基因多态性分析的意义范文

导语：如何才能写好一篇基因多态性分析的意义，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

【摘要】 目的 探讨CYP1A1和GSTM1基因多态性与个体肺癌易感性的关系。方法 全面检索相关文献，应用Meta分析方法对各研究进行数据的合并与分析。结果 共8篇文献入选，累计肺癌病例1067人，对照1416人，分别对CYP1A1*A和GSTM1-、CYP1A1*B/C和GSTM1+、CYP1A1*B/C和GSTM1-联合基因型进行统计分析。异质性检验χ2值分别为6.43、8.83与9.63，P>0.05，文献有同质性，各合并OR及95%CI分别为1.36(1.09～2.77)、1.65(1.26～2.15)和2.01(1.57～2.59)。结论 CYP1A1和GSTM1突变基因型为罹患肺癌的易感基因型，且两者存在协同作用，在肿瘤防治方案中应加以重视从而采取相应措施达到有效预防肿瘤的目的。

【关键词】 肺癌；CYP1A1基因；GSTM1基因；多态性； Meta分析

The Polymorphisms of CYP1A1 and GSTM1 Genes on Inpidual Susceptibility to Lung Cancer:Metaanalysis

Key words：Lung cancer；CYP1A1gene；GSTM1gene；Polymorphisms；Meta analysis

以细胞色素P450(CYP)和谷胱苷肽S转硫酶(GST)为代表的Ⅰ、Ⅱ相代谢酶是环境化学致癌物激活、解毒代谢通路中的重要酶类[1]。CYP1A1可将无活性的前致癌物活化为终致癌物。GSTM1可以与终致癌物结合使其排出体外，两者的变异有可能造成终致癌物在体内的大量堆积，导致肿瘤发生。CYP1A1基因5’端4889位点AG的突变，导致编码异亮氨酸的密码子ATT被缬氨酸密码子GTT取代，形成了CYP1A1 Ile/Val 多态，包括常见基因型A(Ile/Ile)、杂合型B(Ile/Val)及纯合型C(Val /Val)。GSTM1基因的高度同源区发生了同源染色体的不等交换导致了包括整个GSTM1基因在内的 15KB碱基的丢失，形成了GSTM1+/-多态，GSTM1+为功能型，GSTM1-为纯合子缺失基因型。

肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，已列为恶性肿瘤死因的第一位[2]。病因学研究已肯定的认为吸烟、大气污染等是肺癌发生的重要危险因素，但并非与这些因素密切接触者都会发生肺癌，表明除这些因素外，还有其他因素起着独立危险因素的作用或影响这几种因素的作用[3]。许多学者从代谢酶基因多态变异性与肺癌易感性的方面进行了研究，有关CYP1A1和GSTM1的基因多态型与肺癌易感性的研究已有不少，但各研究结果不完全一致，本文运用Meta分析方法对此方面的研究进行了综合客观的分析评价，从而为肺癌的防治策略提供有意义的参考依据。

1材料与方法

1.1文献检索以“CYP1A1”或“GSTM1”，“Polymorphisms”，“lung cancer”为检索词，检索1990年1月～2005年1月在Medline、Elesiver等数据库发表的文献，检索语种为英语。以“肺癌”，“CYP1A1”，“GSTM1”为检索词，检索1994年1月～2005年1月在CNKI和万方数据库发表的文献，检索语种为汉语。各文献有用的参考文献亦作为本研究入选文献。

1.2文献纳入标准肺部原发癌，病理学诊断确诊；有关CYP1A1 Ile/Val和GSTM1基因多态性与各型肺癌易感性的病例对照研究；研究方法相似；有综合的统计指标：比值比（OR）；汇总的结果可用相应的统计指标表达。

1.3统计分析方法[4]参考Lichtentein等[5]提供的文献质量评价标准筛选文献.以比值比（Odds Ratio，OR）作为评价肺癌与易感基因型联系强度指标，采用Meta分析进行数据合并。

1.3.1异质性检验采用Q统计量法，Q服从于自由度为k1的χ2检验。若研究间无显著异质性(P

1.3.2发表性偏倚的评估采用失效安全数法来评价。据公式m>[k×ln(ORMH)/1.96] 2k分析，k 为文献数，m为使得合并效应量出现无统计学意义的最少未发表文献数，为k个文献的平均权重。

2结果

2.1各入选文献研究质量的一般描述

按照材料与方法所述，共8篇文献入选，这些文献均报道了CYP1A1 Ile/Val位点与GSTM1联合基因型和肺癌易感性的关系，入选文献共有1067例病人，对照1416例，各基因多态型的鉴定均采用等位基因特异性PCR和多重差别PCR方法。各文献研究方法均为分组病例对照研究，肺癌诊断标准明确，肺癌患者吸烟状况、年龄均与对照均衡匹配，对照均来源于健康人群。各研究特点及各文献基因型分布，见表1，其中文献［1113］将杂合子B与纯合突变子C合并研究。

2.2Meta分析结果

2.2.1文献异质性检验Q为检验统计量，见表2。

2.2.2文献合并OR分析联合突变基因型中，拥有B杂合子与GSTM1-联合基因型个体数在人群中的频率约是拥有C纯合子与GSTM1-联合基因型个体数的4.5倍[9]，故本研究将CYP1A1突变纯合子B和杂合子C基因型合并起来加以分析。各OR值以常见联合基因型CYP1A1*A和GSTM1+个体为参考算出。本研究采用固定效应模型的方差倒数权重法分析，各文献Meta分析结果见表2、3及图1。

2.3发表性偏倚评估

结果见表2，显示本研究受发表性偏倚影响程度较小，结论较可靠。

2.4敏感性分析

应用随机效应模型方法再进行分析，A和GSTM1-、B/C和GSTM1+及B/C和GSTM1联表1入选文献特点及文献CYP1A1 Ile/Val位点和GSTM1联合基因型分布 注：*指有显著性意义；"-"指未从原文获得；GSTM+:功能型； GSTM-:纯合子缺失型表2入选文献Meta分析结果注：**合并分析时剔除文献12; m为发表性偏倚评估时使得合并效应量出现无统计学意义的最少未发表文献数表3CYP1A1和GSTM1联合基因型和肺癌易感性的Meta分析结果合基因型合并后OR值与95%可信区间分别为1.36(1.08-2.72) 、1.66(1.19-2.29) 和2.02(1.49-2.72)，与方差倒数权重法合并的OR相比非常接近，说明本研究合并结果稳定性好。

3讨论

本文按照经典的Meta分析方法，对有关CYP1A1 Ile/Val位点和GSTM1 基因突变基因型与肺癌的遗传易感性进行了统计分析，结果显示CYP1A1 和GSTM1的突变基因型均为罹患肺癌的易感基因型，携带CYP1A1 B/C 和GSTM1的联合基因型的个体罹患肺癌的危险度较携带单一突变易感基因型的个体高，提示两者协同作用的存在，说明基因基因之间的相互作用也可能会最终导致肺癌的发生，提示CYP1A1突变基因型 和GSTM1基因缺失可能是肺癌的一个生物标志物。

CYP1A1 和GSTM1代谢酶的平衡与人体对环境化致癌物及致突变物易感性密切相关，它们的活性因遗传多态性的不同而有明显的差异，从而影响个体对致癌剂的易感性。人群中携带B与GSTM1-联合基因型个体的频率约是C与GSTM1-联合基因型个体的4.5倍[9]，因此前者对人群肺癌危险度的作用较后者大，更应引起更多的重视，同时有研究也提示CYP1A1 Ile/Val遗传多态性中的杂合子对人群的肺癌危险度有较大的作用[7]，故本研究将CYP1A1突变纯合子和杂合子基因型合并起来加以分析。酵母微粒体表达实验显示[14]：CYP1A1缬氨酸（Val）型较异亮氨酸（Ile）型有较高的芳烃羟化酶（AHH）活性和诱变性，提示Val型AHH能更好的活化PAH等原致癌物，如不能被GSTM1酶及时灭活，这种联合基因型个体则显示有较大的肺癌危险型。由于环境暴露因素的强度也强烈的影响甚至掩盖易感基因的作用，本研究仅仅从遗传易感性来研究肿瘤的发生是片面的。环境致癌物代谢是涉及多种代谢酶的复杂过程，肺癌的发生也是涉及环境因子和多种基因相互作用的复杂过程，本研究提示携带CYP1A1和GSTM1突变基因型的个体属肺癌高危险人群，肿瘤防治方案中应加以重视，虽然尚不能通过改变其肿瘤易感的基因型来防治肿瘤，但可以根据其与环境病因相互作用的特点，采取相应的控制环境病因的措施以达到有效预防肿瘤的目的。

