基因突变范文

导语：如何才能写好一篇基因突变，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

基因突变是基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。

从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因虽然十分稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种稳定性是相对的。在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因。于是后代的表现中也就突然地出现祖先从未有的新性状。基因突变可以发生在发育的任何时期，通常发生在DNA复制时期，即细胞分裂间期，包括有丝分裂间期和减数分裂间期。

（来源：文章屋网 ）

篇2

不知为什么，我总觉得他有用不完的活力。整天嘻嘻哈哈的，给人以不务正业的感觉，就拿早上交作业这种芝麻绿豆大的小事来说他吧！

一大早，我都还没到学校，他就已经早早地坐在位子上了。一般来说只要一到学校就应该先把所有作业本交掉，可是这位大少爷从来没有过?渌??匕炎饕到蝗???苁且?乙欢?僭俣??么咚?趴习炎饕到怀隼础S惺钡攘怂?习胩欤??詈缶谷幻蛔觯?馈??媸且?凰??帽??芰恕U娴姑刮揖固?狭苏饷匆桓鲎樵保。。。。

更气人的是在上一次的美术课上，老师要求我们画一幅可以突出别人外表特点的画，而且要画同班同学呢！可恶的可恨的陈甲森，他最喜欢笑话人了。在别人画完后，他就开始了他的“点评”有说别人画的像猪的，猴子的……还笑别人的画有多么难看。真是有多可恶就有多可恶！我就没看到他画的画有多么好看。我原本也想奚落一下他的画的，可是还没说出口，他就先说：“其实画缪艺是最简单的了，只要用圆规画就可以了。”然后哈哈大笑起来。我知道他是什么意思，不就说我的脸很圆很胖嘛！等等，他的意思是说我的脸很圆很胖。呀！这个该死的陈甲森，如果杀人不犯法的话，他恐怕已经被我杀个几千次了。

篇3

【关键词】基因突变 染色体变异

[Abstract] This essay discusses the differences in the chromosome formation the cause and the results between gene mutation and chromos omestructure variation

[Keywords]Gene mutationchromosomevariation

我们在学习生物变异一节时，学到了基因突变和染色体结构变异，很多学生在做具体题时二者总是混，分不清。现将二者的区别简单加以介绍。

基因突变和染色体结构变异均是可遗传的变异，在遗传中表现出子代性状与亲代性状不同，出现亲代、祖代从来没有过的新性状，且这种性状能在后代中重新出现，可见是遗传物质发生变化了。两者区别表现在：

1 染色体形态

1.1、基因突变是单个基因内部发生变化，从而引起该基因所控制的性状产生不同于亲代的变化。在光学显微镜下也看不到染色体形态的变化。

1.2、染色体结构变异是某个染色体在结构上发生变化，在光学显微镜下可以观察到染色体形态的改变。

2 产生的原因

2.1、基因突变是DNA复制过程中产生偶然差错，个别碱基缺失，增添或替换使基因中相关核苷酸的种类、数量、排列顺序发生改变，因而改变了遗传信息。例如，镰刀形细胞贫血症。

2.2、染色体结构变异是由于外界因素作用，染色体发生断裂和重新组合而造成染色体结构变化，改变遗传信息，我们课本提到了结构变异的四种情况（缺失、易位、倒位、重复）猫叫综合症是人体第五号染色体短辟上的缺失引起的疾病。

3结果不同

3.1、基因突变是不定向的，结果产生等位基因，如基因A可突变a，也可以突变为a1、a2、a3、 ……,a也可以突变成A。即同一性状在不同生物个体中发生突变后有不同的表现。例如，刮大风海岛上有翅昆虫可突变长翅和残翅昆虫。

3.2、染色体相同的结构变异后表现出的生物性状在不同生物个体均相同。如猫叫综合症，患儿都表现两眼距离较宽，反应迟钝，往往过早夭折，哭声似猫叫。

篇4

[关键词] 非小细胞肺癌；KRAS基因突变；抑制KRAS下游效应分子；靶向治疗

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）06（a）-0032-04

Progress in targeted therapy of KRAS mutations in non-small cell lung cancer

ZHANG Yukun GE Wei

The Two Department of Oncology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Lung cancer is one of the most deadly malignancies， ranking the first in global cancer-related death. With the development of multidisciplinary comprehensive treatment， the mortality rate of patients with lung cancer is still high. KRAS gene mutations are the most common type of mutations in non-small cell lung. At present， the targeted therapy of KRAS gene mutation mainly through the direct inhibition of KRAS gene， change the KRAS membrane localization， inhibition of KRAS downstream effector molecules， inhibition of KRAS mutant synergistic lethal genes and other aspects of research. In this review， the status and progress of KRAS mutations in non-small cell lung cancer targeted therapy are briefly reviewed.

[Key words] Non-small cell lung cancer； KRAS gene mutation； Inhibition of KRAS downstream effector molecule； Targeting therapy

肺癌居世界范围内恶性肿瘤死因的第一位，每年有超过100万人因肺癌死亡[1]。其中非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的组织学类型，占所有肺癌的85%[2]。超过40%的患者确诊时已是局部晚期或晚期，失去了手术机会。目前肺癌的治疗逐渐多元化，包括手术、放化疗、靶向治疗、生物免疫治疗等，对于晚期NSCLC的一线化疗方案是以铂类为基础的两药联合，但其疗效已经达到治疗平台，随着医学分子生物学的飞速发展，分子靶向治疗为NSCLC患者带来了新的希望。靶向表皮生长因子受体（EGFR）和间变性淋巴瘤激酶（ALK）已广泛应用于NSCLC的治疗中。然而，10%～30% KRAS突变型肺癌患者无法从EGFR抑制剂中获益。此外，尽管早已确定了NSCLC中存在KRAS突变，但这仍然是一个具有挑战性的靶向治疗目标。

1 治疗方法

1.1 直接抑制KRAS基因

直接抑制KRAS基因已经被证明在临床上是有困难的。但也有学者通过抑制KRAS G12C和GTP结合，促进其与GDP的结合，及抑制KRAS和其下游效应分子Braf结合来抑制KRAS基因的活性，如，Ostrem等[3]发现了一个KRAS G12C突变体特异性抑制剂，该抑制剂能有效抑制KRAS G12C突变体和GTP结合，促进其与GDP的结合，使突变KRAS基因失活。Lim等[4]报道了另一个KRAS G12C抑制剂，在不影响正常KRAS的情r下特异性结合突变的KRAS基因，使突变的KRAS失去活性。

1.2 改变KRAS膜定位

抑制KRAS膜定位，包括多种酶，如法尼基蛋白转移酶抑制剂（FTIs）、香叶基转移酶、RAS转换酶1（RCE1）、ICMT。第1代FTIs如Tipifarnib和Lonafarnib，虽然耐受性良好，但表现出较差的临床效应。尽管缺乏有效性认为是由于香叶基转移酶对KRAS基因选择性异戊烯化，但FTIs和香叶基转移酶的双重抑制也没有任何效果[5]。第2代FTIs如Salirasib[6]，在临床上对肺癌患者无效。这种无效性可能通过香叶基转移酶对KRAS基因选择性异戊烯化或选择性耐药机制来解释，如KRAS基因扩增或脱靶效应[7]。此外，一些RCE1和ICMT抑制剂，已在小鼠模型中有了可喜的成果，但是这些药物还需进一步优化才能进行人体试验。

