基因治疗范文
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导语：如何才能写好一篇基因治疗，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
关键词基因治疗;治疗方式;发展前景
中图分类号r459.9文献标识码a文章编号 1007-5739(2010)01-0025-01
美国是世界上最早开展基因治疗的国家,也是目前开展基因治疗最多的国家。我国在1991年7月开始基因治疗的临床研究,最早的工作是对b型血友病的基因治疗及利用抑癌基因对癌症的基因治疗[1]。基因治疗目前主要用于治疗对人类健康威胁严重的疾病,包括遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等[2]。
1基因治疗的方式
1.1体内基因治疗
体内基因治疗是指将具有治疗功能的基因直接转入病人的某一特定组织中。利用反转录病毒载体已成功地将真核基因转入动物细胞,但通过质粒dna的直接操作,将更加省时而且产量较高;采用温和病毒载体的体内基因治疗主要是通过腺病毒和单纯疱疹病毒来完成的,即将载有矫正基因的载体直接注射入需要这些基因的组织。以腺病毒为载体的体内疗法在遗传性疾病方面,目前主要见于囊性纤维变性的基因治疗研究。多数研究表明,基因治疗纠正了呼吸道上皮的氯离子转运缺陷,使跨上皮基础电位下降,肺功能有所改善[3]。
1.2反义疗法
反义疗法主要是通过阻遏或降低目的基因的表达而达到治疗的目的。反义疗法是通过引入目的基因的rna的反义序列而达到上述目的。当引入的反义rna与mrna相配比后,用于翻译的mrna的量就大大减少,因而合成的蛋白的量也相应大大减少。引入的反义序列也可能与基因组dna互补配对,从而阻遏mrna的转录。这2种情况都会使细胞中靶基因编码的蛋白合成大大减少,以达到基因治疗的目的。
1.3通过核酶的基因治疗
20世纪80年代初,美国科学家cech和altman发现了核酶,核酶是指由rna组成的酶,能够序列特异性地抑制靶mrna。近年来,核酶在抑制癌基因的表达[4]、增强肿瘤对药物的敏感性及抑制肿瘤血管的生成等方面的应用得到了广泛的研究。
1.4自杀基因疗法
自杀基因疗法是恶性肿瘤基因治疗领域最有希望的方法之一,已广泛用于各种恶性肿瘤的基础研究和临床试验性治疗。它是用药物敏感基因转染肿瘤细胞,其基因表达的产物可以将无毒性的药物前体转化为有毒性的药物,影响细胞的dna合成,从而引起该肿瘤细胞的死亡。
2基因治疗存在的问题
2.1基因治疗的社会和伦理问题
基因治疗不仅仅是一种医疗方法,它还涉及很多其他问题。因为当人们试图“纠正”人类自身“不正常”的基因时,这种纠正的后果是无法预料的。由于人类的遗传信息非常复杂,转基因也可能带来不可预料的后果,没有人能保证这种基因结构的改变绝对不会造成人类某一未知功能的缺失。另外,当人们试图把基因治疗引入生殖细胞时,又涉及后代基因结构的改变问题,且改变将直接影响这个“未来人”,这是一个很难解决的伦理问题。
2.2基因治疗的技术问题
目前,基因治疗的对象是单基因的缺陷,但许多疾病涉及多个基因之间复杂的调控和表达关系。对这类疾病的基因治疗难度很大,因为向细胞中导入多个基因后,使几个基因之间能保持正常的调控关系几乎是不可能的。即使是单基因缺陷症,使导入细胞的基因能正常表达也是一个较复杂的问题。将基因导入细胞后,其表达量的多少是直接影响能否达到治疗的目的和有无副作用的关键。但这个问题将会在人类基因组计划完成的基础上,对人类后基因组计划的开展,弄清了人类基因之间复杂的调控联系后而最终得到解决。只有这样,才能在基因治疗中尽量做到使导入的基因处于正确的调控下,取得治疗效果,消除副作用。
3展望
以基因转移为基础的基因治疗要在临床上很好地应用,还有待理论和各种技术的进一步发展。过去20~30年基因治疗的发展已取得了巨大成就,已被看成是对先天和后天基因疾病的潜在有效的治疗方法,不过其依然存在缺少高效的传递系统、缺少持续稳定的表达和宿主产生免疫反应等问题。今后基因治疗研究将向2个方向发展:一是基础研究更加深入,以解决在临床应用中遇到的一些困难及基因治疗本身需要解决的一些难点;二是临床试用项目增多,实施方案更加优化,判断标准更加客观,评价效果更加精确。总之,随着分子生物学、分子遗传学以及临床医学的发展,基因治疗也会不断发展,日趋成熟,很多难题会得到解决,并在临床上得到广泛应用。 编辑整理
4参考文献
[1] 李立家,肖庚富.基因工程[m].北京:科学出版社,2004.
[2] anderson w.human genetherapy[j].nature,1998(392):25.
篇2
但是其在医学上的价值人类依旧不能过于乐观。
一直备受人关注的人类基因图谱最近再次迎来了“喜讯”：由中、美、英等国共同发起的大型国际合作项目“千人基因组计划”最新研究成果10月31日在《自然》在线发表。该协作组公布了1092个高分辨率人类基因组遗传变异整合图谱。
基因治疗采取极为谨慎态度
“千人基因组计划”从实施到现在，已经整整5年时间。
不过在中国科学院基因研究所医学博士甄二真看来，尽管在科学研究上，这样的测序有着比较大的价值和意义，但是实际应用到人类的健康和疾病治疗，依旧还有很长的路要走。
“就算能够将导致一些疾病发生的基因片段或者特定位置找出来，现在人类对它们实际上还是无能为力。”甄二真说。
随着基因科学和技术的发展，目前国内外的很多实验室已经可以通过敲除、关闭、替换具体基因片段或者特定位置的方式对老鼠等一些实验动物进行部分遗传性疾病的治疗实验，但是，这样的实验目前依旧停留在实验室阶段。
“基因领域中有很多东西对人类而言还十分陌生，尽管人类现在已经了解到人体的一些基因片段或者特定位置的变异是某类疾病的缘由，但是将其敲除、关闭或者替换，会出现什么样的结果，存在很大的不确定性。因此人类当前实施这样的手术在安全性上得不到充分的保证。”甄二真说。
国家人类基因组南方研究中心研究员韩泽广近些年来一直在基因方向上进行肝癌的研究，但现在还没有可靠的方法改造突变基因来治疗癌症。
韩泽广说，因为伦理上的一些风险和争议，目前世界各国对于人类基因工程治病一直采取的都是一种极为审慎的态度。
基因治疗存在炒作质疑
人类基因组计划从1990年正式启动、先后共有美国、英国、法国、德国、日本和中国共6个国家的众多科学家共同参与，其预算高达30亿美元。但是，最近国内外不少生物学家及医学专家也都开始质疑基因治疗技术的炒作。
2000年，美国总统克林顿与美两大人体基因研究组织的科学家在白宫联合宣布：有史以来的第一个人类基因组草图完成。
“利用这个新知，人类将获得巨大利益。它能彻底改变我们对大多数疾病的诊断、预防和治疗的方式。”克林顿当时如是说。另外他还预言，未来几年人类通过基因手段有望治愈阿尔茨海默症、帕金森氏症、糖尿病和癌症等。但是时至今日，这些疾病依旧还在严重威胁着人类的健康，人类基因图谱的公布对这些疾病的治疗并没有发挥实质性的作用。
广州中医药大学教授曾庆平认为，尽管现在高分辨率的人类基因组遗传变异整合图谱已经公布，但是其在医学上的价值人类依旧不能过于乐观。
曾庆平说，如果将人类基因组计划与千人基因组计划作一个比较，那么可以说人类基因组计划的完成是印刷了一部生命的“天书”，而千人基因组计划的完成就是把这部“天书”重印或再版一次，只不过其间作过重大修改。形象地说，这些基因图谱上的“基因序列恰如一本火星文小说，没有几个地球人能读懂”，另外现在将基因变异通译成疾病风险的“字典”也还没有完全编撰出来。
警惕“基因疗法”骗局
甄二真说，这些年来，更为严重的是，一些人开始借着全球人类基因组计划和千人基因组计划研究成果对患者进行忽悠和欺骗。
目前在国内，有不少医院都在利用“基因疗法”或“基因工程”治病。有的医院称自己能进行“基因疗法”，能以最新的科技治疗乙肝病人；有广告称，某医疗机构从研究人体基因入手，根据破译的人体糖尿病基因密码，独创了糖尿病“基因疗法”，成功研制出某种新药。甚至一些皮肤病医院也都开始打着“基因疗法”的招牌。
甄二真告诉记者，目前国内所有的医疗机构声称的“基因疗法”及“基因工程”根本就不靠谱，他们有很多人甚至自己也不知道“基因工程”是怎么回事，所谓的“基因疗法”也更不可靠。
“其实，现在进行宣传的大多是小型医院和民营医院。真正有实力的三甲医院几乎看不到这样的宣传。”甄二真说目前在世界上，还没有一个国家有过基因工程成功治病的案例，美国1999年曾经临床尝试利用基因操作的方式对一个囊肿性纤维化遗传病患者进行治疗，但是在治疗过程中，患者却意外发生了死亡。
“现在国内一些声称进行基因治疗的，他们的说法都比较模糊，只是患者不了解而已。” 甄二真说。
近些年，利用人类基因图谱，国内外有公司已经开始开发贮存个人基因组序列数据的“健康风险身份证”，在未来，也许我们只要花上不到万元甚至是更少的费用就可以拥有一张自己的“健康风险身份证”，通过该证，我们就可以了解到我们将来患某种疾病的风险，并提前实施积极的预防。
篇3
1990年美国首次成功地进行腺苷脱胺酸（ adenosine deam inase， aDA）缺乏的基因治疗（ gene therapy）以来，基因治疗已成为当前生物医学中进展最快的领域之一［1］。基因治疗在脊髓损伤（ spinal cordIn-jury， sCI）后轴突再生中亦可望成为有效的手段之一［2—5］。利用外源基因在靶细胞（包括神经元）中的表达，以改变神经元某些内在特性，从而进一步探索 sCI后神经元的存活能力，再生特性和功能恢复的分子机理，最终为 sCI的治疗探讨新途径是目前治疗 sCI的研究方向。它有助于把 sCI治疗提到一个新的水平。值得我们进一步研究。
一、 sCI基因治疗有关分子生物学基础
