细胞生物相容性范文
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篇1
【关键词】 生物相容性；异种去细胞肌腱；制备；实验
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2016.28.195
对于大面积深度烧伤的患者来说， 其自体皮源十分匮乏， 目前临床上较为有效的一类治疗方案为自体微粒皮移植手术[1]。其中选择性去细胞异种皮可帮助患者诱导细胞生长分化， 并有效保护创面， 将该项技术用于修复深度烧伤创面患者的临床意义显著。本次研究采取动物实验方案， 并取得了十分显著的应用效果， 具体报告如下。
1 材料与方法
1. 1 动物与主要试剂 选取3只健康白色家猪， 平均体重（76±8）kg， 成年Wistar大鼠70只， 平均体重（252±14）g， 成年SD大鼠5只， 平均体重（258±12）g， 主要试剂包括25%的戊二醛、胰蛋白酶、小鼠成纤维细胞等。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 将家猪处死后去毛， 并将大张全厚皮剥离后去除脂肪， 将戊二醛稀释至0.1%， 对表皮面连续固定60 min， 反复冲洗后削为0.4～0.8 mm厚的断层皮片， 并采用新洁尔灭连续浸泡15 min， 采用生理盐水反复进行清洗， 给予0.25%的胰蛋白酶消化30 min（37℃）， 并置入TritonX-100溶液内持续进行震荡24 h， 将其反复进行冲洗后置入冰箱内（4℃）保存， 并将包含庆大霉素的生理盐水连续浸泡24 h， 并且每隔6 h换取1次液体， 将其进行封装、辐照消毒并保存。对表皮的保留情况、皮片颜色、质地等进行严密观察， 将选择性去细胞异种皮置于甲醛溶液内（4%）进行固定， 并用石蜡进行包埋、切片、HE染色处理等， 对表皮结构、纤维变化情况等进行严密观察， 同时将新鲜的猪皮进行对照观察。
1. 2. 2 5只成年SD大老鼠， 在手术前24 h对背部进行备皮处理， 将氯胺酮与速眠新进行混合后对腹腔进行注射麻醉处理， 并在大鼠的背部切取全层皮肤， 将其置于生理盐水内备用。70只成年Wistar大鼠， 依据背部皮下植入材料的不同分为1组、2组、3组， 其中1组选择性去细胞异种皮， 2组植入新鲜的猪皮， 3组植入大鼠的异体皮， 并在术前的24 h选择背部备皮， 将全层的皮肤切开， 将皮下组织进行分离后制备皮下囊， 并植入皮片内对切口进行缝合处理， 手术完成后的1、2、4、8、12、16周将大鼠的皮肤切开进行观察， 观察大鼠的皮片与周围组织的粘连情况， 并进行HE染色处理， 对移植区域的炎性反应程度与新生血管、纤维基质细胞长入情况进行观察分析。
对其进行炎性反应分级， 分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级。其中Ⅰ级表示试样的周围无淋巴细胞或者极少量的淋巴细胞；Ⅱ级表示表示出现少量的淋巴细胞；Ⅲ级表示出现少量的中性粒细胞、巨细胞反应、淋巴细胞浸润等；Ⅳ级表示试样周围伴有以中性粒细胞浸润为主的炎性反应。
2 结果
2. 1 对选择性去细胞异种皮与组织学进行观察后得知， 大体观察表现为表皮层较为连续完整， 其表皮面与真皮面分别为黄白色与瓷白色， 较为柔软。
2. 2 进行皮下植入实验后得知， 对其进行大体观察后显示实验动物手术顺利完成， 术后活动良好， 手术切口无肿胀、渗液渗出等情况。
3 讨论
进行微粒皮移植时， 需要采取暂时性的覆盖物进行保护， 较为常见的覆盖物包括新鲜猪皮与异体皮， 其中异体皮可以使得大面积烧伤的治愈率得到明显的提高， 临床应用价值显著， 但是关于异体皮的来源受限较多， 且对于传播病变的微生物可能性难以进行彻底的消除， 所以说， 其临床应用受限[2]。而新鲜的猪皮具有价格经济、来源广泛等特点， 但是发生移植后将出现较早时间的排斥反应， 并且当创面愈合后优于真皮取法将使得功能于外观均不佳。因此， 针对上述问题， 本次研究提出选择性去细胞异种皮的概念， 并将其与自体微粒皮进行有效结合， 将其覆盖深度的烧伤创面将得到较为显著的应用效果。
本次研究选择戊二醛-胰蛋白酶-去污剂进行进行选择性去细胞异种皮实验， 相比以往的临床研究得知， 其中戊二醛的浓度有所下降， 同时胰蛋白酶的作用时间缩短， 将戊二醛作用于表皮面可以助于渗入表皮层， 并产生氨基酸残基反应， 使得胶原分子能够与氨基酸侧链产生交联作用， 将抗原部位进行有效遮蔽， 使得胶原分子之间的稳定性与张力有所提高。其中胰蛋白酶抗原溶解部分真皮层的基质， 使得细胞间隙较为疏松， 并帮助破坏细胞的完整性， 使得胰蛋白酶作用时间缩短， 利于将表皮结构完整进行保留。而非离子型表面活性剂可以与细胞膜磷脂进行结合， 并达到去污、脱细胞的效果[3， 4]。
本次研究结果显示， 对选择性去细胞异种皮大体观察表现为表皮层较为连续完整， 其表皮面与真皮面分别为黄白色与瓷白色， 较为柔软；进行皮下植入实验后得知， 实验动物手术顺利完成， 术后活动良好， 手术切口无肿胀、渗液渗出等情况。
综上所述， 采取戊二醛-胰蛋白酶-去污剂制备选择性去细胞异种皮具有良好的生物相容性与形态学优势。
参考文献
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篇2
关键词：组织工程 载体支架材料 天然材料 合成材料 复合材料
中图分类号：TQ31 文献标识码：A 文章编号：1007-3973（2013）005-052-02
组织工程支架材料在宏观形态、微观结构、机械强度和韧性、可塑性、毒性、免疫原性和细胞相容性等方面都有严格的要求。因此，理想的载体支架材料应具有如下特征：（1）可塑性较好，能构建成特定三维结构。（2）具有良好的机械强度和韧性，满足加工需要。（3）无毒性、无免疫原性、生物相容性好，适宜细胞正常生理功能的发挥。（4）能被生物体降解吸收。
目前，组织工程常用载体支架材料包括：天然材料、合成材料和复合材料。
1 组织工程天然材料
常用于构建组织工程载体支架材料的天然材料主要有：壳聚糖、丝素蛋白和纤维蛋白等。壳聚糖与氨基葡聚糖的性能存在一定的相似之处，而后者是细胞外基质的主要成分。壳聚糖的这一特性使得其被广泛的应用于组织工程的支架材料的制备过程中。壳聚糖制备的载体支架材料除具有良好的生物相容性，还具有抑菌性和促进愈合的性能。将壳聚糖制备的组织工程角膜基质进行板层移植，两周后植片脱落，机械强度不足。闫涛等将丝素蛋白溶液通过透析浓缩后，制成丝素薄膜。但干燥状态下的丝素薄膜质地脆，容易开裂。新西兰大白兔角膜埋植实验表明，丝素蛋白可以体内降解，无明显毒性，生物相容性较好。
2 组织工程合成材料
应用较多的合成组织工程材料主要有聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）以及两者的共聚物（PLGA）等。PGA性质稳定，以其制备的支架机械强度、韧性和降解速率均可控。Hong等用PLGA制备组织工程载体支架，进行兔脂肪干细胞接种，体外培养一周后再自体移植。移植后脂肪干细胞可在支架表面和材料内部正常生长、增殖，脂肪干细胞新分泌合成的胶原纤维和正常角膜胶原纤维较相似，切移植眼角膜内皮与上皮仍旧保持完整且能正常行使功能，逐渐透明。胡晓洁等以PGA为原材料制备载体支架，在体外重建角膜基质。囊袋法植入兔角膜，8周后材料即可完全降解，移植眼的外观与对照眼相似，但PGA降解产物会使移植部位pH值降低。
3 组织工程复合材料
组织工程复合载体支架材料种类主要有：天然材料之间复合、天然材料与合成材料之间复合，以及有机材料与无机材料之间复合。Graf等在复合材料接种角膜细胞进行培养，证明了其能促进角膜上皮细胞进行正常的生长和增殖，同时诱导角膜感觉神经活化，生成YIGSR多肽。有研究显示，将胶原与TERP复合材料移植到角膜上6周后，显示复合支架材料的生物相容性较好，在基质与上皮面之间形成了新的基底膜；复合材料中与基质细胞和上皮细胞结合良好，且有神经长入；复合材料中的细胞能正常行使其生物学功能。
综上所述，天然组织工程载体支架材料的优点在于具有良好的细胞生物相容性和安全性，但材料本身存在的机械强度和韧性不足、降解速率过快等缺陷也是无法忽视的。人工合成组织工程材料本身的物化性能、机械性能和降解速率都是可控的，可以根据组织工程构建的不同需要进行调节，利于规模生产。缺点在于材料本身生物相容性差，且降解产物可能会对生物体产生一定的毒害作用。利用不同性质的载体支架材料构建的组织工程复合材料，具有足够的机械强度和韧性，也具有良好的生物相容性和合适的生物降解速率。既弥补了单一天然载体支架材料本身存在的机械强度和韧性不足、降解速率过快等缺陷，也使得人工合成材料产生细胞毒性、生物相容性差、缺少细胞识别位点的局面有了很大改观。因此，复合载体支架材料在组织工程化组织或器官的构建中越来越受到人们的重视。
参考文献：
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篇3
[关键词]纳米羟磷灰石-脂肪族聚酯酰胺；成骨细胞；生物相容性
[中图分类号]R 783.1[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.01.009
Biological effects of nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite on the osteoblastsDeng Xia1, Xia Xi2.（1. Dept. of Stomatology, Nuclear of Industry 416 Hospital, Chengdu 610051, China; 2. Dept. of Prosthodontics, The Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 400015, China）
[Abstract]ObjectiveTo evaluate the biological effects of nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite（nHA-PEA）on the osteoblast.MethodsThe Dulbecco minimum essential medium（DMEM）leaching liquor of nHA-PEA was applied to the osteoblasts of the test groups while the DMEM itself was applied to control. The methyl thiazolyl tetrazolium assay, flow cytometry and alkaline phosphatase（AKP）analysis were used to evaluate the changes in cell growth, cell cycle and cell function. Moreover, osteoblasts were cultured on the surface of nHA-PEA composite and the attachment, growth and proliferation of osteoblast were investigated. Results The cultured osteoblasts grew well and showed nomorphological variation. Osteoblasts of different test groups demonstrated relative proliferation rate ranging from 92%～107% without dose-dependent effect（P>0.05）. The cell cycle and AKP activity were similar in test and control groups（P>0.05）. Good cell attachment and proliferation manner were observed on the membranes. ConclusionnHA-PEA has no negative effects on the osteoblast and its osteoblastcompatibility is proved.