1.3 抑制KRAS下游效应分子

1.3.1 PI3K PI3K是KRAS下游的一种胞质分子，也是PI3K/AKT/mTOR通路的一部分，它是一个多途径融合的位点。在NSCLC中发现约2%的PI3KCA突变。PI3K通路也可以通过PTEN的缺失、上游酪氨酸激酶受体扩增或KRAS基因突变被上调[8]。新型PI3K抑制剂（例如BKM120、GDC0941和XL147）在第一阶段临床试验中开发并初步显示出有希望的结果。这些药物目前正用于PI3KCA突变的晚期NSCLC患者进行的Ⅱ期临床试验（NCT01297491、NCT01493843）中。然而，尽管KRAS基因活性依赖于下游PI3K活性，但初步数据表明，KRAS突变的肿瘤对PI3K抑制剂单药治疗是不敏感的[9]。因此，单独抑制PI3K通路治疗KRAS突变的NSCLC是不足的，可尝试给予多个KRAS下游信号通路的抑制剂联合治疗。

1.3.2 BRAF BRAF是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可直接作用于结合GTP的KRAS基因及激活BRAF/MEK/ERK/MAPK途径。BRAF基因突变在NSCLC中占1%～4%，其中50%的突变为V600E[10]。BRAF抑制剂达拉菲尼（Dabrafenib）和危罗菲尼（Vemurafenib），首先在BRAFV600E突变的黑色素瘤中做了研究，而且黑色素瘤V600E突变占BRAF突的百分比超过80%[11-12]，研究证明V600E BRAF突变的晚期NSCLC中，Dabrafenib估计反应率为40%[13]。一开放标签，多中心Ⅱ期临床试验中（NCT01336634），Dabrafenib加曲美替尼（Trametinib）治疗BRAF突变（V600E）的NSCLC可达到50%总反应率，且中位无进展生存期>9个月。Dabrafenib加Trametinib治疗BRAF突变（V600E）的NSCLC是很有前途的新疗法，可获得较高的总疗效，更可观的是延长了DOR[14]。

1.3.3 mTOR 在PI3K/AKT/mTOR中，mTOR是另外一种丝氨酸/苏氨酸激酶，也是PI3K家族的成员。临床前数据表明，在KRAS基因突变的肺腺癌小鼠模型中，抑制mTOR基因可抑制肿瘤的生长[15]。一些mTOR抑制剂（例如依维莫司、Ridaforolimus）已在NSCLC的治疗研究获得了有前景的结果。一个Ⅱ期临床试验，70例患者KRAS突变的NSCLC患者接受Ridaforolimus治疗8周，在8周后，28例患者病情是稳定的，随后被随机分配接受安慰剂或继续维持Ridaforolimus治疗。最终，接受Ridaforolimus治疗的PFS是明显高于安慰剂组（4个月和2个月，HR=0.36，P=0.013），而且其OS有一个更好的趋势（18个月和5个月，HR=0.46，P=0.009）[16]。但是Ridaforolimus治疗的临床推广，仍需要更大型的Ⅲ期临床实验来进一步验证其在改善PFS、OS上的作用。

1.3.4 MEK 在RAS/RAF/MEK/ERK通路中，MEK蛋白激酶是KRAS和BRAF下游信号，也被称为MAP激酶级联。磷酸化BRAF激活丝氨酸/苏氨酸激酶MEK，进而激活丝氨酸/苏氨酸激酶ERK，从而激活转录因子促进细胞周期进程和细胞增殖[17]。已经开发的几个小分子选择性抑制MEK，如CI-1040、RO5126766和PD-0325901，都没有较好的临床疗效。最近，其他MEK-1和MEK-2抑制剂已被开发，如司美替尼和Trametinib已用于KRAS突变的NSCLC治疗研究中。在临床前期研究中，司美替尼对BRAF和KRAS突变的细胞系有生长抑制作用，而且在体内实验也证明，司美替尼可抑制小鼠皮下异种移植瘤的生长。通过Ⅰ期临床实验确定了司美替尼的口服剂量为100 mg，每日两次。在对未经筛选的NSCLC患者进行的一些Ⅱ期研究中，比较司美替尼与培美曲塞在作为二线及三线方案的疗效，虽然其起到了一定的临床疗效，但与培美曲塞相比在延长生存期上没有优势。这表明进一步研究需要在BRAF或KRAS突变的NSCLC患者中研究。基于临床前期实验及报告的在服用司美替尼后出现的不良事件（腹泻、恶心、呕吐等）的条件下，对KRAS突变的NSCLC患者进行了一个Ⅱ期临床实验，比较司美替尼联合多西紫杉醇与多西紫杉醇单药治疗的效果，联合组大大提高了反应率（37%和0%，P < 0.01）和PFS（5.3个月和2.1个月，P=0.014），但是OS并没有明显改善（9.4个月和2.1个月，P=0.21）[18]。进而对KRAS突变的NSCLC患者进行了Ⅲ期临床试验，比较多西他赛加司美替尼与多西他赛单药化疗的疗效，但是并没有明显改善RR、PFS或OS[19]。司美替尼/多西他赛Ⅱ期试验亚组分析表明，G12C突变使用司美替尼治疗可能比其他突变型有更高的反应率和PFS[20]。也有研究证明司美替尼联合厄洛替尼治疗KRAS突变型或野生型NSCLC，与厄洛替尼单药治疗相比，预后并无改善。

KRAS基因可以激活PI3K/AKT/mTOR和BRAF/MEK/ERK通路，因此抑制这两条信号通路可能需要完全阻断KRAS基因，有一些前期临床实验尝试了PI3K抑制剂或MEK抑制剂联合mTOR抑制剂治疗NSCLC，患者有较好的耐受性，但这些结果需要行Ⅱ期临床实验来进一步论证，但也给治疗NSCLC带来了新思路。

1.4 抑制KRAS突变协同致死基因

KRAS突变可使癌细胞获得特殊的生物学行为，即其生长和存活依赖于其他协同基因的共同作用，因而抑制这些基因能杀死KRAS突变的癌细胞 ，所以抑制这些协同致死基因是杀死肿瘤细胞的一个间接、有效的策略。这些因子有很多，包括WT1、GATA2或参与NF-κB通路的小分子，并对这些因子作为靶点及特异性抑制剂做了一些临床前期研究。Vicent等[21]分析了大量样本，发现WT1基因高表达可能参与KRAS突变的致瘤作用。Kumar等[22]发现GATA-2是这些KRAS突变NSCLC肿瘤细胞存活所必要的基因。硼替佐米是NF-κB的蛋白酶体抑制剂，目前主要用于多发性骨髓瘤的治疗。在对16例KRAS G12D突变的肺腺癌进行的Ⅱ期研究中发现，患者的中位生存期达到了13个月[23]。

此外，Puyol等[24]在NSCLC的小鼠肿瘤模型中，发现KRAS基因和细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）有合成致死效应。Mao等[25]利用KRAS与CDK4基因之间的合成致死效应，使用携载有针对CDK4siRNA（siCDK4）的混合胶束颗粒对荷瘤小鼠进行治疗。结果显示，携载有siCDK4的KRAS突变的肿瘤生长有显著抑制效果，KRAS野生型的肿瘤生长则没有受到显著影响，证实该治疗方案的特异性、高效性和安全性，为进一步开发针对KRAS突变的siRNA药物提供了新策略。