基因转移（ gene transrer）是实现基因治疗的关键技术［6］。因此，基因治疗的首要步骤是转导基因的分子构建。一般转导基因由目的基因 cDNA，启动子／增强子和载体三部分组成。目的基因重组时除本身特有的（ cD-NA）序列外，通常还需进行必要的修饰，如转录起始修饰，翻译起始，内含子和聚腺苷酸化信号等的修饰。用于重组的启动子／增强子，一般有三种：强组成型（ strongconstita-tive），管家型（ housekeeping），及组织持异型启动子（ tissuesepcific），其中最常用为第一型［7］。理想的体内基因转移载体要求：转移具有细胞靶向性，导入基因的表达可调控，而且转移的方法简便易行。用于 sCI的基因转移载体主要是逆转录病毒载体（ retroviralvector），即乳腺病毒、莫罗尼小鼠白血病病毒和劳斯肉瘤病毒等。构建转录病毒载体的基本原理是：病毒的长末端重复序列（ longterrminalrepeat， lTR）可以对插入的外源基因进行有效转录，这样先在体外构建反转录病毒前病毒 dNA载体，即酶切去除基因组中的反式作用区域（ gag， polenv基因区域），产生缺陷型的反转录病毒，这种病毒只具有控制感染和整合的序列（即顺式作用区域）。缺陷型病毒载体必须依赖包装细胞提供的蛋白质才能完成包装，产生带有外源基因的伪病毒。它能感染受体细胞，载体 dNA将依靠其 lTR整合入受体细胞染色体基因组，这样外源基因被带入宿主细胞并得以表达［2、3、6、7］。逆转录病毒载体感染率高，最常用于体外间接基因治疗，其缺点是要求靶细胞必须有增殖和分裂特性［8］。此外， cao（1995）［9］等研究用阳离子脂质体直接注入 cNS作基因转移获得成功。但因阳离子脂质体对 cNS有毒性，故目前致力于发展非病毒技术，一种阳离子多聚体一聚乙烯亚胺（ polyetnyl－ enimine）业已用于基因转移［10］。另有 selle［6］（1993）等报道的复制缺陷腺病毒也是一种适用于神经系统的理想载体。
在 sCI治疗中，由于受体细胞要植入脊髓内，因此所用受体细胞应当符合一定的标准［4、6］：①容易获取和繁殖；②移植后能长期存活且能继续分裂和具有活力。③无免疫源性及形成肿瘤的危险。目前已用于 sCI试验有雪旺氏细胞（ schwann cell， sC）和成纤维细胞［2、3、11］。此外，肌母细胞也是具有应用前景的较好受体细胞，研究表明肌母细胞转移至 cNS至少可活6个月，且无肿瘤源性［12］。
基因治疗的实施，有赖于将目的基因准确、高效地转入靶细胞，并使之安全，高效和可控地表达。基因治疗中基因转移的策略主要有两种，即活体外法（ exvivo approach）和在体法（ invivo approach）。活体外法就是在体外先对适当细胞进行遗传修饰，使其表达和分泌特定的重组蛋白，然后将修饰细胞移植入活体神经组织，通过神经递质替代或神经营养因子（ neurotrophic factor， nTF）和／其它治疗因子的引入恢复正常的神经功能。这种方法尤其适于因缺乏 nTF或神经递质前体分子等可扩散物质所致的 cNS疾病。如帕金森氏病（ parkinson＇ s diesease， pD）及 cNS损伤。
在体法是利用适当的重组病毒或化学基因转移载体将目的基因及有治疗作用的重组蛋白直接转移，效率较低，故较少采用。此外，活体外法可采用自体的工程细胞移植，在体外可对高表达细胞克隆进行筛选，有效的控制移植细胞的数量和质量，应用立体定位和成像技术可以将工程细胞十分准确地移植到 cNS特定的区域内，以保证在局部产生高浓度的治疗因子。
二、基因治疗 sCI的现状和展望
基因治疗 sCI尚处于实验探索阶段。目前，主要是采用 nTF基因修饰雪旺氏细胞（ sC）或成纤维细胞后再将其植入鼠的脊髓损伤区，观察其轴突再生的情况［2、3、11］。 tuszyski（1994）［11］将 nGF基因导入培养的 sC内，再将 sC移植到损伤的脊髓，发现 sC在体内能稳定地表达 nGF并促进轴突的再生。同年 tuszynski等［2］利用来源于莫洛氏鼠白血病的逆转录病毒载体，将人的 nGF基因导入鼠成纤维细胞中，再将成纤维细胞移植到半横贯损伤的鼠脊髓中（ t7平面）。1年后成纤维细胞仍能表达 nGF，电镜及免疫组化（ cGRP）检查，发现有大量的脊髓轴突再生（感觉纤维）。1996年， tuszynski等［3］采用同样方法，又将 nGF基因导入成纤维细胞中，并将其移植到半横断损伤的鼠脊髓中（ t7平面），14月后，通过 rT— pCR技术鉴定成纤维细胞仍表达 nGF。电镜、免疫组化（ gFAP、 cHAT、 tH、5— hT， cGRP）检查发现有大量的（感觉和运动）轴突再生。作者在国际上首次构造 po—5＇— flanking介导的21.5KD髓鞘碱性蛋白微基因（暂命名为 pSVPoMcat）的基础上，通过阳离子脂质体导入 sC中，然后再将基因修饰的 sC移植入成鼠半横断损伤脊髓，观察其对 sCI的再生修复作用，现已发现 pSVPoMcat微基因修饰 sC对 sCI后细胞凋亡有抑制作用［13］。
篇4
原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma，PHC)是常见的恶性肿瘤之一。目前对PHC主要治疗方法有手术治疗、放疗、化疗以及综合治疗等，然而治疗效果并不理想。随着分子生物学和免疫学技术的发展，基因治疗技术在肿瘤的治疗中具有广阔的前景。基因治疗的方式有两类，一类为基因矫正和置换；另一类为基因增补，不去除异常基因，而是通过外源基因的非定点整合，从而补偿缺陷基因的功能，达到治疗目的。本文就原发性肝癌的基因治疗进展综述如下。
1反义基因治疗
肝癌的发生、发展过程中许多癌基因及生长因子的基因产物大量表达，应用反义核酸在转录水平和翻译水平阻断某些基因的异常表达，以期阻断癌细胞内的异常信号传导，使癌细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡，从而抑制肿瘤的生长。反义基因包括反义RNA、反义DNA和核酶3类。根据碱基互补的原理，利用与目标基因特定序列互补的短链核苷酸片段来封闭目标基因表达，或利用核酶与相应的mRNA结合使其降解，均可达到基因治疗的目的。Wang等［1］利用AFP反义寡核苷酸治疗体外和裸鼠的SMMC7721肝癌模型取得了明显的抗癌作用，减少了AFP的表达，抑制SMMC7721细胞的增生。有研究显示［2］，引用反义胰岛素养生长因子(Insulingrowth factor I，IGFI) 寡核苷酸转染人肝癌细胞，发现肝癌细胞的凋亡阳性指数明显增加，并且被转染的癌细胞的CEA和AFP的分泌下降，表明反义IGFI寡核苷酸可以抑制肝癌细胞的增殖、促进分化并诱导肿瘤细胞的凋亡。
2自杀基因治疗
某些病毒、细菌等原核生物含有一类基因，其编码的酶能将原来无毒的药物前体转化为具有细胞毒性的代谢物而杀伤宿主细胞，这类基因称为“自杀基因”。这种特有的转换酶基因-自杀基因导入体内后，利用其产生的酶将无毒或低毒的药物前体转成细胞毒性代谢产物，从而杀死肿瘤细胞。近年来有关此类研究显示出良好的应用前景。目前常用针对肝癌基因治疗的有单纯病毒Ⅰ型胸苷嘧啶激酶/戊环鸟苷系(HSVTK/GCV) 和胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5Fc)等系统。有研究表明［3］，将“自杀基因”单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Herpes Simplex Virus Thymidine Kinease，HSVTK)转染肿瘤组织，则该细胞的HSVTK将前体药Gancyclovir(GCV)转化为对分裂细胞有杀伤作用的代谢产物，特异性杀伤肿瘤细胞，对肝细胞肝癌在体外有一定的疗效。Won等［4］通过单纯疱疹病毒将AFP反转剪接靶RNA构成酶导入肝癌细胞，取代HCC高效表达AFP的RNA残基，结果明显延缓肿瘤细胞生长并降低了细胞中表达AFP的RNA水平。
3免疫基因治疗
免疫基因治疗通过基因重组技术增强机体的抗肿瘤免疫功能而达到治疗肿瘤的目的。目前有基因疫苗免疫治疗、免疫刺激性因子免疫治疗、共刺激分子免疫治疗、活化的淋巴细胞进行过继免疫治疗、DC为基础的免疫治疗。基因疫苗指的是DNA疫苗，即将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。DC是体内最强专职抗原递呈细胞，能有效刺激静息的细胞，诱发初次免疫应答，还具有发动和调节抗肿瘤免疫反应的特性。薛刚等［5］应用IFNγ修饰的DC刺激T淋巴细胞，发现IFNγDC可促进T细胞增殖，并诱导T细胞向Th1分化。IFNγ的修饰可明显增强肝癌细胞抗原负载的DC所活化的T细胞对肝癌细胞的杀伤作用。由于IFNγ的修饰能促进DC成熟，增强DC促进T淋巴细胞增殖的作用，诱导细胞免疫，增强T细胞的细胞毒作用，使T细胞能有效地杀伤肿瘤细胞，将VEGFR和Tie 基因共同转染DC，不仅活化了特异性CTL，还可以阻止肿瘤新生血管生成，从而将肿瘤免疫治疗和抗肿瘤新生血管生成治疗有效结合起来［6］。
4抑癌基因治疗
到目前为止发现的抑癌基因有p53，转甲状腺基因及其他抗癌基因和Nras，Cmyc，Cest2，IGFⅡR以及CSF1等，在所有的抑癌基因中p53基因的突变率较高，它的失活会阻止细胞进入凋亡，从而使之处于持续分裂状态而增加突变及转化的概率。通过恢复或添加肿瘤细胞中失活或缺乏的抑癌基因，恢复抑癌基因的功能，从而抑制肿瘤的生长和转移，常用野生型p53、p16 等。p53基因的突变或者失活不仅使细胞本身周期失调具有致瘤性，并且可以影响细胞对其他凋亡信号如TGF的感受性下降。穆红等［7］使用p53cDNA的真核表达质粒p53pcDNA3对人源性肝癌细胞系HepG2进行转染，采用RNA原位杂交的方法证明了外源p53cDNA在HepG2p53细胞中的转染和转录，成功导入的p53cDNA可诱导HepG2细胞发生凋亡。p16基因也为抑癌基因，原发性肝癌中p16基因也常表现失活，p16基因能阻抑细胞生长于G1S期，但不诱发凋亡。p16启动子甲基化后，肝癌发生概率明显提高，尤其对于HBV感染者。
5抗血管生成基因治疗
