡肽水平降低[13～16]。
八、局部麻醉药与基因多态性
罗哌卡因是一种新型的酰胺类局麻药，有特有的S-(-)-S对应体，主要经肝脏代谢消除。罗哌卡因代谢产物3-OH-罗哌卡因由CYP1A2代谢生成，而4-OH-罗哌卡因、2-OH-罗哌卡因和2-6-pipecoloxylidide (PPX)则主要由CYP3A4代谢生成。CYP1A2的基因多态性主要是C734T和G2964A。Mendoza等对159例墨西哥人的DNA进行检测，发现CYP1A2基因的突变率为43%。Murayama等发现日本人中CYP1A2基因存在6种导致氨基酸替换的SNPs。这些发现可能对药物代谢动力学的研究、个体化用药具有重要意义[17，18，19]。
九、总结与展望
篇2
【关键词】氯吡格雷抵抗；CYP2c19； 基因多态性； 药物基因组学
【中图分类号】R319【文献标识码】A【文章编号】1672-3783（2014）01-0375-01根据最新的美国心脏病学会（ACC） /美国心脏学会（AHA） ，以及欧洲心脏病学会（ESC） 指南，联合应用氯吡格雷和阿司匹林已经成为了急性冠脉综合征（ACS） 患者和经皮冠状动脉介入治疗（PCI）的标准抗血小板治疗。在氯吡格雷标准治疗后血小板聚集率仍然较高的患者被认为对氯吡格雷低反应或无反应，即氯吡格雷抵抗。大量研究显示，细胞色素P450酶的编码基因之一CYP2C19 基因多态性是引起氯吡格雷抵抗的重要因素，美国食品与药品管理局（ FDA）甚至黑框警示 ："使用氯吡格雷前注意患者CYP2C19 的基因型" [1]。现就其研究现状作一综述。
1 氯吡格雷的吸收代谢及氯吡格雷抵抗
1.1氯吡格雷吸收
氯吡格雷在小肠的吸收受多耐药P-糖蛋白的限制。编码小肠多耐药P-糖蛋白的ABCB1（ 或MDR1） 基因多态性会影响氯吡格雷的生物利用度。ABCB1 基因频率在不同人群中存在差异，中国人群ABCB1 3435 C>T 基因型频率与高加索人近似，但比黑人或印度人低[2-4]。ABCB1 与氯吡格雷药物反应的相关性有待于在不同人群中进一步研究。
1.2氯吡格雷的代谢
氯吡格雷是噻吩并吡啶类前体药物，需要经过肝脏细胞色素P450（ CYP） 的代谢才能转化为有活性的代谢产物，这些活性代谢物不可逆地抑制二磷酸腺苷（ ADP） 受体（ 由P2Y12 基因编码） ，并进一步抑制纤维蛋白原受体（ 糖蛋白[GP]Ⅱb/Ⅲa 受体，由ITGB3 基因编码） 与纤维蛋白原的结合，从而抑制血小板聚集。口服氯吡格雷后，约85% 的药物在肝脏经过肝羧酸酯酶代谢转化为无活性的物质，约15% 经过肝细胞P450 系列酶（CYP1A2， CYP2B6， CYP2C9， CYP2C19， and CYP3A4/5等编码） ，经过两步氧化反应转化为有活性的代谢产物[5]。一项研究表明，对氧磷酶1（PON1）可能也参与了氯吡格雷的活化[6]，然而，这项发现与已经报道的PON1等位基因和氯吡格雷反应变异性之间的关联在其他多项研究之中并不可重复[7]。
1.3氯吡格雷抵抗。
目前关于氯吡格雷抵抗的定义都是经验性的，没有明确的定义，但是有一个被广为认同的概念： "在足量的抗血小板剂量下，氯吡格雷的靶点仍有持续的活性"[8]。也有人称氯吡格雷抵抗有临床和实验室两层含义。临床定义指虽给予氯吡格雷标准化治疗，但不能达到预期的药效学作用，仍有闭塞性心血管事件发生[9]。实验室定义指虽给予氯吡格雷标准化的治疗但实验室仍监测到血小板活性未受到有效抑制[10]。目前检测血小板功能有多种方法，应用广泛的有比浊法（LTA） 、血管扩张剂刺激磷蛋白（VASP） 法，全血阻抗法、PFA -100 和快速血小板功能分析仪（ VerifyNow）。POPULAR 试验[11]比较了6 种不同的血小板功能试验，证实VerifyNow 法与临床终点之间具有最高的相关性，同LTA 法具有相似的"曲线下面积"。
1.4氯吡格雷抵抗的机制
氯吡格雷抵抗的机制尚未阐明，目前所知的有基因多态性、药物的相互作用以及炎性因子等。质子泵抑制剂（PPIs）是最先被提出来有可能影响氯吡格雷代谢的药物。有研究发现PPIs可抑制氯吡格雷的抗血小板作用[12]，同时临床研究证实急性心肌梗死患者联合应用氯吡格雷和PPIs明显增加再梗死的风险[13]。关于他汀类药物之间的相互作用，有大量的试验利用VerifyNow 法检测血小板聚集度，排除了他汀与氯吡格雷之间显著的相互作用，指出以上药物的联用是安全的[14]。近年来，炎性因子对氯吡格雷作用的影响也备受关注。Gorie 等[15]发现，ADP 诱导的血小板聚集与干扰素诱导蛋白和白细胞介素6（ interleukin-6， IL-6） 的血清水平有正相关关系，而与抗炎性细胞因子IL-10 和IL-4 的血清水平有负相关关系。
2CYP2c19基因多态性
CYP2c19基因多态性属于单核苷酸多态性，具有高度基因多态性，已知有超过25种等位基因型[16]。野生型CYP2C19 * 1等位基因与CYP2C19介导的代谢功能相关。最常见的CYP2C19功能损失的等位基因是* 2（c.681G>A；rs4244285），高加索人和非洲人中占约15%，亚洲人中约29-35%。其他CYP2C19基因变异与减少或缺乏酶的活性有关（例如，* 3-* 8）；然而，它们的出现的频率通常低于1%，但CYP2C19 * 3例外（c.636G>A； rs4986893），其在亚洲人出现频率约2-9%5。
根据基因型可确定患者的代谢类型，即超快代谢型（ UM） 、快代谢型（ EM） 、中间代谢型（ IM） 和慢代谢型（ PM） （ 表1） 。大量证据证实，不同人种在CYP2C19的底物的代谢能力有很大差异；2-5%高加索人是弱代谢者，而13-23%的亚洲人是弱代谢者。这是由于在亚洲人口中CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因的高频率造成的[17]。
在一项对2208 例急性心肌梗死接受氯吡格雷治疗的法国患者进行1 年的随访研究中发现，携带任意2 个CYP2C19 失去功能型等位基因（ * 2，* 3，* 4 或* 5） 或1 个ABCB1 变异型等位基因（ CT 或TT） 的患者，与非携带者相比，其死亡、非致死性心肌梗死或中风的危险性增加，携带2 个CYP2C19 失去功能型等位基因和1 个ABCB1 变异型等位基因的患者心血管事件危险性进一步增加，是非携带者的5 倍[18].
[20]Mega， J.L. et al. Reduced-function CYP2C19 genotype and risk of adverse clinical outcomes among patients treated with clopidogrel predominantly for PCI： a meta-analysis. JAMA 304， 1821-1830 （2010）
[21]Holmes， M.V.， Perel， P.， Shah， T.， Hingorani， A.D. & Casas， J.P. CYP2C19 genotype， clopidogrel metabolism， platelet function， and cardiovascular events： a systematic review and meta-analysis. JAMA 306， 2704-2714 （2011）
[22]Wiviott， S.D. et al.； TRITON-TIMI 38 Investigators. Prasugrel versus clopidogrel in patients with acute coronary syndromes. N. Engl. J. Med. 357， 2001-2015 （2007）
[23]Mega， J.L. et al. Cytochrome P450 genetic polymorphisms and the response to prasugrel： relationship to pharmacokinetic， pharmacodynamic， and clinical outcomes. Circulation 119， 2553-2560 （2009）
[24]Sorich， M.J.， Vitry， A.， Ward， M.B.， Horowitz， J.D. & McKinnon， R.A. Prasugrel vs. clopidogrel for cytochrome P450 2C19-genotyped subgroups： integration of the TRITON-TIMI 38 trial data. J. Thromb. Haemost. 8，1678-1684 （2010）
篇3
【关键词】 精神分裂症;精神分裂症断裂基因1;关联研究
中图分类号:R749.3 文献标识码:A 文章编号:1000-6729(2009)008-0590-05
doi:10.3969/j.issn.1000-6729.2009.08.012
精神分裂症是一种严重的精神障碍,几乎影响到世界1%的人口而且占用了大约2.5%的医疗费用[1]。很多研究表明遗传因素在精神分裂症发病过程中起到很重要的作用[2-4]。越来越多的证据表明精神分裂症断裂基因1(DISC1)在精神分裂症发病中起重要作用[5]。DISC1基因最先是在一个大样本的苏格兰家系研究中发现的,它是1号和11号染色体发生平衡异位(1;11)(q42.1;q14.3)[6]。接下来很多遗传连锁和关联研究进一步支持DISC1基因是精神分裂症和分裂情感性精神障碍的易患基因[7-9]。
目前很多遗传学研究关注风险基因和外在表现之间的关系,比如DISC1基因和精神症状之间的关系[10]。最近国外有几个研究观察了DISC1基因的遗传变异与精神分裂症症状之间的关系。一些研究发现DISC1基因可能与妄想和幻觉有关联[11-13]。DeRosse等人发现包含rs821616(Ser704Cys)和rs821597的DISC1基因单体型与精神分裂症妄想的终生严重程度明显关联[12]。