1.5 其他

MET是一跨膜酪氨酸激酶受体，主要在肿瘤侵袭、增殖、血管生成和转移中发挥重要作用，也可以参与激活KRAS信号通路。在肺腺癌中MET扩增约4%，通过激活RAS/PI3K/AKT/mTOR通路，导致EGFR-TKIs获得性耐药。在所有NSCLC的研究中MET作为靶点及KRAS信号激活剂做了研究，目前对肺癌效果较好的抑制剂包括小分子c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂（Tivantinib）及MET受体单克隆抗体（onartuzumab）。有研究显示，Tivantinib联合厄洛替尼并没有改善晚期NSCLC患者的预后，但患者的PFS有明显的改善（P < 0.01）[26]。虽然Ⅲ期研究因缺乏疗效过早终止，但初步分析亚组似乎证实了上述结果。一个初期的Ⅱ期研究表明，onartuzumab联合厄洛替尼治疗MET阳性的NSCLC患者，有较好的预后[27]。

热休克蛋白（HSP）是分子伴侣，参与蛋白质的翻译后折叠和合成。HSP90抑制剂可干扰致癌驱动基因的正常功能，包括突变的EGFR、BRAF、HER2和EML4-ALK。有研究报道，HSP90抑制剂ganetespib联合多西他赛治疗KRAS突变的NSCLC，未能改善患者的PFS和OS，且HSP90抑制剂ganetespib联合MEK和PI3K/mTOR抑制剂的研究中发现，其加大了对KRAS突变细胞的细胞毒活性[28]。

局部黏着斑激酶（FAK）也作为治疗的靶点被研究过，主要黏附于细胞外基质。其中KRAS-RHOA-FAK通路在TP53灭活和CDKN2A缺失的肺癌中，与肺癌的发生、发展密切相关。一个Ⅱ期临床研究评估FAK抑制剂：VS-6063（Defactinib）对KRAS突变型NSCLC（NCT01951690）的疗效，得到了极低的反应率（1/44例），但是12周的PFS率为36%，因此，研究人员认为该抑制剂是有研究前景的[29]。

2 展望

尽管随着医学发展，肺癌的治疗取得了飞速发展，尤其是NSCLC的靶向治疗取得了突破性的进展，但对于KRAS基因突变的NSCLC靶向治疗仍然是一个具有挑战及吸引力的靶向治疗目标。但是抑制KRAS下游效应分子（PI3K、BRAF、mTOR、MEK）显现出令人期待的发展前景，特别是下游效应分子抑制剂联合使用会有较大的发展空间，我相信在不久的将来针对KRAS基因的靶向治疗会为NSCLC患者带来更有效的治疗。

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篇5

【关键词】 角膜营养不良，遗传性;，基因;，突变;，序列分析，DNA;，聚合酶链反应;，系谱

摘要:目的 以基因突变分析一角膜营养不良家系的致病分子基础。方法 应用PCR产物直接DNA测序及限制性内切酶分析检测家系中7例患者和6例表型正常成员的K3、K12和BIGH3基因突变情况。结果 该家系患者成员在K3与K12基因的编码序列区没有发现突变，而BIGH3基因外显子12存在CGG>TGG(R555W)突变杂合子，家系表现正常成员及正常对照均无BIGH3基因突变;限制性内切酶分析结果显示突变与疾病表现型呈完全共分离。结论　利用基因突变分析确诊我国首例报道的Meesmann角膜营养不良家系属于颗粒状角膜营养不良，且为BIGH3 R555W杂合突变类型。

关键词: 角膜营养不良，遗传性; 基因; 突变; 序列分析，DNA; 聚合酶链反应; 系谱

ABSTRACT: Objective Molecular genetic analysis of a large Chinese corneal dystrophy kindred. Methods Thirteen inpiduals including seven affected and six unaffected family members in this granular corneal dystrophy kindred were studied. Genomic DNA was purified from blood peripheral leukocytes. All of the exons of both the Keratin3 and the keratin12 genes， and the exon 4 and exon 12 of BIGH3 gene were amplified using polymerase chain reaction(PCR)， followed by direct bidirectional sequencing for mutation detection.

The mutation was confirmed by restriction digest analysis. Results Direct sequencing of the patients' genomic DNA revealed there was no mutation in all of the exons of K3 and K12 genes， but a missense mutation(CGG>TGG) in the exon12 of BIGH3(R555W) was found. This mutation in this family completely cosegregates with the disease phenotype. Conclusion This kindred was diagnosed with granular corneal dystrophy harbored a heterozygous R555W mutation of the BIGH3 gene.

KEY WORDS:corneal dystrophy，hereditary; genes; mutation; polymerase chain reaction

基金项目: 福建省自然科学基金资助项目(C0510009)，福建医科大学科学研究发展基金资助项目(FJGXY04020)

角膜营养不良(corneal dystrophy)是一组与遗传有关的原发性、具有病理学组织学特征的疾病。目前，已确定与角膜营养不良的致病基因有BIGH3、CHST6、K3、K12、M1S2和GSN等。BIGH3基因突变至少可导致4种类型的角膜营养不良，包括颗粒状角膜营养不良(R555W)、Avellino角膜营养不良(R124H)、格子状角膜营养不良(R124C)和ThielBehnke角膜营养不良(R555Q)[1]。K3和K12基因突变导致Meesmann角膜营养不良[2]。笔者研究的家系为福建医科大学附属第一医院眼科普查时发现，先证者在裂隙灯下检测可见双角膜中央区有散在的细小圆形小泡，位于上皮层，斜照时呈散在的灰白点状，后照亮下呈透明小气泡样，临床表现为Meesmann角膜营养不良[3]。2004年，笔者随访该家系，家系图谱表现为常染色体显性遗传;在裂隙灯下检测先证者，发现不仅角膜上皮层受累，而且累及角膜实质层，临床表现为颗粒状或Avellino角膜营养不良。笔者对该家系进行分子遗传学分析，以确定其类型与致病分子机制。

1 对象与方法

1.1　对象

家系3代38人，受累患者12人，获得其中7例受累患者和6例非受累正常家系成员的血样标本，10例无眼疾正常人的血样标本作为正常对照组(图1)。:获取血样标本的家系成员.

1.2 试剂和仪器

PCR所用试剂、琼脂糖凝胶、溴化乙锭(EB)、BstXⅠ和DNA分子量标记等(大连宝生物公司);PCR扩增BIGH3基因外显子12的引物序列: BIGH3e12F:5’CAGCGTGGTGAGGTATTTAAGG3　BIGH3e12R:5’GTAGTAAAGGCTTCCCAGGGTT3’

1.3 基因组DNA提取

取外周血样3 mL，置于EDTAK3抗凝的真空采血管中;按Wizard Genome DNA Purification Kit(Promega)说明书提取基因组DNA。

1.4 聚合酶链反应(PCR)

PCR反应体系25 μL，包括10×PCR缓冲液(20 mmol/L Mg2＋plus)2.5 μL、dNTP mix(2.5 mmol/L each)1 μL、PCR上游和下游引物(10 μmol/L)各1 μL、基因组DNA(约100 ng)1 μL和TakaRa Ex TaqTM 0.25 μL、ddH2O补足25 μL;PCR反应条件为:94 ℃ 3 min94 ℃ 30 s55 ℃ 30 s72 ℃ 30 s，30个循环;72 ℃ 3 min。