由于各种偏倚的存在，且分析中还有各种混杂因素的存在，因此对于CYP1A1 和GSTM1联合突变基因型在肺癌易感性中的作用，还需要更多的资料、更详实的数据来研究和证实。

【参考文献】

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篇2

[关键词]阿尔茨海默病；AKTl；基因多态性

[中图分类号]R749.16

[文献标识码]A

[文章编号]2095-0616（2016）03-37-04

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又称老年痴呆症，是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病…。研究发现，载脂蛋白E（ApoE）基因、血管转换酶基因（ace）、载脂蛋白c1基因（apocl）、雌激素受体基因等都与阿尔茨海默病发病有一定关系，但并不能完全解释阿尔茨海默病的发病原因。因此，寻找新的阿尔茨海默病风险因子至关重要。研究发现，2型糖尿病患者中，阿尔茨海默病的发病率高于正常人群，与2型糖尿病发病有关的胰岛素P13K-AKT信号转导通路在阿尔茨海默病的病变过程中的作用值得我们进一步的研究。本研究目的探讨胰岛素P13K-AKT信号转导通路相关基因AKT多态性与阿尔茨海默病的关系，以期深入了解AKT基因多态对阿尔茨海默病易感性的影响。

1.资料与方法

1.1一般资料

将2002年1月～2013年12月我院纳入管理的阿尔茨海默病患者为病例组研究对象，病例组入选标准：所有患者符合美国神经病学、语言障碍及卒中一阿尔茨海默病和相关疾病学会（NINCDS-ADRDA）的诊断标准，所有患者均由两位神经内科医师做出诊断。同时选取年龄及性别匹配的健康体检者为对照组研究对象，对对照组研究对象进行MMSE（简易精神状态量表）、ADL（日常活动量表）、CDR（临床痴呆评定量表）的评定，其结果必须均为正常，同时采用汉密尔顿抑郁量表排除抑郁症。两组研究对象均要排除高血压、糖尿病、精神病史、酒精或药物滥用、肿瘤及自身免疫性疾病。两组研究对象均为汉族人群，阿尔茨海默病患者本人或家属对本研究签署书面知情同意书，对照组本人签署书面知情同意书。

本研究中，阿尔茨海默病组患者共231例，男113例，女118例，平均年龄（79.6±9.9）岁，Apoε4（+）者67例，平均MMSE评分（18.6±3.9），健康对照组患者共231例，男113例，女118例，平均年龄（78.5±8.4）岁，Apoε4（+）者39例，平均MMSE评分（28.3±2.7），两组患者平均年龄、性别构成、文化程度差别均没有统计学意义（P>0.05），其结果具有可比性。阿尔茨海默病组Apoε4（+）者比例高于对照组，平均MMSE评分低于对照组。

1.2研究方法

1.2.1DNA提取抽取所有研究对象静脉血并提取基因组DNA，血液标本储存于-70℃待用，并进行DNA含量及纯度检测。

1.2.2基因分型通过NCBI-SNP和HapMap数据库检索，分析AKT基因上的tagSNPs数据，应用PCR测序的方法检测上述入选对象胰岛素信号转导通路相关基因AKT多态性基因型。

1.3统计学分析

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据的处理，运用Hardy-Weinberg平衡法则进行遗传平衡吻合度检验；x2检验分析各组间基因型及等位基因的频数分布差异；计量资料（x±s）的形式表示，采用t检验进行计量资料的比较，以P

2.结果

2.1 rs2498786基因位点与阿尔兹海默病的相关性分析

rs2498786为G/C多态性，包括G/G、G/C、C/C三种基因型。本研究中，AD组与对照组三种基因型分布差异有统计学意义（P

2.2rs74090038基因位点与阿尔兹海默病的相关性分析

rs74090038为C/F多态性，包括C/C、C/T、T/T三种基因型。本研究中，AD组与对照组三种基因型分布差异没有统计学意义（P>0.05），等位基因C、T频数分布在两组之间分布差异没有统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3rs2494750基因位点与阿尔兹海默病的相关性分析

rs2494750为C/G多态性，包括C/C、C/G、G/G三种基因型。本研究中，AD组与对照组三种基因型分布差异没有统计学意义（P>0.05），等位基因c、G频数分布在两组之间分布差异没有统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.4 rs2494751基因位点与阿尔兹海默病的相关性分析

rs2494751为A/G多态性，包括A/A、A/G、G/G三种基因型。本研究中，AD组与对照组三种基因型分布差异没有统计学意义（P>0.05），等位基因A、G频数分布在两组之间分布差异没有统计学意义（P>0.05）。见表4。

2.5 rs5811155基因位点与阿尔兹海默病的相关性分析

rs5811155为T/-多态性，包括T/T、T/-、-/-三种基因型。本研究中，AD组与对照组三种基因型分布差异没有统计学意义（P>0.05），等位基因T频数分布在两组之间分布差异没有统计学意义（P>0.05）。见表5。

2.6 rs2494752基因位点与阿尔兹海默病的相关性分析

rs2494752为G/A多态性，包括G/G、G/A、A/A三种基因型。本研究中，AD组与对照组三种基因型分布差异没有统计学意义（P>0.05），等位基因G、A频数分布在两组之间分布差异没有统计学意义（P>0.05），因此，rs2494752的基因多态性可能与阿尔兹海默病的发病无关联。见表6。

3.讨论

篇3

关键词：自然流产；基因；亚甲基四氢叶酸还原酶

 亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是同型半胱氨酸（Hcy）与叶酸代谢的关键酶。亚甲基四氢叶酸还原酶基因的突变会引起酶活性有所降低，结果使叶酸水平降低，DNA低甲基化得产生及血浆Hcy浓度的升高，导致一系列病理的改变引发多种疾病[1]。最新研究表明，不明原因的重复性自然流产与血液的高凝状态有关。检测了53例自然流产患者和63例健康人，运用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，探讨了（MTHFR）基因多态性与自然流产的相关性，为探索自然流产的发病机理提供资料。

1 资料与方法

1.1  一般资料：选取2009年1月～2011年1月期间在我院就诊的自然流产非孕期患者53例，年龄（28.4±2.5）岁，平均27岁，其中1次25例，2次18例，3次及以上10例。皆符合自然流产诊断标准[2]：排除生殖器解剖学畸形；外周血染色体异常；内分泌功能异常；对照组63例，均为非孕期正常妇女，年龄（26.9±2.8）岁，平均27岁，无相关病史。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2  研究方法：清晨空腹取外周静脉血4 ml，2%乙二胺四乙酸二钠（EDTA）抗凝，严格参照试剂盒说明，提取基因组DNA。利用RFLP可对其基因多态性进行检测。MTHFR C677T基因片段扩增及突变的检测PCR引物[3]：P1（NCO-351）：5′-GAAGCAGGGAGCTTTGAGGC-3′；P2（NCO-352）：5′-CCCATGTCGGTGCATGCCTT-3′。PCR反应体系总体积30 μl：10×Buffer 3 μl，4×dNTP 1.5 μl（2.5 mol/L），P1和P2各1 μl（6 pmol/L），Taq DNA聚合酶（Promega 1 U/μl）1.5 μl，模板DNA 5 μl（40 ng/μl）。94℃预变性5 min，然后进入循环程序：94℃ 45 s，72℃ 50 s，54℃ 30 s，共37个循环，75℃延伸15 min。2%琼脂糖凝胶电泳法检测扩增结果。6%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳法检测突变结果。