为了进一步证实DISC1基因和精神分裂症之间的关系,本文分析了中国汉族人群中466例精神分裂症患者和551例正常对照的rs821597和rs821616两位点的单核苷酸多态性(SNPs)。并采用阳性和阴性症状量表(positive and negative syndrome scale,PANSS)[14]评估患者的临床症状,进一步分析PANSS因子分与DISC1基因多态性的关联。
1 对象和方法
1.1 对象
病例组为2000-2007年在北大六院方便取样住院诊治的汉族精神分裂症患者466例,其中,男268例,女198例,平均年龄(30.3±10.2)岁。依据国际疾病分类第10版( ICD-10)精神分裂症的诊断标准,由两名以上精神科医师(其中至少1名是主治医师)独立诊断,诊断一致并排除其他精神科疾病。正常对照者是来自北京市血液中心的献血者,其年龄、性别均与病例组匹配,经非结构式临床访谈排除精神疾病,且家族中无精神疾病及自杀者,个体间无血缘关系。对照组共551例,男303例,女248例,平均年龄(31.5±9.6)岁。
所有研究对象来自中国北方(秦岭-淮河以北)地区汉族人群,均无严重躯体疾病。所有研究对象在入组前详细了解本研究的目的和程序,并签署知情同意书。本研究获得北京大学医学部伦理委员会的批准。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取
抽取所有受试者外周静脉血5 ml,置于EDTA抗凝管中,混匀后保存于4 ℃冰箱,1周内用Qiagen公司的QIAamp DNA 抽提试剂盒提取基因组DNA,- 70 ℃保存待用。
1.2.2 基因型扩增
采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-based restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法,检测所有研究对象的2个SNPs的基因型。其中SNP1(rs821597)位于DISC1基因的第10个内含子,SNP2(rs821616)位于DISC1基因的第11个外显子。SNP2(rs821616)的变异可以引起它所编码的氨基酸发生改变。检测PCR引物、退火温度(Tm)、限制性内切酶等部分信息参见Qu [9]等的报道。两位研究者分别读取基因型结果以保证结果的正确性。同时我们随机抽取5%的样本进行DNA测序,测序结果与PCR-RFLP方法读取的结果完全一致。
聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法。(1)25 μl的PCR扩增反应体系:10 mM Tris-HCl(pH 8.3),50 mM氯化钾,1.5 mM氯化镁,200 μM dNTPs,0.3 μM引物,40 ng基因组DNA,1单位Taq DNA聚合酶。(2)PCR扩增反应条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,55 ℃~62 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35个循环,最后72 ℃后延伸7 min。对于SNP1(rs821597)和SNP2(rs821616),分别在15 μl PCR产物中加入3 U限制性内切酶EcoRI和BsrI及2 μl酶切缓冲液,置于37 ℃及65 ℃孵箱过夜消化反应。取10 μl酶切产物,用3 %琼脂糖凝胶电泳分离目的片段,经溴乙锭染色、凝胶成像系统扫描后读取基因型。
1.2.3 临床评定
采用阳性与阴性症状量表(PANSS)[14]评估精神分裂症患者的终生临床症状。参加PANSS量表评定的精神科医师于研究开始前接受培训,2名医师评定一致性Kappa值> 0.85,量表评定在患者入院后1周内完成。最后计算PANSS的5因子分[15],即阳性因子分(妄想、幻觉行为、夸大、猜疑和不寻常思维内容),阴性因子分(情感迟钝、情绪退缩、交流障碍、被动退缩、缺乏自发性和动作迟缓),兴奋因子分(兴奋、敌对性、紧张、不合作和冲动控制障碍),抑郁因子分(焦虑、自罪感和抑郁)和认知损害因子分(抽象思维困难、刻板思维、概念紊乱、定向障碍和注意障碍)。
1.3 统计分析
采用SHEsis遗传分析软件[16]进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验、连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)、单位点和单体型(haplotype)遗传关联分析,分别比较病例组与对照组各SNPs的基因型和等位基因(卡方检验)以及单体型的频率差异,并对上述遗传分析结果分别采用Bonferroni校正(显著性水平为单位点α值/位点数)和基于100次样本对换的置换检验(resampling-based permutation test),以消除多重假设检验时可能产生的假阳性误差。使用SPSS 软件13.0版本对风险单体型携带者与非风险单体型携带者的PANSS 5因子分进行t检验。
2 结 果
2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验
2个SNPs位点的基因型频率经Hardy-Weinberg遗传平衡检验,病例组和对照组各多态性位点的观察值和预期值之间差异均无统计学意义(P>0.05),表明该研究对象来自大的群体,个体间为随机婚配,无明显的自然选择、迁移等因素对遗传平衡的影响,资料可靠。
2.2 单位点遗传关联分析
各位点基因型和等位基因的频率分布见表1。SNP1(rs821597)和SNP2(rs821616)的基因型和等位基因的频率在病例组和对照组间差异均有统计学意义。rs821597的等位基因A>G,rs821616 的等位基因A>T,基因型均P
2.3 连锁不平衡分析及单体型遗传关联分析
为了解各遗传标记位点间的连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)情况,对2个SNPs位点进行了相邻位点间的LD分析,结果表明D'值为1.0,提示2个SNPs位点之间存在很强的LD。对2个SNPs位点构成的单体型进行分析,结果表明病例组与对照组间AT和GA两个单体型的估计频率差异有统计学意义(见表2)。上述结果经置换检验,P值仍具有统计学意义。
2.4 风险单体型与临床症状的关联分析
对两个位点SNP1(rs821597)和SNP2(rs821616)组成的单体型,分别依据是否携带风险单体型AT,将精神分裂症患者分为两组:DISC1基因风险单体型AT携带组与非风险单体型AT携带组。对两组进行阳性与阴性症状量表评分比较,结果发现两组的各因子得分差异均无统计学意义(见表3)。
3 讨 论
研究发现在中国汉族人群中DISC1基因多态性与精神分裂症存在关联。病例对照研究提示rs821616与rs821597与精神分裂症明显关联。然而,这两个SNPs组成的风险单体型AT与PANSS的阳性、阴性、兴奋、抑郁和认知损害等5个因子并未发现关联。
与本研究结果类似,很多研究支持DISC1基因与精神分裂症关联[7-9]。一些细胞生物学研究提示DISC1与其他一些蛋白如收缩与延伸蛋白ζ-1(FEZ1)、类核分布元件(Nudel)和转录激活因子4/5(ATF4/ATF5)等相互作用从而影响神经发育进程,如神经元迁移、信号转导以及轴突发育等[17]。Callicott等人报道DISC1基因与大脑海马灰质体积减少及执行认知功能时海马异常衔接关联[18]。这些研究提示DISC1基因变异可能会影响到神经认知功能。本研究发现rs821616(Ser704Cys)多态性与精神分裂症关联。rs821616(Ser704Cys)位于DISC1基因的第11个外显子上。这个外显子被认为能够编码与ATF4/ATF5和Nudel相互作用的一种蛋白的某个区域[19]。因此rs821616(Ser704Cys)的非同义突变可能会通过单体型作用或连锁不平衡其他的功能变异来增加精神分裂症的易感性。然而,有些研究并没有能够复制DISC1基因与精神分裂症关联的阳性结果。其中这个基因最初的发现者在以后的一个研究中也没能复制出阳性结果[20]。Kockelkorn等人[21]在日本人群中及Kim等人[22]在韩国人口中均未能发现DISC1基因与精神分裂症之间的阳性关联。本研究进一步验证了DISC1基因是精神分裂症的一个风险基因。
Callicott等人[18]发现DISC1基因中的一个SNP与大脑的海马结构和功能关联,很多研究发现大脑海马功能异常与精神分裂症阳性精神症状的严重性有关联[23-25]。在上面研究的基础之上,DeRosse等人提出假设DISC1基因与精神分裂症阳性症状关联,并且进一步证实了由DISC1基因中rs821616(Ser704Cys)和rs821597两个SNPs组成的单体型与精神分裂症妄想症状终生严重程度关联[12]。Szeszko等人同时也发现DISC1基因与大脑前额叶皮质体积及阳性精神病性症状关联[13]。Hennah等人研究发现DISC1基因的变异与精神分裂症患者的妄想、幻觉及阴性症状关联[11]。
然而本研究并未发现DISC1基因与精神分裂症的临床症状存在关联。这与国外的一些研究结果不一致,可能与以下几个因素有关。(1)病人来自不同的种族人群:DeRosse等人[12]的研究对象是高加索人,而本文对象是中国汉族人。(2)症状评定工具不同:Szeszko等人[13]使用DSM-IV的定式临床晤谈量表(Structured Clinical Interview for Axis I DSM-IV Disorders,SCID)评定精神病人的临床症状。SCID里面包含有14条阳性症状项目,而本文使用的评定工具是阳性与阴性症状量表(PANSS)[14]。在PANSS里面,阳性症状因子分包括妄想、幻觉行为、夸大、猜疑和不寻常思维内容等几项内容[15]。(3)本研究仅分析了两个SNPs位点。
总之,本文的病例对照研究提供了进一步的证据支持DISC1基因是精神分裂症的易患基因。但并没有发现DISC1基因多态性与精神分裂症临床症状之间的阳性关联。本研究结果提示我们尚需进一步寻找生物学证据来探讨风险基因变异对精神分裂症精神病理学的影响。