1.5 PCR产物直接测序

2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物特异性后，PCR产物直接送大连宝生物公司测序。

1.6 限制性内切酶分析

BIGH3 R555W位点突变产生一个新的限制性内切酶位点，可被BstXⅠ识别(BstXⅠ识别序列为:CCANNNNN/NTGG);酶切反应体系20 μL，45 ℃ 3 h。

2 结果

2.1 K3和K12基因突变检测

Meesmann角膜营养不良是由K3和K12基因突变所致，且目前发现的突变全部分布在K3和K12角蛋白高度保守区HIM(helix initiation motifs)和HTM(helix termination motif)区域[2，4]。首先筛查文献已报道的K3和K12基因突变区域，即K12基因的外显子1和外显子6以及K3基因的外显子7。DNA测序结果表明在这些区域没有突变，进一步扫描K3和K12基因整个外显子区域，也未发现突变。2004年随访，裂隙灯检测发现症状发生改变，先证者的临床表现可能为颗粒状或Avellino角膜营养不良(图2)。

2.2BIGH3基因突变检测

PCR扩增BIGH3基因外显子4和外显子12，DNA直接测序分析，结果显示患者(先证者Ⅱ7和Ⅲ1)在BIGH3基因的外显子12发生杂合突变(CGG>TGG)，即BIGH3 R555W突变(图3A);另外，在两位患者的BIGH3基因外显子12还发现一个多态位点(Phe540Phe)(图3B);内切酶BstXⅠ分析结果显示该家系的BIGH3 R555W突变与疾病表现型呈完全共分离(图3C)，表明该例Meesmann角膜营养不良家系属颗粒状角膜营养不良，且为BIGH3基因R555W突变杂合子。

3 讨论

角膜营养不良一般依据病史和裂隙灯检测可作出初步的临床诊断，且主要按病变发生的解剖学部位将其分为前部、实质部和后部角膜营养不良三类。然而，在进行性病变过程中，角膜营养不良还表现一个共同特点，即开始先侵犯角膜的某一层，晚期可波及邻近层次，甚至影响全层角膜。因此， A:DNA测序分析突变位点; B:BIGH3单核苷酸多态性位点(T/C); C:限制性内切酶BstXⅠ分析.

在临床诊断分型，特别是晚期患者的诊断分型带来很大的混淆。随着角膜营养不良分子遗传学的深人研究，以致病基因的分子特征作为临床诊断和分类、分型的依据，其可靠性和准确性也得到了大大提高，并且越来越受到国内外同行们的广泛认可。

Meesmann角膜营养不良属于前部角膜营养不良，临床表现主要为角膜上皮层内散在着无数细小圆形透明囊泡，是由K3或K12基因突变所致[2]。颗粒状角膜营养不良属实质部角膜营养不良，依据角膜表征目前至少可以分为3种类型：Avellino角膜营养不良、典型颗粒状角膜营养不良和浅表变异型颗粒状角膜营养不良，分别是由于BIGH3基因的R124H、R555W和R124L突变所致[5]。目前，在世界各国的相关研究中均发现BIGH3基因的第4外显子的R124和第12外显子的R555为突变热点;与BIGH3基因R555W突变相关的颗粒状角膜营养不良患者在欧洲和美国较为常见，在日本却较为少见[1]。

分子遗传学分析结果显示，笔者研究的家系受累患者存在BIGH3 R555W突变杂合子，突变与疾病表现型呈完全共分离，而在K3和K12基因没有发现突变。因此，从基因突变分析结果可以确诊该家系不属于Meesmann角膜营养不良，而是典型的颗粒状角膜营养不良。

据报道在该家系中先证者角膜病变开始发生于上皮层[3]，随后波及角膜实质部。因此，结合临床症状与基因突变分析，该家系患者又可能是BIGH3 R555W杂合突变导致的角膜上皮层与基质层先后受累的颗粒状角膜营养不良，可归于浅表变异型颗粒状角膜营养不良。Escribano等研究表明角膜上皮细胞特异性高表达BIGH3基因[6];Hirano等认为BIGH3蛋白是由上皮细胞合成，内皮细胞也可能合成BIGH3蛋白[7];Okada曾报道一种由BIGH3 R555W纯合子突变导致的浅表变异颗粒状角膜营养不良[8]。这些报道间接说明BIGH3 R555W杂合突变也又可能导致浅表变异型颗粒状角膜营养不良。遗憾的是没有先证者的早期裂隙灯照片及组织病理检测来直接支持这种可能性。

参考文献：

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篇6

【关键词】川奇消食化积口服液；小鼠淋巴瘤细胞株；TK基因突变

【中图分类号】TS201.6 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）07-4119-01

保健食品具有补充膳食来源、延缓衰老、美容、改善睡眠等功能，但在生产过程中的各种问题也日趋明显，为更好的控制其质量，促进健康发展，应加强其检验工作。

TK基因突变试验的检测终点是胸苷激酶（thymidine kinase， TK）基因的突变，具有很高的灵敏度，广泛用于检测外来化合物的遗传毒性[1]。该测试系统可检测外来化合物引起的突变，包括碱基对突变、移码突变和缺失等，从而评价保健食品引起突变的可能性，本文采用TK基因突变试验评价川奇消食化积口服液的致突变性。

3 讨论

川奇消食化积口服液的主要成分为山楂、鸡内金、白扁豆、茯苓，可促进消化吸收，用于消化不良者。我国对化合物（包括食品污染物、药物、化妆品等）的常规遗传毒性评价方法包括：①细菌试验（Ames试验）；②哺乳动物体细胞突变试验、小鼠骨髓细胞微核试验、染色体畸变试验；③哺乳类生殖细胞突变试验[2]。

本文采用TK基因突变试验检测川奇消食化积口服液的致突变性。tk+/-基因型细胞突变为tk-/-基因型细胞后能拮抗三氟胸苷（TFT）而存活，据突变集落形成数，计算突变频率，可判定受试物的致突变性[3]。本研究发现，按1%体积比给药，受试物原液、1/2原液、1/4原液、1/8原液四个剂量组均未产生细胞毒性，在活化状态及非活化状态下均不具有致突变性。

参考文献：

[1] 中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S].2003.

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关键词：非小细胞肺癌 ELM4-ALK融合基因 EGFR突变基因

正文

肺癌是全球发病率及病死率最高的恶性肿瘤，其中，非小细胞肺癌的传统治疗方法有化疗，放疗，手术等。随着肿瘤发病机制研究的不断深入，分子靶向治疗已经成为了研发热点，并初步取得了显著疗效。EGFR，EML4-ALK等靶点的分子抑制剂在临床上的成功让学者们将更多的精力投入到靶向分子的研究中，2011年ASCO大会提示肿瘤诊疗已经进入分子靶向治疗的时代。以往大部分的研究都认为，非小细胞肺癌中EML4-ALK多数情况下与EGFR及KRAS突变是相互排斥的[1-3]. 近期陆续发现有EML4-ALK融合基因和EGFR突变共存的案例。在强调个体化治疗的时代，这部分患者其临床表现有何特点？该如何治疗？本文将就这些问题进行探讨。

EML4-ALK融合基因的分子结构及在NSCLC的发生率

ALK(anaplastic lymphoma kinase 间变淋巴瘤激酶)是一个由1620个氨基酸组成的跨膜蛋白，属于胰岛素受体家族[4]。

EML4(echinoderm microtubule—associated protein—like4)由 N末端碱基区、疏水的棘皮动物微管相关蛋白区以及WD重复区3 部分构成，属于棘皮动物微管相关蛋白样蛋白家族。

