微生物多样性分析范文
时间：2023-12-14 17:48:43
导语：如何才能写好一篇微生物多样性分析，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
目前与国家管辖范围外海域海洋生物多样性有关的《联合国海洋法公约》以及《生物多样性公约》，在关于国家管辖范围之外海域生物多样性的法律属性问题上均未做出明确规定，这种独特资源所具备的巨大价值，引起了国际社会的关注，与此同时，在发展中国家和发达国家之间带来了一场巨大的争议。本文通过对争议和理论的分析，认为对于“区域”生物多样性资源的法律属性归属，应当选择人类共同继承财产原则，由全人类共同享有。
【关键词】
国家管辖范围外海域；UNCLOS；公海自由；人类共同继承财产
《联合国海洋法公约》（United Nations Convention on the Law of the Sea，简称UNCLOS）将海洋空间为若干区域，国家管辖权之外的海域，包括“区域”以及公海两个部分。由于此海域的生物多样性资源更是新型海洋资源，故而现有法律规定尚不能对其进行有效的规制。从生物多样性保护的法律规定来看，《生物多样性公约》（Convention on Biological Diversity，简称CBD）的主旨是在国家管辖范围内的海洋生物多样性的保护。具体而言，这两部公约关于国家管辖范围之外海域生物多样性的法律属性均未做出明确规定，国际社会为解决这一争议举行了诸多会议进行讨论，但结果只是对国家管辖权范围外海域海洋生物多样性对人类社会的重要性，及需为其制定保护措施达成一致共识，但未对资源的法律属性归属形成结论性的意见。这是因为，资源属性这一问题牵涉到各国的根本利益，任何的妥协都会对本国利益造成难以弥补的损失。因此，在这一问题上，各国很难达成一致。
一、国家管辖范围之外海域生物多样性现有争议
目前而言，国家管辖范围之外海域海洋生物多样性资源的法律属性是发达国家和发展中国家争议最大的地方，在国际会议中争论激烈。
由于较早的开始了对国家管辖范围外海域海洋生物多样性资源的研究与开发，发达国家依靠雄厚资金和先进科技，在这一问题上占据了优先政治地位以及资源享有。以美国和日本为例，他们认为国家管辖范围外海域生物多样性资源应当适用公海自由原则，各国际主体在有足够经济及科技条件下可以自由的进行开发、利用，通过“先到先得”的方式取得，不应被任何国际主体依而占有。反对将UNCLOS第十一部分“区域”制度适用于深海基因资源，其理由是UNCLOS中有关“区域”资源的定义十分明确，即“区域”制度只适用于国家管辖范围外海域深海底的矿产资源，据此，以美国和日本为首的的发达国家主张，深海基因资源的相关活动应遵循公海自由原则。
对此以我国为代表的发展中国家所成立的“77国集团”表示强烈的反对，巴基斯坦代表在联合国海洋和海洋法问题不限成员名额非正式协商进程第八次会议上，代表77国集团和中国发言时就指出：“‘区域’内资源，包括海洋遗传资源都是人类共同遗产的一部分”。发达国家不能依仗其优势，通过公海自由原则以“先到先得”的方式占有，再利用知识产权保护制度，将该资源变为发达国家或其“阵营”的独享权益。我们认为，UNCLOS中“区域”制度所独有的共同继承财产（或人类共同遗产）原则，既体现“区域”所独有的地理环境和法律地位，又通过这一原则公平合理保护了各国在“区域”内的合法权益。因此应适用人类共同继承财产原则，将该资源纳入UNCLOS的“区域”制度范畴中，通过这一机制，使得发展中国家可以打破发达国家对深海生物多样性资源的垄断，分享其应有利益。
欧盟国家认为现有的法律制度和管理执行方面均存在着空白，应当从处理具体执行差距的基础上，制定新制度完善现有法律框架。他们提议制定UNCLOS第三个执行协定，重点是在公海建立海洋保护区，以确保有效的海洋环境管理。
二、国家管辖范围之外海域生物多样性资源属性法律理论
（一）公海自由原则
1609年荷兰法学家格老秀斯在《海洋自由论》中指出：“流荡不定的海水，必是自由的不能为任何国家所占有。”他主张海洋是全人类用之不竭的资源宝库，这是公海自由所赋予人类的权利。据此发达国家提出，公海自由原则的确立远早于UNCLOS的签署，并且该原则已形成了完整的学术体系以及成熟实践方式，不再需要一个新的制度对这一问题进行规制，过多的规制甚至会限制这一领域的科学发展。同时他们认为，在UNCLOS的相关条款中，已经明确列举了“区域”内的资源是指矿产资源，因此，对于多样性资源应当秉承公海自由原则，由各个国家自由取用。