[Key words]nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite；osteoblast；biocompatibility
有机-无机复合生物材料是组织工程学研究的热点[1]，该材料主要用于修复和重建人体的硬组织。纳米羟磷灰石-脂肪族聚酯酰胺（nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester -amide composite，nHA-PEA）复合材料由nHA粒子与PEA均匀混合制得，其中羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）是人体骨、牙等无机组织的主要成分，PEA及其共聚物是一类新型的生物可降解高分子材料[2]。nHA- PEA复合材料兼具了有机物的韧性和无机物的刚性，具有良好的理化性能。本研究将nHA-PEA复合材料作用于体外培养的成骨细胞，检测其对细胞生长、增殖能力、细胞周期、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性的影响，观察细胞在其表面的黏附、铺展形态，评价其对骨细胞的相容性和生物活性。
1材料和方法
1.1主要材料和仪器
达尔贝科极限必需培养液（Dulbecco minimum
essential medium，DMEM）、胰蛋白酶（Gibco公司，美国），新生小牛血清（成都哈里生物工程有限公司），甲噻唑四唑氮（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂（Sigma公司，美国），AKP试剂盒（北京柏定生物工程有限公司）。Sanyomco-17AI二氧化碳孵箱（Sanyo公司，日本），Olympus IX50相差倒置显微镜（Olympus公司，日本），JSM-5900LV型扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM；JEOL公司，日本），可见光高效分析仪/HTS 7000plus多孔板紫外/荧光（PE公司，美国），流式细胞计数（flow cytometry，FCM；Coulter公司，美国），LightCycler检测仪（Roche公司，德国）。1.2浸提液制备
按文献[3]制得4组nHA-PEA复合材料，按其无机和有机成分的质量分数分组，分别为A组0和100%，B组10%和90%，C组20%和80%，D组30%和70%。将4组nHA-PEA复合材料（平均厚度0.5～1 mm）消毒灭菌后，按照国际标准化组织ISO 10993-5医疗器械生物学评价标准所推荐的试样表面积和浸提介质为6 cm2·mL－1的比例[4]，置37℃滤除细菌的培养液中，浸提3～4 d的浸提液备用。
1.3成骨细胞培养和细胞悬液的制备
取生长稳定的第4代SD乳鼠颅骨成骨细胞，经质量分数0.25%的胰酶消化后行细胞计数，用DMEM配制5×104个每毫升的细胞悬液。
1.4甲噻唑四唑氮比色
将200μL密度为5×104个每毫升的细胞悬液加入96孔板，置于体积分数5%的二氧化碳培养箱，37℃培养24 h，细胞贴壁后弃掉原有培养液，将细胞分为试验组（A～D）和对照组（E），试验组每组均分别加入200、100、50μL终质量分数分别为100%、50%和25%的浸提液，形成A1、
A2、A3，B1、B2、B3，C1、C2、C3，D1、D2、D3，
对照组加入原培养液。每日于相差显微镜下观察细胞形态，生长和增殖情况。分别于第1、3、5、7 d各取96孔板1块，每孔加入20μL的MTT，孵育4 h，每孔加入200μL二甲基亚砜，振荡1 min，混匀，570 nm波长下测定各孔吸光度（A），取3孔均值，计算细胞增殖率（proliferation rate，RP）：RP=（A试验组/A对照组）×100%。1.5流式细胞计数
接种对数生长期的成骨细胞1×105个每毫升瓶，细胞贴壁后A～D组弃原培养液加入质量分数均为100%的复合材料浸提液，E组加入新鲜原培养液，标准环境下3 d换液1次，培养7 d，消化、离心并收集沉淀细胞。流式细胞计数DNA荧光强度及散光参数，Multicycle软件分析细胞的周期分布和程序性死亡情况。1.6碱性磷酸酶活性检测
取1×105个每毫升的细胞悬液3 mL加入小号培养瓶，将其置于体积分数5%的二氧化碳培养箱，37℃培养24 h，细胞贴壁后弃掉原有培养液，A～D组均加入质量分数100%的浸提液，E组加入新鲜原培养液，分别于第4天和第7天中止培养，收集80μL细胞悬液，以AKP试剂盒通过HTS 7000plus多孔板高效分析仪行AKP活性测试。
1.7成骨细胞与材料的复合培养
将载有nHA-PEA复合膜的血盖片试样置于6孔板内，环氧乙烷冷消毒，磷酸缓冲盐溶液浸泡清洗3次，每次1 h，DMEM孵育过夜备用。取1×105个每毫升的细胞悬液，分别接种于已准备好的材料上，37℃，体积分数5%的二氧化碳孵箱继续静置培养5 d。分别于第1天和第5天将试样取出，以体积分数10%的多聚甲醛固定，体积分数30%～100%的乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯置换乙醇，临界点干燥，表面喷金，SEM下观察。1.8统计学分析
使用单因素方差分析，分析各组总体均数间差别有无统计学意义，在检验数据之前对数据行方差齐性检验。用q检验比较两组间均数的差别。P>0.05为差异无统计学意义。
2结果
2.1细胞生长观察及甲噻唑四唑氮比色结果
显微镜下，不同质量分数的nHA-PEA复合材料浸提液组及对照组细胞培养6 h后均已贴壁，12 h细胞突逐渐舒展，24 h细胞开始铺展，72 h后细胞数目明显增多，排列规则密集，细胞呈梭形、三角形或不规则形，形态分析各试验组与对照组细胞形态相似，显示各组细胞均生长良好。试验组和对照组不同时间的MTT比色结果见表1。试验组间的MTT值及其与其对照组间的差异无统计学意义（P>0.05）；试验组成骨细胞的相对增殖率为92%～107%，不同质量分数的nHA-PEA复合材料浸提液组对成骨细胞的细胞毒性级数为0～
1级（0级：细胞相对增殖率大于等于100%，1级：细胞相对增殖率为90%～99%）[5]，不同质量分数浸提液组间差异无统计学意义（P>0.05）。
3讨论
在生物医学材料的细胞毒性试验方法中，最常用的是材料浸提液培养法和细胞材料直接接触法。本试验综合运用了这两种方法，首先选择浸渍法，具体原因如下。1）对于nHA-PEA复合材料，nHA的生物相容性勿庸置疑；而PEA是新型的人工合成的生物降解型高分子材料，其理化性能和降解性能已有相关研究[6]，但其生物相容性鲜有报道。2）由于直接接触法共同培养时，细胞对材料表面和对培养孔板底部的黏附性有差异，细胞洗脱率的不同会产生干扰而使试验复杂化。事实上，仅需考察nHA-PEA复合材料溶出物的
细胞毒性，就可以达到初步评价其生物相容性的目的，而且以材料的浸提液代替材料本身在材料学的研究中已得到公认。本试验严格按照国际标准化组织ISO 10993-5医疗器械生物学评价标准和要求制备生物医学材料浸提液[4]，以浸提出最大量的滤出物质，考察其对成骨细胞增殖和细胞周期的影响。
MTT比色是常用的细胞增殖能力检测方法，可以对材料的细胞毒性作出可靠的定量评价[5]。本试验在相差倒置显微镜下观察到nHA-PEA复合材料浸提液不影响细胞的生长形态；MTT值在试验组间以及各组与对照组间差异无统计学意义，试验组的细胞增殖率在92%～107%，表明nHA-PEA复合材料浸提液对成骨细胞的生长无不良影响。因此在进一步地对细胞周期和功能进行的分析中，仅选用最高质量分数的nHA-PEA复合材料浸提液作为试验组进行分析比较。在加入HA的试验组，MTT值略高于对照组，但差异无统计学意义且无量效关系。原因可能与其中的钙、磷水平较高有关。
流式细胞计数已广泛应用于肿瘤学、生物化学和免疫学等领域，细胞周期检测已成为生物材料生物相容性评价的一种可靠方法和指标[7]，是常规细胞增殖试验的一项重要补充。近年来，生物材料生物相容性研究进展之一是生物材料的生物功能性评价[8]。生物材料作用于细胞后使其周期改变，从而使其行为和功能发生改变。本试验在MTT比色的基础上进一步使用流式细胞计数，旨在从细胞增殖周期的角度来分析nHA-PEA复合材料浸提液对细胞增殖周期DNA合成的影响，从分子水平上评价材料的细胞毒性。从MTT比色可见，组间、组内不同质量分数的nHA-PEA复合材料浸提液对成骨细胞的增殖和增殖周期影响不大，细胞周期各亚期组成比和程序性死亡率差异亦无统计学意义。B、C、D组处于S期的细胞略多，表明加入HA对细胞增殖有一定促进作用，但不显著，不存在量效关系。此结果与MTT比色结果一致。
除了对细胞增殖的影响，生物材料的细胞相容性还表现在材料对细胞重要功能的影响。AKP是骨形成所必需的酶，是生物矿化和成骨细胞分化成熟的早期标志物[9-10]：其表达代表骨形成状况，表明细胞分化的开始，并随细胞分化的发展而增强；其活性的高低，反映了相应细胞向成骨方向化的趋势。本研究采用酶联法对成骨细胞AKP的表达进行检测，结果显示试验组AKP的表达量与对照组相比较差异无统计学意义，说明nHA-PEA复合材料对成骨细胞的功能酶表达无不良影响，也没有明显的促进作用，不抑制其分化功能。
用浸提液作为试验样品测定复合材料中滤出物质对细胞生长、增殖的影响，仅为预测材料植入体内的潜在危害提供了初步依据，其结果尚有一定的局限性；因此，需在浸渍试验良性结果的基础上再采用直接法将成骨细胞与材料联合培养，以进一步考察材料本体的结构性能对细胞生物学的影响。本研究表明，成骨细胞在复合材料上具有良好的黏附、铺展和增殖行为，即nHA-PEA复合材料具有成骨细胞相容性和良好的细胞相容性等特性。
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篇4