EML4-ALK融合基因是由日本学者Soda等在一名62岁有吸烟史的男性腺癌NSCLC患者的肿瘤组织中首次发现的。基因的重排发生在2号染色体短臂上的2区1带和2区3带。ALK基因的3′端与EML4基因的5′倒位融合，EML4基因断裂后形成不同长度的外显子拼接片段，插入位置相对保守的ALK基因的19号、20号外显子之间[5]，融合基因的ALK部分均为20外显子编码的酪氨酸激酶结构片段，而EML4部分则为不同的外显子片段，从而形成有11个变体的EML4-ALK融合蛋白[1, 2, 5-10]，融合基因大多都有致瘤性[11, 12]。

文献报道[13]，不加选择的NSCLC患者EML4-ALK融合基因总发生率为3.4%（范围0.4%-11.6%）。东方人群NSCLC患者的总发生率为4.1%，欧美人群为2.5%。Shaw等[8]在女性，亚裔，不吸烟或者是轻度吸烟（每年吸烟≤10包或戒烟≥1年者）这4个条件中至少满足2个条件的141名肺腺癌患者的肿瘤组织中用FISH法检测了EML4-ALK融合基因的发生率，结果显示其发生率高达13%；在EGFR和KRAS均为野生型的不吸烟/轻度吸烟者则为33%。Zhang等[3]用RACE-coupled PCR sequencing 法在中国NSCLC患者中进行检测，结果表明在中国的非选择性NSCLC患者中该融合基因的发生率为11.6%，EGFR和KRAS均为野生型的不吸烟/轻度吸烟者则高达42.8%。

EGFR突变基因的分子结构及发生率

EGFR（epidermal growth factor receptor表皮生长因子受体）具有受体酪氨酸激酶活性，属于Ⅰ型生长因子受体家族，由1个胞外配体结合区，跨膜区和一个胞内区构成。

EGFR基因位于7号染色体短臂的12-14区，由28个外显子组成，突变多位于19-21外显子（酪氨酸激酶功能区），其突变主要有3种类型：a. 19外显子碱基缺失 改变了受体ATP结合囊（ATP-binding pocket，ABP）角度，增强了肿瘤细胞对TKI的敏感性[14, 15]。Shigermatsu等[16]发现外显子19突变的发生率最高，占EGFR突变总数的50%以上；b. 20外显子点突变或碱基插入突变 20外显子的点突变主要是第790位密码子出现C-T转换，从而引起该处的苏氨酸转变为甲硫氨酸（T790M），这一突变多见于药物治疗后的复发患者，突变后肿瘤细胞对TKI产生抵抗[17]，插入突变出现在第770-775位密码子，插入片段为3-9个碱基，其临床意义目前尚不清楚[16]；c. 21外显子点突变主要是851位密码子出现T-G转换，亮氨酸转变为精氨酸（L858R），突变提高了肿瘤细胞对TKI的敏感性。

在非选择性NSCLC患者中，EGFR在美国的非小细胞肺癌腺癌患者中突变率约为15%[18]，在亚裔人群为30%-50%,且大部分是腺癌和支气管肺泡癌。

EGFR-TKI、ALK-TKI抑制剂与靶向患者的疗效

ALK的口服抑制剂PF-023451066（crizotinib)的I期临床试验（NCT00585195或A8081001）开始于2006年。2009年ASCO（American Society of Clinical Oncology）年会上报道，PF-023451066的反应率达53％ (10／19)，疾病控制率达到79％(12／19)。鉴于良好的安全性和高有效率，FDA批准此药研究直接进入Ⅲ期临床试验，目前，该药的全球Ⅲ期临床试验正在进行中。2011年ASCO对crizotinib的I期临床试验结果进行了更新：入组NSCLC患者已达119例，中位PFS达到10个月（95%，8.2m~14.7m），客观反应率达61%（95%CI，52%~70%）。中位有效应答时间为48wks，中位生存时间达1年的概率为81%。

EGFR的抑制剂Gefitinib和Erlotinib目前已经广泛应用于临床的各线治疗。IPASS研究[24]比较了一线使用EGFR-TKI与一线使用化疗药物的疗效，该研究结果验证了EGFR突变对吉非替尼治疗NSCLC疗效的预测作用，EGFR突变患者是吉非替尼治疗最大获益人群。基于IPASS及其他三项小型临床试验的研究结果，ASCO于今年4月了PCO(Provisional Clinical Opinion)，建议对晚期初治的NSCLC患者进行EGFR突变测定以决定患者是进行EGFR-TKI治疗还是进行化疗[25]。

EML4-ALK与EGFR临床特征及异同

EML4-ALK融合基因型患者与EGFR基因突变型患者有相似的临床特征[8, 19]，多见于不/轻度吸烟的腺癌患者，但EML4-ALK融合基因型患者多为年轻的男性患者，且不能从EGFR TKI治疗中获益[8]。

以往的文献多认为EML4-ALK融合型基因与EGFR基因突变是互为独立的分子事件[1, 5, 8, 20, 21]，EML4-ALK融合型基因可能是继KRAS之后的EGFR对TKI耐药的另外一个原因[8]。但目前已报道有4例[3, 5, 22, 23]EML4-ALK融合型基因与EGFR基因突变共存型患者。#p#分页标题#e#

台湾大学附属医院的Kuo等[22]报道了一例EML4-ALK融合型基因与EGFR基因突变共存对EGFR TKI治疗有效的患者：72岁亚裔女性腺癌（Ⅳ期 脑，骨转移）不吸烟初治患者，经RT-PCR和DNA测序证实的EML4-ALK融合基因（亚型1）与EGFR突变（19外显子缺失突变 delE746-A750）共存。经过92天的吉非替尼治疗之后，CT显示右上肺的肿物显著性缩小，CEA从442.1ng/ml降至87.6ng/ml。

Tiseo等[23]报道了一例48岁的不吸烟高加索男性腺鳞癌患者（大部分的鳞癌混合>10%的局限性低分化腺癌），cT1N0M1(左侧第10肋)，顺铂+吉西他滨治疗了6周期后PET评估肺部病灶PR，肋骨转移灶CR。之后患者行右上肺叶，淋巴结，肋骨切除术。肺部的主要病灶为EGFR 19外显子缺失突变，KRAS野生型，ALK野生型。转移的淋巴结病灶有EML4-ALK融合基因（经FISH验证）。3个月后患者复发，接受Erlotinib 150mg/天（两个月）治疗，无临床受益，最终死于疾病进展。

展望

EML4-ALK融合基因是当前研究的热点，其已成为NSCLC的一个亚型，PF-023451066（crizotinib)的Ⅲ期临床试验正在进行，Crizotinib能否像EGFR TKI一样成为NSCLC治疗上的一个里程碑，让我们拭目以待。EGFR TKI目前已经广泛应用于临床的治疗，在治疗晚期EGFR突变的NSCLC患者中疗效显著。但对于EML4-ALK融合基因与EGFR基因突变共存型患者，目前的研究和报道还很少，仍有许多问题值得思考和研究：EML4-ALK融合基因与EGFR突变基因究竟是同时存在于同一个肿瘤组织中还是分别存在于一个肿块之中？共存型患者其EML4-ALK与EGFR的下游的分子生物学行为如何？两个案例报道中患者对EGFR TKI的反应恰好相反，是否因为EML4-ALK不同亚型对EGFR TKI的敏感性不同？对于共存型患者该如何应用TKI？多靶点抑制剂会不会是共存型患者的更好选择？期待有深入的实验研究和临床研究来解决这些问题，使患者以最小的花费取得最佳疗效，真正在基因水平上实现肺癌的个性化治疗。