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篇4
转化医学(translationalmedicine),又称为转化研究。这个概念主要来源于20世纪90年代的“转化研究”(translationalresearch)一词———1993年,乳腺癌易感基因(breastcancersusceptibilitygene1,BRCA1)被发现,并成为新一代的生物标志和靶点应用于早期诊断,从而把实验室内的的发现真正转变成临床的应用工具。自此,“转化研究”开始逐渐被人们所认知[2]。作为一个新兴的医学概念,转化医学主要包括以下几个方面:①通过实验研究在人类中验证新的治疗策略;②研制新的医疗仪器和发展新的诊断手段;③在以治愈疾病为目标的同时,加深对人类疾病及其复杂性的了解[3]。作为基因组和生物信息学革命的时代产物之一,“转化医学”虽然是一个专业术语,但却贯穿于医疗研究与疾病防治的始终。
国外医学界近年来非常重视转化医学的研究工作。2003年美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth,NIH)董事Zerhouni在Science发表了名为TheNIHRoadmap的文章,引领全世界的研究人员把目光聚焦在转化医学[4]。目前国际上多间大学都已开始设置临床和转化科学中心,NIH设立了“临床和转化科学奖”,JournalofTranslationalMedicine、TranslationalResearch、Science子刊TranslationalMedicine等期刊陆续创立,更加体现了现在医学界对转化医学这一“桥梁”的迫切需求和向往。在国内,国家新科技体系构明确了“一个中心:国家转化整合医学研究中心;三个支撑:研究型医院、研究现场、协同科技环境体系的科技支撑战略”的新思路。目前,医学临床、药学等领域的转化医学已经轰轰烈烈地展开,各研究中心如雨后春笋般纷纷建立,但在预防医学中对转化医学的研究才刚刚起步,许多学科还是一片空白,亟待广大卫生工作者的关注和涉猎。
2预防医学中的转化之路
大量数据表明,随着工业化、城镇化、人口老龄化和生活方式的变化,慢性病已成为威胁我国人民健康的主要公共卫生问题。然而慢性病是可以预防和早期诊断的。因此,只有构建强大的预防医学创新体系,将高速发展的预防医学基础研究尽快应用到实际公共卫生服务中,才能达到更全面更有效的三级预防,以最小的投入赢得最大效益,增进全民健康水平,真正实现人人享有卫生保健的宏伟目标。
2.1转化医学在毒理学领域中的应用和前景在预防医学领域中,毒理学的研究任务主要是描述机体与外源化学物的中毒机理,对外来化学物进行安全性评价,从而为制订有关卫生标准和管理方案提供可靠的科学依据。现在,大量新化学物投入使用,给人类健康带来了许多潜在的隐患。而现行的化学物危险度评价体系,尤其是对毒效应无阈值的化学物的检测评价,存在多种局限性和缺陷,如可以测试的化学品数量少;动物实验周期长;评价的费用高;化学物危险性评价存在物种差异等,这些缺陷正是转化医学在毒理学应用的重大课题[5]。
生物标志物的检测是转化医学在环境和职业毒理学应用的中心环节。新的化学物毒性评价策略提出,应该把当前以死亡、突变、肿瘤形成等终点事件(apicalendpoints)为观察指标的毒性效应评价体系,转换为基于毒作用机制研究结果,以毒性通路(toxicitypathways)相关生物标志表达异常为观察指标的高通量(high-throughout)毒性效应评价体系。即利用高通量的生物技术及生物信息学的发展,测定毒作用导致的“通路”或“关键事件(keyevents)”改变,建立相应的细胞预测模型并进行剂量-反应关系的检测,结合环境检测水平和人群暴露状况进行危险度评价,从而开展预防医学现场的推应用,以此为基础提出实际有效的防治措施。这一依赖灵敏快捷的细胞试验进行危险度评价的理念能大大减少动物试验体系所需的花费和时间,因而与转化医学概念相呼应[6]。
为此,近年来,部分学者已经致力于开展毒理学细胞模型的研究,力图以体外细胞取代传统的动物模型,以获得更快速,更具代表性的检测工具和评价手段。例如,Lundberg等[7]于2002年通过成功导入了猿猴病毒40(SV40)的早期区和端粒酶催化亚基———人端粒酶逆转录酶(hTERT)构建了永生化的原代人类呼吸道上皮细胞,这些永生化细胞可被H-ras或者K-ras致癌基因诱导致恶性转变。在随后的研究中,亦提示出该类细胞株模型对于致癌物的检测可大大缩短细胞转化的间期,从而具有潜在的应用于化学致癌活性筛查的价值。这些研究成果,将为环境致癌物毒性检测带来快速简便的应用手段和工具[8]。综上所述,对于卫生毒理中的基础研究来说,必须在研究过程中始终贯穿转化医学的理念,才能真正实现基础研究成果与预防实践指导间快速有效的转化。
2.2转化医学在营养学领域中的应用和前景从18世纪起源至今,营养学已经从单纯的食品安全和膳食结构的研究开始走向分子营养学的突破期。近年来分子营养学的研究,尤其是对植物化学物的研究更是方兴未艾。如大豆异黄酮,最初是由于流行病学研究显示食用豆制品对女性围绝经期症状、心血管疾病、某些癌症有着重要的防治作用而被发现的[9-12]。经过多学科证实其具有类雌激素的作用。随后,其他植物化学物质如番茄红素,花青素,大蒜素等植物化学物质也逐渐通过基础研究阐明其健康促进的功效,而被广泛应用于改善人群的健康状态和辅助治疗各种疾病,使得营养基础研究的成果发挥了重要的保护人体健康的功效。
如果说植物化学物的研究使得营养学领域更为广泛,那么营养基因组学、营养遗传学的兴起使人们对于人类营养的研究更为深入。从实验室到临床,基因多态性的存在被认为是一个许多基础研究成果无法应用于临床实践的主要转化障碍[5]。而对于营养学,这一障碍却恰恰成为营养学发展的一个转折点。近年来,越来越多的研究表明营养素具有调控基因表达的作用,同时由于异质性的存在,决定了不同的个体对不同的营养需求的质和量的不同。参考摄入量、推荐摄入量、适宜摄入量等名词对由基因多态性引起的个体差异已显得不完全实用了。而近年来日渐成熟的生物芯片、蛋白组学等高通量技术则为营养膳食摄入的个体化指导提供了可能。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的常见C677T多态性便是饮食-单基因多态性相互作用的一个经典例子。过去的研究发现,叶酸和神经管畸形、肿瘤和心血管疾病相关[13]。而MTHFR是叶酸代谢的关键酶之一。缺乏这一关键酶将导致严重或者中度的高半胱氨酸血症。MTHFR有两种多态现象:C677T(A222V)和A1298C(E429A)[14]。在欧洲人中,MTHFRC677T的发生率是0.233%~0.410%。包含前者的MTHFR可降低酶的活性,从而导致在缺乏叶酸的情况下血清中同型半胱氨酸浓度的上升,从而增加神经管缺陷儿童的出生率。
由此可认为,对于携带MTHFRC677T基因的个体,需要补充更多的叶酸,才能获得更好的生存质量和优生学的预防作用。此外,基因多态性和饮食的相互作用与多种慢性疾病和引起慢性疾病的危险因子之间关联紧密,包括癌症、冠心病和肥胖等[15-17]。国外的一些公司,如Genova和MetaMetrix等,已经开始就基因-饮食的相互作用特点开展专业诊断,为个体的饮食补充决策给予指导和帮助。由此可见,从人群膳食指南到个体化膳食指导的转化,将会是新世纪的营养学发展趋势所在。
2.3转化医学在妇幼卫生学领域中的应用和前景耳聋是一种严重影响身心健康的疾病。在世界范围内,每100名新生儿中就有1名患有先天性耳聋[18]。而我国每年新生听障儿童也多达3余万人。不可忽视的是,遗传因素在所有致聋原因中占有高达60%的比例。如何通过快速、敏感的筛查方法进行产前诊断,减少遗传性耳聋患儿的降生,是妇幼保健的关注重点之一。
近年,我国遗传性耳聋的流行病学调查发现,在中国的遗传性耳聋中的基因位点较为集中。针对这一结果,中国人民总医院聋病分子诊断研究所联合博奥生物有限公司共同研发推出“遗传性耳聋基因芯片检测系统”,为遗传性耳聋的广泛筛查,尽早诊断提供了有效的科技手段,同时也为临床医生的诊断提供了病因学方面的证据。从2006年到2007年,中国人民总医院进行的515例双盲对照实验中,芯片结果与测序结果符合率为100%,非综合征性重度和极重度耳聋患者的突变检出率为42.41%[19]。从而使得该技术在中国人民总医院、北京同仁医院、中国聋儿康复研究中心等医院开始得到了应用。这一检测技术能否像唐氏综合症的产前诊断那样灵敏与特异还需要进一步的证明。但是,在这个从基础到临床,把科研成果转化为儿少预防保健技术的过程是明确的———从临床观察到实验室研究,再根据流行病学的调研结果,协同相应产业共同开发,推出相应手段应用于临床与预防保健。
2.4转化医学在突发公共卫生事件领域中的应用和前景2003年的SARS病毒造成的非典型肺炎流行和2009年甲型H1N1流感病毒引发的流行性感冒引起了全球公共卫生工作者的高度关注。但正是这些突发公共卫生事件的出现,为疫苗的基础研究向实际应用的快速转化带来了新曙光:例如,传统的疫苗生产的方法从研发、毒理学和动物研究直到一、二和三期人体试验至少需要数年的时间,而近年来,疫苗佐剂改良、皮内接种节约疫苗用量以及反向遗传学技术和应用重组DNA技术直接细胞培养等研究成果均可大大缩短产品的生产时间[20],而采用鼻腔喷雾的方法也将使接种更简易快速[21],同时由于这些突发事件带来的影响,政府对于疫苗管理审批制度程序化的改革也大大加快了疫苗投入使用的时间。因此应该认识到,以基础科研人员、临床医生、公共卫生工作人员的技术成果为支持,相关企业产业化为依托,多学科共同协作为平台,政府的决策支持为后盾,才能真正快速有效地应对突发公共卫生事件,使基础研究的成果和科学实践结合,把“转化医学”的桥梁搭建于研、产、学的鸿沟间,实现科学进步、公众健康的双赢局面。
篇5
[关键词]药用植物； DNA标记辅助育种； 三七； 连作障碍； 抗病品种；简化基因组测序技术； 单核苷酸多态性