HA是一种天然的高分子直链多糖,它是由N-乙酰基-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替连结而成的线型多糖。广泛分布在动物和人体组织及细胞外基质中,在眼玻璃体、房水、滑液、皮肤和脐带中含量较高。被认为是一种填充空间、稳定结构、涂层细胞和保护细胞的多糖。其主要生物作用是稳定细胞间纤维和膜蛋白结构,粘弹性的HA溶液对细胞及细胞间基质的影响,形成了目前HA在医学上应用的基础。对于增加HA的粘弹性和更好的固体性的需要,使开发它的交联衍生物显得尤为必要。交联的衍生物不仅具有更好的流变性能,而且仍保持良好的生物相容性。
2透明质酸衍生物
HA多糖链中含有三种能被衍生的官能团类型,即羟基、羧基和乙酰氨基。由于聚合物的分子量很高,一般不考虑这些残留的端基,用不同的化学试剂和这些官能团反应能得到许多HA衍生物,而各种HA衍生物的实际意义是由它在医学领域上的应用决定的。
2.1羟基改性
羟基改联的HA衍生物(羧基和乙酰氨基不参加反应)被称为hylan。在反应中使用各种不同官能团的交联剂,其中包括甲醛、二羟甲基脲、二羟甲基乙基脲、聚异氰酸酯以及乙烯基砜,在不同的基质中分别可得到形状为粉末、薄膜或涂层的不溶于水的制品。用二乙烯基砜(divinylsultone,DVS)作为交联剂,可得到性能变化很大的HA类凝胶。在室温下,DVS砜很容易和HA碱性水溶液反应而生成交联的HA凝胶,这个反应进行得很快,在几分钟内能得到浓厚的凝胶。这些凝胶在水及含水的介质中膨胀,膨胀率依赖于凝胶的交联度,交联度可以通过改变HA的分子量,HA在反应混合物中的浓度,碱的浓度以及HA/DVS比率来控制。一般用DVS改性得到的HA凝胶拥有特殊的生物相容性和其它有用的性能,使它们成为医学应用上极好的产品。用醛作为交联剂,可得到唯一可溶的HA衍生物(HA流体)。在从动物组织,如公鸡的鸡冠中提取HA之前,用一种能与蛋白质及HA在水性介质中反应的物质处理该组织,这种物质包括甲醛、戊二醛、乙二醛等,但最好是甲醛。此时,HA被化学修饰。从动物组织中抽提HA时,首要问题是去除蛋白,而用甲醛处理后的HA溶液中的蛋白含量比未处理的HA溶液的蛋白含量低得多,并且HA分子量也大大增加,其溶液(HA流体)表现出很高的粘弹性。在碱性介质及有机溶剂存在时,用多官能团的环氧化合物作交联剂,可得到水溶性的交联的HA。根据反应条件,特别是多环氧化合物与HA的比例,也能得到不溶于水的交联HA,最终聚合物的溶解度是由交联度决定的。不溶于水的HA凝胶被推荐用作玻璃体替代物以及用于视网膜剥离手术。
2.2羧基改性
上述方法得到的HA衍生物是以HA的羟基和交联剂反应得到的,通过用交联剂和HA的羧基反应也能得到HA衍生物如酯和胺。例如:在二甲基亚砜中,HA的四丁基铵盐和碳与卤素原子直接连接的任何物质反应生成酯,这些HA酯被推荐用在医学上,包括药物缓释、皮肤疾病等的治疗。在亲核试剂或聚阴离子多糖(除HA外)不存在时,用碳化二亚胺和HA反应制备不溶于水的生物相容性凝胶、薄膜和海绵[2]。可以通过用二碳化二亚胺进行交联和用一碳化二亚胺对HA进行化学修饰而减小它在体内的水溶性和扩散性。在用单官能团的化学试剂时,最终产物不是交联的,它的不溶性是通过引入疏水性的烷基酯得到的,这类产品被推荐用于防止手术后粘连、药物缓释等。而用二官能团的化学试剂交联的HA是一种水凝胶,它拥有不影响其生物相容性的新的药物结合区域,这些交联的化合物作为生物材料和药物输送的相对不溶性的基质是非常有用的。
3透明质酸的临床应用
3.1粘连性手术
HA最初的医学应用是在眼科领域,并已公认HA凝胶的应用是眼科显微手术中的一大里程碑。HA作为粘连性手术器械的目的是在手术期间保护组织,并且给手术提供一个让出空间和移动组织的安全工具,在手术后,当被留在手术部位时,它们变成粘连性手术植入物,保证组织表面的分开,提供一个防止手术后渗出的屏障。粘连性手术植入物的功效是以它们的粘弹性为基础的,粘连性手术植入物最重要的性能除它们的流变性能外,还有生物相容性。HA作为粘连性手术器械主要用于白内障手术,现在HA凝胶已被广泛用于白内障囊内外摘除术、人工晶体植入术、视网膜剥离术和角膜移植术等多种眼科手术中[3、4]。在移去白内障晶状体及进行人工晶体移植时,它能减少手术损伤;在玻璃体视网膜手术后,它也可用作玻璃体的替换物。最新交联的HA凝胶在临床实验中被用作玻璃体的替换物,并证明了HA凝胶能成功地实现脱落视网膜的长期持续的再附着;并且由于hylan流体的粘弹性是相同浓度HA溶液的几倍,所以在眼科学上正在探索hylan流体作为更有效的粘弹性工具。
3.2关节炎治疗
70年代前期,粘性填充物已作为一种新的治疗形式而被应用到医学上。在各种形式的关节炎中,特别是骨关节炎中,关节软组织内细胞基质的粘弹性下降,这种下降是由HA的浓度下降和分子量下降,从而降低了关节滑液的生理性保护,冲击吸收等功能。当使用HA时,关节液的低粘弹性立即升高,疼痛减轻,关节的灵活性增加,并且流变性能通常能恢复到正常水平,而且外源性的HA注射在关节腔内,改善了关节腔的生物环境,促进患者自身体内合成高分子量的HA[5]。粘弹性物补充疗法在治疗膝关节炎中用HA表现出一种安全的方式,但为了达到疗效通常要进行多次注射,可能是HA制剂缺乏足够的粘弹性或在关节中代谢太快的缘故。这两种性能可以通过增加HA的分子量来提高。交联的HA被开发作为骨关节炎滑液粘弹性物补充疗法的治疗制剂,它具有更好的粘弹性以及更长的关节内滞留时间,并且通过临床实验证明了它的有效性和安全性[6、7]。HA已成为临床上治疗各种骨关节病的首选生物医学材料。
3.3防止粘连
HA和它的衍生物在手术后防止组织粘连中的应用已得到了广泛的重视,其应用效果在国内外的大量临床实践中得到了证明[8]。在手术期间或手术后,在手术部位组织间引入HA凝胶、薄膜或海绵来分离正愈合的组织或者防止正愈合的组织术后粘连,而不会影响伤口的愈合。在一段合适的时间后,HA凝胶、薄膜或海绵将扩散或降解。但必须保持在合适的位置,并在一个长时间内防止组织接触,以便当HA凝胶、薄膜或海绵扩散或降解,组织开始接触时,不再有粘连的趋势。生物相容性的HA凝胶、薄膜和海绵防止粘连的手术包括:在腹部区域进行的手术中,防止肠或肠系膜粘连;在涉及肌腱的手术中,在手术后的定位期间,防止肌腱和周围膜或其它周围组织间的粘连。在眼科手术中,它被用在眼前房防止角膜和虹膜间的虹膜粘连,特别是用于神经受损后的重修,而且可降解的或永久的移植片在青光眼手术或斜视手术后防止粘连效果也较满意。
3.4药物缓释
HA及其衍生物已被研制作为有生物活性的分子的被控和定位的药物载体,并且具有缓释作用[9]。HA是一种具有特殊的生物相容性和独特的流变性能的天然多糖,化学改性的HA既保留了天然HA的生物相容性,又提供了各种释放体系的主要成份,当改性的HA用作载体来缓释有药物活性的物质到动物机体所需部位时,有药物活性的物质被选择与改性的HA共价结合形成一个能控制释放的药物缓释体系;另一方面,有药物活性的物质也能与改性的HA非共价相互作用。HA及其衍生物对各种有药理活性分子的优先释放能力可在体外和体内测定。HA缓释体系的治疗药物可以是水溶性的或非水溶性,阴离子或阳离子型,只要它们能与HA上的基团形成共价键或离子键等相互作用,HA缓释体系特别适合于控制生长因子(白细胞素、前列腺素等)、固醇类、抗生素、止痛药、、防腐剂等多种药物。HA缓释体系能以多种形式如静脉注射、关节内注射、皮下注射等引入体内。HA及其衍生物载体能提供独特的生物相容性、流变性能及化学和物理多样性,是一种有药理活性分子的有效缓释体系,HA和各种药物结合将是HA临床应用的重点。
3.5软组织的增大
一种非水溶性的、可注射的、可移植的HA衍生物被研制用于软组织的修补和增大。由于改性的HA的生物相容性,非致炎性和致免疫反应,其交联结构和水不溶性限制了它的扩散和迁移作用以及其流变性能,使其在泌尿科学、皮肤病学及胸部增大中用作软组织增大的一种安全、有效的替代物。
3.6经皮的栓塞治疗
经皮的栓塞形成已有效地用于治疗血管损伤、动脉瘤及肿瘤。在此应用中,实现纤维蛋白酶的局部血管内输送是为了通过催化纤维蛋白原到纤维蛋白的聚合,引起快速、局部的血凝块的形成。初步的人体内实验证明改性的HA凝胶栓塞形成剂能形成完整的和长期的动脉阻塞[10]。
篇5
[关键词]3Y-TZP；生物相容性；体外细胞毒实验
[中图分类号]R783[文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2008）03-03
Preliminary evaluation on biocompatibility ofall-ceramic dental material:3Y-TZP
LI Guo-hua1,GONG Zhen-yu1,YU Shu-xiang2,CHEN Ji-hua3
(1.Department of Stomatology, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command, Fuzhou 350025,Fujian,China)
Abstract: Objective To preliminarily evaluate the biocompatibility of 3Y-TZP which were used as a new dental all-ceramic materials. Methods According to ISO standards, in vitro cytotoxicity-test (MTT method) on L-929 cell were carried on. Results The OD-value of each test group were similar to the negative control and significantly different from positive control which indicated that the materials tested were safe to L-929 cells. Conclusion It is preliminarily estimated that 3Y-TZP is a safe material for dental clinical application.