参考文献

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篇8

【摘要】

目的 应用变性高效液相色谱技术(DHPLC)异源双链分析对鼻咽癌患者XRCC4基因突变进行筛查与鉴定，研究鼻咽癌患者XRCC4的基因突变情况，探讨DHPLC在筛查相关基因突变、预测放疗敏感性方面的应用。 方法 采用聚合酶链反应(PCR)和DHPLC筛查88例鼻咽癌患者XRCC4基因的突变。 结果 对DHPLC图形异常的PCR扩增片断进行DNA测序鉴定突变位点及性质，检测出28例XRCC4基因8号外显子第377位C变成T，导致126号密码子的serphe，导致氨基酸残基的替代变化(丝氨酸苯丙氨酸)。 结论 用PCRDHPLC筛查结合测序分析检测XRCC4突变是一种高效、经济、简便、可靠的方法。

【关键词】 鼻咽肿瘤 辐射耐受性 突变 肿瘤细胞 培养的 DNA修复 色谱法 高压液相 基因型

DNA分子是恶性肿瘤放疗辐射作用的靶点，细胞对电离辐射反应的分子基础是DNA损伤[1]。DNA双链断裂是放射治疗过程中的主要损伤形式，而细胞内产生的DSBs可以通过同源重组和非同源末端连接两种途径进行修复。未修复的DSBs损伤将导致细胞死亡。近年来的研究表明，DNA修复基因突变、单核苷酸多态性均可改变DNA的修复能力。因此检测DNA修复基因的分子状态可能成为个体肿瘤放疗敏感性的预测指标。XRCC4是DNA损伤修复的主要基因之一，缺乏XRCC4的细胞特别容易受到离子辐射的伤害。XRCC4基因的突变可能影响肿瘤细胞的DNA损伤修复能力，进而影响其对辐射的敏感性以及放射治疗的疗效。因此，XRCC4基因的突变检测可为其与肿瘤放射敏感性关系的研究以及探讨作为肿瘤个体放疗敏感性的预测指标的可行性提供研究基础。

变性高效液相色谱(denaturing highperformance liquid chromatography，DHPLC)是一种高通量筛选基因组DNA序列变异的新手段。本研究采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和DHPLC异源双链分析与DNA测序等方法对88例鼻咽癌患者进行XRCC4基因突变筛查与鉴定，探讨DHPLC检测该基因突变的适宜条件，为DHPLC技术在筛查相关基因突变，预测放疗敏感性的应用方面提供研究基础。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2002年9月-2003年9月福建省肿瘤医院放疗科经病理确诊、初治的鼻咽癌患者88例，男性67例，年龄(48±12.71)岁(21～76岁);女性21例，年龄(48±11.15)岁(26～69岁)。治疗前经鼻咽镜取鼻咽活检组织。DNA抽提试剂盒(德国Qiagen公司);Taq DNA聚合酶(金牌酶，瑞士Roche公司);基因扩增仪(PTC200，美国BIORAD DNA ENGINE公司);DHPLC(4500WAVE，美国Transgenomic公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA抽提 用组织DNA抽提试剂盒抽提患者鼻咽部癌组织基因组DNA，核酸蛋白检测仪定量，-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR引物设计与合成 人类XRCC4基因有8个外显子，因为此基因突变多发生于其1号、4号、7号和8号外显子，其中第8外显子较长，需分成2个相互重叠的片段进行扩增，故选择这4个外显子设计5对引物。引物由上海博鸿生物公司合成。引物序列如下：片段名引物名引 物 序 列Exon1R

FCCGGAAAAGGCGGGATTTAG

GGGGATTCTCGCATTGTGGAExon4R

FGTGTATGCTTAAAACCAGGC

AACAACATAAAGAGGGCTCCExon7R

FTCAATGCTAAAACAGCAAGT

GATTCAAACATTTTACAATTCCExon81R

FCTTTTACTCTATAACAGAAGTT

ATAGTTTAGAATAATGTGCCExon82R

FGTGAATTGAAACCATTGTGC

GGTTACATTTACATTAATAAGCAGT

1.2.3 PCR反应体系及条件 PCR反应体系50 μL，含0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L Mg2+，DNA模板100 ng，Taq DNA聚合酶1.25 U，上下游引物各0.2 μmol/L。PCR反应条件：94 ℃变性10 min94 ℃ 40 s54 ℃～64 ℃ 45 s 72 ℃ 35 s，循环35次，72 ℃延伸10 min，PCR产物用1%琼脂糖(含溴化乙锭0.5 μg/mL)凝胶电泳检测。

1.2.4 DHPLC筛选XRCC4突变 对有效扩增的PCR 产物行DHPLC筛查突变，检测PCR反应产物，其分离柱固相为烷基化C18，中间桥分子为TEAA，洗脱缓冲液主要成分为乙腈。标本上机之前通过软件分析序列的理论温度分离曲线，摸索出最佳的分离温度后进行突变筛选分析。

1.2.5 DNA测序 根据DHPLC系统检测结果，将不同峰型的PCR产物送日本TAKARA公司进行DNA序列测定。

2 结 果

2.1 DHPLC筛查结果 每份样本均检测上述5个片段的PCR产物，每份样品在50 ℃的非变性温度下均为对称性单峰;在部分变性的温度下，1号、4号、7号和8号外显子的81片断均为单个色谱峰，只有8号外显子的82片断的扩增产物出现杂合峰与纯合峰两种情况，单个色谱峰显示为纯合链，双峰或三峰表示是杂合异源双链。出现杂合峰显示有突变的异源双链存在。不同样品的PCR产物的8号外显子82段在同一DHPLC运行条件下突变峰形基本相同(代表峰形见图1)，提示8号外显子的82段具有单一类型的突变。

2.2 DNA测序结果 选择DHPLC检测为杂合峰与单个峰的标本测序，测序结果显示28例患者的XRCC4基因第8号外显子第377位碱基C变成T(图2)。

3 讨 论

DHPLC异源双链分析法是近年来才发展起来的一项新的基因突变高通量筛查技术。与其他相关技术相比，DHPLC的DNA分离柱具有很好的温度稳定性和酸碱稳定性，具有很长的有效寿命(>6 000次进样)和极好的分析稳定性(99%)。DHPLC异源双链分析法解决了RFLP技术受酶切位点和酶切条件的限制、扩大了检测范围、提高了检测的准确性、又解决了SSCP技术耗时耗力的缺点，实现了样品的自动化检测;同时检测的灵敏度、重复性和检测的通量也得到大提高，从而在基因筛查工作中具有更广泛的应用范围[2]。已有学者进行了DHPLC相关的方法学比较研究，均提示其敏感性和特异性可达96%～100%[3]，明显高于常用的变性梯度凝胶电泳、构象敏感性凝胶电泳、单链构象多态性分析等变异检测技术。DHPLC突变检测技术与其它方法相比，具有更高的准确性和敏感性[45]。