1.3  统计学分析：运用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析，观察数据以均数±标准差（ ）表示，率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

    两组MTHFR基因型和等位基因频率分布：见表1。

表1  两组MTHFR基因型和等位基因频率分布[例（%）]

组别

    例数

基因型频率

等位基因频率

TT

TC

CC

T

C

自然流产组

53

15（28.30）

25（47.17）

13（24.53）

40（54.05）

34（45.95）

正常对照组

63

12（19.05）

18（28.57）

33（52.38）

38（32.20）

80（67.97）

MTHFR C677T相关的基因型和等位基因频率比较：自然流产患者组基因型频率与正常组比较，差异有统计学意义（χ2=9.05，P＜0.05）；自然流产患者组等位基因频率与正常组比较，差异有统计学意义（χ2=5.42，P＜0.05）。总的突变T等位基因显著高于对照组（χ2=11.35，P＜0.05）。自然流产组MTHFR C677T基因型C/C、T/C、T/T基因型频率分布与正常对照组比较，差异有统计学意义（χ2=9.05，P＜0.05）。自然流产组T等位基因型频率为54.05%，亦与正常对照组者分布差异有统计学意义（χ2=11.35，P＜0.05），T等位基因与自然流产发生明显相关（OR=2.28），95%可信区间：1.24～4.26。

3 讨论

重复性自然流产的病因至今尚不完全清楚，近几年研究者发现流产发生的一个重要原因与蜕膜绒毛缺血性坏死有关[4-5]。亚甲基四氢叶酸还原酶缺陷导致同型半胱氨酸向甲硫氨酸转化发生阻碍，导致同型胱氨酸血症。本文已确诊的自然流产患者与健康人进行对比分析，结果表明自然流产患者突变等位基因频率与纯合突变基因型频率均明显高于对照组，证明亚甲基四氢叶酸还原酶基因的多态性可能是自然流产的一个遗传风险因素，值得我们进一步研究。

4 参考文献

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篇4

1 资料与方法

1.1 临床资料 我院2011年—2012年体检健康人群，无药物过敏史，检测CYP2C19基因型，选择CYP2C19*1/*1野生型10例，CYP2C19*2/*2 or*3突变型纯合子10例，CYP2C19*1/*2 or*3突变型杂合子10例。其中男18名，年龄21岁～34岁（28岁±4岁），女12名，年龄20岁～35岁（29岁±5岁）。研究对象受试前2周及受试期间禁烟、酒，并且不服用任何药物。

1.2 基因分型 利用ARMS PCR技术建立CYP2C19基因多态性检测方法，设计特异性引物和探针序列，引物和探针委托生工生物工程（上海）有限公司合成及纯化。样本处理：抽取受试者静脉血3 mL，EDTA抗凝，利用基因组提取试剂盒纯化核酸，基因组提取试剂盒购自北京天根生化公司，按照其说明书操作。Taq酶扩增系统购自上海Promega公司。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃预变性15 s，60 ℃退火、延伸、信号采集40 s，40个循环。反应仪器：Mx3000荧光定量PCR仪，购自美国Agilent公司。基因分型结果由基因测序进行验证。

1.3 ADP诱导的血小板聚集率分析 受试者在第1天（300 mg）、第2天（75 mg）、第3天（75 mg）早饭前空腹服用氯吡格雷，并分别于首次服药前和服药后4 h采集静脉血3 mL，枸橼酸钠抗凝。氯吡格雷购自法国赛诺菲-圣德拉堡制药公司。采血后随即进行血小板聚集率分析。ADP购自美国Sigma公司，反应浓度为5 μmol/L，MPG-3型多功能血液凝聚仪购自上海斯隆医电公司。

1.4 统计学处理 使用SPSS 11.0软件对数据进行统计，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，同一基因型服药前后血小板聚集率比较采用配对t检验，不同基因型之间血小板聚集率比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基因分型 采取受试者全血样本进行CYP2C19基因多态性分型，选择CYP2C19*1/*1野生型10例，CYP2C19*2/*2 or*3突变型纯合子10例，CYP2C19*1/*2 or*3突变型杂合子10例进行血小板聚集率分析研究。分型结果利用基因测序确认，二者一致。

2.2 ADP诱导的血小板聚集率分析 通过对受试者服药前后ADP诱导的血小板聚集率进行分析，3组CYP2C19基因型个体服药前ADP诱导的血小板聚集率差异无统计学意义（P>0.05），服药后3组个体均较服药前明显降低（P<0.01），其中CYP2C19*1/*1野生型组服药后聚集率明显低于CYP2C19*1/*2 or *3突变型杂合子和CYP2C19*2/*2 or*3突变型纯合子（P<0.05），CYP2C19*1/*2 or*3突变型杂合子与CYP2C19*2/*2 or*3突变型纯合子差异无统计学意义（P>0.05）。详见表1。

3 讨 论

氯吡格雷是一种常用的血小板聚集抑制剂，临床疗效显著，备受关注。氯吡格雷临床效果存在明显的个体差异，实验室检测ADP诱导的血小板聚集率降低不显著，未能达到预期的抗血小板作用，被称为“氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）”。国外研究约20%的用药者疗效不佳[6]。导致氯吡格雷临床效果个体差异的主要因素是CYP2C19基因多态性，该基因编码的酶作用于氯吡格雷前体的活性转化。其中CYP2C19*1/*1基因型转化效率最高（强度代谢，EM），CYP2C19*1/*2 or*3突变型杂合子次之（中度代谢，IM），CYP2C19*2/*2 or*3突变型纯合子最差（弱代谢，PM）。东亚人群弱代谢突变型分布频率（20%）远高于高加索人群（3%～5%）[7]。

基因多态性分析的方法有基因测序、限制性内切酶酶切片段长度多态分析法（RFLP）和ARMS PCR等。基因测序是基因分析的“金标准”，但操作复杂，仪器昂贵。限制性内切酶酶切片段长度多态分析法同样操作步骤多，易污染，灵敏度低。ARMS PCR操作简便、快捷，灵敏度高，对实验室要求较低，适合基层医院的使用。本研究基于ARMS PCR技术，建立了CYP2C19基因多态性分析方法。并且经基因测序验证，二者的检测结果完全一致。

ADP诱导的血小板聚集率分析结果显示，3组CYP2C19基因型个体服药前ADP诱导的血小板聚集率差异无统计学意义（P>0.05），服药后3组个体均较服药前明显降低（P<0.01），其中CYP2C19*1/*1野生型组服药后聚集率明显低于CYP2C19*1/*2 or*3突变型杂合子和CYP2C19*2/*2 or*3突变型纯合子（P<0.05），CYP2C19*1/*2 or*3突变型杂合子与CYP2C19*2/*2 or*3突变型纯合子差异无统计学意义（P>0.05）。CYP2C19*1/*1，CYP2C19*1/*2 or/*3，CYP2C19*2/*2 or*3基因型个体服用氯吡格雷的疗效逐步降低，进一步证明了遗传因素对药物效果的影响。

综上所述，本文建立了一种CYP2C19简便快捷的基因分型方法，进一步证实了CYP2C19基因型与氯吡格雷疗效个体化差异的关系，彰显了药物基因组学分析的重要性。通过对受试者基因分型检测，判定受试者的药物代谢速率类型，从而辅助医生合理调整药物剂量，提高药物的有效性，这也符合个体化医学发展的趋势。

参考文献：

.Drug Metab Dispos，2010，38（1）：92-99.