肿瘤血管生成是肿瘤生长转移的关键步骤，是促血管生成因子和抑制因子作用失衡的结果。肿瘤血管生成是由肿瘤细胞和肿瘤浸润炎症细胞，如巨噬细胞或肥大细胞产生的促血管形成因子所介导的。恶性肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的形成，为了不断地获得氧和养料，肿瘤细胞就要不断的分泌促血管形成因子，不少细胞因子与肿瘤血管形成密切相关，因此，抑制肿瘤血管形成可以导致肝癌细胞衰退。肿瘤血管生成中最主要的是血管内皮细胞生长因子(VEGF)。有试验表明，用脂质体法转然反义RNA对抗血管内皮生长因子，能够抑制裸鼠的种植性肝癌的生长［8］。
6RNA干扰技术的应用
RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，也称为基因沉寂疗法，是利用双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)诱发对宿主细胞特异性RNA转录的抑制，从抑制特异的基因表达的方法。利用 RNAi技术可同时阻断多个癌基因的转录表达，从而有效抑制肿瘤的生长，达到治疗肿瘤的目的。体外RNA干扰技术的主要特点在于其能利用细胞本身的成分，使外源重组干扰片断能持续转录，同时能以一种类似酶促方式对目标mRNA进行切割，从而形成高效、稳定而持久的干扰效应。尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)是一种在肝癌细胞中高表达的蛋白，参与机体的多种生理和病理过程，其表达水平与患者的生存呈负相关。李华等［9］构建针对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因siRNA真核表达载体pLXSNEGFPU6siTERT，以hTERT siRNA逆转录病毒为表达载体，感染HepG2细胞24、48、72 h后，端粒酶活性分别下降了23.84%、58.03%和85.01%( P＜0.05)，感染后24h细胞凋亡29.05%，肝癌细胞生长受到抑制，并存在一定量效和时效关系。除了上述介绍的六种比较经典的基因治疗方法外，近年又出现了一些新的基因治疗方法。有专家设想利用超声/微气泡介导目的基因进入靶组织的靶胞内［1011］，可以达到靶向性、可控性转导基因治疗的目的，有望成为有实用价值的临床基因治疗技术。不同的基因治疗策略联合应用可相互协同，常采用免疫基因和自杀基因的联合治疗［12］，在增强机体抗肿瘤免疫能力同时直接杀伤肿瘤细胞，达到根治肿瘤的目的。
7展望
目前肝癌的基因治疗策略已有很大发展，具有广阔的应用前景，而早期临床证据和临床实验表明，基因作为一种药物有重要的地位，将来的发展方向主要集中在下列几方面：①寻找转染效率高、基因容量高、毒性小的基因治疗载体。近年来，利用超声对比剂微泡作为基因载体并用超声技术处理，提高转染率已取得成功［1315］；②开发基因，实现可调控的基因转染系统，以期提高在肝癌组织中的表达阳性率，进行更加精确的基因治疗；③设计更具靶向性和安全性的基因转运系统，寻找肝癌特异转录调控元件，从而使外源基因能够持续、稳定和特异表达，真正实现肝癌的基因治疗从动物实验转向临床应用，将是肝癌基因治疗的主要研究方向。尽管还存在很多需要解决的问题，但随着分子生物学及相关学科的发展，我们相信肝癌的基因治疗终将会广泛地应用于临床。
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0引言
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis， UC)和克罗恩病(Crohns disease， CD)都属于炎症性肠病(inflammatory bowel disease， IBD)， 其发病可能由感染、遗传、免疫等多种因素相互作用所致. 传统观念认为通过基因转移替代缺陷基因的基因治疗只适用于致病基因明确的疾病， 目前慢性炎症性疾病和自身免疫性疾病也被纳入了基因治疗的范围，可通过基因转移使机体表达免疫相关蛋白质， 从而下调致病的炎症和免疫反应， 上调保护性反应. 相对于囊性纤维化、重症联合免疫缺陷和肿瘤， IBD的基因治疗尚处于起步阶段. 本文就IBD的基因治疗作一概述.
1IBD的免疫病理机制和肠干细胞
CD的肠黏膜炎症以1型辅T细胞(Th1)型CD4+淋巴细胞占主导地位， 而UC则主要是由Th2型CD4+淋巴细胞介导的. 尽管CD和UC发生的机制并不完全相同，但最终的肠壁损伤均可归咎于巨噬细胞、粒细胞等炎性细胞及其产生的炎性细胞因子. 一方面， 淋巴细胞、巨噬细胞在肠道局部聚集并释放各种促炎细胞因子， 如TNFα，白细胞介素(IL)6，IL8，IL12，IL18等， 其中多数与疾病活动性呈正相关; 另一方面， 抗炎细胞因子如IL10，IL4，转化生长因子(TGF)β等的分泌相对不足. 这种促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间的失衡促进和加剧了肠壁的炎症反应. 细胞因子失衡可由Th1/Th2细胞比例失衡引起， 又可反馈性地加重Th1/Th2细胞失衡， 形成恶性循环， 因此被视为IBD发病机制中的重要环节. 肠上皮细胞不断更新， 衰老的细胞脱落至肠腔， 新的细胞则由位于肠隐窝底部的干细胞不断补充， 因此位于肠腺底部的干细胞成了基因治疗的最佳靶细胞. 但是肠干细胞缺乏明确的形态学特征或理化特性， 目前还无法与其它肠上皮细胞鉴别， 因此无法直接证明目的基因已成功转移至干细胞. 给予携带目的基因的载体后， 需要对干细胞成功地进行基因修饰， 肠上皮细胞才能持久稳定地表达目的基因. 腺相关病毒(AAV)载体能使肠上皮细胞于口服感染后1 mo内稳定高效地表达目的基因. 予免疫缺陷鼠静脉注射5型重组腺病毒(AD5)载体， 亦发现结肠上皮细胞长时间表达目的基因， 而消化道其他部位目的基因表达阴性. 肠道相关淋巴组织内的免疫细胞无疑是IBD基因治疗中最受关注的靶细胞， 但由于肠道黏膜上皮屏障的存在， 载体不能有效到达固有层. M细胞是存在于黏膜集合淋巴结滤泡顶部上皮中的一种特殊细胞， 其主要功能是将肠腔内抗原和病原体跨上皮转运至上皮下淋巴组织. 可利用M细胞能广泛摄取各种抗原物质的功能，及其与免疫细胞之间的对话方式， 通过M细胞将载体导入黏膜淋巴组织， 从而调节局部黏膜免疫反应和机体的系统免疫反应［1］. 有实验表明AAV载体能感染肠道固有层内细胞， 并使17%～19%的固有层细胞于感染后6 mo内持续表达目的基因.
2目的基因转移至胃肠道组织
实验表明［2］， 阻断小鼠肝动脉和门静脉后， 经眶后静脉丛予重组腺病毒载体， 30 min后恢复肝脏血供， 肠壁血管、血管周围组织和小肠绒毛持续表达目的基因达数周之久. 局部予经包装的质粒、脂质体、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和AAV载体均能将目的基因转导至肠道黏膜，且黏液溶解剂(二硫苏糖醇、N乙酰半胱氨酸)和蛋白酶体调节剂(MG101)能促进转导效率. 上述载体中， 以AAV载体系统的应用前景最广阔. 重组AAV(rAAV)载体去除了所有编码序列， 只保留145 bp的末端重复序列， 不含任何病毒基因， 感染细胞后，前病毒DNA定向整合至19号染色体的AAVS1区域. 在人类基因治疗的常用病毒载体中， rAAV是目前唯一没有引起宿主病理反应的载体［3］. 实验表明， 以AAV载体对空腹大鼠灌胃6 h后， 胃十二指肠和近端空肠固有层细胞开始表达目的基因， 并能持续稳定表达6 mo; 虽然未观察到结肠有目的基因表达， 但是可以推测灌肠能使目的基因被转导至结肠固有层细胞. 此外， 虽然没有直接证据表明AAV载体能感染肠干细胞， 但除固有层外， 肠上皮细胞亦表达目的基因1 mo. AD5是体内实验使用最多的载体， 该载体由于E1缺失造成病毒复制缺陷. 腺病毒载体可高效感染多种靶细胞， 对分裂期细胞和增殖停止期细胞均有很高的导入效率， 这是逆转录病毒载体所不具备的. 据报道， 经十二指肠饲管予大鼠E1缺失的重组腺病毒载体后， 目的基因能有效导入十二指肠、空肠和回肠上皮细胞. 以E1/E3缺失的重组腺病毒载体灌肠后， 结肠上皮细胞能高效表达目的基因. 而且炎症性肠病的基因治疗AD5载体感染IBD患者肠上皮细胞的效率远高于非IBD患者［4］. 但是经消化道予腺病毒载体主要感染的是更新速率很快的肠上皮细胞， 因此AD5载体转导的目的基因在肠道内的表达时间只能维持数天， 为达到治疗IBD的目的， 需反复给药， 同时还要避免机体的免疫反应. 有报道称， 经尾静脉注射重组腺病毒载体后， 免疫缺陷小鼠结肠上皮细胞和隐窝细胞可长时间表达目的基因， 而消化道其他部位无目的基因表达. 该实验结果非常诱人，但由于E1缺失造成病毒复制缺陷， AD5载体不能像逆转录病毒载体一样整合至宿主基因组.
3IBD基因治疗的策略和研究现状
3.1下调促炎细胞因子的表达IL18是一个多功能细胞因子， 结构类似IL1家族， 能活化T淋巴细胞内的核因子(NF)κB和激活蛋白(AP)1， 与IL12诱导的STAT4协同促进T 淋巴细胞表达干扰素(IFN)γ［5］. 此外， IL18还通过上调TNFα，IL6和IL1的表达加剧炎症反应. 以IL18结合蛋白(IL18BP)治疗三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠结肠炎， 可减轻肠道炎症. 鉴于IL18在CD中的重要作用， Wirtz等［6］尝试以IL18为靶点对CD动物模型进行基因治疗. 构建表达IL18反义寡核苷酸的重组腺病毒载体， 予移植CD4+ CD62L+T淋巴细胞形成的CB.17SCID小鼠结肠炎模型灌肠. 蛋白质印迹分析显示表达IL18反义寡核苷酸的重组腺病毒载体能抑制结肠组织产生IL18， 实验组结肠炎的内镜和组织病理学改变均较对照组明显改善. 此外， 该实验还观察到局部给药方式只抑制结肠固有层单核细胞产生IFNγ， 而不影响来源于脾脏的单核细胞.