Key words：3Y-TZP;biocompatibility;vitro cytotoxicity-test(MTT method)
随着人们对审美要求的不断提高，越来越多的修复专业人士及患者乐于接受色泽逼真，无龈缘灰线的全瓷修复体。以往的全瓷材料因脆性大使其临床应用尤其是后牙桥、多单位长桥受到限制，氧化锆具有应力诱发相变增韧性能而被称为韧性陶瓷，是最有希望替代金属烤瓷的全瓷材料[1-2]。目前国内外的此类产品研究方兴未艾。良好的生物相容性是生物材料包含牙科材料得以应用的重要前提，也是保证临床安全的重要技术指标。因此针对这种材料的生物学评价是十分必要和重要的。本研究采用体外细胞毒性试验的方法检测该材料对细胞生长状况的影响，从而初步评价其生物相容性。
1材料和方法
1.1实验材料：3mol%氧化钇稳定的四方多晶氧化锆（3Y-TZP）全瓷材料试件；受试细胞株：小鼠结缔组织成纤维细胞（L-929细胞），ISO推荐；主要试剂与设备：①MTT：全称为3-（4，5-二甲基噻唑基-2）-2，5二苯基四氮唑溴盐（Sigma，USA）；实验前用PBS（0.01mol/L，pH值7.4）新鲜配制，0.22μm微孔滤菌器过滤除菌；②DMSO（西安化学试剂厂）：全称为二甲基亚砜；③DMEM培养液，10%小牛血清；④BioRAD Model-550酶联免疫酶标仪；⑤Heraus二氧化碳孵箱；⑥Olympus IX-70倒置相差显微镜。
1.2实验方法
1.2.1陶瓷材料浸渍液的制备：将实验材料所作试件打磨圆钝后，无水乙醇超声清洗20min，干燥后在121℃，33MPa压力下灭菌处理后放入无菌培养皿，加入10mlDMEM培养液（表面积与浸提液之比为1.5cm2/ml）后置于37℃培养箱中浸泡24h，制成浸提液。完成后用DMEM培养液分别稀释，制备100%、50%、25%、12.5%的浸提液，放入4℃冰箱保存。
1.2.2冻存L-929细胞复苏后经过两次传代，生长情况稳定。取对数生长期的受试细胞系，胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度约1 000个/ml，接种细胞于96孔培养板（200μl/孔，n=4）置于5%CO2、37℃培养箱中，在饱和湿度条件下培养24h。
1.2.3准备4块96孔培养板，分别用于连续培养1、2、4、8天组。每块培养板按照阴性对照，4个不同浓度的实验组，阳性对照，空白对照组（调零）划区分组，每组样本5孔。
1.2.4观察细胞贴壁良好后，弃去原培养液，按照实验分组分别将当日要用的不同浓度的材料浸提液按10%的浓度加入小牛血清，后加入各实验组（200μl/孔），阴性对照为DMEM培养液，加入血清的培养液，单纯浸提液。阳性对照为0.1%苯酚，常规培养。
1.2.5 MTT检测：分别培养1、2、4、8天（其中4天与8天组需要隔3天换液一次），终止培养前4h加入0.5%MTT（20μl/孔），继续培养4h，加入DMSO150μl置于室温下15～20min，震荡培养板10min使染色均匀，采用酶联检测仪在490nm波长测定各孔光吸收值（OD值），计算出各组的均值。
1.2.6采用倒置相差显微镜，观察细胞形态，于MTT检测前对细胞照相。
1.2.7评价方法：计算出每种材料的阴性对照和各浓度组的OD均值（n=4）。以阴性对照的OD值作为100%细胞增殖率，则各浓度组的细胞增殖百分率可依式P%=各浓度组OD均值/阴性对照组OD均值×100%求出，将浸提液各浓度组的P%转化为0～5级细胞毒性：
2结果（见表1～4，图1～4）
培养同样的培养时间各浓度实验组的OD值之间没有明显的差异（P＞0.05）；随培养时间延长，各浓度组OD值都逐渐增高，不同浓度的各实验组与阴性对照组之间无显著性差异（P＞0.05）；各实验组均与阳性对照组有显著差异（P＜0.01）。可以认为实验材料细胞毒性分级与阴性对照同为0级，阳性对照毒级为5级。根据细胞增殖曲线可见：各浓度实验组的细胞增殖曲线都与阴性对照组走势相似，与阳性对照组差别明显。
图2～4分别为MTT检测前阴性对照组8天、100％浓度的实验组培养8天及阳性对照组培养1天细胞的照片。可见实验组细胞形态良好，为长梭形和多角形，并可见圆形分裂细胞，表明细胞生长旺盛，细胞折光性强，与阴性对照组相似。阳性对照组正常细胞形态消失，核固缩或溶解，漂浮在培养液中。染色后，实验组MTT结晶物密度与阴性对照组相似，呈现为透明的蓝紫色，阳性组染色后变色不明显。
3讨论
为了检测牙科材料的生物相容性，细胞毒性实验常常是材料初选时的必测项目[3]。本实验采用间接接触方法，通过细胞的增殖率来测定细胞的生长增殖情况，从而间接检测材料对细胞的毒性作用。在正常培养基中，L-929细胞通过有丝分裂呈指数增长，当有外来因素影响其生长时，则会出现细胞粘附力、细胞生物合成活性及细胞增殖率的下降，严重时可导致细胞死亡[4]。本实验基于此原理，通过材料对细胞增殖率的影响大小，来判定材料的体外细胞毒性程度。
MTT法的原理是生活细胞线粒体上的琥珀酸脱氢酶可与外源性的MTT发生氧化还原反应，被还原成不溶于水的蓝紫色结晶物沉积于细胞内，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，然后酶联免疫检测仪在490nm波长处测定光吸收值，就可以间接反应活细胞的数量[5]。目前国际上在评价一种细胞毒性实验方法时，往往把该方法的生物学终点和其证实过程放在首位，即看该方法最终测定的是细胞哪个方面的生物学变化。如观察细胞的形态学变化，细胞核计数及测定细胞的酶活性改变等。MTT试验法的生物学终点是重要的细胞器-线粒体，线粒体在细胞的生命活动中是一个能量供应站，其数目在细胞生命活动旺盛时增多，衰退时则减少。线粒体病变被认为是表示细胞受损伤最灵敏的指征。MTT试验法用线粒体作为其生物学终点，可以十分灵敏地反映出被测试材料对细胞造成的毒性损害程度。
MTT试验法具有通用性，广泛用于各种器械材料的评价。通常可以根据生活细胞的数量，细胞的形态学观察，死亡分解的细胞数量和弥散范围等方面来衡量，将细胞增殖度法与细胞的形态学观察相结合，可以更加有效地评价材料的细胞毒性。细胞毒性与被测材料的量尤其是表面积有关[6]，本实验为此设计了不同浓度的浸提液比较，其统计结果无显著性差异，也从侧面说明本实验材料对细胞没有毒性。
4结论
从毒性评级比较，本实验所检测的3Y-TZP全瓷材料的毒级为0级，可认为对细胞无毒，即该材料属于惰性材料，不会干扰生物细胞的正常功能，可以初步认为该材料对人体是安全的。
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篇6
【关键词】 骨支架材料； 生物衍生骨； 骨髓间充质干细胞
Experimental Study of Rabbit Bone Mesenchymal Stem Cells With Xenogeneic Biological Derivative Cancellous Bone/XIAO Shi-hui，WEI Qing-jun，WEI Ji-hua，et al.//Medical Innovation of China，2012，9(13)：003-005
【Abstract】 Objective：To explore good bone tissue engineered scaffold.Methods：To made biological derivative bone material with fresh pig femoral，then coculture with rabbit bone mesenchymal stem cells，the cell attachment and growth were detected to evaluate the celluar compatibility to biomaterial.Results：Xenogeneic biological derivative cancellous bone have 3D porous structure，meanwhile have good biocompatibility and material-cell interface.Conclusion：There are bright prospects in clinic application for the xenogeneic biological derivative cancellous bone，applicable to the construction of the bone tissue engineering.
【Key words】 Bone scaffold material; Biological derived bone; Bone mesenchymal stem cells
First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China
doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2012.14.002
创伤、肿瘤术后等原因常常造成大段骨缺损、肢体功能丧失。为了满足修复治疗的需要，众多研究者摸索了大量修复骨缺损的方法，目前组织工程提供了一个新的途径，运用组织工程的方法，以支架材料为载体，复合分离的种子细胞，在体外预先构建有生命的种植体，植入体内以修复组织缺损，替代后重建器官结构，维持改善组织器官功能。本实验从探寻良好的骨组织工程支架材料的目的出发，拟制备一种生物骨衍生材料，将此材料与兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外复合培养，通过电镜对复合培养过程进行动态观察，了解该材料与BMSCs的生物相容性及黏附情况，寻找一种有临床应用前景，适用于构建组织工程骨的支架材料。
1 材料与方法
1.1 实验动物 纯种新西兰大白兔1只，4周龄，体重1.5 kg，购自广西医科大学实验动物中心。
1.2 主要仪器 培养箱(HERACAN 150i)，超净工作台(苏净)，倒置显微镜(OLympus CKX41)，离心机(上海飞鸽)，VEGA3 TESCAN扫描电镜(捷克)，低糖DMEM培养基(Hyclone)，胎牛血清(杭州四季青公司)，0.25%胰蛋白酶(吉诺)。
1.3 实验方法
1.3.1 生物衍生骨的制备 取新鲜市售新鲜猪股骨，剔除周围软组织、骨膜和关节软骨，保留松质骨，再将其制成1 cm×0.4 cm×0.3 cm的骨条，经脱蛋白、脱脂、脱钙后制成生物衍生骨，-80 ℃深低温冰箱保存48 h后，经环氧乙烷消毒，-4 ℃保存备用。取部分骨支架做扫描电镜观察支架形态[1]。
1.3.2 兔BMSCs的分离 3%戊巴比妥钠按1 ml/kg剂量经兔耳缘静脉行全身麻醉。常规消毒铺巾，于双侧股骨近端及胫骨近端作骨穿(注射器内含0.2 ml的肝素钠200 U/ml)，抽取骨髓4~5 ml，抽出的骨髓血立即用等量的PBS洗涤后，离心1000 r/min，离心5 min，弃去上清液，重复上述操作2次后，接种于50 ml的培养瓶，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，3 d后全量换液，去除悬浮细胞。原代培养细胞长满瓶底面积80%~90%时，加入0.25%胰蛋白酶消化2~3 min，加含血清的DMEM培养基终止消化。1000 r/min离心5 min，弃上清液，以1∶3接种。
1.3.3 细胞与支架的复合 无菌条件下取第3代骨髓间充质干细胞(BMSCs)，以胰蛋白酶消化细胞后吹打制成单细胞悬液，调整细胞数量约为2×106/ml，用微量移液枪将细胞悬液250 μl滴入预湿处理过的生物骨衍生材料松质骨面上，使之充分渗入。预培养4 h后，小心加入含10%胎牛血清的L-DMEM培养基中复合培养，隔日换液，倒置显微镜及电镜观察复合培养的情况，了解材料与BMSCs的相容性及黏附情况。
1.3.4 细胞在材料上的增殖检测 取处理后的异种骨支架24块，以上述方法接种细胞。24 h后取复合物3块用PBS冲洗材料，使未贴壁的细胞脱落，再用0.25%胰酶消化，计算附着于材料上的细胞数。以后每天取3块材料按同样的方法计数细胞连续计数8 d。
2 结果
2.1 异种生物衍生骨外观呈乳白色，具有天然网架孔隙结构。扫描电镜下观察孔隙不规则，生物衍生骨支架表面粗糙，可见大小不等的裂隙与微孔，并互通形成网状结构。孔隙直径：150.8~306.7 μm，平均直径：225.3 μm。孔隙率：84.5%~89.7%。见图1、图2。
图1 支架外观 图2 扫描电镜下支架外观(×100)
2.2 倒置显微镜观察原代培养的兔BMSCs呈成纤维细胞样生长，细胞成梭形或多角形，细胞轮廓清晰，细胞质折光性好，但存在一部分杂细胞，通过多次换液后，传代培养的BMSCs杂细胞数量明显减少，逐渐形成细胞集落，并绕集落呈放射样排列，表现出骨髓间充质干细胞的生长特点且生长力旺盛。见图3、图4。
图3 原代培养的兔BMSCs(×100) 图4 传代培养的兔BMSCs(×100)
2.3 扫描电镜(SEM)下观察到复合培养的情况：复合培养3 d发现细胞附着与材料表面，细胞形态不均一，有的成梭形，有的细胞扁平状平铺于支架孔隙侧壁有多个突起，见图5。培养5 d后，细胞生长连接成片呈层状生长，细胞接触紧密，见图6。7 d后细胞多层生长，细胞生长成堆，部分区域有细胞外基质分泌，见图7。
2.4 细胞在支架材料的增殖能力 从描绘出来的增殖曲线可以看出，细胞在异种骨支架上的增殖情况与细胞在培养瓶中培养时的生长情况相似。从曲线的变化可以看出，细胞与支架复合培养后，rBMSCs在接种的前2 d为细胞潜伏适应期，第3~6天生长曲线基本为线性曲线，表明这段时间是细胞的对数生长期。第6天后曲线逐渐变得平缓，细胞增殖减慢，表明细胞增殖进入平台期。见图8。
3 讨论