药用植物传统育种主要依赖于植物的表型选择，一个优良品种的培育往往需要花费几年甚至十几年的时间，如何提高育种效率，是育种的关键。基因型与环境间互作等多重因素会影响表型选择效率，现代分子生物技术可加快药用植物育种进程，而且缩短育种周期，其中药用植物DNA标记辅助育种以DNA多态性为基础，依据分子杂交、聚合酶链式反应、高通量测序等技术，筛选与高产、优质、抗逆等表型相联的DN段作为标记，辅助新品种的选育，该技术可应用于遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源遗传多样性、分子标记辅助选择等方面。随着测序成本的降低，已经陆续在中草药开展了转录组、全基因组测序，这些序列信息提供了大量的SSR和SNP等分子标记，有利于高密度遗传图谱和物理图谱的构建，高密度图谱加速了分子标记与优良性状之间的连锁研究，为发掘植物抗逆及参与有效成分合成途径的新基因提供了许多线索和启示，提高了选育的效率。陈士林等首次提出“Herbgenomics”的概念，该学科涉及中草药结构基因组、功能基因组、基因组辅助育种、中草药蛋白质组学、中草药宏基因等内容，并阐明本草基因组学将加速药用植物优良品种的选育并促进绿色中药农业的科学化和规模化发展[12]。
本文以三七Panax notoginseng（Burk）FH Chen为例，介绍了药用植物依据DNA多态性为基础，利用高通量测序技术筛选与抗病相关联的SNP标记，辅助三七抗病新品种的选育。三七是五加科人参属植物，其性温、味甘、微苦，具有散瘀止血、消肿定痛的功能，是片仔癀、云南白药、复方三七口服液等常见中药制剂的主要原料之一[3]。三七在心脑血管方面的独特疗效越来越被人们所认可，其需求量逐年增加。为满足日益增长的需求，三七已经开展了系统的栽培技术研究，形成了较为规范的GAP技术体系[4]。然而三七为典型的生态脆弱型阴生植物，其分布区域较窄，连作障碍等问题严重[56]。三七的人工栽培过程中病虫害比较严重，例如根结线虫病害显著抑制了三七块根的生长，抑制率高达30%以上[7]；三七种植导致根际土壤微生物多样性及组成的变化，随着其种植年限增加根腐病致病菌Fusarum oxysporum的丰度显著增加[8]。在病害防治过程中，高毒农药的投入破坏了三七田间生态系统，并造成三七农残及重金属超标。而三七不同栽培品种的抗病性存在显著性差异，选育抗病性品种可获得性状优良、抗逆性强的三七群体植株，有效的减少农药的使用量[911]。抗病新品种的选育是保障三七产业可持续发展的策略之一。
系统选育是三七遗传改良的方式之一，也是三七育种的重要手段。O玉琴等对三七植株性状差异进行比较，结果表明三七植株的茎、块根、休眠芽、花序、叶、果实存在明显变异，为三七育种工作提供了依据[12]。通过对三七不同变异类型中皂苷含量的比较分析，确定将紫根、复叶柄平展型、长形根、宽叶4种类型作为三七品种选育的目标[13]。然而系统选育育种周期长，受环境影响较大，在短时间内选择优良性状难度极大。采用DNA标记辅助三七新品种的选育，该方法不仅准确性高，而且缩短育种周期。本研究利用高通量测序技术检测抗病群体中的SNP位点，结合PCR技术筛选与三七抗病关联的DN段，以此基因片段作为标记辅助系统选育，并利用该关联基因片段筛选潜在的抗病群体。该模式可加快新品种选育及推广的进程，为中药材可持续发展提供思路及策略。
1材料与方法
11三七DNA标记辅助新品种选育流程从文山周边收集抗病单株并播种于云南文山三七科技示范园的试验田，该试验田为三七连作5年病圃。采集病圃中存活三七单株的种子，建立抗病群体；采用简化基因组测序技术（restrictionsite associated dna sequencing，RADSeq） 结合PCR技术筛选抗病群体的关联SNP位点，辅助三七新品种的系统选育；通过淘汰非目标性状，分离和纯化抗病群体，选育三七抗病新品种，三七DNA标记辅助选育流程见图1。
12SNP位点分析采用高通量测序技术筛选抗病植株特异的SNP位点，阐述其特异性。分别采集30株抗病及感根腐病三七植株，采用HiSeq PE150测序，有效数据用于分析寻找SNP标记。测序流程为：利用多种限制性内切酶对该物种DNA分别进行酶切，根据酶切实验的结果选择合适的酶进行后续实验；质检合格的DNA样品，采用RAD建库方式构建长度范围在300～500 bp的pairend文库；Illumina HiSeq PE150测序，有效数据用于分析寻找海量SNP标记。
首先，对每个样品中的RADtag进行比对归类，按照每类tag的深度信息由大到小进行排序，得到每个个体的RADtag频数表[14]。每个样品的RADtag内部进行比对得到样品内部的杂合位点信息。不同样品之间的RADtag进行互相的比对，寻找个体之间单碱基差异信息[15]。综合考虑每个个体RADtag的频数表信息和比对信息，过滤掉可能来自重复区域的结果，从而得到高可信度的群体SNP标记基因分型结果[16]。其中性状关联的算法参照GLM（General Linear Model）模型[17]。
13SNP位点开发基于RADSeq技术获得的SNP位点，设计引物筛选与三七抗病性关联的SNP位点。在人工病圃中分别采集60株三七抗病株及感根腐病植株，采用植物基因组提取试剂盒（天根，中国）提取三七叶片总DNA，DNA浓度及质量经检验后，于-20 ℃备用。随机挑选SNP位点进行开发，以record_519688位点设计抗病及对照群体的通用引物，引物序列为F1：5′TCATTATTATTATCCTC3′，R1：5′GAGCTTAACTAGCCCAG3′。针对上述SNP位点设计抗病群体的特异引物，为提高SNP分析的特异性，在特异引物的3′端区域加入1个人工错配碱基，序列信息为Fk1：5′CATTATTATTATCCTCTTC3′，其中反向引物为R1。采用Pyrobest DNA Polymerase（货号 DR005A，日本TaKaRa公司）对供试DNA进行PCR扩增，反应体系参照王瑞等[18]报道。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，产物送美吉公司进行测序。将产物的序列信息与RADSeq获得的序列进行比对，确定与抗病相关联的SNP位点。
14种苗等级分析将抗病群体的种子收集并播种后，分析种苗等级（n=186），其分类等级依据见表1，同时以常规栽培品种（n=186）为对照，分析抗病品种的种苗质量。表1三七种苗分级标准
Table 1The classification standard of notoginseng seedlings
分级单株重/g外观形态一级≥25休眠芽肥壮，根系生长良好，无病虫感染和机械损伤二级125～25休眠芽肥壮，根系生长良好，无病虫感染和机械损伤三级075～125休眠芽生长一般，根系生长一般，无病虫感染和机械损伤
15病害调查随机取30株种苗，分析其病害类型及发病情况，以常规栽培种为对照，3次重复；调查二年生及三年生三七病害类型及发病率（n=60），并以常规栽培种为对照，3次重复。
16利用与抗病关联的SNP位点筛选潜在抗病群体采用与抗病性关联SNP位点（record_519688）的引物筛选留种基地的三七单株，保留含目标位点的植株栽种到人工病圃中进行系统选育，该模式扩大三七目标株系的繁育群体，提高育种效率并加快其新品种推广的进程。
17数据分析采用SPSS 160软件，在005水平进行显著性方差分析。
2结果
21抗病植株的SNP位点开发结合SNP数据和表型数据，使用tassel v52进行性状关联分析，与感病群体相比，抗病群体具有12个差异的SNP位点（极显著LOD>3）.
833%），而感病株无条带，见图2B。测序产物序列与RADSeq序列结果一致，感病株与抗病株的变异位点，见图2C。结果表明，本试验中该SNP位点与三七抗病性相关，可作为三七抗病品种的DNA标记。依据该位点对抗病群体后代进行选择，目标株为667%，淘汰非目标株辅助系统选育。
A通用引物PCR产物；B特异引物PCR产物；C感病株与抗病株的PCR产物序列信息；1～10及a～k抗病品种；11～12感病品种；MDNA Marker；CK感病株；RC抗病株。
22三七抗病品种的种苗等级基于三七种苗质量及外部形态，制定了种苗的等级指标见图3A。休眠芽肥壮，根系生长良好，无病虫感染和机械损伤，单株质量大于等于25 g的种苗为一级，单株质量125～25 g的种苗为二级；休眠芽及根系生长一般，无病虫感染和机械损伤，单株质量075～125 g的种苗为三级；单株质量小于075 g榧断轮置纭39嬖耘嘀钟肟共∑分值囊患吨置绶直鹞400%，389%；二级种苗分别为156%，267%，三级种苗分别为111%，167%，级下种苗分别为333%，178%见图3B。常规栽培种及抗病品种的一级和二级种苗总量分别为556%，656%。
23三七抗病品种的病害类型及发病率调查发现，该试验区内常规栽培种及抗病品种种苗的主要病害类型为根腐病及锈腐病，见图4。常规栽培种及抗病品种种苗根腐病的发病率分别为67%，11%，而锈腐病发病率分别为156%，44%，抗病品种的根腐病及锈腐病发病率分别下降836%，718%。结果表明，抗病品种种苗对根腐病及锈腐病表现显著的抗性。
调查结果表明，二年及三年生三七主要病害类型为根腐病，见图5A，B。常规栽培种及抗病品种的
二年生三七根腐病发病率分别为34%，19%，三年生三七该病的发病率为114%，42%，见图5C。与对照相比，二年及三年生三七抗病品种的根腐病发病率显著下降了436%，629%。结果表明，二年及三年生三七抗病品种对根腐病表现出显著的抗病性。
24利用与抗病关联的SNP位点筛选潜在抗病群体在3个留种基地进行5 000份单株留种，利用抗病品种的SNP位点进行筛选，见图6。留种基地分别为平远镇莲花塘、砚山县郊址村及文山县平坝镇。随机抽取每个基地100份单株，采用通用引物（F1，R1）均检测出清晰的目标条带（n=300），特异引物（Fk1，R1）检测该300份三七样品的56份样品包含清晰的目标条带。结果表明，随机检测的自然群体中，包含目标位点的单株为187%。后续试验中将目标株通过人工病圃进行系统选育，加快抗病品种的扩繁。
4讨论