3.2上调抗炎细胞因子的表达IL10能抑制巨噬细胞活化和分泌IL1α， ILβ， IL6， IL12， IL18和TNFα等细胞因子， 下调人类白细胞抗原(HLA) Ⅱ类分子的表达; 通过影响抗原递逞细胞功能而强烈抑制CD4+ T淋巴细胞的增殖和分泌细胞因子. 此外， 其还能直接抑制T淋巴细胞产生IL2，TNF 和IL5. IL10基因敲除小鼠可自发形成Th1型淋巴细胞介导的结肠炎. IL10对IBD动物模型有效， 对CD患者的临床实验结果却不令人满意， 其原因可能是肠道局部IL10浓度过低， 起不到抑制炎症的作用， 而加大剂量又会伴随严重不良反应; 也可能是因为IL10半衰期太短所致. 一些研究小组尝试以不同的给药方式(灌肠、经静脉和经腹腔) 评估AD5 IL10对IBD动物模型的预防和治疗作用，结果显示AD5 IL10能预防实验性结肠炎的发生; 静脉给药的血IL10浓度显著高于腹腔给药，但并不能显著提高结肠局部IL10浓度; 灌肠给药的结肠局部IL10浓度高于静脉给药［7-10］. 虽然这些研究没有得到预期的结果， 但至少证明以病毒载体表达细胞因子在IBD 基因治疗中是可行的. 与IL10一样， IL4也具有抑制巨噬细胞产生TNFα，IL1等促炎细胞因子的作用. 此外， 作为Th0细胞向Th2细胞分化的主要诱导因子， IL4可调节Th1/Th2细胞平衡，缓解结肠炎症，但有研究［11］显示IL4抗体能下调SAMP1/Yit鼠IFNγ的表达并明显缓解肠道炎症， 而移植分泌IL4的Th细胞可诱导SCID小鼠发生肠炎.
转贴于 因此， IL4在肠道免疫中可能并非仅起抗炎作用， 其在人类IBD中的确切作用尚有待确定. TGFβ作为一种抗炎细胞因子在肠道免疫平衡中发挥重要作用， Kitani等［12］研究了TGFβ1质粒在TNBS 诱导的结肠炎中的作用，结果显示鼻内一次给药可预防和治疗实验性结肠炎， 而腹腔给药无治疗作用. 肠固有层和脾脏持续2 wk表达TGFβ1 mRNA， 并同时出现产生TGFβ1的T淋巴细胞和巨噬细胞， 且并不引起肠道、肺、脾、肝、肾发生纤维化. TGFβ除抗炎作用外， 在组织纤维化， 特别是病理性纤维化中也起重要作用. TGFβ1经蛋白激酶C和细胞外信号调节激酶1/2丝裂原活化蛋白激酶通路促进CD患者肠道成纤维细胞产生纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原和结缔组织生长因子［13］. Vallance等［14］以表达TGFβ1 的重组AD5载体灌肠， 导致小鼠结肠发生纤维化， TNBS诱导的结肠炎恶化并加速肠壁纤维化进程.
4展望
基因治疗为目前无法治愈的疾病提供了希望， 上述临床前试验为IBD的基因治疗勾勒出了诱人的前景. 分子生物学的不断发展将使高效、特异性地下调基因表达成为可能. RNA干扰是一种在生物体内普遍存在的、在RNA水平调节基因表达的方式， 双链RNA能高效、特异性地诱导与之同源的mRNA降解. 有报道称局部给予针对TNFα的小干扰RNA能有效缓解胶原诱导的关节炎症［15］. 综上所述， 虽然IBD的基因治疗研究已取得了令人鼓舞的成绩， 但仍应认识到基因治疗在IBD中尚处于起步阶段， 在应用于临床之前还有很长的路要走.
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篇6
原发性高血压病是由遗传与环境因素相互作用而导致的多基因遗传病,遗传因素对其发病的影响占30%～50%［1］。目前有关高血压基因治疗的研究很多,肾素血管紧张素系统（RAS）是研究的热点之一。
1肾素血管紧张素系统
降低基因表达（亦称反义基因疗法）是指根据靶基因结构特点设计反义寡核苷酸（AS-ODN）分子，导入靶细胞或机体后与双链DNA或与mRNA结合形成杂合体，从而封闭或抑制升高血压相关基因的复制或表达，以期达到降压目的。RAS的过度活动是人类原发性高血压及许多高血压动物模型主要病理机制之一。目前肾素基因（REN）、血管紧张素转化酶基因(ACE)、AngⅡ1型受体（AT1R）和血管紧张素原基因(AGT)是RAS反义基因治疗的主要靶点。
1.1肾素基因(REN)Wang等［2］将反义肾素核苷酸导入冷诱导高血压（CIH）大鼠后降压幅度达40mmHg，持续至少5周，并有效抑制了整个的RAS。
1.2血管紧张素转化酶基因(ACE)Gelband 等［3］给新生自发性高血压大鼠（SHR）心内注射ACE-AS，血压降低(18±3)mmHg,且持续时间较长，其F1代大鼠也保持了这个水平。与高血压发展相关的肾血管反应性、电生理及钙离子的动态平衡均得到改善，该研究还发现虽然ACE-AS对SHR的血压下降程度不是很大，却可以永久预防肾血管的病理性改变。Wang等［4］给SHR静注逆转录病毒携带的ACE反义核苷酸，结果显著降压，并阻断了高血压引起的心、肾、血管病理改变。同时还发现ACE-AS被整合入亲代基因组传递给子代，使子一代的血压较对照组明显降低，其心肌肥厚程度也有所改善。
1.3血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)1型受体(AT1R)基因Phyills等［5］以AT1R为靶目标研究反义基因治疗的效果，向SHR的心内注射携带有AT1R的反义cDNA的白血病病毒逆转录载体(leukemia virus retroviral vector,LNSV)，可以观察到39日龄大鼠的血压显著降低。Pachori等［6］以逆转录病毒将AT1R的ASODN转染SHR,可使大鼠血压持续下降。此外,用转肾素基因大鼠建立高血压及其相关心肌肥厚动物模型,以逆转录病毒将AT1R的ASODN一次性注入新生大鼠心肌中,结果发现该ASODN能长时间持续抑制AT1R在心血管组织中(包括心脏)的表达,虽然血压未降至正常水平,但心肌肥厚程度明显减轻。Hiromichi 等［7］研究发现，AT1R基因可以使血压下降，并能逆转心肌肥厚。
1.4血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)2型受体(AT2R)基因AT2R与AT1R介导的作用相反。Metcalfe等将以慢病毒为载体的AT2R cDNA导入SHR体内，转染21周后，SHR左心室壁厚度降低，心脏肥厚程度下降［8］。由慢病毒介导的AT2R在AngⅡ灌注高血压大鼠模型中也具有抗肥厚和抗重塑作用。虽然血压持续升高但AT2R转染可以保护由高血压引起的心脏损害［9］。
1.5血管紧张素原基因(AGT)Sugano等［10］将携带有AGT mRNA反义核苷酸的重组腺相关病毒载体(rAAV-AGT-AS)一次性注入5 d龄的SHR心肌中,结果发现高血压发病推迟91 d,且大鼠在成年后血压明显降低,并持续6个月。重组腺相关病毒载体稳定,且未见肝脏毒性作用发生。但AGT-AS不能将血压完全降至正常水平，也不能完全逆转血管重塑。
2RNA干扰(RNA interference)
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来新兴的一种由双链RNA诱发的“基因沉默”现象,能高效特异地阻断靶基因的表达［11］。RNAi技术已广泛应用于抗病毒、抗肿瘤等与基因高度相关疾病的研究［12-14］。
Chen等［15］把腺病毒介导的AT，aR-shRNA注射入C57BL小鼠脑的背侧迷走神经核区域，发现夜间血压明显下降。何军华等［16］用RNAi技术下调ACE表达，观察其对SHR血压及肾脏表达ACE的影响。研究显示:Ads-EGFP-ACE-shRNA经鼠尾静脉注射后，可被主动脉、肺、心肌、肾脏组织良好吸收。SHR出现明显的血压下降，降压作用至少可持续14 d之久，降压的同时未引起心率的改变，并且这种效应来源于单次给药，较现有降压药物有明显的优势。陈闽荔等［17］观察应用RNAi技术靶向基因沉默AT1R对肾性高血压大鼠血压及组织AT1R基因表达的影响。结果发现注射rAAV-AT1R-shRNA 24 h后,收缩压较注射前明显下降(22.3±5.5) mmHg（P
孙成林等［18］实验证实针对大鼠AT1R的mRNA设计的dsRNA质粒载体转染体外培养细胞,显著降低靶基因mRNA和蛋白表达,实现了基因沉默,并可以拮抗AngⅡ所诱导的体外培养血管平滑肌细胞的增殖作用。张璞等［19］发现靶向大鼠AT1R基因mRNA的短发夹RNA腺病毒载体,在体外和体内环境下高效特异性抑制靶基因的表达,能达到基因干扰目的。
张敬群等［20］以高肾素型高血压模型Goldblatt两肾一夹肾血管性高血压大鼠模型为研究对象,用构建的RNAi质粒pAT1a-shRNA1或pAT1a-shRNA2单次尾静脉注射,不仅阻断了进行性的血压升高趋势,并有一定程度下降,有统计学意义。研究还发现,RNAi质粒能显著抑制肾血管性高血压导致的心肌肥厚、重构，血管壁的重构硬化得到显著改善。
3问题与展望
高血压的基因治疗取得了令人瞩目的成就，有着令人鼓舞的前景，但是目前高血压病的基因疗法尚处于动物实验阶段,尚未达到广泛应用于临床这一既定目标，有许多问题仍然需要克服和解决。如靶基因的界定，基因转录的高效性、安全性、长效性问题、定向表达问题、给药途径问题、单一基因转移为主的基因疗法到多基因多因素多环节整体调节等。
但是随着分子生物学技术迅猛发展，深入了解血压及高血压相关基因对血压的调控机制，阐明人体组织器官生物学特性和疾病发展的病理生理过程，明确动物实验和临床研究的差距，相信基因治疗能成为高血压病治疗的最佳有效途径之一。
1）为天津市科委重点基金课题（No.09JCZDJC20600），课题名：中药干预肝阳上亢型高血压不同模型物质基础变化的机理
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篇7
【关键词】 阿尔茨海默病;β淀粉样蛋白;基因治疗
阿尔茨海默病(AD)主要症状为进行性记忆力和认知力减退。目前，药物治疗仍是治疗AD的主要手段，但现在所开发的药剂多为化学合成药，药物作用位点不专一，特异性弱。相反，采用基因治疗的方法不仅定位准确，作用持续时间长，而且没有非靶器官的副作用，是一种较为理想的治疗方法。此外，虽然研究证实AD是一种多病因介导的疾病，但是脑内β淀粉样蛋白(Aβ)代谢异常造成的Aβ片段聚集沉积引发的级联反应是AD的主要致病原因。Aβ的稳态水平依赖于生成、清除和内流间的平衡，因此，若能通过基因治疗的手段减少Aβ生成或上调酶介导的Aβ降解，促进受体介导的Aβ脑外流，抑制Aβ脑内流，便可有效地治疗AD。