在组织工程中，细胞与材料的复合是一项较为复杂的技术，细胞与材料的相互作用也是极为重要的，在构建组织工程骨的过程中，细胞与材料的粘附是基础，只有种子细胞与材料发生适当地粘附，才能进一步发生增殖和分化。然而，细胞与材料的粘附作用受到材料的含水量、材料表面理化性质、材料表面的改性处理、材料表面几何性质、表面特化结构等因素的影响[2]。所以在实验过程中应该选择适当的细胞外基质作为组织工程骨支架材料。理想的支架材料必须要有具备如下特点[3]：(1)具有良好的三维立体多孔结构；(2)吸收动力学与新的骨组织形成速率匹配，使局部负荷逐渐过渡到新生骨组织；(3)材料降解产物应无毒且容易被机体排出，具有良好骨传导及骨诱导作用，生物相容性好；(4)与宿主骨有相似的机械性能，能与之间形成稳定的界面，局部不易诱发形成瘢痕组织；(5)可以耐受国际标准要求的对于用于临床的骨支架的灭菌方法；(6)能够制备与缺损组织形态相似的最佳的支架形态。
生物衍生骨支架材料主要指异体骨和异种骨材料，通过各种理化方法可以降低甚至基本消除其抗原性，因此，异种骨研发应用的前景更为广阔。处理过后天然生物衍生骨材料保留原有骨的骨小梁、小梁间隙及骨盐支架的三维结构，解决了其他骨支架材料的孔隙率、孔隙直径大小、孔隙连通等方面的问题，因此，天然衍生骨材料具有良好的细胞材料界面。同时由于骨组织结构的高度同源性，呈现良好的生物相容性。雷荣昌等[4]用兔骨髓基质干细胞成骨诱导后与猪松质骨支架体外复合培养，通过扫描电镜观察猪松骨材料对成骨细胞生长、粘附的影响，发现松质骨支架联合培养1 d后，可见细胞附着于材料表面，但数量不多，细胞呈圆球形，7 d后细胞生长密集，似葡萄状粘附于脱矿猪松质骨的孔壁上，细胞呈不规则圆球形，细胞相互融合，可见细胞遮盖微孔间隙。党洪胜等[5]利用胎兔成骨细胞与经肝细胞生长因子(HGF)修饰的异种脱蛋白松质骨(DPB)进行体外复合，电镜发现成骨细胞能够在DPB表面附着及生长，且HGF/DPB对成骨细胞的碱性磷酸酶活性有明显的促进作用，并能促进成骨细胞的增殖。马绍英等[6]将兔骨膜源性成骨细胞与冻干人松质骨支架复合培养，电镜观察发现体外复合培养3 d，细胞粘附伸展，个别部位有少量细胞增殖；培养1周，形成了由一层或几层细胞构成的细胞膜片，覆盖整个骨小梁网架表面；培养3周，所形成的细胞膜片已较厚，细胞表面有基质分泌。四川大学华西医院对异种骨的改进做了一系列的研究，制成部分脱钙骨(PDCB)、部分脱蛋白骨(PDPB)、复合型完全脱蛋白骨(CFDB)三种材料，三种材料都保持原骨组织的天然网状孔隙结构，都有良好的生物相容性，分别与人胚骨膜成骨细胞体外复合培养，结果显示三者都有良好的成骨性[7]。
本实验采用异种骨通过脱蛋白、脱脂、脱钙，深低温冷冻制成生物骨衍生材料，将其与培养、扩增后的兔BMSCs共同培养，实验结果：电镜下观察支架具有三维孔隙结，BMSCs不仅能与生物骨衍生材料黏附，而且能在支架上分裂、增殖，表明此种方法制备的异种生物衍生骨材料与骨髓间充质干细胞在体外有较好的生物相容性和细胞材料界面，且具有骨诱导特性，是一种有临床应用前景的、适用于构建组织工程骨的支架材料。
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篇7
【关键词】 ，磷酸钙骨水泥
Effects of chitosan on properties of selfmade calcium phosphate cement
【Abstract】 AIM: To investigate the effect of chitosan on the physical characteristics， ultramicrostructure and biocompatibility of a selfmade calcium phosphate cement (CPC). METHODS: Two different cement formulations were prepared by mixing CPC powder respectively with 50 g/L chitosan lactate and 1 mol/L dibasic sodium phosphate used as liquid phase. For physical properties， washout resistance， primary setting time and compressive strength were measured. Scanning electron microscopy (SEM) was used to examine the microstructure and the intramuscular implantation of a rat model and rat mesenchymal stem cells (RMSC) seeded on CPC disks were used to compare the biocompatibility of the two formulations. RESULTS: CPCchitosan composite was more stable in water than conventional CPC and it did not disintegrate within 3 min even when placed in water immediately after the mixing. The mean setting time was 8.38 min in CPCchitosan and 23.68 min in the control. The mean compressive strength of composite increased to 6.52 MPa， whereas the control samples exhibited much lower values (2.08 MPa). SEM examinations showed that globular and platy particles were formed on surfaces of all samples but the particles on the surface of the CPCchitosan composite seemed to connect together viscously， with smaller pores than those of control. Slight signs of inflammation， which disappeared after four weeks， were detectable around the specimens implanted within one week. After 12 weeks， the experimental implants became soft， while the controls remained the same in appearance. Necrosis was not detected in the muscles around the implants. SEM showed that cells adhered to CPCchitosan composite disks， but the visible amount of the adherent cells was greater than that of control. CONCLUSION: Chitosan is suitable for the stabilization of CPC in a wet environment for it accelerates the setting reaction and improves the mechanical properties and biocompatibility of the cements.
【Keywords】 calcium phosphate cement； chitosan； compressive strength； biocompatibility
【摘要】 目的：了解壳聚糖对自制磷酸钙骨水泥（CPC）物理性能、超微结构及生物相容性的影响. 方法：分别以50 g/L乳酸壳聚糖和1 mol/L磷酸氢二钠为液相制备CPC试样，通过防水试验、测定初步凝结时间、抗压强度；扫描电镜观察凝固体超微形态；大鼠肌肉植入及骨髓基质干细胞表面种植试验比较两者差异. 结果：复合壳聚糖的CPC在水中更稳定，混合后即刻投入生理盐水3 min内不散开；平均初步凝结时间8.38 min，对照组23.68 min；平均抗压强度6.52 MPa；对照组2.08 MPa. 扫描电镜发现凝固体表面为颗粒状及片状晶体，实验组晶体互相连接，孔隙较对照组少. 植入肌袋1 wk有轻微炎症反应，4 wk后反应减退，12 wk后实验组材料变软，对照组外形基本未变. 肌肉无坏死. 电镜下细胞可在水泥盘上贴附、生长， 实验组可见的细胞数较多. 结论：CPC壳聚糖复合物在潮湿条件下更稳定，固化时间缩短，抗压强度提高，生物相容性更好.
【关键词】 磷酸钙骨水泥；壳聚糖；抗压强度；生物相容性
0引言
骨缺损是困扰矫形、颌面、脑外科的一个常见而又棘手的难题. 自固化磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement， CPC）终产物的化学结构与骨的矿物成份相似，具有良好的生物相容性、可降解性、骨传导性，并且可随意塑性，与周围骨组织紧密连接等多种优点［1］，因而得到材料界及医学界的重视，成为骨缺损修复材料研究和应用的一个热点. 但是普通CPC缺乏韧性、固化时间长、降解速度较慢、抗压强度低等不足使其临床应用受到一定限制. 如何进一步改性，更好地满足临床需要成为研究的焦点. 研究发现改变其固相颗粒大小、液相、液固比例、温度，添加适当的有机或聚合材料等方法可以在一定程度上改善其性能 ［2-5］.
壳聚糖（chitosan， CS）是地球上含量极为丰富，仅次于纤维素的天然聚合体―甲壳素的脱乙酰化衍生物，其结构与硫酸软骨素、透明质酸等物质类似，是一种由2氨基2脱氧βD葡萄糖通过β1，4糖苷键聚合的天然聚阳离子多糖. 研究表明CS可被包括溶菌酶在内的多种特异或者非特异性酶降解为氨基葡萄糖而被吸收，并且具有生物相容性、止血、抗感染、可塑性及黏附性等诸多优点［6］， CS单独或者与复合其他材料可制作敷料、释放药物、基因的载体、生物涂层、组织工程支架等［7］. 我们拟研究CS对自制的自固化CPC性能的影响.
1材料和方法
1.1CPCCS复合物的制备参照文献［8］所述方法制备无水磷酸氢钙和磷酸四钙，球磨过筛，前者平均粒径1 μm，后者17 μm. 等摩尔比混合作为CPC固相. 液相：实验组50 g/L乳酸壳聚糖（上海源聚生物公司)，对照组1 mol/L磷酸氢二钠. 粉(g)∶液(mL)=2∶1.
1.2防水试验用手将0.3 g CPC粉及0.15 mL液体揉合，作成小球，立即放入含4 mL 37℃生理盐水内的小瓶内，比较肉眼可见的散开程度.
1.3初步凝结时间测定0.6 g CPC粉与0.3 mL液体在玻璃板上混合30 s后，置入直径5 mm高12 mm玻璃管内，塑料膜覆盖管顶及管底，C型夹固定，置于相对湿度100%，37℃湿盒内，定期取出用水泥凝结时间测定仪（上海东星建材实验仪器有限公司）间隔不同时间测定. 从试针接触试样表面，让滑杆自由滑下，至试针插入试样不超过1 mm所需时间为水泥初步凝结时间（n=5）.
1.4抗压强度测定标准抗压试件为直径比高度小于2的圆柱体. 0.6 g CPC粉与0.3 mL液体混合，装入直径5 mm高12 mm模具，直径5.6 mm不锈钢棒周期挤压（压力约19.6 N）. 脱模后，放入直径8 mm高20 mm玻璃管内，塑料膜封口， 37℃相对湿度100%的湿盒内固化2 d. 标本放在材料万能试验机量压缩头之间，抗压测试加载至试件变形，记录最大压力，计算抗压强度（n=5）.
1.5扫描电镜分析样品的形态力学测量后断裂表面脱水干燥并经真空镀膜仪表面喷金，扫描电镜(日产JSM35C型)观察各样本表面形态.
1.6肌肉植入试验0.2 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉动物后，背部正中纵行切口，小心分离脊柱两侧椎旁肌肉形成肌袋，各植入经γ射线灭菌的实验及对照组水泥柱一枚，分别于术后1 wk，1 mo，3 mo照相、取材，40 g/L多聚甲醛缓冲固定液固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色. 每组4只SD大鼠（第四军医大学实验动物中心）.
1.7细胞种植实验及对照组分别制备成直径10 mm，厚4 mm 的水泥盘，固化48 h后乙醇漂洗2次，γ射线灭菌. 取成骨性培养基条件下培养的第2代大鼠骨髓基质干细胞，胰酶消化以1×105个/mL种植于水泥盘. 2 d后PBS液洗涤10 min， 10 g/L戊二醛固定，梯度乙醇脱水，真空干燥，喷金. 再次以扫描电子显微镜观察.
统计学处理：所有数据均用x±s表示，SPSS软件两独立样本t检验比较试样初步凝结时间及抗压强度. 检验水准设为P＜0.05.
2结果
2.1防水试验水泥小球放入装有生理盐水的瓶中，对照组产生较多水泡，很快散开；实验组只有很少的水泡，可保持原来的外形3 min.
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2.2水泥初步凝结时间测定实验组(8.4±1.2) min，对照组(23.7±2.7) min. Levene方差齐性检验F=0.596，P=0.462，可以认为两样本方差相等，进行方差齐性检验时，t=-20.455， P≈0.000，认为两者差异有统计学意义.
2.3抗压强度测定实验组(6.52±1.61) MPa，对照组在(2.08±0.70) MPa. Levene方差齐性检验F=0.393，P=0.548，可以认为两样本方差相等，进行方差齐性检验时，t=6.732， P≈0.000，结果两者差异有统计学意义.
2.4超微结构分析扫描电镜检查发现试样的表面均有颗粒状晶体形成，较多微孔，分布均匀，直径几个至十几个微米. 添加CS后，晶体仍然呈现颗粒状，证明添加CS对水泥的固化反应产物未形成影响. 只是颗粒间互相连接更加紧密，孔隙较对照组少（Fig 1）.