本研究利用DNA标记辅助系统选育技术获得首个三七抗病新品种，选育纯化后的抗病品种表现一致性、稳定性及特异性，作为新品种进行登记，该品种命名为“苗乡抗七1号” （云林园植新登第2016060号），对根腐病具有显著的抗性。本研究采用简化基因组测序技术，快速检测抗病品种的SNP位点，依据抗病表型结合PCR技术筛选并确定与抗病相关的SNP位点，利用该位点筛选目标株辅助系统选育，加快三七抗病新品种的选育。此外，利用该关联位点辅助筛选留种基地潜在的抗病群体，之后将包含目标位点的株系在人工病圃中进行系统选育，进一步筛选并纯化抗病群体，该模式扩大了目标株系的繁育群体，提高育种效率并加快中药材的选育及推广，研究结果将陆续发表。
利用DNA序列的遗传多态性可建立物种的遗传标记，加快药用植物品种选育的进程。检测DNA
水平上的遗传变异最精确的方法是直接测定DNA序列，因此可利用高通量测序技术对测定的物种进行分析比较，揭示生物体在单个核苷酸水平上的遗传多态性，辅助系统选育。RADSeq技术是在二代测序基础上发展起来的一项基于全基因组酶切位点的简化基因组测序技术，技术流程简单，不受有无基因组的限制，即可获得数以万计的多态性标记，该方法快速鉴定高标准性的变异标记（SNP），已广泛应用于分子育种，系统进化，种质资源鉴定等领域[19]。石璇等[20]以简化基因组测序技术获得40 765个有效单核苷酸多态（SNP），并用这些SNP位点分析了8个种质的群体结构和系统发生树。简化基因组测序能高效、低成本开发出大量可用于群体遗传分析的SNP标记，为新品种的选育奠定基础。本研究利用简化基因组技术检测SNP位点，为三七分子辅助育种提供有效的分子标记，并为无参考基因组中药材分子辅助育种提供思路及策略。此外，前期工作中作者解析了三七块茎的转录组，获得30 852 单一序列，其中702% 的序列为注释序列，筛选出11个参与三萜皂苷生物合成途径的基因[21]；并依据转录组数据克隆了三萜皂苷合成途径中编码关键酶的基因（PnSE1，PnSE2）[2223]。因此可依据三七转录组及表达谱的研究，以参与或调控皂苷合成途径的关键基因为目标基因，辅助选育高产优质的三七新品种，进而保障优质无公害的三七原料。
本研究首次对三七抗病品种进行系统选育，利用连作5年地块作为三七抗病品种筛选的病圃，选种明确并加快了选育的进程。随着栽培面积的不断扩大，连作障碍造成三七的损失巨大，已成为制约该地区三七产业可持续发展的重要因素[2425]。三七栽培中根腐病及锈腐病是其主要病害类型，其中根腐病造成损失可达70%以上，甚至可导致毁园绝收[2627]。因此，抗根腐病三七新品种的选育是克服连作障碍的有效途径之一。三七的单株根重、株高、茎粗等主要农艺性状与种苗质量有明显的相关性，表现出随着种苗质量等次的提高而增加的趋势；且三七产量也随着种苗等级的提高而提高[28]。本研究中抗病品种的一级及二级种苗总量高于常规栽培品种，抗病品种的种苗对根腐病及锈腐病表现较强的抗性，两年生及三年生三七对根腐病表现显著的抗性，该三七抗病新品种的大面积推广将有效减少农药的使用量，减轻环境污染，降低农残对人体健康的危害，促进并保障三七产业的可持续发展。本文以三七为例系统阐述了药用植物DNA标记辅助育种，而抗病关联DNA标记的进一步验证及潜在抗病群体筛选的研究将在后续文章中发表。
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篇6
1.前列腺癌诊断新进展
前列腺特异抗原（PSA）用于临床前列腺癌诊断已有20余年，其在肿瘤检测、临床分期及预后监测等方面都发挥了一定的作用。然而PSA是否能用于前列腺癌的早期筛查和诊断仍存在着一些争议，其主要原因是良性前列腺增生（BPH）及前列腺炎等均会出现不同程度的PSA升高。另外已有研究表明仅约30%PSA异常（>4.0ng/ml）的患者最后通过穿刺和手术证实罹患了前列腺癌[2]。因此，临床上需要更加特异的前列腺癌早期诊断分子标志物。
1.1PSA异构体：前体PSA（p2PSA）是前列腺癌中具有特异性的PSA异构体。有研究表明，p2PSA和总PSA的比值（p2PSA/tPSA）出现异常升高具有更高的前列腺癌诊断效能[3]。
1.2长链非编码RNA（lncRNA）：lncRNA是一段长度大于200bp，不翻译表达蛋白质的RN段。近年来，随着高通量测序技术的迅猛发展，越来越多的lncRNA被挖掘出具有生物学功能，并能作为疾病的诊断和分型的工具。如前列腺癌抗原3（PCA3）[4]，肺腺癌转移相关性转录子1（ALAT1）[5]。
1.3前列腺癌特异性的单核苷酸多态性（SNPs）：SNPs是指人群中2个相配对基因DNA序列的某一位点出现的差异和多态性，常常用于疾病相关遗传基因的定位、克隆和鉴定。SNPs在前列腺癌领域具有重要的意义和价值，现已发现有50多个SNPs与高加索人群前列腺癌的发病相关[6]。
1.4融合基因：21号染色体上的TMPRSS2和ERG基因间的融合出现在50%以上的高加索前列腺癌人群中。除可在组织中检测到融合基因TMPRSS2-RG之外，研究发现有42%的局灶性前列腺癌患者的尿液中TMPRSS2.ERG的阳性率也显著上升，为TMPRSS2-RG作为无创性诊断标志物提供了有力的证据[7]。
2.前列腺癌治疗新进展
2.1极低危前列腺癌的治疗：在低危前列腺癌的风险分级基础上，2010年美国国家综合癌症网络制定的《前列腺癌临床实践指南》提出了极低危前列腺癌的概念，主要指T1a期肿瘤、Gleason评分≤6分、PSA
2.2前列腺癌根治的微创治疗：目前临床上已广泛开展腹腔镜下前列腺癌癌根治术。随着机器人辅助腹腔镜技术在国内的逐渐展开，它的优点得到广泛认同。与传统腹腔镜下前列腺癌根治术相比，机器人辅助的腹腔镜手术视野更加清晰且具有3D视觉，手术操作灵活方便，术者操作更为舒适，学习曲线更短[8]。特别适合在盆腔深处的吻合操作。机器人辅助腹腔镜前列腺癌根治术更加微创，适合于高龄高危前列腺癌患者，年龄将不再成为前列腺癌根治术的禁忌[9]。机器人辅助腹腔镜手术可能成为前列腺癌根治术的金标准。
2.3高危前列腺癌的治疗：高危前列腺癌的定义标准存在不一致性，CUA的标准是PSA≥20ng/ml或Gleason评分≥8 或临床分期≥T2c的前列腺癌。放疗是目前治疗高危前列腺癌使用最广泛的方案，尤其是外放射治疗结合雄激素去除疗法，被证明可取得比单纯放疗更好的肿瘤控制效果近年。近年，不断有学者尝试对更晚期患者行前列腺癌根治术，例如对T3a、T3b期患者，甚至对于有局部淋巴结转移的患者，仍然推荐行前列腺癌根治术，认为根治术能够最大限度切除肿瘤，包括扩大的淋巴结清扫能够最大限度切除盆腔局部转移的淋巴结，术后辅放疗及内分泌治疗，可以提高患者的生存期。但有研究表明高危前列腺癌患者RARP术后除无生化复发生存率明显低于低、中危患者外，其术后排尿功能和的恢复也差于低、中危患者[10]。
2.4去势抵抗前列腺癌的治疗：近年，去势抵抗前列腺癌（CRPC）的概念取代了雄激素抵抗前列腺癌。在体内血浆雄激素仍然维持在去势水平的状态下，前列腺癌细胞局部的雄激素浓度可能升高，前列腺癌细胞本身及肾上腺也可能产生雄激素，此即为抗雄激素合成药物阿比特龙的作用机理。国外报道，对于CRPC患者来说，在化疗之前，先应用阿比特龙能够更好地延缓病情的进展，延长患者的生存期，使患者更多的获益。除阿比特龙外，恩杂鲁胺、疫苗、米托蒽醌等药物也能够延长患者生存期。另外，从临床研究的结果可以得出结论，治疗肾癌的分子靶向药物用于治疗CRPC能够延缓一部分患者的疾病进展，如舒尼替尼。随着人们对前列腺癌研究的进一步深入，去势抵抗性前列腺癌的治疗一定会取得良好效果。
综上所述，随着前列腺癌发病率的持续上升，全世界学者正不断关注并投入前列腺癌的研究。肿瘤的早期诊断、分型、分期，早期治疗是所有肿瘤研究的热点问题。提高肿瘤的早期诊断率，以减少前列腺穿刺带来的风险和不便。并尽早接受最佳的治疗，达到理想的预后。
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生物药剂学与药物动力学是药学专业的主要专业课程之一，作者在教学过程中从二个方面进行了教学改革的尝试:改革教学内容，以实例做模板阐述课本知识;改革教学方法，以PBL法结合LBL法进行理论教学。在进行PBL教学尝试过程中，学生的参与积极性高，学生的准备情况各异，学生的综合能力有所提高，取得了较好的教学效果。
关键词:
生物药剂学与药物动力学;教学改革
生物药剂学与药物动力学是药学类专业本科生的主要专业课程之一。生物药剂学是研究药物及其剂型在体内的吸收、分布、代谢与排泄过程，阐明药物的剂型因素、机体生物因素和药物治疗之间相互关系的科学［1］。而药物动力学是应用动力学原理和数学处理方法，定量地描述药物通过各种途径进入体内的吸收、分布、代谢、排泄过程的“量时”变化或“血药浓度经时”变化的科学。生物药剂学与药物动力学是一门实践性很强的课程，通过这门课的学习，要使学生具备合理设计制剂处方、科学评价药物制剂质量、科学制订给药方案等方面的基本理论知识和实验技能，为从事制剂研究和应用工作奠定基础。
对于生物药剂学与药物动力学这种内容较多的药学主干学科课程，目前国内的教学大多采用传统的医学教育模式，“以教师为主体，以讲课为中心”，即通常所说的“lecture－basedlearing，LBL”(以授课为基础的学习)。这种模式多是采取全程灌输教学，学生始终处于消极被动地位。教学方法的改革主要是改变单一的以课堂讲授为主的传统教学方法，代之以行之有效的适合该门课程特点的各种教学法，使学生真正由被动接受知识变为主动探求知识。美国许多药学院采取了以问题为基础的学习(problem－basedlearning，PBL)，使授课过程能以学生为中心，激发学生自学，从而达到独立、发挥个性的目的。
PBL对药学学生自主学习、自我管理、独立思考、专题讨论和分析解决问题的能力培养均有促进作用。尽管我国高校的教学改革已进行了多年，但从总体上看，目前大学的教学过程并没有真正摆脱传统教育模式的影响［2］。生物药剂学与药物动力学是药学类专业本科生的主要专业课程。因此，要想很好地掌握这门课程，不仅要求老师讲课生动，而且学生也要充分发挥主观能动性，使自己参与到教学中来。因此，结合生物药剂学中“口服药物的吸收”这一章的教学，作者尝试进行教学改革，并总结了部分心得。