1 降低Aβ生成的基因治疗
Aβ由分泌酶水解β淀粉样前体蛋白(APP)产生。体内有α、β、γ三种分泌酶参与APP的降解。α分泌酶的酶切位点位于APP蛋白中部，避免了完整Aβ分子序列的产生，且分解产生的可溶性淀粉样前体蛋白α(soluble amyloid precursor protein α，sAPPα)对神经细胞具有神经营养和神经保护作用，是正常人体内APP的主要代谢方式;β分泌酶使APP裂解成游离的sAPPβ及仍结合在膜上的CTF99，CTF99再被γ分泌酶水解，生成P3和含有39～42个氨基酸残基的Aβ，Aβ(尤其是Aβ40和Aβ42)聚集形成淀粉样斑块，产生神经毒性。
1.1 APP基因 APP基因突变形成新的酶切位点，易为β、γ分泌酶(尤其是γ分泌酶)水解，进而产生大量的Aβ40和Aβ42，促进了淀粉样斑块的形成。用携带siRNA的单纯疱疹病毒载体封闭APP突变基因的表达有效阻断了AD小鼠海马淀粉样斑块的形成〔1〕。
1.2 α分泌酶 α分泌酶及β、γ分泌酶两个酶系统对同一底物APP进行竞争。如果α分泌酶活性增强，既生成了对细胞具有营养作用的sAPPα，又减少了Aβ的产生，因此提高α分泌酶的活性或表达，利于对AD的治疗。
α分泌酶不是单一的蛋白酶，而是一类膜结合蛋白。金属蛋白酶10(adisintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10)具有α分泌酶的生物学功能。Colciaghi等〔2〕发现在AD患者中，ADAM10的水平降低，且随疾病的进展，其下降程度增加。通过转基因技术，使AD模型小鼠神经元中适度过表达ADAM10基因，sAPPα的分泌增加，淀粉样斑块的生成减少;相反，转染ADAM10突变基因的AD模型小鼠，脑内淀粉样斑块的沉积加剧〔3〕。这些结果在一定程度上提示了ADAM10对于AD具有潜在的治疗作用。ADAM10并非唯一的α分泌酶，过表达ADAM9、ADAM17或ADAM19的细胞，sAPPα的分泌也增加。因此，它们也是α分泌酶的活性成分之一，但其在AD治疗中的潜在作用还需要进一步的研究。
1.3 β分泌酶 1999年，Vassar等〔4〕用基因筛选的方法纯化出一种新的、在β分泌酶位点剪切APP的蛋白酶，称之为APP的β位点剪切酶(betasite APPcleaving enzyme 1，BACE1)。细胞实验显示，将化学合成的针对BACE1的siRNA转染APP基因突变小鼠神经元，干扰内源BACE1基因的表达，Aβ的生成下降〔5〕。Kobayashi等〔6〕的研究也发现BACE1基因敲除的AD模型小鼠的大脑Aβ沉积显著降低。构建BACE1 siRNA的慢病毒表达载体，将载体注射到AD模型小鼠海马中，小鼠海马组织BACE1的表达显著下降，Aβ的生成及淀粉样沉积显著降低，小鼠的行为学缺陷也得到一定改善〔7〕。
BACE2和BACE1同样具有剪切APP的功能，但它主要在Aβ序列的19Phe20Phe和20Phe21Ala部位进行剪切，破坏完整Aβ的形成而具有了类似α分泌酶的作用。BACE2与BACE1相互拮抗，竞争同一作用底物APP，从而抑制Aβ的生成。用慢病毒载体介导BACE2基因转染AD模型小鼠，BACE2在神经元内高表达，小鼠脑内Aβ的沉积显著降低〔8〕。
1.4 γ分泌酶 γ分泌酶是一组复杂的多亚基复合体，早老素(presenilin，PS)1和PS2为同源异构体，是γ分泌酶的组分之一。PS1和PS2基因突变可使Aβ42的水平选择性升高。APP、PS1和PS2基因突变被认为与早发型AD密切相关。除PS是γ分泌酶复合体组分外，还有Nicastrin(Nct)、APH1和PEN2，任一组分表达水平下调均将导致γ分泌酶复合体形成障碍。例如，用siRNA抑制细胞PS1的表达，γ分泌酶活性下降的同时，细胞中Aβ42的生成也显著降低〔9〕。γ分泌酶的相关研究为AD基因治疗提供了新的靶点，但其仍有待于深入的研究。
2 加速Aβ降解的基因治疗
降解Aβ的酶有很多种，主要是脑啡肽酶(Neprilysin，NEP)、内皮素转化酶(endothelinconverting enzyme，ECE)和胰岛素降解酶(insulin degrading enzyme，IDE，也称insulysin)。此外，还有纤维蛋白溶酶(plasmin)、组织蛋白酶B(cathepsin B，CatB)等。
2.1 NEP NEP属中性M13Zn金属蛋白酶家族，是位于脑神经轴突和突触膜上的II型跨膜糖蛋白，主要在黑质纹状体通路表达，海马和大脑皮质也有表达。NEP的催化位点暴露在细胞外，是脑中细胞外不溶性Aβ的主要降解酶。NEP水平及活性的降低会导致Aβ的沉积，促使AD的发生。研究发现，随年龄的增长，NEP的表达下降。AD患者大脑皮层和海马处NEP的活性和水平也显著降低〔10〕。用慢病毒载体、腺相关病毒载体或单纯疱疹病毒载体将NEP基因导入AD模型小鼠脑中，显著降低脑内Aβ水平，减少淀粉样斑块的沉积，降低氧化应激和炎症反应，抑制海马和额叶的神经病变，提高了AD小鼠的空间识别能力〔1，11〕。
2.2 ECE ECE也是M13Zn金属蛋白酶家族的一员，参与脑内Aβ的降解。细胞学研究显示，抑制ECE的活性，Aβ的聚集增加;ECE过表达，Aβ的聚集减少。动物实验研究显示，ECE基因缺失的小鼠脑内Aβ的水平升高〔12〕;相反，将表达ECE的重组腺相关病毒注射到AD模型小鼠大脑皮层及海马中，注射部位Aβ水平显著降低〔13〕。
2.3 IDE IDE位于神经元细胞膜上，主要参与细胞内可溶性Aβ单体的降解。随年龄增长，脑IDE的水平逐渐下降。敲除IDE基因，小鼠脑中Aβ的降解下降，脑内Aβ水平显著升高。IDE基因缺陷也将导致AD患者皮层微血管Aβ累积，形成脑淀粉样血管病变。通过转基因技术使AD模型小鼠脑IDE的表达增加了约2倍，显著降低脑Aβ的水平，延迟或完全预防脑中淀粉样斑块的形成〔14〕。
2.4 Plasmin Plasmin介导的酶解过程除了在纤溶、细胞迁移等病理生理过程发挥作用外，也参与脑内Aβ的降解。有活性的plasmin是由组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator，tPA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinasetype plasminogen activator，uPA)催化没有活性的血纤维蛋白溶酶原(plasminogen)而形成的。在AD模型小鼠脑中可见tPA和plasminogen共同表达于淀粉样沉积部位，对Aβ42降解起到了重要的作用。但在plasmin基因敲除小鼠脑中并未观察到内源性Aβ水平的升高，推测plasmin可能在Aβ聚集发生以后才发挥降解作用〔15〕。在AD患者或AD模型动物脑内，plasmin的表达与正常个体相比均显著降低。而用uPA或tPA和plasminogen联合应用均可显著降低AD模型小鼠脑内Aβ的沉积及淀粉样斑块的形成，为治疗AD提供了新的策略〔16，17〕。
2.5 CatB CatB也可以降解Aβ，尤其是Aβ42。抑制AD模型小鼠CatB基因的表达，Aβ42的表达升高，淀粉样沉积加剧。用慢病毒介导CatB基因转染老年AD模型小鼠，显著降低了已有的Aβ沉积〔18〕。CatB具有抗淀粉样沉积和保护神经作用。
3 加速Aβ转运的基因治疗
脑内Aβ的转运清除包括血脑屏障(bloodbrain barrier，BBB)转运和经非特异性脑间质液泵流到脑脊液后进入血液清除。脑内绝大多数的Aβ是经BBB途径转运出脑，10%～15%的Aβ由脑间质液泵流清除。可溶性Aβ通过BBB，是由受体介导的跨膜转运完成的：低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)和P糖蛋白(Pgp)介导可溶性Aβ由脑转运至血液，进而转移至肝脏降解;晚期糖基化终产物受体(RAGE)介导Aβ经血液由外周转运至大脑。
3.1 LRP 胞外可溶性Aβ与血管内皮细胞表达的LRP结合，经转胞作用过BBB进入血液循环;脑内可溶性Aβ通过脑间质液进入脑脊液同样需要LRP的介导;血清中还存在一种可溶性的LRP(sLRP)可以结合血清中70%～90%的Aβ，抑制血液中的Aβ进入脑内。AD患者或AD模型小鼠脑微血管LRP的表达与正常个体相比显著降低〔19〕。LRP基因缺失或表达量降低，造成AD模型小鼠脑Aβ沉积加剧，神经功能损伤加强。因此，增加血管内皮细胞LRP的表达或外周血液sLRP的含量，可有效降低脑中Aβ的积聚，为临床治疗AD提供了一条新的途径。2007年，Sagare等〔20〕利用重组型sLRPIV对AD模型小鼠进行治疗，显著降低了血管壁和脑中Aβ的沉积，改善了AD小鼠的学习记忆能力。
3.2 Pgp Pgp是一种膜结合蛋白，属于转运蛋白ATP结合物(ABCT)超家族成员之一，由MDR1基因编码。Pgp分布广泛，在担负重要生物屏障作用的脑毛细血管内皮细胞和肠上皮细胞中呈高表达。Pgp与多药耐药的产生关系非常密切，也参与脑脊液及BBB处的Aβ转运，介导Aβ的脑外流。Aβ40或Aβ42和Pgp相作用经囊泡转运出细胞。将Aβ40和Aβ42显微注射到Pgp基因缺失小鼠脑中，Aβ从脑内的清除速率与野生型小鼠相比下降了50%。抑制AD模型小鼠Pgp的活性，脑间质液中Aβ的水平在数小时内就有显著升高。敲除AD模型小鼠Pgp基因，脑内Aβ水平升高，Aβ的沉积加剧〔21〕。因此，增加Pgp的表达，促进Aβ的脑外流，降低脑内Aβ的水平，为治疗AD提供了又一可能，但目前尚未见此类报导。
3.3 RAGE RAGE是一种多功能的细胞表面受体，属于免疫球蛋白家族，分胞外域、跨膜域和胞内域。AD患者脑中过度的Aβ数量可上调RAGE的表达。脑微血管内皮细胞RAGE表达的升高，使RAGE介导的Aβ脑内流更加显著，加重了神经功能障碍;Aβ与小胶质细胞表达的RAGE相作用，促进前炎症因子的释放，导致持久的慢性神经炎症反应的发生;Aβ和神经元上的RAGE结合还将导致神经元存活率的下降〔22〕。Arancio等〔23〕通过转基因技术使AD小鼠脑中表达的RAGE缺乏胞内域，不能触发细胞内信号转导，缓解了Aβ诱导的神经功能损伤，使AD小鼠的学习记忆力得到了部分保留，神经病理表现也较轻微。此外，机体内还有一种RAGE缺乏跨膜域和胞内域，仅具备胞外域，可由细胞分泌出来进入血液循环，形成可溶性RAGE(sRAGE)，sRAGE与全长RAGE竞争和血液中的Aβ结合形成sRAGEAβ复合物，但是sRAGE不能穿过血脑屏障，抑制了Aβ的脑内流，从而间接抑制了RAGE的功能。目前，Deane等〔24〕将通过转基因技术获得的sRAGE对AD模型小鼠连续注射3个月，小鼠表现出较正常的空间识别和学习能力。