本组资料应用DHPLC分析鼻咽癌组织XRCC4的突变，探讨DHPLC检测该基因突变的适宜条件。由于PCR产物中杂带的存在会导致目的峰周围出现干扰峰，这些干扰峰往往会误判为突变峰形，应用DHPLC分析时笔者通过以下几种方法来排除干扰峰：(1)通过优化PCR反应条件防止杂带产生;(2)通过比较部分变性温度和非变性温度下的峰形来排除干扰峰，凡是在部分变性温度下呈现的双峰或多峰在50 ℃的非变性温度下同样表现出来，则提示有干扰峰的存在;(3)通过保留时间来判断有无干扰峰存在，因为突变引起的双峰或多峰的保留时间应相差不大。

本研究通过PCRDHPLC筛查，共检测了88例患者XRCC4基因各5个片段的PCR产物，在部分变性的温度下，28例患者的8号外显子82所扩增的片段中出现杂合峰与纯合峰两种情况，经DNA测序分析证实单个色谱峰样本未测出突变，双峰或三峰样本检测出突变，即8号外显子第377位碱基C变成T，此外，不同样品的PCR产物的8号外显子在同一DHPLC运行条件下突变峰形基本相同，提示8号外显子具有单一类型的突变。该变异导致126号密码子的serphe，致使氨基酸残基发生替代变化(丝氨酸苯丙氨酸)，这一替代对改变DNA修复能力的作用以及是否影响鼻咽癌细胞DNA损伤修复能力和放射治疗疗效，还有待于进一步的研究探讨。

参考文献

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篇9

【摘要】 目的 探讨急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia， AML)患者人Fms样酪氨酸激酶3内部串联重复(Fmslike tyrosine kinase3intenal tandem duplication， FLT3ITD)基因突变及其临床意义。方法 采用聚合酶链反应变性高效液相色谱(polymerase chain reactiondenaturing high performance liquid chromatography， PCRDHPLC)方法检测60例初治AML患者和10例对照组骨髓FLT3ITD基因突变。结果 60例AML患者FLT3ITD突变阳性率21.67%(13/60)，10例对照组均未检测到该突变;FAB各亚型FLT3ITD突变率不同，有M3型突变率较高的趋势;FLT3ITD阳性组外周血白细胞数、骨髓白血病细胞比例高于FLT3ITD阴性组(P

【关键词】 急性髓细胞白血病;FLT3;内部串联重复;基因;聚合酶链反应变性高效液相色谱技术

ABSTRACT: Objective To investigate the mutation of FLT3 internal tandem duplication (ITD) in patients with acute myeloid leukemia (AML) and its clinical significance. Methods The mutation of FLT3ITD in bone marrow samples from 60 patients with de novo AML and 10 control groups was detected by polymerase chain reaction denaturinghigh performance liquid chromatography (PCRDHPLC). Results There were 13 out of 60 (21.67%) AML patients identified with FLT3ITD mutation， which was not identified in 10 of the control groups. Different FAB subtypes of AML had different mutation rate， and M3 had an obviously higher mutation rate than other subtypes. The peripheral white cell count and bone marrow blast cells were significantly higher in patients with FLT3ITD mutation than in those without (P

KEY WORDS: acute myeloid leukemia; FLT3; internal tandem duplication; gene; polymerase chain reaction-denaturing high performance liquid chromatography

人FLT3是Ⅲ型酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase， RTK)家族成员的原癌基因，其蛋白产物属于受体，定位于细胞膜上。在正常人骨髓中，FLT3的表达仅限于CD34+干/祖细胞，该受体与多种胞浆蛋白作用介导一系列细胞内信号传导，诱导细胞增殖和分化。近来研究发现FLT3基因的异常表达、突变与急性白血病(acute leukemia， AL)的发生、发展、预后有密切关系[13]。酪氨酸激酶受体基因FLT3的内部串联重复序列(FLT3 internal tandem duplications， FLT3ITD)是一种FLT3的近膜区的突变，由NAKAO等[4]研究急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia， AML)时，于1996年首先报道。为探讨AML患者FLT3ITD的突变情况，我们采用聚合酶链反应变性高效液相色谱(polymerase chain reactiondenaturing high performance liquid chroma

tography， PCRDHPLC)技术检测60例初治AML患者骨髓FLT3ITD的突变情况并分析其临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 60例初治AML患者，诊断及疗效标准参照《血液病诊断及疗效标准》[5]。男27例，女33例，中位年龄48岁(18～79岁)。FAB分型为M0 3例，M1 3例，M2 14例，M3 13例，M4 13例，M5 12例，M6 2例，M7 0例。老年AML 30例(年龄>60岁)，非老年AML 30例，正常人及良性血液病患者为对照组共10例(3例健康人，5例缺铁性贫血患者，2例特发性血小板减少性紫癜患者)。

1.2 实验方法 采用聚合酶链反应变性高效液相色谱(PCRDHPLC)方法。①DNA制备。取患者骨髓液2mL，应用美国Promega公司DNA提取试剂盒抽提总DNA。测定吸光度A260nm/A280nm值，确定DNA的纯度及浓度，并以去离子水稀释DNA样本为1g/L。②PCR扩增。应用Primer Express V2.0软件包以13号染色体外显子14、15设计引物，包括整个近膜区(JM)和激酶结构起始部分，扩增产物为329bp。引物由上海捷瑞公司合成，正义引物：5′GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC3′;反义引物：5′CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC3′。PCR反应体系(50μL)：10×PCR缓冲液5μL，25mmol/L MgCl2 6μL，10mmol/L dNTP 1μL，10μmol/L正/反义引物各2μL，模板DNA 4μL，Taq DNA酶0.5μL，双蒸水29.5μL。PCR条件：94℃，5min，1个循环;94℃，45s，56℃，45s，72℃，45s，共循环35次;72℃延伸10min，1个循环。③测序分析。部分变性DHPLC分析突变阳性产物：5μL预处理的PCR产物上样于Transgenomic公司的DNA sep分离柱，然后观察DHPLC图谱形态。发现异常的图谱形态PCR产物，纯化后测序(由大连宝生物生物公司帮助完成)，分析各FLT3ITD序列。

1.3 统计学方法 应用SPSS 11.5统计软件包对实验数据进行统计学分析。计量资料在作t检验、方差分析前先进行正态性、方差齐性检验，单变量两组资料采用t检验，方差不齐者采用非参数检验;计数资料采用卡方检验，P

2 结 果

2.1 AML患者FLT3/ITD基因突变的检测 60例初发AML患者，13例FLT3ITD突变阳性患者(21.67%)，其中M2 21.4%(3/14)，M3 30.8%(4/13)，M4 23.1%(3/13)，M5 25.0%(3/12)，M0、M1、M6、M7均未检测到该突变，有M3型突变率较高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。本实验检测的突变均为杂和突变，各例突变区域大小不等(6～100bp)，均为框内突变。10例对照组均未检测到突变。

2.2 FLT3ITD阳性AML患者临床特征 60例初治AML组中，13例FLT3ITD突变阳性，其中女8例(占25.0%)，男5例(占17.9%)，差异无统计学意义(P>0.05);30例老年AML组，8例 FLT3ITD突变阳性，突变阳性率26.7%，30例非老年AML组，5例FLT3ITD突变阳性，突变阳性率16.7%，二者相比差异有统计学意义(P

2.3 FLT3ITD阳性AML患者的疗效 采用DA(柔红霉素、阿糖胞苷)或HA(高三尖杉酯碱、阿糖胞苷)方案治疗;M3首选维甲酸;13例FLT3ITD阳性AML患者6例获得CR(46.2%)，47例FLT3ITD阴性AML患者34例获得CR(72.3%)，二者相比差异有显著性(P