（二）人类共同继承财产原则
结合“区域”制度及相关表述可以得出，“区域”部分所包含的资源应当属于全人类共同所有，由人类共同继承。目前，虽然对该原则特征的表述认识存有争议，但通常各观点均认为要为和平目的而保护利用，排除单方侵占保证资源的人类共有性，以及为了后展的需要对现有资源进行合理有效的养护和利用。这些特点在UNCLOS的条文中均有包含，加之UNCLOS以明文形式阐述了“区域”及其资源是人类共同继承财产，因此可以得出结论，UNCLOS要求各国在“区域”中的行为应以全人类的共同利益为考量，对于人类共同继承财产的开发，即使各国不能实际参与开发利用活动，也可以通过合理的机构和制度分享开发所获得的利益，并通过大会以及海底管理局等相关机构协调各方面的利益分配。
三、国家管辖范围之外海域生物多样性资源法律属性分析
对于“区域”生物多样性资源的法律属性归属，应当选择“人类共同继承财产”，第一，国家管辖范围之外海域生物多样性资源的生存环境与普通海域不同，极端环境下所具有的独特生态系统造就了动植物独特的生存能力和生存方式，成就了其资源的独特性以及人类社会对这一资源的不可复制性。这种这种独特的地理生态环境造就了海洋生物多样性资源极高的价值，因此该资源与“区域”地理环境具有高度的伴随性，甚至可以说，国家管辖范围外海域海洋生物多样性资源与“区域”是一个密不可分的整体，与“区域”环境不可分割；第二，海洋法的健全完善，不但受时代背景的影响还受科学水平的左右。在UNCLOS关于“区域”资源定义做会议讨论之时，关于国家管辖范围外海域生物多样性资源并没
有出现在国际社会的认识之中，而当1977年热夜喷口及相关生态系统被发现时，关于“区域”资源的定义已经被会议确立，因此现行1982年UNCLOS第十一部分并没有涉及国家管辖范围外海域的海洋生物多样性资源。可通过梳理不难发现，设立“区域”制度时只是由于科技和人类认识的不足，导致在细化这一概念的内涵以及外延出现了法律空白，并非故意将其割裂；最后，通过UNCLOS序言可以得知，其目的是在于维护全人类的共同利益，而国家管辖范围外海域海洋生物多样性资源的开发与保护，是以发达的深海勘探技术为依托，雄厚的经济实力为支持，这就尤其需要各国携手共同合作。从这一点而言，是符合人类共同继承财产这一法律属性的，即需要国际社会共同来携手合作、维护管理以及科考研究。
参考文献：
[1]《国家管辖范围以外海洋生物多样性养护与可持续利用问题非正式工作组会议若干热点议题》，http：///chn/xwdt/t240388.htm，2014420；
[2]百度百科：http：///link？url=Qc8p1KBxl_tiwU5 rnuHcWsO4r8s3Oj
4JTFwTMmA603KIpBv9gUJix8S059fsFA3，2014420；
[3]Statement on Behalf of the Group of 77 and China by Mr.Farukh Amil， Deputy Permanent Representative of Pakistan to the UN， at the Eighth Meeting of UNICPOLOS on Marine Genetic Resources，http：///statement/getstatement.php？id=070625，2014420；
[4]Farukh Amil .Statement on Behalf of the Group of 77 and China by Mr . Farukh Amil， Deputy Permanent Representative of Pakistan to the UN， at the Eighth meeting of UNICPOLOS on Marine Genetic Resources [ EB/OL]，http：//www .g77/org/statement/getstatement .php ？ id =070625，20140304；
[4]王铁崖.论人类共同继承财产的概念[M]，中国国际法年刊，1984
[5]1982年《联合国海洋法公约》
[6]贾桂德，尹文强.国际海洋法发展的一些重要动向[J]，太平洋学报，2012.1
[7]金建才.深海底生物多样性与基因资源管理问题[J]，地球科学进展，2005.1