篇5

关键词：TaqMan探针；MTHFR；多态性；DNA测序；胃癌

胃癌（Gastric cancer）是世界范围内的高发肿瘤之一[1]。近年研究表明，低叶酸水平可增加包括胃癌在内的许多肿瘤发生的危险性[2]。亚甲基四氢叶酸还原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）是叶酸代谢途径中的一 关键酶，MTHFR参与的体内同型半胱氨酸（Hcy）和甲硫氨酸之间的循环反应，反应中生成的S腺苷甲硫氨酸（SAM）是体内代谢唯一的甲基供体，涉及DNA的修复与合成，影响DNA代谢，与许多肿瘤化疗药物的疗效相关。

MTHFR的活性很大程度上可能受基因多态性的影响，从而影响疾病的发生和药物的疗效。MTHFR基因C677T和A1298C为两个常见的多态性位点，有研究表明该位点的基因多态性会导致MTHFR酶活性的改变[3]，可能导致患者之间出现较大的个体差异。因此，测定MTHFR的基因型对疾病的预防和合理用药有重要的意义。现已有的MTHFR基因多态性的研究，大多数采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术，该技术不仅费时，且易污染造成假阳性。不适宜用于临床检测。本研究旨在探讨一种可用于临床快速准确检测MTHFR基因型的方法，故选用TaqMan探针技术对MTHFR的C677T和A1298C两个多态性位点进行分型。

1资料与方法

1.1一般资料 经CT、MRI或病理组织学活检确诊的胃癌患者43例，来源于昆明医科大学第一附属医院，收集样本人群的外周静脉血2 mL。采用Genomic DNA Purification Kit（PROMEGA公司）对基因组DNA进行提取，使用Nanodrop 2000测定DNA的浓度和纯度。

1.2 TaqMan探针技术检测MTHFR基因C677T和A1298C位点的多态性 TaqMan探针试剂由ABI公司为MTHFR基因C677T（SNP ID：rs1801133），A1298C（SNP ID：rs1801131）多态性设计的TaqMan SNP分析试剂，每个位点的TaqMan SNP基因分型试剂中，含有两条MGB探针。MTHFR C677T一条以VIC荧光标记碱基G，对应样本基因突变位点C；一条以FAM荧光标记碱基A，对应样本基因突变位点T。MTHFR A1298C一条以VIC荧光标记碱基G，对应样本基因突变位点C；一条以FAM荧光标记碱基T，对应样本基因突变位点A。探针序列，见表1。

MTHFR C677T及A1298C多态性 real-time PCR采用25 μL反应体系：40×SNP Genotyping Assay Mix：0.625μL；TaqMan 2×PCR Master Mix：12.5 μL；DNA模板：1 μL；dd H2O：10.875 μL。探针检测在BIO-RAD IQ5实时荧光PCR仪上进行。反应条件为：95℃预变性10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，共40个循环。由于仪器的限制，本研究使用的BIO-RAD IQ5实时荧光PCR仪中没有VIC荧光检测通道，我们选择了HEX荧光通道替代，两种荧光相差1nm波长。

1.3 DNA测序法验证TaqMan探针技术检测MTHFR基因多态性

1.3.1目的片段的扩增 设计MTHFR C677T及A1298C两个多态性位点的测序引物（Invitrogen公司合成），引物序列，见表2。

2结果

2.1 Taqman探针基因型分析 MTHFR C677T和A1298C real-time PCR散点图基因分型结果分别，见图1、图2。

2.2 DNA测序验证 采用Lansergene SeqMan软件分析测序结果。

2.3 MTHFR基因多态性分型结果 43例样本MTHFR C677T基因型分别为野生纯合型CC 14例（32.5%）、突变杂合型CT 23例（53.5%）及突变纯合型TT 6例（14.0%）。A1298C基因型分别为AA 24例（55.8%）、AC 18例（41.9%）、CC 1例（2.3%）。本研究中，TaqMan探针技术检测及DNA测序验证，两种检测方法得到的基因分型结果一致。

3讨论

中国是个胃癌高发的国家，每年新发病例数占全球总数的40%。胃癌化疗方案众多且无标准方案，目前临床应用最广泛的是基于氟尿嘧啶类药物的化疗方案，在实际的化疗过程中，氟尿嘧啶类药物的个体差异较大，氟尿嘧啶类药物在体内均需转化为5-FU，继而发挥抗肿瘤作用。MTHFR是5-FU代谢中的一个关键酶，5-FU的活性代谢产物还原型叶酸（CH2FH4）在MTHFR的作用下转变为5-甲基四氢叶酸，使CH2FH4与胸腺嘧啶核苷酸合成酶（TS）、三磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷（FdUTP）组成的三元复合物减少，从而削弱5-FU的抗肿瘤作用。

C677T突变产生丙氨酸被缬氨酸取代的错义突变，其合成的蛋白质会出现热稳定性降低和酶活性的改变[4]。有研究提出，MTHFR基因的C677T多态性通过影响DNA甲基化和核酸稳定性，参与了胃癌的发生。A1298C突变使得编码后谷氨酰胺被丙氨酸替代，有报道称[5]纯合子突变型可使酶活性降低到正常值的60%左右。因此，测定MTHFR的基因型对肿瘤患者的个体化用药具有至关重要的意义。

但是，常规实验室多应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法检测MTHFR的基因多态性，该方法需要用凝胶电泳对扩增产物进行分析，易造成样本间污染，影响结果判读。TaqMan探针技术省时、简单、准确、安全、实时分析是它突出的优点[6]。同时，TaqMan探针在闭合单管中进行检测，避免了由样本间污染造成假阳性的结果[7]。

在我们的研究中，为了进一步验证TaqMan方法的准确性，我们进行了DNA测序验证，与TaqMan探针基因分型结果相比较，发现结果完全一致。本研究采用的TaqMan探针分型方法结果准确可靠，故我们认为使用TaqMan技术为MTHFR C677T及A1298C基因多态性分型可用于临床检测。TaqMan探针基因检测法具有很好的临床实用性，是临床快速诊断MTHFR基因型较有价值的方法。

参考文献：

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[5]Warren R B，Griffiths C E.The potential of pharmacogenetics in optimizing the use of methotrexate for psoriasis[J].Br J Dermatol.2005，153（5）：869-873.

篇6

【摘要】 目的 研究细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen4，CTLA4)基因外显子1+49A/G位点和启动子318位点多态性与粤西汉族人Graves病(GD)发病的关联性。方法 应用PCRRFLP分析102例GD患者与100例正常对照组CTLA4基因的外显子1+49位点A/G及启动子318位点C/T多态性。结果 GD组外显子1+49A/G位点的GG基因型及G等位基因频率显著高于正常组(P

【关键词】 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4;格雷夫斯病;多态现象;遗传

Abstract:Objective To investigate the relationships between exon 1 (+49A/G)， promoter (318T/C) polymorphism of CTLA4 gene and Graves' disease (GD) in Han population in western region of Guangdong province.Methods The exon 1 (+49A/G) and promoter (318T/C) polymorphism of CTLA4 gene was detected by PCRRFLP in 102 GD patients and 100 healthy controls.Results The frequency of GG genotype and G allele of CTLA4 gene exon 1 (+49 A/G) in GD patients and those with family history was significantly higher than that in control subjects and GD patients without family history (P0.05).Conclusion The predisposing factors of GD patients in western region of Guangdong province could be related to GG genotype and G allele of CTLA4 gene exon 1 (+49 A/G) other than promoter (318T/C) polymorphism， especially in those with family history.