1从以下二个方面进行了教学改革的尝试
1.1改革教学内容，以实例做模板阐述课本知识在强调基本原理和概念的前提下，结合老师自身的科研实践情况，将相关的内容补充到教学过程中［3］。这样，学生既掌握了经典的理论基础，又可以将所学理论知识转换到实践科学中去。比如，“基因多态性与个体化给药”章节中，作者将研究过的“CYP2D6基因多态性对药物药动学影响”案例给学生做一个概述，通过数据和图片的了解，使学生更能清楚基因多态性的理论知识。这样注重学用结合，大大吸引了学生的学习兴趣，促进了教学质量的提高。同时要求老师有丰富的实践和科研经验，能够将理论和实践结合起来，在教学过程中引入更多的实践和临床实例及学科的前沿发展。对老师的自身修养提出了更高的要求，需要老师不断的查阅文献获取新的信息、通过实验和实践将理论知识拓展到新的台阶。
1.2改革教学方法，以PBL法结合LBL法进行理论教学对于教材较为明确的概念、理论，采用LBL教学法。将概念讲解透彻，按书本上的顺序循序渐进，重点的内容详细讲，一般的知识概述讲。比如，该章中药物的吸收机制、影响药物的吸收因素是理论基础，需要讲解清楚。而其中的剂型与制剂因素是药剂学中详细讲解的内容，在这里就可以粗略的概述，学生通过阅读能很快理解。如果老师仍然花很多的时间去讲解这部分内容，学生会觉得枯燥无味。对于综合性比较强的部分，采用PBL教学法。比如，该章中第三节“生物药剂学分类系统与口服药物制剂设计”，这是与实践衔接紧密的部分，在讲解完基本理论后，我们进行了一次PBL教学，题目是:×××药物的剂型改进。给予学生一星期的时间去查阅资料、总结、以WORD文档或PPT的形式发给老师。然后以自荐的形式推出2个同学上台讲解，讲完后其他同学提出问题或互相讨论。该章中第四节“口服药物吸收的研究方法与技术”，这是实践性很强的部分，光靠老师在讲台上讲解，学生未必能理解，而关于这部分内容的文献很多。因此，我们对这部分内容也进行了一次PBL教学，要求学生通过查阅整理文献，详细透彻了解一种口服药物吸收的研究方法。并自荐1～2名同学上台讲解。
2在进行PBL教学尝试过程中，作者有很多感触
2.1学生的参与积极性高作者和学生交流了PBL教学思想后，大部分学生肯定了这种方式，学生也希望老师不要采用“填鸭式”的教学方式。老师在上面讲，学生在下面听的教学模式不能让学生兴奋起来。以致有很多学生不上课，或者上课的时候干自己的事情:看英语、玩手机等。第一次PBL教学尝试的时候，只有个别的同学参与进来，他们认真准备，克服自己胆怯的心理大胆自荐上台展示。在同学和老师的鼓励下愉快的完成了自己的挑战，之后，同学间的提问和互相讨论，气氛很轻松。第二次PBL教学尝试的时候，同学们积极响应，热情很高，让作者觉得很欣慰。有几个同学上台后，由于过度紧张，展示好像进行不下去了，我们给予足够的耐心和友好，终于顺利完成。学生在获得知识的同时，抓住机会锻炼自己，提高各方面的能力才是大学生应该具备的。
2.2学生的准备情况各异在这次教学尝试中，作者没有硬性规定每个学生都必须去完成，因为作者认为只有在自愿的前提下才能看出教学改革的利弊和学生的主动性。有很多同学通过查阅文献认真的准备了PPT，特别是自荐上台展示的同学高度认真，完成得很好。内容上很有条理，PPT的制作很精致。也有少数同学没有准备或应付式的准备，大段文字的拷贝，这让我们看到传统教学下的应试态度和学生心理。
2.3学生的综合能力有所提高作者从教学改革尝试中体会到，教学方法的改革带来很多的好处。比如:(1)大大地促进学生动手查阅资料的能力:现在我们是网络时代，随时可以通过网络去了解每一个学科的发展和动态。当给予我们的学生一个明确的目标去查询的时候，就能引导他们对网络的正确运用，而不只是运用网络沉迷于游戏。(2)提高学生PPT制作水平:从上台展示的学生PPT制作水平来看，有的学生的PPT有很多地方需要进行提高，如PPT页面的布局，字体的大小和颜色的搭配，层次的整理，还有很多同学就是大段文字的拷贝让观众觉得很啰嗦。在问题讨论时，作者会给同学提出这些方面的不足，为学生的毕业答辩奠定基础。(3)培养了学生的语言表达能力:在展示的同学中，有的同学讲得很有老师范，条理清楚，大方得体，经询问知道这样的学生因为多次参加各种活动累积了经验;而有的同学是头一次登台，展示过程中紧张得不能继续了，经鼓励和支持好不容易才熬到最后。作者认为，如果课堂上能经常给同学机会去展示，那么对于那些缺少锻炼的同学是一次很好的提高。(4)增强了学生的自学能力:有的同学说，在准备过程中，会涉及到多门学科的综合，比如药剂学，药物分析，临床药学等。当给学生布置一个明确的任务后，学生在查询过程中会了解到相关的知识，扩大了学生的知识面。最终使学生从根本上掌握了相关教学内容，促进了教学质量的提高。
3展望
时下各个学校都在提出改革教学方法，将以老师为主的课堂转换成以学生为中心的课堂。作者从实践中也深刻体会到教学改革的必要性，“授之以鱼不如授之以渔”。学生在大学过程中会接触到很多学科的学习，如果能激发学生的学习主动性，那么他们的大学生活不会仅仅是机械地接受老师课堂所讲，然后应付期末考试之后将知识抛之脑后;学生将根据自己的兴趣和爱好，挖掘学科真正的内在，为以后的发展奠定坚实的基础。
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蛋白质组学和功能蛋白质组学随着蛋白质组的提出，蛋白质组学也自然而然地孕育产生。但目前，蛋白质组学仍无明确的定义。一般认为它是研究蛋白质组或应用大规模蛋白质分离和识别技术研究蛋白质组的一门学科，是对基因组所表达的整套蛋白质的分析。现阶段，蛋白质组学研究的内容不仅包括对各种蛋白质的识别和定量化，还包括确定它们的细胞内外的定位、修饰、相互反应、活性，和最终确定它们的功能。并对由此获取的数据进行数据库构建，以及不可或缺的推动这一学科进步的蛋白质组分析技术研究。由于对全部蛋白质的研究是非常困难的。所以中国的科学工作者提出了一种全新的研究策略：功能蛋白质组学。它是位于对个别蛋白质的传统蛋白质研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组研究之间的层次。研究特定时间、特定环境和试验条件下基因组所表达的蛋白质。
2 中医证候的现代研究方法
“证”是生命物质在疾病过程中具有时相性的本质的反映，“候”的原意是说明事物变化的性状，在医学范畴是指病变的临床表现。“证候”说明了中医学是通过观察病人的异常表现来把握疾病本质的。证具有整体性、定型性＼定系性、制约制、时相性，可以概括反映疾病发生的原因和病机、部位和范围；反映邪正相争的态势、病变的性质、类型和机能异常。证候是在致病因素作用下。机体内外环境各系统之间相互关系发生紊乱所产生的综合反应。是反映疾病处于某一阶段病因、病性、病位、病势等病理要素的综合性诊断概念。而证候的多态性是指在目前所认为的某一最基本的证型中包含着若干可分辨的有意义的不同病理状态网。中医的“病”是以中医理论为指导，有其自身的特点和理论体系，每一个病都有各种不同的临床特征，各个不同疾病的发生发展。变化转归等一整套理论体系。中医的病与证是密切联系的。病统辖证，证从属于病，一病可以见数证，某一证候可以见于数病。临床上，一般先了解病人的各种临床症状，舌脉表现，判断疾病的证候，使用相应的方药进行治疗。辨病与辨证是用药的前提，没有正确的疾病诊断和辨证分型，就无法正确地进行治疗。
目前，中医证候学研究方法有：(1)多学科多层次多因素分析法。该法是借用数学模型达到辨证的计量目的。(2)在宏观辨证的基础上，用现代医学的方法，寻找证的客观指标，探讨其本质，即用微观指标认识与辨证。(3)主次症状判断法，根据中医的现证，用传统的辨证方法分析综合，通过临床实践，反复修改、完善，确定主次症状，制定辨证标准。(4)主症辨证法，主症通常是诊断该证必须依靠的特征症状或非特异性症状的特意组合，在证中起决定和主导作用，而次症只起补充和参考作用，此法在辨证中将复杂的辨证条理化、简明化、系统化。
中医重视疾病某阶段机体的整体状态。传统中医学对疾病的认识侧重于整体、宏观、司外揣内，通过疾病表现在外的征象推测演绎疾病的病因、病性、病位。归纳出证的概念。证候是致病因子与体质因素相互作用的综合反应，这种综合反应的过程具有一定的物质基础，用现代科技手段和方法来揭示其物质基础并进行定量和定性对证候及辨证的规范化具有十分重要的意义。中医界早年致力于探索证候的高特异性和高灵敏性的指标，试图建立证候实验诊断单个金指标，然而，由于证的整体性、动态性和异病同证，同病异证等特征，不可能用单一指标作定性、定量、定位的说明。据此，脏腑证候客观化研究采用综合指标，精选非特异指标进行特异组合，建立能反映证本质并能区别他证的定性、定量、定位综合实验指标，辅助四诊，确定证候诊断。
篇9
[关键词] 中西医结合；中医存废
[中图分类号] R2-031 [文献标识码]B [文章编号]1673-7210（2008）08（c）-098-03
中、西医学分属两个不同的医学体系，他们的不足之处恰好是对方的优势所在，在临床实践中做到优势互补就能使两者效能最大化。中医学不会因为有部分缺点而被历史淘汰。
1中、西医学两个体系各有所长和不足，优势互补
中、西医学分属于两个不同的医学体系，由于产生的地域与历史背景不同，两者之间存在着很大差异。中医学植根于博大精深的中国传统文化，是在长期的中医诊疗实践活动中形成并逐渐丰富发展起来的，强调整体观念、恒动观念和辨证论治，其优势在于具有现代“三论”先进科学思想的整体恒动观，三因制宜的辨证论治临床思维与防治方法符合现在生物-心理-社会医学模式，中药方剂安全低毒和中医治疗相对的简便廉验更易为现代人接受，中医的摄生防病更符合现代人的养生保健模式；缺点在于中医学科的现代科学基础薄弱，理论概念抽象，缺乏当代医学界可以接受的评价方法和技术标准，受经验主导，临床疗效可重复性低，方法传统古朴难接受现代科技的成果。西医学源于欧洲文化，是以实验结果为主要依据理论的实验医学，西医学强调诊断治疗的实验室依据，诊断规范、疗效确切，可重复性强，与现代自然科学同步发展，其科学形式和思维方法易为现代人接受；缺点在于偏重局部研究，过分依赖定量检测，整体认识复杂的生命现象不足，从总体上还是偏重生物医学，尚未真正完成医学模式的现在转变，医源性、药源性疾病日益增多，医疗费用及医疗保险费用越来越昂贵，它的现实要求是寻求“替代医学”。 故而有人评价中医学“精于穷理而拙于格物，信理太过而涉于虚”；西医学“长于格物而短于穷理，逐物太过则涉于固”[1]。中、西医学研究对象和最终目标具有高度的同一性，决定了两者可以在临床实践中对同一个目标得到统一，这是中、西医学两大体系沟通的基石。更重要的是中西医学的不足之处都恰好是对方的优势所在，二者结合可以各取所长，做到优势互补，因此，中西医的兼融与互补成为中西医结合的必由之路，也将是中国医学走向世界的必经之路。