4 总结与展望
由于世界范围人口老龄化，AD发病率的日益上升，研制与开发安全有效的治疗方案面临巨大挑战。基因治疗以其特异性强、作用时间长、疗效好和副作用低等优势具有广阔的发展前景。目前，部分基因治疗在啮齿类和灵长类动物中已被证明安全有效，对人类的治疗正进入临床试验阶段，进一步临床研究正在进行中〔25，26〕。Aβ代谢相关基因更是因为其和AD的发展密切相关，越来越受到人们的关注，很有可能在不久的将来Aβ代谢相关的基因治疗会成为治疗AD的主要手段。
但要把基因治疗真正应用于临床，还需要克服许多技术上的困难和障碍。例如，携带目的基因的病毒载体本身会引起机体抗病毒的免疫反应，从而对组织器官产生损害。此外，上调或抑制Aβ代谢相关基因的表达，虽然可以治疗和预防AD，但这些基因产物除了参与Aβ代谢外，还参与其他的生理功能，其表达水平改变给治疗带来的副作用也不容忽视。例如：(1)敲除BACE1基因的AD模型小鼠，Aβ的沉积有所减少，但把正常小鼠的BACE1基因敲除，出现了意想不到的感觉运动障碍，空间记忆力衰退等症状。因此BACE1除了诱导Aβ的生成，其在正常的学习、记忆和感觉运动过程中也发挥着一定的作用〔27〕。(2)在封闭γ分泌酶表达的同时，还可能会影响到一些重要信号通路的传导(如Notch)。Notch为一膜蛋白受体，其介导的信号途径与胚胎发生、造血及神经干细胞分化、发育有关，因此有可能会带来一些严重的副作用。(3)除Aβ外，NEP还有很多作用底物，持续的NEP激活也会对机体造成伤害。例如，过表达NEP可以降低AD模型果蝇脑内Aβ42的沉积和神经元损伤，但同时也引发了年龄依赖的轴突衰退，使果蝇的寿命缩短了一半〔28〕。(4)临床上ECE抑制剂常被用于治疗高血压病，若上调ECE水平，有可能导致患者血压升高。(5)过多的plasmin的生成，易造成细胞连接降低。(6)LRP除介导Aβ的脑外流，还促进APP和BACE1发生相互作用，导致Aβ生成增加〔29〕。因此，研制更安全的病毒载体，选择性地提高或抑制Aβ代谢相关基因中与Aβ代谢相关结构域的表达将会成为AD基因治疗研究的重点。若这些问题能得到妥善解决，相信AD的彻底治疗也就为期不远了。
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篇8
【关键词】脂联素;脂联素受体;内皮细胞;保护作用;基因治疗
糖尿病大血管病变是糖尿病患者致死、致残的最主要原因之一。脂联素(adiponectin)脂肪细胞分泌的具胰岛素增敏作用的细胞因子,对血管内皮细胞有着潜在的保护作用。与其他脂肪因子不同,在肥胖患者及肥胖相关疾病,如动脉粥样硬化、2型糖尿病、血脂代谢异常中,脂联素的水平往往是降低的。相反,提高血浆脂联素水平,可有效地降低血管并发症的发生。载脂蛋白E缺陷小鼠的球状脂联素转基因表达的动物模型显示:球状脂联素可改善载脂蛋白E缺陷小鼠的动脉粥样硬化病变。故深入对脂联素的血管保护作用机制的研究,有助于为糖尿病大血管病变的防治提供新的思路。
1脂联素及其受体概述
脂联素,亦称apM1(脂肪组织最丰富的基因转录产物)、GBP28(28KDa凝胶结合蛋白)、Acrp30(30KDa脂肪补体相关蛋白)等,是由脂肪细胞特异性分泌的具有244个氨基酸的多肽,包括N端信号肽、氨基端非螺旋功能区、胶原结构域以及C端球形结构域(gAcrp)。人脂联素定位于染色体3q27处糖尿病及心血管疾病的易感位点。脂联素因其具有改善胰岛素抵抗、抗动脉粥样硬化、降血糖、血脂、抗炎、抗氧化等作用而成为当前研究的热点。
2003年6月Yamauchi等克隆了脂联素受体(Adiponectinreceptor,AdipoR)AdipoR1与AdipoR2后,AdipoR也成了新的研究热点,2004年Hug同样用分子克隆技术得出结论T钙粘蛋白(Tcadherin)是脂联素的一种新受体,且Tcadherin是脂联素六聚体和高分子质量多聚体的受体,不与脂联素球状结构域、脂联素三聚体结合。
2脂联素的胰岛素样血管活性作用
脂联素的胰岛素样血管活性作用是指脂联素可致内皮依赖性血管舒张,主要体现在脂联素对血管舒张因子一氧化氮(NO)生成的影响。
内皮源性NO通过增强血管舒张、抑制血小板聚集、单核细胞黏附以及血管平滑肌细胞增殖等作用而对血管系统起着保护作用。脂联素可以通过以下三个方面影响内皮细胞NO的生成,从而保护血管内皮细胞。第一,AMPKPI3KAKTeNOS途径:AdipoR1与AdipoR2都在人脐静脉表达。脂联素作用于其受体后,可激活AMPK,AMPK再活化eNOS。活化eNOS的过程依赖于丝/苏氨酸激酶(Akt)的活化,其中Akt与其上游磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信号通路相连。因而通过上述途径,脂联素有益于血管内皮NO的产生,从而保护内皮功能;第二,接头蛋白APPL1对NO生成的影响。接头蛋白APPL1是AMPK的上游信号分子,新近研究表明,脂联素与其受体的结合将促进接头蛋白APPL1与AdipoR1、AdipoR2的胞质尾区相互作用。而通过RNA干扰抑制人脐静脉内皮细胞APPL1的表达,将减弱脂联素诱导的AMPK第172位苏氨酸位点和eNOS第1177位丝氨酸位点的磷酸化激活,也减弱eNOS和HSP90复合物的形成,最终导致NO产量的明显下降。可见APPL1介导脂联素诱导的内皮细胞NO产量和内皮依赖性血管舒张;第三,抑制NADPHOxidaseRos途径,一项在主动脉内皮细胞进行的研究提示,球形脂联素可通过抑制NADPH氧化酶(NADPHOxidase)的活性,抑制氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的反应性氧化产物(ROS)的产生,从而恢复eNOS的活性并减少NO的破坏。
3脂联素的抗炎、抗氧化作用
3.1脂联素的抗炎作用现在已知的与内皮细胞作用相关的物质有:自由脂肪酸,细胞因子如肿瘤坏死因子(TNFα),以及氧化强化剂分子如氧化修饰型低密度脂蛋白(oxLOL)等。这些物质激活信号激酶,也与活性氧(ROS)密切相关。代谢综合征和糖尿病就根源于ROS主导的炎症反应。目前发现脂联素对血管功能和炎症细胞都有直接影响,在动脉粥样硬化早期,炎症因子如TNFα能激活产生黏附分子,从而使单核细胞与血管内皮细胞黏附。脂联素可抑制TNFα诱导的细胞黏附分子(如VCAM1,E选择素,ICAM1)在人主动脉内皮细胞表面表达,脂联素通过激活环磷酸腺苷(cAMP)蛋白激酶A(PKA)信号通路,抑制TNFα介导的核因子κB(NFκB)的抑制分子(IκBα)的快速磷酸化及降解,从而抑制NFκB的活化,来减轻内皮细胞的炎症反应。脂联素还可减少TNFα诱导的人主动脉内皮细胞中的IL8的表达水平。此外,脂联素的抗炎症效果还包括抑制白细胞聚集、减轻噬菌细胞的活性以及降低巨噬细胞TNFα的分泌水平。
3.2脂联素的抗氧化作用不断增加的氧化应激是肥胖和糖尿患者血管机能障碍的致病基础。临床研究也表明,血浆脂联素水平与反应氧标记物呈负相关。
当低密度脂蛋白(LDL)颗粒在血管壁处吸收并氧化,可以促进泡沫状细胞的形成,遏制内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性,引起炎症反应并刺激活性氧(ROS)的产生,从而最终导致动脉粥样硬化的形成。利用大动脉内皮细胞进行研究,结果表明脂联素(gad)能够抑制oxLDL诱导的细胞增殖、过氧化物的释放和对有丝分裂原激活蛋白激酶(p42/p44MAPK)的活化,对内皮起到抗氧化作用。较新的一项研究亦表明,脂联素可通过cAMP/PKA途径,抑制高糖状态下的内皮细胞反应氧的产量,从而发挥血管内皮保护作用。
4抗动脉粥样硬化
动脉粥样硬化的发生发展的两个主要机制是:一,单核细胞在细胞黏附因子的作用下黏附于血管内皮,分化为巨噬细胞,然后转化成泡沫细胞;二,内膜增厚,中层平滑肌细胞增生并迁移至内膜下。脂联素通过对这两个过程的干预,进而发挥抗动脉粥样硬化的作用。
脂联素通过对这两个机制的干预,起到抗动脉粥样硬化的作用。第一,脂联素通过减少黏附分子在血管内皮细胞上的表达来抑制单核细胞对内皮细胞的黏附;通过减少血管内膜下巨噬细胞清道夫受体的表达和脂质的积聚来抑制其向泡沫细胞的转变;第二,脂联素可抑制诸如成纤维细胞生长因子、表皮样生长因子、血小板源性生长因子BB等致动脉粥样硬化生长因子介导的人主动脉平滑肌细胞的增殖和向内膜下的迁移[14]。类似地,一项新近的研究也表明,脂联素可抑制由血小板源性生长因子BB诱导的载脂蛋白E缺陷小鼠肺主动脉平滑肌细胞的增殖。脂联素的抗平滑肌增殖的作用可能是由于其与那些生长因子的结合,从而阻断了生长因子与它们相应的膜受体的结合。
5脂联素对内皮保护的相关基因治疗研究
脂联素的基因治疗目前处于体外细胞转染和体内动物实验的阶段,通过载体将脂联素基因输入细胞或体内,使其表达,从而达到研究目的。
篇9
【关键词】 pUDKH基因；血管；肌肉；组织病理