Key words: cytotoxic Tlymphocyte associated antigen4 (CTLA4); Graves' disease; polymorphism; genetics

CTLA4基因的编码产物CTLA4是与自身免疫疾病有关的代表标志分子，被认为是Graves病(Graves'disease，GD)的遗传候选基因，其与HLA基因各占GD遗传易感性的50%[1]。但其与GD的遗传易感性在不同地区、人种的研究结论并不一致[23]。为此，本研究对CTLA4基因外显子1+49 A/G和启动子318位点多态性与粤西汉族人GD遗传易感的关系作一研究。

1 对象和方法

1.1 对象

收集2006年1月至6月广东医学院附属医院内分泌专科门诊及住院的GD患者102例(男23例，女79例)，年龄(44.17±1.54)岁，其中有GD家族史37例(男8例，女29例)，GD患者均根据病史、临床症状、体征、甲状腺功能检查得以确诊。从广东医学院附属医院体检健康人群中100例作为正常组，其中男22例，女78例;年龄(44.20±1.46)岁，无甲状腺疾病及其他自身免疫性疾病。以上人群均无亲缘关系，祖籍是粤西地区，三代均为汉族。

1.2 方法

所有观察对象抽取外周静脉血，取1mL置于EDTA抗凝试管，用血液基因组DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取白细胞DNA，采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction fragment length polymorphism， PCRRFLP)方法进行检测。 引物设计与合成：根据GenBank中的CTLA4 DNA序列设计两对PCR引物，外显子1+49 A/G多态性上游引物5'GCTCTACTTCCTGAAGACCT3'，下游引物5'AGTCTCACTCACCTTTGCAG3'。启动子318C/T多态性上游引物5'AAATGAATTGGACTGGATGGT3’，下游引物5'TTACGAGAAAGGAAGCCGTG3'。取目的基因10μL行PCR扩增反应，再经BbvⅠ内切酶处理后行3%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统扫描。

1.3 统计学处理

以Hardy-Weinberg平衡检验分析研究样本的群体代表性，采用直接计数法计算各组基因型、等位基因数目及频率，计数资料采用χ2检验，计算优势比(OR)及OR值95%可信区间(95%CI)。显著性检验水准为0.05。

2 结果

2.1 各组样本基因型分布

均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性。

2.2 基因型判定

外显子1的 PCR扩增片段为162bp，酶切结果为：AA基因型为162bp一个片段，AG基因型为162、88、74bp三个片段，GG基因型为88、74bp两个片段，见图1。启动子PCR扩增片段为226bp，酶切结果为：CC基因型为226bp一个片段，CT基因型为226、130、96bp三个片段，TT基因型为130、96bp二个片段，见图2。

2.3 CTLA4基因外显子1+49位点A/G多态性分布

GD组GG基因型及G等位基因频率显著高于正常组(P

2.4 CTLA4基因启动子318位点C/T多态性分布

TT基因型在正常组中例数为1，理论频数很低，将TT及CT组合并。GD组启动子318位点的各基因型、等位基因频率以及是否有家族史者与正常组相比差异均无统计学意义(P>0.05)，详见表2。表1 GD组与正常组CTLA4基因外显子1+49位点多态性分布与正常组比较：*P0.05。

3 讨论

CTLA4基因多态性是从基因表达调控角度影响CTLA4分子功能及分子水平。其外显子1 +49A/G位点A/G多态性决定了前导序列的蛋白质糖基化效率，从而影响前导序列的翻译后修饰作用[45]。Chistiakov等[6]研究发现外显子1第17密码子49位点A/G的二态性导致苏氨酸/丙氨酸的交换可影响前导链的构象，使之不能正确引导细胞内CTLA4分子的运输，使细胞表面CTLA4分子减少。有研究进一步发现，CTLA4基因外显子1+49A/G位点为A或启动子318位点为T的人群，其CTLA4分子表达水平在受到刺激后及CTLA4 mRNA的表达水平在不刺激状态时均较高[7]。Han等[8]研究认为CTLA4启动子318位点为T时的启动子活性较高，可以上调CTLA4分子的表达水平。

由于遗传易感基因受到种族和环境的影响，CTLA4基因外显子1+49 A/G位点和启动子318位点C/T多态性与GD的遗传易感性在不同的地域、种族、年龄阶段不一致。Esteghamati等[4]研究发现意大利GD患者CTLA4基因外显子1+49A/G等位基因G的频率较正常组高，差异有统计学意义;伊朗GD患者CTLA4启动子318位点C/T基因多态性与GD无关联性。Braun等[9]则认为CTLA4基因启动子的多态性与GD的相关性是由于启动子与外显子1存在连锁不平衡，因此它只是GD的一个遗传危险标志，但不具有独立易感作用。在本实验中，GD组GG基因型及G等位基因频率显著高于正常组(P

通过本实验，我们认为使用基因替代的方法以同源重组方式将保护基因取代易感基因，或者使用免疫基因治疗将融合蛋白CTLA4Ig阻断协同刺激信号途径以选择性抑制T细胞活化阶段，有可能减少GD等自身免疫性疾病的发病风险。

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篇7

【摘要】 目的 探讨张家口地区健康中老年人群CYP1A1基因MspⅠ的多态性。方法 采用等位基因特异性扩增和聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)技术，分析了360例张家口地区健康成人的CYP1A1基因3′端限制性内切酶MspⅠ位点的3种基因型的分布规律。结果 对照组MspⅠ基因型TT占35.8%，基因型TC占50.2%，基因型CC占14.0%，等位基因TC分别为60.9%、39.1%;实验组MspⅠ基因型TT占34.0%，基因型TC占51.2%，基因型CC占14.8%，等位基因T、C分别为59.6%、40.4%。结论 张家口地区健康老年人群CYP1A1基因存在MspⅠ的多态性，与健康中青年人群没有显著性差异。

【关键词】 细胞色素P4501A1;等位基因;基因多态性;MspⅠ

CYP1A1属细胞色素P(CYP)450超基因家族成员，是外源性和内源性化合物在体内代谢的重要Ⅰ相酶之一，参与多种内外源性化学物质的体内代谢过程〔1〕。现今，已发现CYP1A1基因MSPⅠ多态在不同的种族、年龄、民族和地区的分布具有差异，并有报道其多态性与某些癌变的发生相关〔2〕。CYP1A1基因主要分布于肺、肾、胃肠道、皮肤、胎盘等组织中，对内源性和外源性化合物在体内的代谢有重要的作用，主要通过氧化、还原、水解等作用，改变化合物所具有的功能基团，或使其分解。CYP1A1主要参与多环芳烃类化合物(PAH)的代谢，把其代谢为酚类物质活性很强的环氧化物，这些环氧化物在致癌、致突变中都有重要作用〔3〕。本研究采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)的技术，探讨张家口地区健康中老年人群CYP1A1基因MspⅠ多态性分布，以期为本地区癌症的病发提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 对照组随机选择360例无血缘关系的健康张家口地区人员，均在原籍稳定居住2代以上，年龄18～55岁，其中男性186例，女性174例。老年组随机选76名无血缘关系的健康张家口人：年龄60～78岁，平均年龄65岁，其中女性32例，男性44例。经张家口河北北方学院第一附属医院门诊查体健康，无遗传疾病的健康人群。

1.2 标本收集 从上述人群中均抽取空腹外周静脉全血3 ml，应用赛百盛公司的基因组DNA快速提取试剂盒提取基因组DNA。

1.3 主要试剂及仪器 引物由北京纽英伦生物公司合成，限制性内切酶MspⅠ购于北京纽英伦生物公司，德国Eppendorf PCR扩增仪， DYYIII2稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)，纽英伦生物公司的基因组DNA快速提取试剂盒，BioRad凝胶成像分析仪。

1.4 CYP1A1 MspⅠ位点基因分型 采用等位基因特异性扩增方法PCRRFLP技术为CYP1A1MspⅠ位点基因分型。PCR的反应条件:反应总体积50 μl，含有200 μmol/L dNTP，上游引物序列为5′CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT3′，0.4 μmol/L，下游引物序列为5′TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT3′，0.4 μmol/L，模板DNA 0.4 μg，1 U TaqDNA聚合酶，最后加灭菌双蒸水补齐至50 μl。扩增参数：97℃预变性7 min，然后95℃变性50 s，66℃退火50 s，72℃延伸1 min，30个循环后72℃继续延伸10 min。取10 μl PCR产物，加10 U MspⅠ限制性内切酶，37℃水浴4 h，酶切产物经2.0%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml溴化乙锭)电泳60 min，电压100 V，在凝胶成像分析仪上观察结果。