篇2
关键词：土壤类型；烟田土壤微生物；根土比；多样性指数
中图分类号：S154 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）01-0056-04
土壤微生物是陆地生态系统中最丰富的物种，相关研究表明，每克农田土壤拥有的基因组量为140～8 800个，相当于400～26 000个不同物种。土壤微生物组成与活性决定了生物地球化学循环、土壤有机质的周转及土壤肥力和质量，也与植物的生产力有关。土壤微生物还可以敏感地指示气候和土壤环境条件的变化，土壤微生物参数可能是最早用于反映土壤质量的指标。土地利用方式、种植制度、农地管理方式及作物种类都会对土壤微生物产生影响[1-3]。Waldrop等[4]在研究森林转换为耕地条件下的土壤微生物群落结构时发现土壤中有机碳和氮下降了50%～55%，微生物量下降了75%，β-葡萄糖苷酶活性下降了54%，微生物特征和种类发生明显的变化。
土壤类型对微生物生长发育有着较大影响。土壤类型不同，土壤微生物种群数量和组成也必然会存在某种程度的差别，这种差异反过来又会对土壤结构以及土壤肥力特别是对烟草的生长产生一定的影响[5]。土壤微生物是土壤中动植物残体分解的主要推动者，在土壤物质转化中具有多种重要作用，与土壤肥力和植物营养有密切关系。因此土壤微生物是反映土壤供肥能力、土壤健康状况的敏感性参数。为此，在湖北省保康县和兴山县选取两种有代表性的土壤类型，研究不同类型土壤中主要微生物类群数量的变化规律，为合理利用土地资源、保证其可持续发展提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验设计
试验于2009年5～12月在湖北省保康县和兴山县进行。选取黄棕壤和紫色土两种土壤类型，育苗、肥水管理、病虫害防治及其他田间管理均按照当地农民种植习惯进行。供试烟草品种为K326。
1.2 土壤样品采集
分别于移栽前期（5月12-13日）、旺长期（7月8-9日）及采收期（8月15-16日）取样。采用5点取样法采集5～20 cm根际土和非根际土，用无菌自封袋包装，立即带回实验室。将新鲜土样研磨过2 mm筛存放在4 ℃冰箱中。
1.3 土壤微生物测定
采用稀释平板法测定土壤微生物总数；细菌采用牛肉膏蛋白胨固体培养基；固氮菌采用阿须贝氏琼脂培养基；放线菌采用高氏1号培养基；真菌采用马丁氏（Martin）培养基。结果以每克干土所含微生物数量表示[6]。
1.4 数据分析
根土比（R/S）是指根际土中微生物数量与非根际土中微生物数量的比，其中R表示根际土中微生物数量，S表示非根际土中微生物数量。
微生物数量变化速率是指根际土中微生物数量与移栽前期根际土中微生物数量的比。
生物多样性指数是描述生物类型数和均匀度的一个度量指标，它在一定程度上可反映生物群落中物种的丰富度及其各类型间的分布比例。本研究中土壤微生物菌群多样性指数和土壤微生物菌群的均匀度计算方法如下：
1）土壤微生物菌群多样性指数（Shannon-Wiener指数[7]）：H=-∑Pi×1nPi
2）土壤微生物菌群的均匀度[8]：
R=（-∑Pi×1nPi）/1nS
式中，Pi=Ni/N为某群落中第i个类型的个体数占总个体数的百分比，S为微生物类群数量。
2 结果与分析
2.1 不同类型烟田土壤中微生物数量
由图1至图4可知，在不同土壤类型烟田土壤中4种微生物数量从多到少依次为：细菌、固氮菌、放线菌、真菌。其中，细菌数量最多，占微生物总量的58.77%～82.98%，固氮菌占微生物总量的10.80%～32.75%，放线菌占微生物总量的3.79%～10.39%，真菌数量最少，占微生物总量的0.04%～0.22%。由此可见细菌在烟田土壤微生物中占绝对优势。
在不同生育时期不同土壤类型的烟田土壤中，旺长期细菌数量高于采收期，保康县黄棕壤和紫色土烟田旺长期土壤中细菌数量分别为11.740 2×107 cfu/g和11.654 2×107 cfu/g，兴山县黄棕壤和紫色土烟田旺长期土壤中细菌数量分别为29.437 0×107 cfu/g和11.295 9×107 cfu/g。