我们在承认现代中医学越来越借鉴西医学诊疗方法的同时，也应该看到现代西医学界越来越多地在运用中医学的思路（如整体观），治疗手段（如针灸）和药物（如中草药）。中西医学在很多方面已经是你中有我、我中有你，轻言废除中医无论对于中医学还是西医学危害都是相当大的。
2中西医结合对西医学的促进
2.1中医学对西医学的替代作用
中医药在国外属于替代医学, 它包括中医中草药、针灸、气功及现代医学以外的各国各民族的传统方法。进入21世纪, 替代医学正在欧美日韩等发达地区兴起, 它为人类提供了一种全新的健康医疗模式。何谓替代医学? 在美国替代医学( Alternative Medicine) 是指西医以外的医疗; 在英国叫辅助医学( Complementary Med icine) , 是指对西医起辅助作用的疗法。现在国际上通称辅助替代医疗(Complementary and Alternative Medicine, 简称CAM ) 。它包括传统医学和民间疗法, 大多是经验性的、增强人类与生俱来的免疫力的、保健预防及治疗作用的, 其中许多未经现代科学证实。替代医疗( CAM ) 的兴起反驳了“废除中医”的论调: C就是说西医有不足之处, 需要中医来补充, 中医、西医各有所长,可以互补；A就是说西医不是唯一的, 还有其他的医学, 特别中医是最佳选择, 原因是西医对许多疑难病症目前仍无解决办法, 而替代医疗则起着发挥人类自身对疾病的抵抗力和免疫功能；西药毒副作用严重, 而替代医疗可提供缓解和摆脱药物依赖性的办法；西医使用先进的医疗仪器和器具、药品,手术费价格昂贵, 而替代医疗是一条寻求减少社会和个人医疗费用负担的途径。
2.2西医学在中西医结合中可以找到自己的发展空间
西医学是实验医学与临床医学的结合，一方面从自然科学（包括基础生命科学）的发展中不断引入新的观点、理论和方法，把其中具有应用前景的研究成果及新技术转化为能应用于临床医学的有效手段；同时也和临床医学保持密切的联系，把临床诊断、疾病分析以及病原学方面的难点纳入自己的视野，形成自己的思路与研究方向，并在此过程中不断丰富、充实和发展自身的学科体系。
然而，不能否认由于我国不论是在西医基础医学还是在西医临床医学上同国外发达国家都具有相当大的差距，这种差距在相当长的时期内还会存在，这就不可避免地造成了我国西医学与发达国家西医学的差距。我们不能通过照搬别人的东西来提高自己，更不能在国内中西医结合蓬勃发展的大好形势中保持沉默，放弃提高自己的机会。将国内实验医学的成果与中医临床医学结合起来是我们的优势所在，通过这条路，中国西医学界将走出一条更有自己特色的道路。
3中西医结合对中医学的促进
3.1对中医辨证的客观化的促进
辨证论治是中医学的精髓。辨证思维的方法起源于《内经》，奠定于《伤寒论》，经过二千余年的发展，形成自己特殊和固定的模式。历代中医十分重视对“证”的研究，先后创立了八纲辨证、病因辨证、经络辨证、脏腑辨证、气血津液辨证、六经辨证、卫气营血辨证、三焦辨证等。在辨证过程中，由于各个医生自身的主观性，对客观认识的差异和思维过程的特异性，造成中医辨证在实际应用中缺乏标准化、规范化、微量化，很难求得客观的判断和统一的标准。随着现代化西医学日新月异的发展，减少由主观因素带来的差异，借助现代科技成果，使中医证候的定义从微观定量的角度加以充实，从而制定出一套客观、量化的依据。
当今的中医辨证客观化研究取得了一定进展。如充血性心力衰竭(congestive heart failure, CHF)中医辨证客观化指标的选择呈现从简单到复杂逐步深人的趋势。通过对122例CHF患者的血流变学变化的分析，发现血液黏度增高按心肾阳虚气虚血瘀>阳虚水泛>心气阴虚变化[3]。CHF患者的心钠素（atrial natriuretic peptide, ANP）、肾素(renin angiotensin, RA)、血管紧张素(angiotonin, ANG)、醛固酮(aldosterone, ALD)、内皮素(endothelin, ET)和降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)浓度，在正虚证中大致呈单纯气虚
高血压病的中医辨证通过与西医学的结合，研究认为高血压的辨证分型与血液流变动力学[5]、交感神经系统的去甲肾上腺素（noradrenaline, NA）含量、肾素-血管紧张素-醛固酮系统、血管活性物质ANP、一氧化氮（nitrogen monoxidum, NO）等密切相关[6-8]。
应用现代科技手段对来慢性肾功能衰竭(chronic renal function failure, CRF)的不同证型进行客观化研究已日趋深化，许多实验室指标与中医证型之间存在着一定的相关性，多学科、多系统、全方位的探讨CRF各证型的客观化指标，最终有可能建立一种比较完善的辨证方法乃至新的辨证体系[9-12]。
中医辨证与西医学的结合，使中医辨证的客观化研究前进了一大步，虽然目前的中医辨证客观化研究还未形成一个系统的理论体系，但随着研究的深度和广度不断加强，西医学必将为中医辨证客观化的发展做出更大的贡献。
3.2对中医“证”本质的研究的促进
中医学所说的“证”，其内涵和实质，应当是哲理、医理与临床实践有机结合。中医对证的认识起源于临床实践中，证是中医理论中用于诊治疾病的一个基本单元，是辨证论治的前提。证候实质研究是中医理论现代化研究的主要领域，证候实质研究的目的是为了用相对客观监测指标对证做出定量诊断，并以此为中介物，实现中西两种医学本质上的交汇与融合。
不同的证具有不同的临床表现和特有的病理生理特点。如肝郁脾虚证、肝血瘀阻证、肝阴不足证，病位都在肝，但肝郁脾虚、血瘀、阴虚决定了截然不同的证候特征。
现代中医对证的实质进行探讨，如肝郁脾虚证，患者发生了四项主要变化：①自主神经功能异常，血浆NA、肾上腺素(adnephrin, AD)含量减低；②环磷酸腺苷/环磷酸鸟苷(cyclic adenosine monophosphate, camp/cyclic guanosine monophosphatec, cGMP)比值下降；③血黏度升高，红细胞电泳时间延长；④小肠吸收功能降低。其中三项以上同步出现率达65%。说明肝郁脾虚证主要是神经内分泌功能失调及消化机能障碍的综合表现[13]。
对各种不同疾病所表现的寒证、热证患者分别测定其血中三碘甲腺原氨酸(triiodo thyronine, T3)、四碘甲腺原氨酸(tetraiodothyronine, T4)、游离三碘甲腺原氨酸(free triiodothyronine, FT3)、游离四碘甲腺原氨酸(free thyroxine, FT4)、睾酮(testosterone, T)、雌二醇(estradiol, E2)、及皮质醇(cortisol，CO)等指标，FT3、FT4数值热证高而寒证低，依次为虚热证组>实热证组>对照组>实寒证组>虚寒证组，提示热证基础代谢及氧消耗升高而寒证相反，CO值实证高而虚证低，依次为实寒证组>实热证组>对照组>虚热证组>虚寒证组，提示CO为形成虚实的因素之一，与寒热关系不显著，性激素T热证高而寒证低，E2女性热证低而寒证高，提示T值高为形成热证的因素之一，E2值高为形成女性寒证的因素之一[14]。
肾阳虚证病人有下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴不同环节、不同程度的功能紊乱。同样在对肾阳虚病人的T3、T4、促甲状腺激素刺激激素(thyrotropic-stimulating hormone, TSH)，T、E2、E2/T等进行测定时，均发现其值比正常人低或发生改变[15,16]。肾阳虚患者的血浆中前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)、PGE2α、环核苷酸cAMP、cGMP 与cAMP/cGMP 均有改变，并且PGE2与PGE2α、cAMP与cGMP 似乎与中医的阴和阳有着对应关系[17]。近年不少学者将cAMP、cGMP之比作为中医阴阳理论的物质基础，对此进行了大量的临床研究，并取得了较为一致的意见，一般认为阴虚证血浆cAMP占优势，阳虚证血浆cGMP占优势，经相应治疗后皆复常，提示血浆cAMP和cGMP含量的改变，是阴虚、阳虚的特征之一。
目前已有不少学者在基因水平上对证的实质研究作了有益探索，其中从基因多态性角度探讨不同基因型在证候易感性方面的差异，是后基因组时代研究的热点内容。由于证候与基因表达差异及基因多态性之间存在着密切的内在联系，所以我们可以此为切入点，充分利用先进的试验方法和检测手段，在基因多态性与证候易感性的相关性研究基础上，深入研究证型的基因差异表达谱，并从功能基因组学的角度对相关基因的调控网络进行分析，进一步研究探讨证候的实质[18]。
另外应用先进的蛋白质组学技术从微观入手，研究机体整体或某一器官、组织乃至细胞全部蛋白质的表达和功能，两者的思路和研究方法具有趋同性，运用蛋白质组学技术和方法，对同一疾病不同证候或同一证候不同疾病的蛋白质组进行分析研究，对了解中医证的实质及临床辨证规范化具有十分重要的意义[19]。
证实质的研究是中医现代化研究的热点，在与西医学的结合过程中，不少证的现代医学描述为广大学者所接受，尤其证的实质研究与当今现代的基因组学和蛋白质组学相结合，必将进一步推动证实质的深入研究。
3.3对中医诊断的促进
传统的中医诊断是在中医理论的指导下，根据四诊（望、闻、问、切）所得，对疾病的类属、病因病机做出判断，为治疗提供依据。西医学往往能够提供患者重要的检验、影像、病理学等客观诊断依据，在一些疾病的诊断中甚至有决定性的意义。