1.5 CYP1A1 MspⅠ基因型测定 扩增产物经酶切后分为3种基因型：没有MspⅠ切割位点的等位基因为纯合子基因型TT(野生型)，可见340 bp一个片段;有MspⅠ切割位点的等位基因为纯合子基因型CC(突变型)，可见200及140 bp 两个片段;杂合子基因型TC(杂合型)，可见340、200、140 bp 3个片段。

1.6 统计学处理 采用SPSS11.5软件，分析等位基因和基因型频率分布，检验群体基因型频率分布是否符合HardyWeinberg平衡定律，组间进行t检验。

2 结 果

CYP1A1基因MspⅠ多态分布，张家口地区中青年健康人群该多态位点T及C等位基因的频率分别为60.9%，39.1%。TT，TC，CC基因型分布频率分别为35.8%，50.2%，14.0%。经χ2检验基因型分布符合HardyWeinberg平衡定律(χ2=0.031，P>0.05)。张家口地区老年健康人群该多态位点T及C等位基因的频率分别为59.6%，40.4%。TT，TC，CC基因型分布频率分别为34.0%，51.2%，14.8%。经χ2检验基因型分布符合HardyWeinberg平衡定律(χ2=0.039，P>0.05)。对张家口地区健康老年和中青年人群CYP1A1基因MspⅠ多态分布差异不显著。该多态位点PCR扩增产物的MspⅠ酶切电泳见图1。

3 讨 论

CYP1A1是细胞色素P450的同工酶，位于第15号染色体q22qter上，有7个外显子和6个内含子，基因全序列为6 311个碱基对〔4，5〕。CYP1A1在肝脏总的CYP450含量中存在不到1%，但是参与2.5%的物质代谢过程，广泛分布于机体组织中〔6～8〕。目前研究发现，CYP1A1基因发生在CYPIA1基因的3′非编码区腺苷酸下游264 bp处，位于6 235位点，由碱基TC，即CYP1A1基因MspⅠ多态性，突变基因变异导致酶活性增高，而且提高了酶的诱导性，同时，CYP1A1基因MspⅠ多态分布具有明显的地区和种族差异。大量研究发现，CYP1A1基因多态性与环境毒素暴露相关的肿瘤遗传易感性有关〔9，10〕。本研究发现张家口地区健康中老年人群CYP1A1基因呈多态性分布，与中青年人群差异不显著，为进一步研究张家口地区CYP1A1基因多态性与肿瘤等疾病的关系奠定了基础，并有助于基因多态性与肿瘤易感性的研究，对识别肿瘤高危人群，有针对性地进行行为干预，对人类的身体健康和生活质量的保证，具有十分重要的临床意义和实用价值。

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篇8

【摘要】 目的研究中国南方汉族人群中血管紧张素原(AGT235)、血管紧张素转换酶(ACEI/D)、心钠素(ANP2238)、C型心钠素受体(NPRC-55)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS298)基因多态性与原发性高血压(EH)的关系。方法选择EH患者81例及对照者120例，采用基因芯片技术检测AGT235、ACEI/D、ANP2238、NPRC-55、eNOS298基因多态性，并比较其基因型及等位基因频率。结果EH组AGT235 TT基因型频率(53.1%)与对照组(45.8%)无差异(P>0.05);EH组患者ACEI/D DD基因型频率(48.1%)与对照组(4.2%)差异显著(P0.05);EH组NPRC-55CC基因型频率为65.4%，对照组(68.3%)无差异(P>0.05);EH组eNOS298DD基因型频率为3.7%，与对照组(0.8%)无差异(P>0.05)。结论ACEI/D基因可能是EH的易感基因，AGT235、ANP2238、NPRC-55和eNOS298基因与EH不具有相关性。

【关键词】 原发性高血压;基因多态性;血管紧张素转换酶

原发性高血压(EH)的基因多态性研究有助于阐明EH的病因，为其防治提供依据。目前对于EH候选基因的研究大多局限于单个基因，对于多个系统、多个基因的协同研究较少。国内外的研究显示血管紧张素原(AGT235)、 血管紧张素转换酶(ACEI/D)、心钠素(ANP2238)、C型心钠素受体(NPRC-55)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS298)的基因多态性与EH具有相关性，但结果尚不一致〔1〕。本研究采用基因芯片技术，检测EH人群5种基因的多态性对EH的影响，旨在确定高危人群探讨EH的发病机制。

1材料与方法

1.1研究对象选择2006年4月至2009年4月我院保健体检部和老年病科的就诊患者。EH患者81例，诊断符合WHO关于EH的诊断标准，年龄56~93〔平均(76.79±6.96)〕岁，男62例，女19例。对照组120例，年龄38~59〔平均(50.91±5.59)〕岁，男105例，女15例。经相关检查除外引起继发性高血压的疾病，以及糖尿病、慢性肝病、慢性肾病、恶性肿瘤等。所有病例为无血缘关系的华南地区汉族人群。

1.2研究方法1.2.1标本采集抽取受检者肘静脉血3 ml，EDTA抗凝，快速裂解法提取基因组DNA。

1.2.2基因多态性分析分别在各扩增液管中加入Taq酶溶液0.8 ml;在各扩增液管中分别加入阴性对照管溶液、阳性对照管溶液或抽提的样品上清液，混匀;在PCR仪中扩增。取各管PCR扩增产物于98℃热变性5 min，-20℃保存;在杂交舱进行杂交;加入显色液，44℃放置44 min;BaiO基因芯片识读仪检测，图像经Array Doctor软件分析，检测AGT235、ACEI/D、NPRC-55及eNOS298基因多态性位点。BaiO基因芯片识读仪和基因芯片检测所需的试剂由上海百傲公司提供。

1.3统计学处理 采用SPSS16.0软件包进行χ2检验。

2结果

2.1两组基因型分布两组基因型频率适合度检测均符合Hardy-Weinberg平衡。EH组及对照组AGT235TT基因型频率分别为53.1%和45.8%，无显著差异(χ2=5.96，P>0.05)。EH组ACEI/D DD基因型频率为48.1%，与对照组(4.2%)比较有显著差异(χ2=56.76，P0.05)。EH组及对照组NPRC-55CC基因型频率分别为65.4%和68.3%，差异无统计学意义(χ2=4.06，P>0.05)。EH组及对照组eNOS298DD基因型频率分别为3.7%和0.8%，差异无统计学意义(χ2=5.87，P>0.05)。见表1。表1两组候选基因的基因型分布

2.2两组等位基因分布EH组ACEI/D D等位基因频率为59%，与对照组(30%)，差异显著(χ2=31.6，P

S298D等位基因频率分别为4%和5%，差异均无统计学意义(P>0.05)。

3讨论

EH是多基因遗传病，其发生是环境因素和遗传因素共同作用，相互累加的结果。EH的候选基因涉及肾素血管紧张素醛固酮系统、交感神经-肾上腺系统、水盐代谢、内皮细胞功能等至少150余种。十余年来，国内学者〔2～6〕对汉族EH基因多态性现象进行了大量研究。但各家说法不一。研究显示ACE基因I/D多态性不仅与高血压发生相关，而且与高血压的多种并发症有关〔7，8〕。在本研究中，我们采用基因芯片技术分析了201例EH和正常血压者的5个心血管基因的多态性，结　果显示，高血压组ACEI/D DD基因型频率为48.1%，与对照组(4.2%)比较差异具有统计学意义(P