不同类型的烟田土壤中，黄棕壤中细菌和固氮菌数量均高于紫色土，保康县黄棕壤烟田旺长期土壤中细菌和固氮菌数量分别为11.740 2×107 cfu/g和24.033 4×106 cfu/g，保康县紫色土烟田旺长期土壤中细菌和固氮菌数量分别为11.654 2×107 cfu/g和15.163 0×106 cfu/g；保康县黄棕壤烟田采收期土壤中细菌和固氮菌数量分别为11.250 4×107 cfu/g和34.551 7×106 cfu/g，保康县紫色土烟田采收期土壤中细菌和固氮菌数量分别为10.302 8×107 cfu/g和31.938 6×106 cfu/g。兴山县黄棕壤烟田旺长期土壤中细菌和固氮菌数量分别为29.437 0×107 cfu/g和99.007 3×106 cfu/g，兴山县紫色土烟田旺长期土壤中细菌和固氮菌数量分别为11.295 9×107 cfu/g和32.766 6×106 cfu/g；兴山县黄棕壤烟田采收期土壤中细菌和固氮菌数量分别为16.694 6×107 cfu/g和66.275 2×106 cfu/g，兴山县紫色土烟田采收期土壤中细菌和固氮菌数量分别为7.679 0×107 cfu/g和23.956 8×106 cfu/g。
2.2 不同类型烟田土壤中微生物数量变化速率
以移栽前期根际土中微生物数量为参照，不同类型烟田土壤中微生物数量变化速率如图5和图6所示，黄棕壤中细菌、固氮菌、放线菌和真菌的变化速率都高于1，表明在烟草生长过程中黄棕壤烟田土壤中细菌、固氮菌、放线菌和真菌数量在增加，而紫色土中固氮菌和放线菌的变化速率存在低于1的情况，表明在烟草生长过程中紫色土烟田土壤中固氮菌和放线菌数量存在减少的趋势。
在黄棕壤烟田土壤中，细菌变化速率高于固氮菌变化速率，固氮菌变化速率高于放线菌变化速率，放线菌变化速率高于真菌变化速率。在兴山县黄棕壤烟田旺长期土壤中，细菌、固氮菌、放线菌和真菌的变化速率分别为6.895 5、4.161 8、2.561 1和1.529 9。
在不同类型烟田土壤中，黄棕壤烟田土壤中细菌变化速率、固氮菌变化速率、放线菌变化速率和真菌变化速率分别高于紫色土中4种微生物变化速率。兴山县黄棕壤烟田采收期土壤中，细菌、固氮菌、放线菌和真菌的变化速率分别为3.910 7、2.785 9、2.659 0和2.136 4，兴山县紫色土烟田采收期土壤中，细菌、固氮菌、放线菌和真菌的变化速率分别为1.636 5、1.527 7、1.583 8和1.911 7。
2.3 不同类型烟田根际土中微生物根土比
由图7和图8可知，不同类型土壤中细菌、固氮菌、放线菌和真菌根土比都大于1，表明根际土中细菌、固氮菌、放线菌和真菌数量均高于非根际土，表现出明显的根际效应。不同类型烟田土壤中，黄棕壤中固氮菌根土比高于紫色土，兴山县黄棕壤中固氮菌根土比最高，为7.007 1。黄棕壤中4种微生物根土比之和高于紫色土，旺长期保康县黄棕壤和紫色土中4种微生物根土比之和分别为5.958 3和4.820 9，旺长期兴山县黄棕壤和紫色土中4种微生物根土比之和分别为13.852 2和6.742 4。
2.4 不同类型烟田土壤中微生物种群结构变化
细菌与真菌数量的比值（B/F）是表征土壤肥力的一个潜在指标。有资料表明，土壤中细菌密度高，表明土壤肥力水平较高。表1为不同土壤类型烟田土壤中微生物的B/F变化趋势。黄棕壤烟田土壤中旺长期细菌与真菌数量的比值（B/F）高于采收期，兴山县黄棕壤烟田土壤中旺长期和采收期细菌与真菌数量的比值（B/F）分别为26.431 4和11.541 7。不同类型烟田土壤中，黄棕壤中细菌与真菌数量的比值（B/F）几乎都高于紫色土，兴山县黄棕壤中旺长期细菌与真菌数量的比值（B/F）最高，为26.431 4。黄棕壤烟田土壤中细菌与真菌数量的比值（B/F）高于紫色土，表明黄棕壤烟田土壤更适合烟草种植。
2.5 不同土壤类型对土壤微生物多样性指数的影响
土壤微生物菌群多样性指数（H）反映微生物群落的丰富度，用根际土中微生物菌群多样性指数与非根际土中微生物菌群多样性指数之比（R/S）衡量烟叶种植对烟田生态系统中微生物多样性指数的影响。从表2可知，黄棕壤根土比大于紫色土。保康县黄棕壤和紫色土根土比分别为0.887 18和0.748 94，兴山县黄棕壤和紫色土根土比分别为1.019 26和0.866 43。
3 小结
对不同类型的烟田土壤中细菌、固氮菌、放线菌和真菌进行分离，对不同微生物种群进行数量和多样性分析。结果表明，不同类型烟田根际土壤中，黄棕壤中细菌和固氮菌数量均高于紫色土。在黄棕壤烟田土壤中，细菌变化速率高于固氮菌变化速率，固氮菌变化速率高于放线菌变化速率，放线菌变化速率高于真菌变化速率。黄棕壤烟田土壤中细菌、固氮菌、放线菌和真菌变化速率分别高于紫色土中4种微生物变化速率。黄棕壤中4种微生物根土比之和高于紫色土，兴山县黄棕壤中固氮菌根土比最高。黄棕壤中细菌与真菌数量的比值（B/F）几乎都高于紫色土，兴山县黄棕壤中旺长期细菌与真菌数量的比值（B/F）最高，为26.431 4。黄棕壤根际土中微生物菌群多样性指数与非根际土中微生物菌群多样性指数之比高于紫色土。