3 讨 论

FLT3ITD突变是近年来AML中最常见的突变类型之一。正常情况下，酪氨酸激酶磷酸化作用是由酪氨酸激酶和酪氨酸激酶拮抗调节维持平衡的。如发生基因突变，将导致酪氨酸激酶持续活化，进而阻断对细胞的分化、增殖和凋亡调节功能，与肿瘤发生有密切关系。有研究表明[67]，约有19.2%～32.0%的AML患者存在有FLT3ITD突变，在成人新发AML的阳性率22.9%，在老年AML的阳性率为31.4%，在FAB亚型中，FLT3/ITD突变在M3的阳性率最高，M5次之，M2、M6的阳性率较低。我们检测的结果显示，在AML中FLT3ITD突变阳性率为21.67%，其中M3最高，M5次之。说明FLT3ITD突变在AML患者的疾病发生、发展中起一定作用，也提示FLT3ITD对于M3可能是一个预后不良的指标。

从临床资料分析，FLT3ITD有它独特的临床表现，男女无统计学意义;老年AML患者FLT3ITD突变阳性率高于非老年，二者有显著性差异，提示FLT3ITD突变可能与年龄有关，与老年AML的发生及预后存在密切关系，这与国内外报道相似[78]。我们的结果还显示，FLT3ITD突变阳性者具有外周血白细胞数高、骨髓白血病细胞比例多的临床特点，这与YANADA等[9]报道相似。我们的结果显示，FLT3ITD阳性AML患者CR率较FLT3ITD阴性AML患者低，二者有显著性差异。一方面说明FLT3ITD阳性AML患者对化疗不敏感，有抗药性，这与BANG等[10]报道一致，另一方面说明FLT3ITD阳性AML患者预后差。有作者对FLT3ITD重复序列的长度与预后的关系进行了研究，认为较长的重复序列与不良预后相关[11]，我们的结果显示，FLT3ITD阳性AML患者CR率较FLT3ITD阴性AML患者低，二者有显著性差异，FLT3ITD阳性AML患者外周血白细胞数、骨髓白血病细胞比例高于FLT3ITD阴性AML患者，这两个指标均提示预后差，说明FLT3ITD基因突变可作为预测AML预后的一个指标。

参考文献

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[4]NAKAO M， YOKOTA S， IWAI T， et al. Internal tandem duplication of the flt3 gene found in acute myeloid leukemia [J]. Leukemia， 1996， 10(12):19111918.

[5]张之南，沈悌. 血液病诊断及疗效标准 [M]. 第2版. 北京：科学出版社， 1998:168193.

[6]SMALL D. FLT3 Mutations: biology and treatment hematology [J]. Am Soc Hematol Educ Program， 2006:178184.

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[8]STIREWALT DL， KOPECKY KJ， MESHINCHI S， et al. FLT3， RAS and P53 mutations in elderly patients with acute myeloid leukemia [J]. Blood， 2001， 97(11):35893594.

[9]YANADA M， MATSUO K， SUZUKI T， et al. Prognostic significance of FLT3 internal tandem duplication and tyrosine kinase domain mutations for acute myeloid leukemia: A metaanalysis [J]. Leukemia， 2005， 19(8):13451349.

篇10

关键词：遗传性对称性色素异常症；ADAR基因；基因编码区

Abstract：Objective To detect the ADAR mutant gene in the family of hereditary symmetry pigment abnormalities.Methods clinical data of patients with peripheral blood DNA extraction，all PCR amplification of ADAR gene encoding region of exon and flanking sequences，PCR products were purified and directly sequenced，and compared with the genomic sequence，find no mutation.Results No mutations were found in all the exons and flanking sequences of the candidate gene coding region.Conclusion The ADAR gene coding region is not related to the pathogenesis of hereditary symmetry pigment abnormalities in this study.

Key words：Hereditary symmetry pigment abnormalities；ADAR gene；Gene coding region

遗传性对称性色素异常症（Dyschromatosis symmetrica hereditaria，DSH）是一种少见的常染色体显性遗传性皮肤病。主要表现为散在分布于手足背的对称性色素沉着及色素减退斑，少数伴有面部雀斑样损害，可延及四肢及全身[1]。2003年张学军等[2]将该病的致病基因定位于1q11～1q21区域。Miyamura等[3]将该病的致病基因确定为ADAR基因。我们收集到1个DSH家系，利用PCR和直接测序方法进行突变检测，以期发现在该家系中是否存在ADAR基因突变。

1资料与方法

1.1一般资料 先证者：女，6岁。双手足背出现色素异常4年，皮疹渐加重，无不适。系统查体：未见明显异常。皮肤科检查：双手足背可见米粒至黄豆大小褐素沉着斑，夹杂色素减退斑，见图2、图4。面部散在粟粒至黄豆大小色素沉着斑，见图1。父母非近亲结婚。家系调查：先证者父亲，31岁，自3岁起双手足背、面部出现与先证者相似皮损，见图3、图5、见图6。亦呈夏重冬轻现象。无其他自觉症状。系统查体：未见明显异常。皮肤科检查：双手足背可见米粒至黄豆大小褐素沉着斑，夹杂色素减退斑。面部散在粟粒至黄豆大小色素沉着斑。家系图，见图7。组织病理检查：（先证者父亲右足背色素斑） 表皮轻度角化过度，表皮基底细胞灶性黑素减少与增加交替分布，真皮浅层血管周围少许淋巴细胞浸润，见图8、图9。诊断：遗传性对称性色素异常症。

1.2材料与方法

1.2.1 外周血基因组DNA提取。

1.2.2 PCR扩增及DNA测序ADAR基因，见表1。

ABI PRISM 3730XL自动测序仪直接测序。测序结果利用Sequeneher 4.10.1Demo软件与基因组标准序列进行比对分析。

2结果

2.1 基因突变检测

2.1. 扩增DSRAD基因的15个外显子编码区及侧翼序列，经过http：//ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/进行反复仔细比对，未发现任何致病突变。

3讨论

遗传性对称性色素异常症（DSH ）， 系常染色体显性遗传病，最先由Toyam a于1910年描述， 并于1929年正式命名。婴儿期或儿童期发病。张学军等首次将本病定位在1q11-1q21区间内， 该区间内的双链RNA 特异性腺苷脱氨酶基因（ADAR） 被证实是本病的致病基因。迄今已超过140种不同的ADAR基因的突变报道，其中约60%的突变点位于编码ADEAMc区的碱基序列上，因此有笔者认为ADEAMc区是该病基因的突变热点区域。本家系2位患者ADAR基因的15个外显子编码区及侧翼序列进行测序未发现任何致病突变。刘红等曾对8个DSH家系进行ADAR的直接测序，其中的2个家系也未发现任何突变，分析原因可能位于内含子区域、5'端启动子区域。考虑到遗传异质性，原因还可能是致病基因ADAR之外的其它基因。至今中国人遗传性对称性色素异常症的分子遗传学研究报道中尚未发现除ADAR基因编码区以外的突变位点。因此定位汉族人群中该病的易感基因或筛查已知易感基因的突变类型仍是该病的一个研究方向。本家系致病基因的定位研究，仍在进行中。

参考文献：

[1]赵辨.中国临床皮肤病学[M].第1版.南京：江苏科学技术出版社，2010.1479.