参考文献

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篇9

【关键词】 双氢克尿噻

【摘要】 目的 探讨原发性高血压患者血管紧张素Ⅱ受体-1（AT1R）基因多态性与双氢克尿噻降压疗效的相关性。方法 200例未服用过任何药物或者已停用抗高血压药物两周的原发性高血压患者入选本实验，其中符合研究目的且资料完整的共计177例，入选人群同时开始服用双氢克尿噻12.5mg/日，共6周，在服药前及服药后每两周记录血压数值一次。用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）及限制性酶切方法进行AT1R基因A1166-C位点的多态性分布检测，并测定入选者的空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白。入选人群按AT1R基因多态性分为AA、AC基因型两组。结果 双氢克尿噻对于AA及AC基因型原发性高血压患者的收缩压和舒张压均有明显的降压效果（P均<0.05），并且这种降压效果主要表现在用药后的前两周内。AA及AC基因型患者的收缩压下降程度的比较无统计学意义（P>0.05），而AC基因型患者的舒张压下降程度与AA基因型患者的比较差异有显著性（P<0.05）。结论 双氢克尿噻对于原发性高血压患者舒张压的降压效果可能与AT1R的基因型有关。

关键词 血管紧张素Ⅱ受体-1 基因多态性 原发性高血压 血压 双氢克尿噻 疗效

Correlation of angiotensinⅡTypeⅠReceptor gene A1166C polymorphism with the effect of antihypertensive treatment by hydrochlorothiazide

【Abstract】 Objective To study the correlation of AngiotensinⅡTypeⅠReceptor（AT1R）Gene A1166C Polymorphism with the effect of antihypertensive treatment by Hydrochlorothiazide in essential hypertensive patients.Methods 177hypertensive subjects who were untreated or who had untaken medicine for two weeks were enrolled.Blood pressure was measured before taking medicine and was examined every two weeks after taking Hydrochlorothˉiazide12.5mg per day for six week.Polymerase Chain Reaction（PCR）combined with restriction enzyme digestion was used to detect the variation of A1166C allele.Fasting blood glucose and serum cholesterol、triglyceride and high density lipid were measured in the enrolled subjects.The patients were characterized according to the observed alleles as AA or AC.Results The reduction in SBP was no statistical significant difference between AA and AC groups（P>0.05）.But the reduction in DBP of AC group was higher than that of AA droup（P<0.05）.Conclusion There may be correlation of AT1R A1166C polymorphism with the effect of antihypertensive treatment in DBP by Hyˉdrochlorothiazide in essential hypertensive patients.

Key words angiotensinⅡTypeⅠReceptor gene polymorphism essential hypertension blood presure Hydrochlorothiazide efficacy

尽管目前有多种不同类型的抗高血压药物，但是血压能被较好控制的患者仍然不到40% ［1］ ，不同的患者对于同一种抗高血压药物有不同的反应，患者对于抗高血压疗效的反应及药物副作用的个体差异与遗传有一定关系，因此目前对于某些基因多态性与各类抗高血压药物降压效果间的对应性研究颇受关注。肾素-血管紧张素系统（Renin angiotensin system，RAS）是体内调节血压和水电解质平衡的主要系统，刺激或抑制该系统可引起血压的变化，因此在原发性高血压（Essential Hypertension，EH）发病机理中起着重要的作用，编码RAS的基因被公认是与EH相关性最强的基因。RAS中的血管紧张素Ⅱ（angiotensin II，AngⅡ）收缩血管的作用主要是通过AngⅡ受体-1（AT1R）介导的 ［2］ ，本研究旨在观察抗高血压药物双氢克尿噻的降压效果与AT1R基因A1166C多态性的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本院2001年1月到4月收治的1～2级EH患者共200例，均未服用过任何抗高血压药物或者已停用抗高血压药物两周，其中符合研究目的且资料完整的共计177例，男92例，女85例，平均年龄（65±8）岁。血压的测量方法及诊断标准采用《1999WHO/ISH高血压治疗指南》。临床化验检查除外继发性高血压、其他心脑血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤，严重肺部、肝脏、肾脏疾病。

1.2 实验方法 血液生化指标的测定应用自动生化分析仪，随时质控检测，性能稳定。检测AT1R基因:每例采晨起空腹静脉血3～5ml，2%EDTA抗凝，用低渗法分离白细胞，蛋白酶K消化，氯仿/异戊醇法提取DNA，TE保存。引物设计为:上游5′-ATAATGTAAGCTCATCCACC-3′，下游5′-GAGATTGCATTTCTGTCAGT-3′，PCR反应设置94℃预变性240s，后进入循环94℃变性60s，94℃退火60s，72℃延伸90s，循环30次，后延伸72℃，300s后结束反应。PCR扩增产物经DdeI酶切后，用2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外线灯下观察结果。

1.3 给药方法 入选人群同时开始服用双氢克尿噻（江苏省丹阳市药厂LotNo.242107）12.5mg/日，共6周，在服药前及服药后每两周记录血压数值一次，在观察期间不加用其它任何抗高血压药物或增减药量。

1.4 统计学方法 资料输入计算机，用Excel软件建立数据库，用SPSS10.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（ˉx±s）表示，组间计数资料比较用χ 2 检验，组间计量资料比较用t检验或方差分析，组间血压下降数值的比较因为方差不齐，故比较时采用秩和检验。P<0.05为有统计学意义。

2 结果

（1）AA、AC不同基因型间的性别、年龄、体重指数、胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、肌酐、血糖的比较无统计学差异，AA基因型组的收缩压和舒张压均较AC组的低，两组比较差异有显著性，见表1。

表1 AA、AC两组人群临床参数比较 （略）

（2）AA、AC两组基因型患者服用双氢克尿噻2周后收缩压和舒张压均有明显下降，（P均<0.05），并且这种降压效果主要表现在用药后的前2周内。服药4周及6周时的收缩压、舒张压与前一次的血压数值比较无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 AA、AC两组基因型患者治疗前、后收缩压、舒张压水平变化 （略）

注:组间比较 P<0.05;组内比较 Δ P<0.05（服药后每经过两周与前一次血压值比较）

（3）AA及AC基因型患者的收缩压下降程度的比较无统计学意义（P>0.05），而AC基因型患者的舒张压下降程度与AA基因型患者的比较差异有显著性（P<0.05），见表3。

表3 AA、AC两组基因型患者治疗后收缩压、舒张压下降水平变化 （略）

注: 组间比较 P<0.05

3 讨论

EH是一种由遗传因素和环境因素共同作用引起的多基因遗传病，尽管目前有多种不同类型的抗高血压药物，但是血压能被较好控制的患者仍然不到40% ［1］ ，这与EH发病需要一组易感基因和一组环境因素的共同作用、不同患者的发病可能存在这些因素的不同组合有关。基于EH发病机制的特点，目前对于高血压的治疗提倡个体化原则，对于某些基因多态性与各类抗高血压药物降压效果间的对应性研究也越来越受到重视。近年来一项在美国进行的TOHP临床实验进行了血管紧张素原（AGT）基因的G-6A多态性分析，发现AA基因型组在限盐摄入或减轻体重后，血压的降低程度显著大于GG基因型组，提示基因多态性分析可帮助我们估计患者对治疗的反应效果。