参考文献：
[1] ZELLES L.Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterization of microbial communities in soil：A review[J]. Biol Fert Soils，1999，29（11）：111-129.
[2] LARKIN R P， HONEYCUTT C W. Effects of different 3-year cropping systems on soil microbial communities and rhizoctonia diseases of potato[J]. Phytopathology，2006，96（1）：68-79.
[3] YAO H， HE Z， WILSON M J， et al. Microbial biomass and community structure in a sequence of soils with increasing fertility and changing land use[J]. Microb Ecol，2000， 40（3）：223-237.
[4] WALDROP M P，BALSER T C，FIRESTONE M K. Linking microbial community composition to function in a tropical soil[J]. Soil Biol Biochem，2000，32（2）：1837-1864.
[5] 习金根，孙光明，陆新华.不同的施肥方式对剑麻施肥区域土壤微生物类群的影响[J].中国麻业，2005，27（5）：235-239.
篇3
Abstract： Based on the comparative study of the number and groups of bacteria in inside and outside of the Xiaotongzi Forest soil （0-30cm） in Shuangbai County， this paper made variance analysis and diversity indices analysis on the bacteria. After the related experiments， the results show that： the number of bacteria inside and outside the forest has a significant difference （p
关键词： 小桐子林地；细菌群落；细菌多样性
Key words： Xiaotongzi Forest；bacteria groups；bacteria diversity
中图分类号：S792 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2014）19-0321-02
0 引言
小桐子，其自然学名为落叶灌木，这种树的生长环境很广泛，主要生长在气候比较干热的亚热带和热带雨林。该种树耐干旱，能适应贫瘠的土壤环境。小桐子的自然价值和社会经济效益比较高，可以用作工业生产中的原材料，在农业和环保及生态建设领域均有重要的应用价值，其在药用方面有很高的药物学价值。随着社会生产对传统资源消耗的日益增多，生物能源的利用逐渐进入科学研究的视野。在土壤的生态系统（如图1）中，微生物的分布对于土壤的发育状况有着十分重要的影响作用，土壤微生物中分参与土壤的能量转化，为林地的生物多样性提供了必要的土壤营养基础，小桐子林木属于生物能源的范畴，其生长和发育的好坏，关系到林木资源的开发利用程度的高低。本文主要分析了林地土壤微生物多样性对于林木生长的相关影响。
1 材料与方法