2.5肌肉植入试验术后老鼠饮食、活动正常，伤口愈合良好. 大体观察1 wk时有轻微炎症反应，4 wk后炎症反应消失，柱状体包裹在肌肉内，两者间无纤维膜. 12 wk后实验组质地变软，可见软组织长入，对照组基本维持原来植入的形状. 未见肌肉坏死.
2.6细胞种植扫描电镜观察细胞种植于材料表面3 d后，于表面贴附生长，呈多边形. 实验组材料表面的细胞数目多，细胞呈现团块生长，对照组的细胞数目少（Fig 2）.
3讨论
CPC是20世纪80年代中期研制的自固化型、非陶瓷类羟基磷灰石（HA）类人工骨材料. 其固、液相按比例混合后，先形成一种可任意塑形的膏体，在室温或者体内环境下凝固可转变成含微孔结构的HA晶体. 理想的抗压强度，适宜的凝结时间是CPC研究的一个重要方向. 理想的抗压强度应该介于皮质骨和松质骨之间，适当的凝结时间以利于手术进行为原则，一般认为5~20 min为宜. 随着对CPC水合机制的深入研究发现原料成分、颗粒大小及匹配度、钙磷比、晶种、固化液的量、温度等等因素都能显著影响CPC的水合反应，进而影响水泥的理化特性. 同时凝胶、胶原、藻酸钠等添加剂也能改善CPC的性能，但是都不是很理想.我们利用CS作为CPC改性的添加剂，发现添加5%CS可以缩短凝结时间，提高抗压强度. 分析原因可能是当CPC与酸性壳聚糖溶液混合后，酸和钙发生螯合反应，很快凝固形成水凝胶，缩短初步凝结时间. CS由并列的H结合链组成，与天然骨的力学性能更接近，所以能提高复合物的力学性能，同时抗压强度提高还可能与微孔结构减少有关.
生物骨替代材料如果不稳定，接触体液或血液后会发生溃散、迁移. 一方面会影响成骨，因为在骨愈合的初期植入材料的稳定非常重要；另一方面可能损伤健康组织. 模拟生物材料(analogue biomaterials)概念的提出引发了生物活性微粒加聚合体基质构成仿生骨这一思路［9］. 生物活性成分促周围组织生长，将组织和植入材料牢固结合，聚合体基质则提供材料的柔韧性，限制颗粒的迁移. 我们利用壳聚糖作为基质，改善CPC的粘结性能，限制CPC颗粒的移动，提高其临床操作的柔顺性、抗水冲刷能力. 随着复合物在体内降解，壳聚糖可为骨基质合成提供氨基多糖原料. 当然这仅仅是简单材料组成的模仿，绝非是真正意义上的仿生.
CPCCS复合物生物相容性如何是进行进一步动物实验前必须考虑的问题. 对生物材料相容性评价方法主要有两类：一是动物体内实验，即将材料植入体内，分阶段将植入体与周围组织取出，行组织学检查，观察材料及周围组织病理变迁. 二是体外实验，观察材料或材料浸提液对组织细胞生长及代谢的影响［10，11］. 从理论上讲，CPC水合过程中以及水合后的产物HA呈碱性；壳聚糖溶解于弱酸溶液内，其代谢产物也呈酸性. 两者可能正好中和［12］从而减轻因为非生理性pH值所引发的不良反应，而且CS表面为亲水基团，可以有利于吸附血清或者体液内的细胞外基质蛋白，从而促进细胞黏附及增殖. 短期肌肉植入试验发现在固化体植入后，两者局部有炎性反应，植入区有炎性细胞浸润，但是随着观察期延长，反应减轻直至消失，说明炎性反应在一定程度上是由手术创伤所致. 各时间段病理检查未见肌肉坏死. 3 mo后实验组软化，可见大量软组织长入，可能与CS的吸收有关，而对照组仍然是植入时的形状. 要完成骨愈合，支架材料必须有利于成骨前体细胞迁徙、贴附、分化. 由于材料不透光，所以本实验选用细胞种植扫描电镜观察的方法，发现成骨条件培养基中诱导后的大鼠骨髓基质干细胞可以在复合材料表面很好的生长. 从而证实材料无细胞毒性作用，适合成骨前体细胞的贴附、生长.
本研究初步显示，CS可以改善自制CPC的理化及生物相容性. 复合材料的成骨性能如何还有待进一步研究.
参考文献
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［11］ 刘峰， 吴军正， 陈建元. 应用四唑盐比色法对5种骨水泥的细胞毒性的测试［J］. 第四军医大学学报， 2001;22(4):379-380.
篇8
——有机硅的生物相容性与安全性评价
生命是人们永恒探究的课题，在漫长的求索过程中生物医用材料一直扮演着不可或缺的角色。有记载表明，早在古希腊时代人们就已经开始用马尾上的毛作为外科缝合线进行一些外科手术。时至今日生物医用材料已获得长足的进步，其中医用高分子材料更是被誉为医疗技术发展史上的一次飞越。
在此我谨对医用高分子材料中的有机硅材料谈一些我个人的认识。
1954年，mc dougall发现对外界影响极为敏感的热血动物的各种细胞组织与液态、半液态和类似橡胶态的有机硅制品接触时，其细胞组织的发育状态未见异常，表明硅橡胶不会对细胞生长产生不良的影响。医用硅橡胶的医学特性就此被发现。随后在20世纪60年代，国外开始将硅胶制品植入人体。心脏起搏器、人工心脏瓣膜等的应用给不少患者带来福音。到70年代，国外已有许多医用硅橡胶制品（硅橡胶、指关节、眼眶底托、气管插管、耳廓、脑积水引流管、腹膜透析管、带气囊分道导管、导尿管等）投入了临床应用。我国的发展虽然晚与外国，但在十几年来也获得长足进展。目前我国的硅胶制品已涵盖了脑外科，心胸外科，内科，皮肤科，整形外科等诸多领域。因为生物医用材料最基本的要求是它必须与生物系统直接结合,所以生物医用材料都必须具备生物学性能,即生物相容性,这是生物医用材料区别于其它功能材料的最重要的特征,并且要求这种材料不会因与生物系统直接结合而降低其效能与使用寿命。生物医用材料与活体系统的相互作用表现在两个方面:一是材料反应,即活体系统对材料的作用,包括生物环境对材料的腐蚀、磨损和性质退化、甚至破坏。二是宿主反应,即材料对活体系统的作用,包括局部和全身反应,如炎症、细胞毒性、凝血、过敏、致癌、畸形和免疫反应等。其结果可能导致对机体的中毒和机体对材料的排斥。
接下来我们就选取有机硅的几个具体应用案例来对它的生物相容性及安全性进行评价。
一 用一次性硅胶导尿管作引流管治疗气胸和胸腔积液
《中华实用医药杂志》20__ 年 6 月 第 5 卷 第 12 期
黑龙江省佳木斯市结核医院对20例患者采用一次性硅胶导尿管进行胸腔闭式引流术，肺复张较快无痛苦，引流全过程无脱落，引流管滞留时间3～15天，平均7天，引流通畅性良好，未见明显不适反应。
在上述病例中我们了解到硅胶导尿管在人体中滞留一段时间后患者并没有出现明显不适反应，这说明硅胶制品无毒性并且具有较好的组织相容性。
二 使用硅胶管治疗泪道阻塞
中国人民第264医院
临床资料
23例泪道阻塞患者，男性4例，均为单眼，共4只眼，女性19例，单眼14例，双眼5例，共24只眼，总计28只眼。年龄18～53岁，平均42岁。病程1～15 a，平均5.6 a。
结果
23例中随访1 a者5例，0.5 a者1例，3个月以上者17例。拔管后23例28只眼中22只眼症状完全消失，占78.57%，2只眼症状明显改善，占7.14%，4只眼虽症状改善，但仍主诉有较明显的溢泪，占14.29%，这4只眼行2次插管，留置时间为2～4周，拔管后3个月再复查，溢泪症状均消失。
在上述病例中我们可以发现硅胶材料在人体内停留了较长时间但患者并未产生不良反应并且在材料取出后一段时间内也未有不良症状产生。由此可见硅胶材料应具有良好的生物相容性。
三 硅胶鞍鼻注射整形1014例五年随访分析
《生物医学工程学》 华西医科大学附属医院
本院用gn514室温硫化硅橡胶作鞍鼻注射整形1014例,其中男性132例,女性882例,患者年龄由16岁至53岁,年龄存30岁以下者占800例。gn514硅胶为液态,使用前为两组份,即gn514—m和gn514—n.当两组份液体等量均匀混合后,经30—60分钟可硫化成为固体硅胶。从1979—1984年我们应用gn514硅胶对1014例鞍鼻患者进行注射整形,其中仅3例分别于注射后第4,7,12月发生局部炎症反应(不良反应率为0.3％)。此3例经手术刮除部份感染组织,作了组织病理学检查,为局部慢性炎症,但未发现癌变。
上述病例充分说明硅胶具有良好的组织相容性不良反应率低。且在术后一年内致癌可能性低。
四 假体
篇9
[关键词] 海藻酸钙； 纳米羟磷灰石； 复合材料； 骨髓基质干细胞； 生物相容性
[中图分类号] R 783.1 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.01.007
Preparation of sodium alginate-nanohydroxyapatite composite material for bone repair and its biocompatibility Wang Yanmei1， He Jiacai1，2， Li Quanli1，2， Shen Jijia3. （1. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery， Stomatological Hospital Affiliated to Anhui Medical University， Hefei 230032， China； 2. Key Discipline of Clinical Science of Stomatology in Anhui Province， Province Laboratory of Oral Diseases， Central and Local Working Together for the Oral Medical Center Labora-tory， Hefei 230032， China； 3. Dept. of Microbiology and Parasitology， Anhui Medical University， Hefei 230032， China）
[Abstract] Objective To prepare sodium alginate-nanohydroxyapatite composite material and to explore its feasibility as a bone repair material. Methods Sodium alginate-nanohydroxyapatite composite material was prepared using chemical cross-linking and freeze-drying technology. The composite was characterized by X-ray diffraction （XRD） and scanning electron microscope （SEM） and its porosity was measured by liquid displacement method. The fifth passage of bone marrow stromal stem cells （BMSCs） were incubated on the composite material and then growth was observed by inverted micros-cope and SEM. BMSCs were cultured with liquid extracts of the material， methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） assay was used to calculate the relative growth rate （RGR） on 1， 3， 5 d and to evaluate the cytotoxicity. Fresh dog blood was added into the liquid extracts to conduct hemolysis test， the spectrophotometer was used to determine the optical density （OD） ??and to calculate the hemolysis rate. Results Sodium alginate-nanohydroxyapatite composite material displayed porosity， the porous pore rate was （88.6±4.5）%. BMSCs showed full stretching and vigorous growth under inverted microscope and SEM. BMSCs cultured with liquid extracts of the material had good activities. The toxicity of composite material was graded as 1. Hemolysis test results showed that the hemolysis rate of the composite material was 1.28%， thus meeting the requirement of medical biomate-rials. Conclusion The composite material fabricated in this study has high porosity and good biocompatibility.