由于利尿剂可使尿钠排泄增加，使血浆容量、细胞外液容量和心输出量下降，以致使血压下降的作用已得到肯定，因此利尿剂在EH的治疗中被广泛应用。最近Turner等人在EH的个体化治疗的研究中发现噻嗪类利尿剂（双氢克尿噻）的降压效果与G蛋白β 3 亚基C825T基因多态性有关，研究表明噻嗪类利尿剂对于低血浆肾素、主要由容量负荷所致的EH患者中的TT基因型患者的收缩压和舒张压的降压效果与CC、CT基因型患者的相比疗效显著、两者比较差异有显著性 ［3］ 。本研究主要是探讨双氢克尿噻的疗效与AT1R基因多态性的关系，血管平滑肌细胞上主要存在的是AT1R，AT1R是调节血压的主要中介，它与AngⅡ结合后引起多种生物学效应，如血管收缩、醛固酮分泌、心肌细胞正性肌力作用;此外还参与AngⅡ的促有丝分裂原活性，引起血管平滑肌细胞增生、间质组织胶原表达以及心肌肥厚 ［4］ ，因此AT1R基因结构与表达量的变化与高血压关系密切。本研究结果显示，AA、AC两组基因型患者服用双氢克尿噻2周后收缩压和舒张压均有明显下降（P均<0.05），并且这种降压效果主要表现在用药后的前2周内，这与利尿剂在最初几周可使血容量降低以致使血压下降有关。双氢克尿噻对于不同基因型（AA、AC）EH患者收缩压的治疗效果的比较没有统计学意义，但AC基因型患者舒张压的降压幅度要明显大于AA基因型患者，两者比较差异有显著性。说明双氢克尿噻对于原发性高血压患者舒张压的降压效果可能与AT1R的基因型有关。了解不同基因型对于药物的不同反应，对于指导我们制定合理的治疗方案与估计疗效有一定的指导意义。

有研究表明，AT1R基因A1166C多态性与血浆血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）活性有关，但本实验没有测定不同基因型患者的血浆肾素活性水平、血浆醛固酮浓度、尿醛固酮排泄率、血浆AngⅡ活性水平等指标，因此尚不能解释不同基因型对于利尿剂的不同反应是否与血浆肾素活性水平、血浆AngⅡ水平及醛固酮的激活有关。另外本实验入选患者年龄较大、样本量较小，这是本实验不足之处。基于EH的特殊遗传背景，今后的研究除进一步扩大样本量，还要在基因 组的水平上，观察多个EH后选基因与药物疗效的关系。用分子生物学手段检测基因型对于药物开发及其疗效与作用的评估预测有极重要的意义，药物基因组学的研究进展将最终使我们能够根据基因分型结果实现EH患者个体化治疗。

参考文献

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篇10

【关键词】 人类白细胞抗原；PCR-SSP；基因； 多态现象

Investgation of HLA—DQA1 polymorphism in national minority of Inner Mongolia by PCR-SSP

【Abstract】 Objective To investgate the distribution of HLA-DQA1 gene polymorphism in Ewenki and Hui nationalities of Inner Mongolia;Having compared with other groups in China to analyze the charactoristic of the gene types.Methods By the polymerase chain reaction(PCR)-squence specific primer(SSP).Results Gene frequncy of 99 in Ewenki were : *0301（0.394），*0104（0.212），*0102（0.152），*0501（0.152），*0103（0.04），*0201（0.051）；*0601，*0401，*0302were abcent ；Gene frequncy of 56 in Hui were *0301（0.339），*0102（0.214），*0501（0.143），*0601 （0.143），*0401（0.036），*0201（0.054），*0103 （0.071）；*0302，*0101， *0104 were abcent.Conclusion There was not only the same charactoristics but also the special ones in HLA—DQA1 gene polymorphism of Ewenki and Hui nationalities which had some difference by comparing with other groups in China.

【Key words】 human leucocyte antigen;PCR-SSP;gene;polymorphsim

HLA是人类主要组织相容性复合体，它不仅具有个体差异，而且还有不同民族的差异。不同群体HLA基因分布的调查，对于探讨各民族起源有很重要的意义［1］。HLAⅡ类抗原DQ由高度多态的A、B链构成，研究DQA的多态性对于人类种群关系研究、人类进化、相关疾病和异体移植有着重要的理论意义和实践意义。鄂温克族是个人口总数很少的民族，主要聚居在我国东北地区，少数居住于黑龙江省。回族分布在全国各地。近几年随着分子生物学的快速发展，对人类健康群体的研究不断深入。本文采用PCR-SSP法，从探讨鄂温克族、回族HLA-DQA1基因多态性入手，研究其基因分布的异同点，并与中国其他民族做比较。

1 材料与方法

1.1 研究对象 99例鄂温克族健康人标本来源内蒙古东部地区三代以上父母均为鄂温克族，男48例，女51例，平均年龄23.30岁。静脉取血2～3ml，加抗凝剂，-20℃保存。56例回族健康人，标本来源健康体检，男34例，女22例，平均年龄38.60岁。

1.2 实验材料和方法

1.2.1 标本DNA制备 参照文献［2，3］。

1.2.2 PCR—SSP法1.2.2.1 引物设计 HLA-DQA1特异性扩增引物参照文献［4］稍作修改， 9个5′引物及7个3′引物共组成12对不同的引物对，能鉴定有表达产物的HLA-DQA1等位基因。

1.2.2.2 PCR扩增条件及试剂 每管PCR反应液总体积为10μl，包括：DNA模板1μl(80ng);10ⅹBuffher 1μl;4ⅹdNTP 1μl(2.5mM);Primer 1μl(各5pmol);Taq DNA 聚合酶0.35U(华美生物工程公司提供)加去离子四蒸水至10μl，混匀，稍加离心，加2μl无菌石蜡油以防蒸发。置PCR仪上按92℃预变性（2′）；92℃变性（30″）；60℃退火（45″）；72℃延伸（60″）；72℃最后延伸（10″）的程序进行32个循环扩增。

1.2.3 统计学方法 基因频率用直接计算法统计，群体间的等位基因比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 内蒙古地区鄂温克族、回族HLA-DQA1等位基因频率 见表1（略）。

2.2 内蒙古地区鄂温克族、回族HLA-DQA1等位基因分布与其他民族比较 见表2。

根据测得的鄂温克族、回族HLA-DQA1等位基因频率与国内学者对其他民族群体该基因位点研究的数据进行了比较，结果见表2。 表1 内蒙地区鄂温克族、回族HLA-DQA1等位基因的分布频率（略）表2 内蒙地区鄂温克族、回族HLA-DQA1等位基因频率（略）注：与鄂温克族比较：1）P

3 讨论

MHC-Ⅱ类抗原在人类称HLA-Ⅱ类抗原，他是存在于人体第六对染色体短臂上一组密切连锁基因群的表达产物，一般认为有三个亚区，即DP、DR、DQ，每一个位点至少有一个α基因和一个β基因。据研究表明［5，6］，HLA不同基因座位的各等位基因在人群中以一定频率出现，且呈现为连锁不平衡。由于这些特点，某些单体型在群体中以较高频率出现，并较之单一HLA基因型更能显示人种和地理族的特点［7］。

本文运用PCR—SSP法对鄂温克族和回族人群的DQA1基因多态性进行了研究，并与云南汉族、满族、维吾尔族、北方蒙古族做比较。研究结果表明：鄂温克族和回族的HLA-DQA1*0301、*0501、*0102的等位基因频率较高；*0201、*0103均较低，在统计学上差异无显著性。而回族的*0601基因是高频率基因，在鄂温克族却未检测到；鄂温克族的*0104是高频率基因，在回族却未检测到。与其他民族群体比较，鄂温克族与云南汉族在*0601；与满族在*0601、*0104、*0301、*0101；与维吾尔族在*0101、*0103、*0201、*0301；与北方蒙古族在*0101、*0102、*0103、*0302、*0601上差异均有显著性。回族与云南汉族在*0104、*0201、*0601；与满族在*0101；与维吾尔族在*0101、*0103、*0201、*0301；与北方蒙古族在*0101、*0102上差异均有显著性。

对上述资料的解释为：我国是个多民族的国家，中华民族的形成和发展经历了一个复杂的融和、变迁的历史过程。由于历史、地理、自然环境、社会等各种因素的影响，不同民族，甚至同一民族的不同群体的HLA基因型构成存在差异。经比较鄂温克族与南方汉族仅在*0601上差异具有显著性，而在其他基因型上却无明显差异；回族与满族在*0101上差异有显著性，而在其他基因型上却无明显差异。这种现象能否运用地理、历史、环境、社会等因素来解释，有待进一步加大样本量，来分析以上两个民族的遗传规律及基因结构。

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