【Abstract】 AIM: To observe the effects of pUDKH administration locally on blood vessels and muscles in dogs with hindlimb ischemia. METHODS: Dogs were anesthetized with an intravenous injection of sodium pentobarbital (30 mg/kg). Then the left external iliac artery as well as all of the above arteries were ligated completely with silk thread. Thus the completely ischemic hindlimb model was established. The dogs with completely ischemic hindlimb were randomly pided into 2 groups: control group (control vector pUDK) and HGF transferred group (pUDKH)， 4-6 dogs each. Then pUDKH or pUDK was injected directly into the left ischemic limb muscles. Three months (90 d) after injection， left external iliac arteriography was performed， blood flow rate of the left femoral artery was quantified and the temperature of distal muscle in hindlimb was measured. At the same time，the left femoral artery and femoral around muscles at the sites of injection of pUDKH and pUDK plasmids were removed and stained with HE to observe their histopathological changes by light microscopic examination. RESULTS: The degree of augmentation of collateral vessel formation was significantly greater than that treated by control vector in hindlimb ischemia models. In addition， the blood flow rate of femoral artery in dogs treated with pUDKH was recovered on day 90， while the flow rate was only 1/5 to 1/3 in control dogs. Degeneration and breakage of muscle fibers and edema among muscle bundles were observed in ischemic limb of control dogs， but in ischemic hindlimb transfected with pUDKH， no significant pathological changes were found. For control dogs， collapse of the left femoral artery， thickening of vessel wall and stenosis even occlusion of small blood vessel among muscle bundles were observed， few new blood vessels were found. But in pUDKH dogs， above all were almost normal. CONCLUSION: pUDKH has a protective effect on blood vessels and muscles in dogs with hindlimb ischemia.
【Keywords】 pUDKH；artery；muscle；histopathology
【摘要】 目的: 观察pUDKH(携带肝细胞生长因子基因的质粒)基因治疗犬下肢缺血后对其血管和肌肉组织病理学的影响. 方法: 杂种犬在静脉内注射苯巴比妥钠麻醉下，于左后侧腹股沟在股动脉由髂外动脉分支处的起始端进行全结扎，造成肢体缺血模型. 模型犬被随机分为对照组和pUDKH处理组，并在结扎后即刻分别注射pUDK（空白质粒）或pUDKH. 于手术后3 mo，行左髂外动脉造影术，测定股动脉血流量和下肢远端局部温度，并从被结扎的后肢股动脉及内外侧肌肉取组织标本，经常规组织病理切片染色，光学显微镜下观察. 结果: 3 mo时血管造影pUDKH组可见明显血管网的形成，而转移空质粒的对照组仅见少量新生血管；此时转移pUDKH组犬股动脉血流量已恢复到结扎前的水平，而对照组股动脉血流量仅为结扎前的1/5~1/3；转移pUDKH组结扎侧肌肉温度与健侧相比无明显差异，而对照组两肢体肌肉温度却相差1~2℃. 组织学观察对照犬可见结扎点远端股动脉塌陷，肌束间动脉管壁变厚，管腔变小甚至消失，少见新生的小血管；pUDKH处理组犬结扎点远端股动脉管腔开放，肌束间小动脉壁均普遍未见增厚，管腔亦未缩小；对照犬结扎侧肌纤维变性、断裂、肌束内水肿、脂肪性变，pUDKH处理组结扎侧的肌肉组织中上述病变不明显. 结论： pUDKH的局部注射对犬下肢缺血后血管和肌有保护作用.
【关键词】 pUDKH基因；血管；肌肉；组织病理
0引言
下肢缺血主要是血栓闭塞性脉管炎或糖尿病性下肢中小血管病变、周围神经病变等所造成的下肢慢性缺血，涉及血管、神经、肌肉等组织的病变，当病变进展而减少了动脉的横截面积至80%或更多时，患者表现间歇性跛行、功能障碍，甚至肢体坏死（坏疽）. 目前对此尚无理想的药物治疗方法，最终需行截肢手术而致残，预后较差［1-4］. 近年来基因治疗为其开辟了一条新的途径，通过合适的载体介导，转移促血管生长因子的基因于缺血组织，可促进新血管在局部的产生，形成血管“网”和血管“桥”，建立“分子搭桥”机制.
人肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor， HGF）是一多功能生长因子，除促进血管新生外［4］，对器官/组织的损伤有一定的修复作用［5］，包括肌肉、神经等. 本文利用犬后肢结扎股动脉造成血管闭塞性疾病的动物模型，采用股动脉周围骨骼肌肉内多点注射携带HGF基因的裸质粒pUDKH方法，探讨其治疗犬肢体缺血时对其血管和肌肉组织病理学的影响，为局部pUDKH基因治疗的实际应用提供实验依据.
1材料和方法
1.1材料
动物：河北地区草狗18只，雄性，年龄为1.5~3岁，体质量12~15 kg，由军事医学科学院动物实验中心提供. pUDKH: 携带人肝细胞生长因子基因的重组裸质粒， pUDK: 未携带人肝细胞生长因子基因的空质粒， 军事医学科学院放射医学研究所三室提供.
1.2方法
1.2.1动物模型的建立犬经15 g/L戊巴比妥钠静脉麻醉（30 mg/kg）后. 在无菌条件下分离左侧髂外动脉远端及分支和股动脉近端，将髂外动脉远端及股动脉分支全部结扎，造成左下肢血管完全闭塞性血管病模型. 在股动脉处安置血流量计探头，左外侧肌肉插入THRNST针型体温度电极，测定股动脉完全闭塞前、后10 min内股动脉血流量及左、右外侧肌肉温度，以判断左侧髂外动脉远端已完全闭塞. 右侧下肢动脉不予结扎.
1.2.2基因转移将模型动物随机分为4组：模型对照组（给予不携带HGF基因的空质粒pUDK 0.30 mg/kg (6只），pUDKH 0.15 mg/kg组(4只)，pUDKH 0.30 mg/kg组(4只)和pUDKH 0.60 mg/kg组(4只). 按每公斤体质量给犬的药量，将pUDK或pUDKH稀释在1 mL生理盐水中，于手术后10 min内，在左大腿肌内侧注射3点，左大腿肌外侧注射2点，每点注射体积为0.2 mL，最后逐层关闭伤口. 以后的饲养过程中不再进行基因转移.
1.2.3动脉血管造影每组全部犬的术后90 d，于右侧股动脉内插管行至髂总动脉端，行左髂外动脉造影术，导管尾端连接一高压注射器快速注入泛影葡胺，拍摄X光片以观察新生血管和侧支循环的形成情况.
1.2.4股动脉血流量及肢体温度测定在术前和术后0 d，90 d各测定股动脉血流量和下肢远端局部温度一次.
1.2.5组织病理学检查于手术转基因后3 mo，从结扎的后肢股动脉及内与外侧肌肉取组织标本，经常规组织病理切片染色，光学显微镜下观察.
统计学处理： 实验数据采用SPSS 10.0软件分析. 实验数据以x±s表示，用方差分析法及LSDt检验比较各给药组与对照组的差异，组内左、右比较采用配对t检验. P
2结果
2.1血管
2.1.1转移质粒pUDKH可明显促进缺血肢体血管网的建立股动脉完全结扎后，转移质粒pUDKH组于结扎后即刻进行血管造影便可见到血流完全阻断，90 d时有明显的新生血管和血管网形成. 这些新生血管和血管网形成后，从股动脉结扎点到股动脉远端由许多小血管网连接，从而使髂外动脉灌注到结扎点远端股动脉血流运行通畅（图1A）. 单纯转移空质粒
A： pUDKH组，转移pUDKH 0.30 mg/kg后第90日；B： 对照组，转移空质粒pUDK 0.30 mg/kg后第90日， 箭头所示为结扎部位.
(pUDK)的对照组，90 d的新生血管数显著少于转移pUDKH基因组，股动脉结扎点以下的动脉全部消失(图1B). 转移pUDKH 0.15，0.30，0.60 mg/kg三个剂量组之间差别不明显，0.60 mg/kg组比其他2个给药组更容易使髂外动脉结扎点到股动脉接点缩短.
转染pUDKH的三个剂量组在/100 cm2骨骼肌内、外侧和皮肤中血管数明显比模型对照组多，差别非常明显. 与未手术的右下肢骨骼肌内、外侧和皮肤比较，无明显的差异. 转pUDKH基因大、中、小剂量组犬骨骼肌组织之间的血管数与健康肢骨骼肌组织血管数相差不明显(表1).表1左下肢内、外侧骨骼肌和皮肤血管数的变化(略)
2.1.2股动脉血流量及肢体温度测定髂外动脉完全结扎后即刻，股动脉血流量从平均(41.50±5.99) mL/min，下降为0，随着术后饲养时间的延长，模型对照组下肢股动脉血流有所增加，术后90 d比术后即刻增加了7 mL/min. 而转染pUDKH的3个剂量组在术后90 d，结扎侧股动脉流量已经恢复到术前的水平(表2).表2转染pUDKH后股动脉血流量（略）的变化
转染pUDKH后90 d犬左侧下肢肌肉温度与健侧肌肉温度无明显差异，而模型对照组左右后肢肌肉温度相差1~2℃(表3).表3转染pUDKH后左侧肢体温度的变化(略)
2.1.3股动脉形态对照犬有的股动脉仍处于塌陷状态，致使管腔几乎完全消失（图2A）；pUDKH 处理犬股动脉的横截面上可见内弹力板完整，有的管腔已伸展完全，可与正常犬者相当（图2B）.