[Key words] sodium alginate； nanohydroxyapatite； com-
posite material； bone marrow stromal stem cells； biocom-patibility
创伤、感染、肿瘤等造成的骨缺损的修复是临床医学亟待解决的难题之一。在缺损区植入骨修复材料是解决上述问题的重要手段。人工材料是常用的骨修复材料，目前所用的主要是以钛为代表的第一代生物惰性材料和以生物玻璃、磷酸钙类陶瓷为代表的第二代生物活性材料。骨组织是由有机大分子和无机矿物组成的复合物，其中有机基质主要是Ⅰ型胶原，但胶原具有一定的免疫原性和细胞毒性且降解速度不可控，因此其作为生物材料应用于临床受到一定限制[1-3]。海藻酸钠（sodium alginate，ALG）是从褐藻类的海带或马尾藻中提取的一种碳水化合物，其分子中含有能与多种金属离子（如Ca2+）反应形成凝胶的羧基和羟基，它具有良好的生物相容性、生物降解性和可塑性，作为组织工程的载体材料能承载大量的细胞。羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）是人体骨组织的主要无机成分，具有良好的生物相容性和生物活性，能够与骨组织形成生物键合，被广泛地用于人体硬组织修复[4]；但是单纯的HA脆性大、骨诱导作用弱、不易降解，限制了其应用；因此，本实验采用化学交联及冷冻干燥技术将两者结合，制备海藻酸钙-纳米羟磷灰石复合材料（composite material，CM），评价其生物相容性。
1 材料和方法
1.1 实验动物
选取由安徽医科大学动物实验中心提供的比格犬为研究对象。实验动物体质量约10 kg，雌性。
1.2 主要试剂和仪器
ALG、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Sigma公司，美国），纳米HA（北京德科岛金科技有限公司），硫酸钙（北京国药集团化学试剂有限公司），DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶（Hyclone公司，美国）。冷冻干燥仪（LABCONCO公司，美国），扫描电镜（scan-ning electron microscope，SEM）（FEI公司，美国），X线衍射仪（理学电机公司，日本），酶标仪（BIOTEK公司，美国）。
1.3 方法
1.3.1 材料的制备与表征 分别称取6 g ALG、6 g nHA粉末、2 g硫酸钙，各加入100、100、200 mL双蒸水中，配成6%ALG溶胶、6%nHA浆料、1%硫酸钙浆料。上述过程在磁力搅拌下持续2 h。硫酸钙浆料静置24 h以上，用前搅拌5 min。然后在磁力搅拌下将nHA浆料缓慢加入ALG溶胶中，再次搅拌3 h，反应过程中不断调节pH值，使其始终保持在7.0～
8.0。将所得混合物低温预冻8 h，冷冻干燥24 h即得ALG-nHA复合物。室温下将硫酸钙浆料缓慢加入ALG-nHA复合物中，抽真空交联48 h后双蒸水反复漂洗，再次冷冻干燥即得最终产物海藻酸钙-纳米羟磷灰复合材料。将所得材料采用X光衍射（X-ray diffraction，XRD）进行物相结构分析，液氮脆断后断面行SEM观察。
1.3.2 孔隙率测量 采用液体置换法测定孔隙率[5]：量筒称取V0体积的无水乙醇，将一定大小的材料完全浸入其中，抽真空约30 min，此时体积记为V1；将材料取出，剩余乙醇体积记为V2，计算支架孔隙率（P），公式为P=（V0-V2）/（ V1-V2）×100%，共测6个样品，取其平均值。
1.3.3 骨髓基质干细胞（bone marrow stromal stem cells，BMSCs）的分离培养 将实验犬常规麻醉、备皮、消毒、铺巾，于髂后上棘后下约1 cm骨质较平处垂直穿刺，抽吸骨髓液5 mL，加入含肝素的离心管中。用5 mL DMEM混合上述骨髓液，常温下以1 500 r·min-1 离心5 min。弃上清，培养基重悬后接种于培养瓶中常规培养。3 d后首次换液，以后3～4 d换液1次。7～10 d待细胞融合至约80%时用胰酶消化后按1︰2的比例传代接种。其后3 d传代1次，选取生长良好的P3～P5细胞进行下列实验。
1.3.4 直接接触实验 将消毒后的材料制备成5 mm×5 mm×3 mm大小置于24孔板中，加适量培养液，培养箱内预湿24 h。将细胞浓度为每毫升1×106个的P5细胞以每孔300 μL接种于材料上，孵育2 h后每孔再加2.5 mL培养液常规培养。3 d换液，倒置显微镜下观察细胞生长情况。第5天时用3%戊二醛4 ℃固定材料4 h，梯度乙醇脱水，真空干燥后行SEM观察。
1.3.5 体外细胞毒性试验 依据《ISO10993-5：2009医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》进行实验。将材料按0.1 g·mL-1加入培养基中37 ℃浸提24 h，过滤除菌备用。P3细胞常规消化后制成浓度为每毫升2×104个的细胞悬液，以每孔100 μL接种于96孔板常规培养。细胞贴壁后弃培养液，按照分组情况每孔分别加入培养基（A组）、浸提液（B组）、6.4%苯酚（C组）200 μL，每组8个复孔。分别于第1、3、5天取出培养板，在倒置显微镜下观察细胞生长情况，然后进行甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）检测操作，最后490 nm下酶标仪测定各孔光密度（optical density，OD）值，并计算相对增殖率（relative growth rate，RGR），公式为：RGR=ODB组/ODA组×100%。根据RGR值评价细胞毒性[6]，评价标准如下。1）0级：RGR≥100%；2）1级：RGR为75%～99%；3）2级：RGR为50%～74%；4）3级：RGR为25%～49%；5）4级：RGR为1%～24%；6）5级：RGR为0。
1.3.6 溶血试验 溶血试验参照《ISO10993-4：2002医疗器械生物学评价第4部分：与血液相互作用试验选择》设计实验。采集犬血2 mL与1 mL肝素混匀，加入2.5 mL生理盐水稀释备用。实验分为浸提液组、生理盐水组（阴性对照组）、双蒸水组（阳性对照组）。每组5个平行样本，每个样本5 mL，每个样本中加入0.1 mL备用血，37 ℃孵育1 h后2 500 r·min-1离心5 min，观察样本外观。取上清液，分光光度计545 nm下检测OD值，按公式计算溶血率：溶血率=（OD浸提液组-OD阴性对照组）/（OD阳性对照组-OD阴性对照组）×100%，溶血率
1.4 统计学分析
采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行处理，组间比较采用两样本t检验，P
2 结果
2.1 材料的形貌及孔隙率
SEM扫描结果显示材料具有多孔性，孔径和孔形态不一，且孔与孔之间有一定的贯通性，孔隙率高达（88.6±4.5）%，孔的存在有利于细胞的生长及引导新骨长入。材料无明显的无机颗粒团聚现象，仅在孔壁见少量的nHA附着（图1）。
图 1 复合材料的观察结果 SEM × 2 000
Fig 1 Observation of CM SEM × 2 000
2.2 材料结晶度分析
ALG、CM及nHA的XRD图谱见图2。由图2可见，ALG没有尖锐狭窄的晶体峰，峰都较宽，意味着ALG的低结晶特征。CM的衍射图中出现了HA的特征峰，分别在2θ=25.7°、31.7°、32.9°和34.0°处。但与nHA衍射谱相比，各个峰较弥散，强度较弱，表明nHA结晶度变低或晶体体积减小，这一特点与天然骨类似。而ALG的特征峰在CM中消失或不明显，说明硫酸钙和nHA的加入破坏了ALG原有的结晶性，使其转变为无定形状态。此外，CM中还出现了硫酸钙的特征峰，可能是未反应完的残存硫酸钙。导致ALG、nHA结晶度降低的原因可能是ALG中的羟基与nHA中的羟基产生氢键连接。
图 2 ALG、nHA及CM的X线衍射图谱
Fig 2 XRD patterns of ALG， nHA and CM
2.3 BMSCs与CM共培养的形态学观察
材料与BMSCs共培养5 d时在其周围可见细胞附着，并伸展贴壁，细胞呈长梭形或多角形，密集区呈放射状向周围扩展，细胞状态良好（图3左）。SEM下观察可见，材料上附着了大量干细胞，细胞密度较高，呈梭形、多角形，伸出伪足并连接成片覆盖在材料表面形成网状结构（图3右）。
左：倒置显微镜 × 100；右：SEM × 250。
图 3 BMSCs在材料上生长5 d的形态学观察
Fig 3 Morphology of BMSCs attached to composite in fifth days
2.4 材料浸提液对BMSCs的毒性试验
细胞与浸提液共培养1 d后，倒置显微镜下可见B组和A组BMSCs透亮，贴壁良好，多已充分伸展，形态正常，2组细胞数量、形态无明显差异，细胞间隙稍大（图4）；C组细胞颜色变暗，部分细胞轮廓增粗，开始变圆皱缩，个别细胞飘浮（图4）。各组OD值、RGR及毒性分级见表1。由表1可见，B组细胞毒性为1级，即材料基本无细胞毒性，符合生物材料的安全标准。
2.5 溶血试验结果
生理盐水组和浸提液组离心后血细胞沉积于管底，上清液透亮接近无色；双蒸水组颜色均一，呈淡红色，无明显血细胞沉积（图5）。浸提液组、生理盐水组和双蒸水组OD值测定结果分别为0.014±0.008、0.003±0.001、0.865±0.009。统计分析结果显示，生理盐水组和浸提液组OD值间差异无统计学意义（P>
0.05），而上述两组与双蒸水组OD值间差异均有统计学意义（P
图中从左至右分别是生理盐水组、浸提液组、双蒸水组。
图 5 溶血试验样本大体观
Fig 5 General observation of samples after hemolysis test
3 讨论
人体硬组织修复材料按来源可分为3类：1）自体骨移植材料；2）异体骨移植材料；3）人工材料。自体骨作为骨修复材料的“金标准”可促进骨的愈合并为受植区提供结构上的支持，但是其来源有限且供区有一定的并发症，如血肿、骨折、疼痛等。异体骨虽具有自体骨的一些优点，但其存在免疫排斥反应，并有感染人类免疫缺陷病毒和肝炎等病毒的风险，而且制样、处理和存贮成本较高，所以其临床应用受到很大的限制[7-8]。为了克服这些局限，人们开始研究可用作骨替代物的人工材料。本实验制备的海藻酸钙-纳米羟磷灰石复合材料即属于人工合成无机/高分子材料，它具有以下优点：1）水溶性ALG的加入可以提高材料的亲水性；2）ALG与钙离子交联形成网状结构，对nHA材料起增强增韧作用；3）ALG中的羟基与nHA的羟基键合，不仅可以增加有机相和无机相之间的结合力，使得nHA粒子更稳定地分散于有机相中，还降低了nHA的结晶度，CM与人体骨结构更接近，生物活性增加。