中医诊断结合西医学有助于早期发现和诊断疾病，控制病情缩短病程，提高治愈率。传统中医是以症状和体征作为诊断依据的，但很多疾病出现症状时已错过了最佳治疗时机，而这些疾病大多在出现症状和体征之前就发生了生理学指标的变化，西医学可以检测到这些客观指标的变化，为中医学发挥其作用提供更大的舞台。例如治疗恶性肿瘤的关键就在早诊断早治疗，然而患者在早期多没有症状以致延误病情，通过各种基因、免疫学、影像学检测可以早期发现癌变，可以使中医药尽早发挥其效能，为救治肿瘤患者赢得了宝贵的时间。另外，中医诊断结合西医学也有助于提高自身的准确性与可读性。实验室数据为中医诊断提供了科学依据，使其更容易被大众接受。中医学的基础理论建立在中国古代哲学思想上，其“四大经典”虽博大精深，但晦涩难懂，这就降低了中医诊断的可读性，不易被患者和西医界理解与接受，而实验室数据客观可信，可为中医学的普及做出贡献。
3.4对中医临床疗效评价的促进
传统中医学临床疗效评价的指标缺乏客观性，很难为世界医学界所接受和交流，这严重阻碍了中医学走向世界的步伐。很多西医学没有明显疗效的疾病，经过中医学治疗后都会有显著改善，各种实验室指标能够科学客观反映中医学的疗效。如病毒性肝炎患者经过一定时期的中医药治疗后肝脏功能会明显恢复，此时肝脏血清酶谱和蛋白质代谢的改变是中医药发挥明显疗效的客观证据。再如西医学对自身免疫性疾病系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)的治疗多用激素和免疫抑制剂，但愈后较差。中医学认为此病病机以肝肾阴虚为主，以热毒、血瘀为标，故以滋肝肾之阴，清热解毒和活血祛瘀为治疗原则，常有不错疗效，此时检测血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、补体C3、抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）成为让人信服的评价疗效的客观指标[20,21]。
4中西医结合的迅速发展有力地反驳了中医废除论
医学是一门非常实用的科学，目的即治病救人，简单而明确。中西医结合的迅速发展和壮大恰恰说明了中西医学不论在思维、方法、手段等诸多方面有差别，但两者在治病救人这一终极目标上得到了高度统一和整合。在今天快速发展、日趋强调多元文化交融的世界大潮中， 我们应该多一份对自然的敬畏，对人性的敬畏，对传统的敬畏；多一份对其他科学、文化与传统的尊重与宽容，承认不同学科与文化之间的差异，并以宽容和理解的态度和做法应对这些差异，处理不同意见、信念或学科知识，只有这样，才能充分利用对话以实现不同认识或知识之间的交流与沟通，才能使人类科学文化更加丰富多彩。
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篇10
[关键词] 药理学;总论;教学方法
[中图分类号] R96[文献标识码]C [文章编号]1673-7210(2010)04(a)-192-02
药理学在医学教育中有桥梁学科之称,其地位举足轻重。本门课程知识面广泛,涉及众多基础学科,又与临床学科密切相关。因此,药理学的教学存在难度,而纵观整门课程又以总论教学难度最大。药理学总论主要介绍药理学基本概念,药物代谢动力学基本规律,药物效应动力学基本机制及影响药物作用的因素,虽然在整个教学中所占比例不大(8～10个学时),但它负担着开宗明义、提纲挈领之作用,是药理学学习的总纲和具体药物学习的基础。总论课上得好坏在很大程度上将影响学生对本门课程的学习情绪,产生先入为主的效果,对本门课程的后期学习效果起决定性的影响[1]。教师如能讲得精彩,可使学生变被动接受为主动、科学地学习,为学生进行全课程的学习和取得良好的教学效果打下基础[2]。笔者结合多年来的教学经验,就如何上好药理学总论课谈几点体会。
1 激发学习兴趣,寻找学习动力
怎样拉开总论课的序幕,才能强烈地吸引住每位学生,使他自觉、主动地进入药理学世界的大门呢?教育家布鲁纳曾说过:“学习的最好刺激,乃是对所学材料的兴趣。”兴趣是学生学习知识、掌握技能的原动力,也是发明创造的精神源泉。培养学生浓厚的学习兴趣是教师在总论课上的首要任务之一,对今后教与学的密切配合有着重要意义[3]。
笔者在第一堂课上,首先根据药理学的研究对象和学科任务,有目的性、有针对性地提出几个与日常生活密切相关的问题,而不是照本宣科。如:在大家的经历中,多多少少都曾受过疾病的侵袭,治病的手段都有哪些?学生争相回答后可总结并提示:在各种治疗方法中,药物治疗是临床医生治病的基本手段,是应用最广泛的治疗方法。紧接着再抛出第二组问题:在用药过程中,有没有这样的疑问:为什么每种疾病要选择相应的药物进行治疗,药物进入机体后如何发挥作用,机体如何代谢药物,等等。然后再举出一个临床实例,简要回答上述问题。这样既可以使学生初步明确药理学的基本概念和范围,又可以活跃课堂气氛,吸引学生,激发学生的学习兴趣和强烈的好奇心与求知欲。喜欢药理学,就会以浓厚的兴趣、高涨的热情积极地投入其中,由此收到“一石激起千层浪”的教学效果。
再比如,不良反应是药物使用过程中一个不容忽视、必须谨慎对待的问题,但初接触药理学的学生对此并没有足够的认识。因此,在介绍这部分知识之前,首先以具体数字向学生展示药物不良反应的发生率和致死率之高;再举出实实在在的案例,如反应停事件,使学生深刻认识到不良反应对患者、家庭乃至社会造成的危害之大。至此,学生自然而然要想到究竟什么是药物的不良反应,都有哪些种类的不良反应,各自发生于什么情况,等等。在学生的注意力和兴趣及求知欲被高度唤起的时候,再给他们讲授具体的理论知识,学生理解和掌握起来势必要容易得多,甚至还有的学生感觉这些内容不够多,会在课外自觉主动地通过其他方式来了解更多有关药物不良反应的问题。由此达到了不仅“授人以鱼”,还“授人以渔”的良好教学效果。
总之,学习兴趣是推动学生主动学习的一种内部动力,是提高教学质量的关键。在教学过程中,教师应多想办法激发与维持学生的学习兴趣,变“要我学”为“我要学”,“要我会”为“我要会”,使之爱听、愿学、勤问,敢于知难而进,真正使学生在兴趣中学到知识,从而提高教学质量。
2 掌握基本概念,打好学习基础
药理学总论涉及众多概念,如药物、首过效应、受体等。对这些概念的正确理解与熟练应用,对今后具体药物的学习具有重要指导作用。但概念往往是一些枯燥无味、概括性较强的内容,学生也普遍反映学习起来难度较大。笔者在多年的教学过程中总结出分解-合并-实例验证-引伸的方式,彻底将抽象的概念讲透讲清。
如教材中药物的定义是这样的:药物是指可以改变或查明机体的生理功能及病理状态,可用以预防、诊断和治疗疾病的物质。看似简单的一句话,仅凭死记硬背却难以奏效。在讲解这个概念时,先将其拆分为容易理解的单句:药物的作用、用途、本质分别是什么,并采取边板书边提问的方式进行,学生结合以往知识很容易回答上述问题,在回答问题的同时,既掌握了药物的概念,又理解了药物所涵盖的范畴,纠正了以往一些不正确的认识。继而复述整句话时学生对药物的定义就有了新的理解和认识,也不再认为难以接受。最后再介绍一些有关药物的其他知识以加深印象,如药物的特性,尤其是两重性,处方药与非处方药等。
再如,副作用是药理学中一个非常重要的概念,但学生在学习具体药物之前对此并没有太深的认识。将概念分解,着重指出其要点,如发生前提是治疗剂量下(有别于毒性反应发生在药物剂量过大或体内蓄积过多时),发生原因是药物的药理效应选择性低,本质是药物本身固有的药理作用,可随用药目的而改变,并以阿托品为例来强化上述认识。
通过以上方法的实施,使得抽象的药理学名词变得形象化、具体化、清晰化,不仅改变了药理学教学乏味单调的状况,调动了学生学习的积极性,还能达到事半功倍的效果,为后期药理学的教学奠定良好的基础[4]。
3 把握时代脉搏,触摸学科前沿
当今药物研究日新月异,新药层出不穷,药理学内容也与时俱进,更新较快。总论内容却相对较为固定,但这并不意味着对总论的讲解就可以是“一潭死水”,而应是不断更新的“活水”。总论教学同样要紧跟学科前沿进展,力争在讲授既成知识体系的同时,又向学生介绍药理学的研究热点与发展动态,紧跟时展步伐。
长期以来,临床用药总是针对同一疾病应用相同的药物和剂量,由于个体差异常导致相当比例的患者药物治疗效果差,甚至出现严重不良反应。生物医学模式的转变使得药物治疗学正经历着由经验式向个体化治疗的革命性转变。
大量研究证实,除环境因素外,药物代谢酶、药物转运蛋白以及药物作用靶位等基因的变异是引起药物反应个体差异的根本原因[5]。因此,以基因为导向的个体化用药将为临床更安全、有效和更经济合理地使用药物提供重要途径。这就是方兴未艾的药物基因组学研究[6],即通过对包括药物起效、活化、排泄等过程相关的候选基因进行研究,鉴定基因序列的变异,用统计学原理分析基因突变与药效的关系,将基因的多态性与药物效应的个体多样性紧密联系在一起,并使研究结果更易于在临床得到应用。药物基因组学研究是药理学研究的重要前沿课题,也是人类进入“个体化医学”的重要标志,其结果有可能对每位患者的药物选择、剂量、给药方式等作出预测,从而提高用药的有效性、合理性和安全性,也将大大降低新药研发的成本,提高其投入产出比。
通过这些知识的介绍,一方面拓宽了学生的知识面,进一步激发了学习兴趣,另一方面也使学生深刻认识到学好药理学的重要性和必要性。重要的是,还可以引导学生把学习人类已知和探索人类未知结合起来,培养学生的科研能力,发展学生的探索性思维和创新精神,为他们今后从事创造性的工作打下基础。最后也使我们的教育工作能够适应21世纪医药卫生发展趋势,符合更好地培养跨世纪医药卫生人才的要求。
通过以上教学手段的实施与合理运用,学生普遍反映对总论部分不再感到畏惧,而认为是药理学课程必不可缺的组成部分;在学习时有所侧重,能够抓住学习精华和知识点。重要的是,通过总论的学习,学生对药理学课程产生了浓厚的兴趣和强烈的探索欲,这对他们今后的学习和临床工作必将产生深远的影响,再次印证了我们古老的谚语:良好的开端是成功的一半。
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