2.1.4肌束间血管形态对照犬肌束间小动脉管壁变厚、管腔变小甚至消失，且肌束间或肌外衣下纤维组织中也罕见新生的小血管. 中等大小动脉管腔亦变小、管壁变厚（图3A）. pUDKH处理犬除个别者外，肌束间小动脉壁均普遍未见增厚，管腔亦未缩小. 此外，肌束间或肌外膜下的结缔组织中常含有较多的新鲜红细胞（图3B）.
2.2肌肉形态对照犬观察到结扎侧肌纤维变性、横纹不清晰；肌纤维及细胞核变细、断裂、染色淡，肌束内水肿，以及出现脂肪（图4A）. pUDKH处理犬经各剂量处理的结扎侧的肌肉组织中上述病变均已不很明显（图4B）.
3讨论
在实验中，经活体股动脉血管造影已清楚地观察到，pUDKH处理组犬使结扎侧肢体比用不携带HGFA： 对照组，转移空质粒pUDK后第90日，示肌束内及肌束间中小动脉管壁变厚，管腔变小，甚至几尽消失; B：pUDKH组，转移pUDKH（0.30 mg/kg）后第90日，示肌束间中小动脉管壁未见增厚，管壁无缩小，管腔内充满新鲜的红细胞.
基因的空质粒处理的对照组犬的相应肢体中，更早而更多地出现新生的血管，转染pUDKH后90d血管造影可见到血管“桥”和“网”的大量的形成，髂外动脉完全结扎点血流仍然通畅，在结扎点周围有许多血管“网”和血管“桥”，使髂外动脉与股动脉血流通畅无阻，结扎点下方的股动脉血管变粗，血管充盈，使缺血损伤的股动脉的血管功能恢复，骨骼肌内、外侧有大量小血管形成，有助于股动脉远端的肌肉组织血液供应，从而使转染pUDKH动物肢体功能恢复，提高了动物的生存质量. 本文通过结扎后3 mo活杀时所取标本进行常规组织病理学观察的结果，也为此提供了组织形态学的证据. 转染pUDKH 0.15，0.30，0.60 mg/kg三个剂量组之间差别不明显，0.60 mg/kg组比其他2个给药组更容易使髂外动脉结扎点到股动脉接点缩短或完全融合成一个完整的血管网. 转染pUDKH的三个剂量组在/100 cm2骨骼肌内、外侧和皮肤中血管数明显比模型对照组多，差别非常明显. 与未手术的右下肢骨骼肌内、外侧和皮肤比较，无明显的差异. 转pUDKH基因大、中、小剂量组犬骨骼肌组织之间的血管数与健康肢骨骼肌组织血管数相差不明显，表明转染pUDKH的骨骼肌组织内血管并没有因药物剂量增加而血管成倍量的增长.
由于被结扎的肢体于用HGF处理后得到了充分的血液供应，该患肢的肌肉也理所当然地获得了足够的氧气和必需的营养物质，从而促使其恢复因缺氧和营养物质而造成的结构与功能的损伤. 本文的组织病理学观察结果也为此提供了形态学的证据. 此外，结扎股动脉后只予以空白质粒处理犬的患肢肌肉中出现有肌纤维变细、断裂或某些肌束中有缺失肌组织以及脂肪组织浸润的现象，而在pUDKH处理组肌束中则少见这种图像；因此可以推测，随着血运逐渐重建的过程，已发生变性的肌肉就会发生逆转，而肌组织缺失处也会有新生的肌纤维予以补充. 这也是可能发生的，因已有报道表明HGF对能够形成新生肌纤维的肌卫星细胞有刺激增殖的作用［5］.
本文观察的结果（资料未列出）还表明，因股动脉被结扎而使血运严重受到干扰的患肢中从股神经直到肌束间的细小神经都发生了显著的退行变，累及轴突、髓鞘和施旺氏细胞核，而经pUDKH处理犬的各级神经均已得到了明显的恢复，有的甚至已经达到了正常犬的图像. 这些外周神经的恢复，估计得利于HGF的双重作用：①缺血造成的神经纤维损伤，由于HGF促进了供血系统的重建而得以修复；②据文献报道HGF本身也有促进神经恢复的作用［6］. 这两种因素在本实验模型中究系各起到多大比重，目前尚无法加以估计.
本实验只是一个探索性的工作，因而没有在结扎并用空白的或携带HGF基因的裸露质粒处理后的不同时间段，进行系统性的动态取样观察. 推测在血管新生和形成血管网的早期节段，能够在剂量效应关系方面，或全或半结扎模型的疗效差别方面作出一定的评价. 如有可能今后可以做这方面的探讨，还要做一些特殊染色（例如肌肉和髓鞘等特殊染色方法）的观察. 除此之外，如有条件，还可做一些生理学指标的观察，例如在供血系统重建过程中对肌力和神经传导速度的动态观测量等.
【参考文献】
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篇10
【关键词】消化系统；基因诊断；治疗
【中图分类号】R57 【文献标识码】C 【文章编号】1008-6455（2010）11-0186-01
1基因诊断技术及应用
基因诊断是以基因型为基本，因而可在疾病未出现症状前，及至胚胎时期便可明确诊断。传统基因诊断时常应用基因探针技术和聚合酶金链反应（PCR）技术检测相关基因的核苷酸序列。基因探针技术包括斑点杂交、Southern印迹法、Northern印迹法、原位杂交竺，其中以Southern印迹法最为常用，但这些技术操作复杂、自动化程序低，对洗繁的基因筛选几乎是无能为力的。基因芯片技术的旌为疾病的基因诊断提供了新的解决方案。基因芯片（gene chip），也称基因微矩阵（microarray），是在玻璃、硅待载体上有序地、高密度地（目前点与点之间的距离小于500um）排列，以固定大量的靶基因片段（也称分子探针）。样品核酸分子经过标记，与固定在载体上的DNA阵列中的点同时进行杂交，杂交信息通过计算机进行集约化和平行处理，获得信息量的效率是传统生物学技术无法比拟的，可以同时研究成千上万个基因地某种生理和病理条件下的表达变化，为疾病的基因诊断提供了一个强有力的工具。
消化系统恶性肿瘤是一类多基因异常疾病，在肿瘤发病的不同阶段，可 相应的基因异常，一直为基因诊断研究的热点。与已明确胰腺癌最常见的基因异常是K-ras基因12密码子的点突变，食管癌、胃癌、结肠癌、肝癌的P53突变率达50%-60%，胃癌中CD44异常表达几近100%，结肠癌中K-ras点突变也达80%。基因芯片为癌相关基因大规模筛查提供了可能，目前国内外已有学者应用基因芯片技术对食管癌、肝癌、结直肠癌和胰腺癌等组织或体外细胞株进行基因表达谱的研究，成功地发现了涉及细胞生长周期、细胞内信号传递、炎症反应和细胞因子等上百条表达上调或下调的基因，并结合基因导入的方法，开展了关键基因的功能研究，如：Lu等应用cDNA芯片筛查了正常黏膜组织、轻度不典型增生、中度不典型增生、原位癌（CIS）和鳞状细胞癌等5个级别食管病变组织细胞基因表达谱的改变，通过聚类分析发现了一批与食管癌的基因草图，构建人结直肠癌、正常结肠黏膜和结肠癌转移灶的基因表达情况。可以设想：应用基因技术分析肿瘤不同阶段基因表达谱的改变，找出与恶性肿瘤发生发展、生物学特征、治疗敏感性及不同预后有关的基因，重新组合、设计制作成用于恶性肿瘤早期诊断、疾病特征分析和预后判断的工具芯片，理论上是完全可行的。虽然基因消化系统肿瘤的基因诊断中刚刚起步，但已显示出广阔的应用前景。
除对肿瘤的诊断外，基因诊断还应用到消化系多个方面。炎症性肠 （Znflammatory Bowel Disease，ZBD）因在我国的发病呈显著上升趋势而得到越来越多的关注，IBD病因至今不清，种族发病差异较大，近年来在欧美和澳大利亚进行了疾病候选基因的研究和筛查，已成功定位了疾病相关连锁区，主要有16、12、6、14和5号染色体，已分别命为IBD1-5，并发现了NOD2基因，NOD2基因产物为细菌组分的细胞内受体，由此证明了IBD与天然免疫之间的重要联系。
2基因治疗方法与应用
基因治疗是指将新的遗传物质（治病基因）转入由于基因缺陷而致病的细胞或组织中，以纠正疾病细胞的表型，达到治疗疾病目的的一类治疗方法。用于基因治疗的基因转移方法分两大类：一类为病毒载体，包括应用逆转录前病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒等。近年来，又探索将慢病毒家庭中的人免疫缺陷病毒（HIV）经改造作为载体。第二类基因转移方法为非病毒法，包括阳离子脂质体转染法、裸DNA直接注射法、磷酸钙沉淀法、微粒子轰击法（基因枪）、微注射法、受体介导法等。
目前，一个新基因治疗系统-EC-CD/5-FC（大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶、5-氟胞嘧啶）系统正日益受到高度关注。胞嘧啶脱氨酶是大肠杆菌代谢旁路中的一种酶，哺乳动物细胞中不含该酶。Ausin等于1992年首先从大肠杆菌菌株中采用传统方法提取质粒DNA，并初步构建成原核细胞中表达的CD质粒载体，由于哺乳动物细胞中不存在胞嘧啶脱氨酶，因而不能将胞嘧啶转化成尿嘧啶，更不能将5-氟胞嘧啶（5-Fluorocytosine，5-FC）转化成5-氟尿嘧啶（5-Flu-orouracil，5-FU）。但通过基因转移技术将胞嘧啶脱氨酶基因转入哺乳动物细胞，则哺乳动物细胞可将一些原来无毒性的原药（5-FC）经胞嘧啶脱氨酶转化为有细胞毒性的代谢产物（5-FU），导致细胞自杀性死亡。现已用于结肠癌、肝癌、胰腺癌等多种消化系肿瘤的研究，取得了很好的效果，但设计安全、高效、稳定、特异、可控、简便易行并可携带不同长度DNA的新载体仍是该基因治疗研究中亟待解决的问题。