生物材料不仅要满足临床应用时所需的理化性能，还需有良好的生物相容性，确保其临床应用的有效性和安全性。细胞培养法是检测材料生物相容性的重要手段之一，它可直接观察细胞与材料的复合生长情况，且操作相对简单，可控性强。BMSCs具有自我复制、高度增殖和多向分化潜能，在特定条件下可向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等间叶组织细胞分化[9]。此外，BMSCs取材容易，体外扩增能力强，易定向分化，植入体内后能很好地适应受区生理、病理和应力环境并保持成骨活性[10]，因此，它成为最具应用前景的种子细胞。本实验将BMSCs直接接种到CM上进行体外培养，倒置显微镜及SEM观察发现细胞在材料周围及表面附着良好，伸展充分，初步表明该材料有较好的生物相容性，符合生物材料应用的基本要求。细胞毒性试验结果显示BMSCs的增殖活性基本未受影响，无细胞毒性反应，进一步证实了材料具有良好的生物相容性，无潜在毒性。溶血试验结果也证实了上述结论。因此，该材料有望成为一种理想的骨替代材料。
海藻酸钙-纳米羟磷灰石复合材料修复骨缺损的理念主要是人体硬组织缺损的永久替代和功能恢复，它不能向活体组织一样随生理负荷、生化刺激作出相应反应，其生物活性仍有待提高。Hench等[11]提出构建第三代生物材料：即把生物材料的“可吸收性”和“生物活性”结合，从替代生物组织的修复理念转向主动诱导、激发组织器官再生。这一新的理念的提出必将为骨修复材料的研究带来新的希望。
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篇10
［关键词］抗菌不锈钢;口腔医学;感染
不锈钢材料因其具有良好的刚性、加工成型性、耐腐蚀性以及生物相容性，并且价格低廉，已广泛应用于医疗器械及人体植入材料。在口腔医学中，不锈钢材料可用来制作正畸托槽、弓丝和微种植体，义齿支架、卡环，颌骨夹板等。口腔是多种微生物共同定植的复杂环境，不锈钢材料在口腔中的存在可能改变局部微生态构成，使口腔致病菌增多或毒力增强，从而导致感染性疾病的发生。抗菌不锈钢是近年来研究发展的一类新型材料，通过在不锈钢中添加抗菌元素，使其既可作为结构材料，又具备功能材料的抗菌作用，因此被广泛应用于公共保健设施、食品加工设备、医疗器械及其他卫生敏感领域。抗菌不锈钢具有广谱抗菌、抗菌时效长、不产生耐药性以及生物相容性好等优点，大大拓展了医用不锈钢的临床应用范围。本文将就抗菌不锈钢在口腔医学领域的研究进展及应用作一综述。
1抗菌不锈钢概述
1.1抗菌不锈钢的抗菌原理
抗菌不锈钢的抗菌性能来源于其加入的抗菌物质，如抗菌剂、光催化剂及抗菌金属元素。研究表明，金属离子都具有不同程度的抗菌能力，综合安全性考虑，学者们认为银的抗菌效果最好，其次是铜和锌［1］。目前金属离子抗菌的原理尚不完全清楚，普遍接受的抗菌机理为“接触式杀灭”［2，3］，即细胞接触金属离子后死亡。Ag+、Cu2+等金属离子在有氧的情况下可催化相关反应产生活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)。ROS的作用对象是细胞存活所必需的基本成份，如细胞膜蛋白、脂类，尤其是细胞膜磷脂中的不饱和脂肪酸。以铜为例，Cu2+从金属析出后与细菌直接接触，最先引起细胞膜损伤，使细胞膜的脂质过氧化，细胞膜电位消失，细胞呼吸停止，同时细胞膜的完整性遭到破坏，导致细胞膜穿孔，细胞内容物外泄;随即Cu2+进入细菌细胞内，使酶类等蛋白质变性，甚至DNA降解，从而损伤细胞的正常组成及其功能，达到抑制细菌生长繁殖或消灭细菌的目的。
1.2抗菌不锈钢的种类
根据抗菌物质或抗菌相在不锈钢材料中的分布，抗菌不锈钢可分为涂层型及合金型。涂层型抗菌不锈钢是指以不锈钢为基体，通过喷涂、离子注入、溶胶-凝胶等工艺将具有抗菌功能的材料涂覆于不锈钢表面，如表面涂氟、洗必泰、Ti、Ag等［4］。涂层型抗菌不锈钢的缺点是其抗菌性可能随着抗菌涂层的磨损和剥脱而衰退。合金型抗菌不锈钢是指在不锈钢材料中添加抗菌金属元素，一般添加Cu、Ag，经过特殊热处理使不锈钢表面与内部均匀分布着抗菌相。相比涂层型抗菌不锈钢，合金型抗菌不锈钢具有稳定且持久的抗菌性能。抗菌不锈钢还可根据不锈钢所含抗菌金属元素来分类，如含银、含铜抗菌不锈钢。Ag+具有很强的抗菌性能，其抗菌活性是Cu2+的100倍、Ni2+的800倍，少量的银即可发挥出优良的抗菌效果，具有广谱抗菌性，并且几乎不产生耐药性。但由于银的价格较贵，目前研究及应用较多的是含铜抗菌不锈钢。铜是人体必不可少的微量元素，作为许多金属蛋白和酶类的辅助因子参与多种生理和代谢过程，适量铜元素的添加能赋予不锈钢材料强烈而广谱的杀菌功能，且生物相容性良好，对材料的力学性能、加工性能及抗腐蚀性等几乎没有影响。
2抗菌不锈钢在口腔医学中的研究与应用
2.1抗菌不锈钢应用于正畸矫治
正畸矫治用托槽、弓丝、带环、微种植体以及绝大多数附件均由不锈钢材料制成。固定矫治装置在口腔中的存在，使局部微生态环境改变，口腔致病菌大量增殖，从而导致牙釉质脱矿、龋病、牙龈炎及种植体周围炎等疾病的发生。为此，学者们致力于开发具有抗菌性能的固定矫治用不锈钢材料。2.1．1载Ag涂层抗菌不锈钢固定矫治最常见的细菌源性不良反应为牙釉质脱矿。在不采取任何预防措施的情况下，牙釉质脱矿的发病率高达80%以上。研究显示，变形链球菌(Streptococcusmutans)、乳杆菌、放线菌等与牙釉质脱矿有关，其中S．mutans是最重要的致龋菌。另外，固定矫治附件使牙周致病菌更容易在龈缘处堆积，引发牙龈炎、种植体周围炎等。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingi-valis)作为一种证据充分的牙周致病菌，是牙龈炎、种植体周围炎的优势菌。研究证实，添加银离子的正畸矫治用不锈钢材料可有效抑制口腔致病菌的生长。有学者的体外实验证明镀Ag涂层不锈钢托槽对S．mutans具有强抗菌性［6-7］。Mhaske的体外研究显示，镀Ag涂层不锈钢弓丝对嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophi-lus)有明显的抗黏附性和抗菌性［8］。Metin-Gürsoy等［9］进一步证实，纳米银涂层的不锈钢托槽在动物模型中可有效抑制S．mutans的生长并降低平滑面龋的发生。Morita的体外研究分别检测了镀银涂层正畸固定保持器对S．mutans和远缘链球菌(S．sobrinus)2种致龋菌以及P．gingivalis、中间普式菌(Prevotellain-termedia)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)3种牙周致病菌的抗菌性能，在径向扩散实验中，所有镀银涂层组周围2mm内均无细菌生长［10］。2.1．2光催化活性抗菌不锈钢光催化抗菌材料主要为N型半导体材料，最常见的是TiO2型光催化剂，其在光照作用下会产生电子空穴，表面的空穴与吸附的水分子及氢氧根离子生成具有强氧化能力的羟基自由基(•OH)，分解细菌体内的蛋白质和脂类，使细菌失去活性死亡，达到抗菌目的。有学者发现，在正畸弓丝表面覆盖一层TiO2后可以有效的抗S．mutans和P．gingivalis黏附［11］。Shah等［12］也发现，经TiO2表面改性的不锈钢托槽对L．acidophilus有较强的抗黏附和抑制生长作用。张晟等［13］进一步通过载入具有光学诱导还原作用的贵金属Ag作为纳米TiO2的活性剂，提高了纳米TiO2的光催化性能，使纳米Ag/TiO2涂层托槽在微弱光甚至无光照条件下同样产生抗P．gingivalis的效果，并且证明纳米Ag/TiO2能够降低P．gingivalis重要毒力因子———牙龈素的活性，其可能的机制为纳米TiO2产生的强氧化性自由基干扰牙龈素蛋白酶的合成及纳米Ag与牙龈素的巯基结合进而使牙龈素失活。2.1．3含Cu抗菌不锈钢微型支抗钉目前使用的支抗钉材料一般为纯钛、钛合金及不锈钢。钛的骨结合能力强，但其材质较脆易折断，且价格较高。不锈钢具有良好的延展性和强度，可抵抗一定程度的旋转力，降低微型支抗钉折断的风险。学者已证实，不锈钢合金与钛合金具有相近的组织相容性和稳定性［14-15］。但微型不锈钢支抗钉脱落率较高，种植体周围炎是主要的影响因素之一［16］。因此开发抗菌不锈钢微型支抗钉具有重要的临床意义。张丹等［17-18］评估了含铜不锈钢(304-Cu、316L-Cu)体外抗P．gingivalis的能力及细胞毒性，结果表明含铜不锈钢与不含铜医用304不锈钢相比，前者对P．gingivalis有更强的抗菌性，并且二者的细胞毒性无显著差异。有学者将医用纯钛、医用不锈钢和含铜抗菌不锈钢分别与人骨肉瘤细胞共培养120h，根据5级毒性评价标准对各组细胞毒性进行评价，结果显示三者的细胞毒性等级均为0级［19］。徐璐［20］等证明316L-Cu不锈钢有利于血管内皮细胞黏附及增殖，并有效降低血管内皮细胞的早期凋亡率。Li等的研究显示，316L-Cu不锈钢较传统不含铜316L不锈钢可通过抑制TNF-α、IL-1β等炎症因子，从而减少白细胞的招募、浸润，降低血管支架植入后的炎症反应［21］。以上结果提示，含铜不锈钢具有较好的生物相容性，可作为传统不锈钢微型支抗钉的替代材料，具有良好的应用前景。
2.2抗菌不锈钢应用于口腔颌面外科
不锈钢材料在口腔颌面外科学领域应用也较为广泛，例如正颌手术、唇腭裂修复手术及骨折固定用克氏针、夹板等。Liu等［22-23］研究显示，纳米银颗粒和聚乳酸-羟基乙酸共聚物共涂层的不锈钢植入体在感染的大鼠股骨腔中可有效抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，同时可诱导骨的形成。其机制可能是通过促进人类骨髓基质干细胞迁移、启动ERK1/2信号并上调成骨性相关基因的表达，增强成骨向分化。铜也是研究较广泛的抗菌及骨诱导元素。有学者在模拟体液实验中发现，随着Cu2+的释放，316L-Cu不锈钢可有效抑制大肠杆菌生长［24，25］。铜离子还可以刺激机体细胞释放多种生长因子，进而促进成骨细胞分化及钙盐的沉积［26］。有学者研究表明，317L-Cu不锈钢同样具有良好的生物相容性并对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有抗菌性，且具有比钛合金更强的成骨能力［27-28］。Wang等［29］通过体内外实验证明，317L-Cu不锈钢在早期阶段，Cu2+通过促进TNF-α的分泌从而调节NF-κB信号通路和Caspase3，引起植入物周围的炎症反应和细胞凋亡;但随着组织的愈合，炎症反应和凋亡显著降低，提示317L-Cu不锈钢异物反应较小。镁基金属在人体内降解会引起周围环境的碱性增加，从而破坏细菌的生存条件，起到杀菌的作用。Robinson，杨柯等［30-31］学者均证实镁基金属在体内可以杀死大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等常见感染细菌。Sutsha等［32］通过体外实验，综合考虑抗菌性和生物相容性后得出，含2mol%镁的羟基磷灰石/甲壳素共涂层316L不锈钢具有强抗菌性，革兰阳性菌(如金黄色葡萄球菌)对镁含量的增加更为敏感。Sutsha等［33］还发现，羟基磷灰石/甲壳素共涂层316L不锈钢随着表面硅质量分数的增加，抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的能力增强，且当硅的质量分数为1%时，表面活性最佳，可诱导类骨样羟基磷灰石层的形成。
3展望