1.1 试验地概况 本实验的地区位于云南省楚雄州双柏县，东经101°03′-102°03′，北纬24°03′-24°55′，海拔556m-2946m，处在低纬度的山地，其气候从细分来看是亚热带高原季风气候。常年平均气温在15℃左右，一年之中月最低气温平均9.2℃，夏季最热月的平均气温达到36℃，通常年平均降水920.1mm，年平均相对湿度72%。
1.2 材料
1.2.1 土样的采集 土壤样品于2011年8月采集于云南双柏县，采集0cm-30cm表层，5cm为一个层次，共7个层次。
1.2.2 使用到的试剂 本实验主要使用牛肉膏蛋白胨培养基。如图2。
1.3 主要实验方法及实验步骤
1.3.1 测定土壤的含水量 先称取待测土壤的样品，在烘干冷却后称其重量，根据以下公式计算其含水量：土壤含水量=（湿土重-干土重）/湿土重×100%。
1.3.2 测定土壤的微生物，采用比较常见的测量方法――稀释涂布平板法。
1.3.3 统计分析 本实验的数据统计采用SPSS17.0统计软件进行，再对相关数据处理分析后，形成实验数据报告。
2 结果与分析
2.1 土壤细菌的数量分布（如图3）
表1为土壤细菌数量值及其差异。方差分析表明：不同采样点小桐子林土壤细菌在土壤中的垂直分布存在差异。土壤细菌数量在各个样地有共同特点，即30cm处土壤细菌数量最少，在15cm处最多，5cm层细菌数量比0cm层多。
2.2 林内林外小桐子林地土壤细菌群落多样性分析 林内样地土壤细菌4种多样性指数除丰富度指数（S）外，其它均小于林外样地。林外样地Shannon多样性指数比林内样地高0.3%，说明调查样地林内与林外物种丰富度相近（图4）。
3 本实验的相关结论和讨论
3.1 在细菌数量的分布上，小桐子林外要比林内多。因为小桐子林成林时间较短，在林木下面的植被也不是很浓密繁茂，同时当地气候降雨量较小，光照比较充足，所以蒸发量很大。在土壤的中下层集中了大量的水分，而土壤上层较少。在树林内部的树枝、树叶凋落较多，在土壤中腐烂后形成有机物，其中氮磷钾的含量比没有树叶树枝腐烂的地方高很多，这些地方的土壤肥沃，适合细菌的生长。
3.2 两样地表层的细菌数量都比较少，这种原因主要是土壤类型不同，这些土层比较浅，土壤中有含有大量砂砾，在土壤厚度增加的同时，其紧实度、致密度也随之增加。过于致密的土壤不利于透气、透水，这种不利条件限制了有氧细菌的生长。
3.3 土壤细菌的分布在数量上呈现一定的垂直差异，其中主要的规律为先增后减。具体来说在15cm的地方出现最大值。这种情况与土壤的透气性和含水量密切相关。
参考文献：
[1]Heller Joachim，physic Nut. Jatropha curcus L[M].Italy，Rome：Internattional Plant Genetic Resources Institute，1996.5-12.
[2]Vandana Joshi.Cultivation of non traditionaloil seed plant- Jatropha curcus for utilization of forest wastelands[J].Annals of Forestry，2005，13（1）：59-62.
[3]谭天伟，王芳，邓利.生物能源的研究现状及展望[J].现代化工，2003，23（9）：8-12.
[4]庄铁诚，林鹏，陈仁华.武夷山不同森林类型土壤异养微生物数量与类群组成[J].厦门大学学报，1997，36（2）：293-298.
[5]薛立，邝立刚，陈红跃，等.不同林分土壤养分、微生物与酶活性的研究[J].土壤学报，2003，40（2）：280-285.
篇4
关键词：环境工程；分子生物；微生物；应用
前言：作为集环境监测、环境工程、保护学以及微生物学于一体的学科，微生物学在不断发展中逐渐衍生出较多亟待解决的问题。尽管近年来有较多先进理念与技术被引入该学科中，但对于部分环境监测或环境净化等问题，所取得的效果并不理想，要求充分发挥分子生物技术的优势。因此，本文对环境工程微生物中分子微生物技术的应用分析，具有十分重要的意义。
1分子生物技术的相关概述
1.1测序技术
细胞中的rDNA本身表现出明显的高突序列、保守序列以及稳定特征，但其是分类微生物中的指标之一。通常测序分析中，为使微生物种群得以分析，对分离物或分类单元进行确定，便需借助rRNA分析方式。从该基因序列的类型看，有较多如16SrRNA、23SrRNA与5sRNA，其中后两者包含的含核苷酸分别过多与过少，很难为测序分析提供指导。所以在原核生物系统研究中，可考虑将16SrRNA引入。具体测定中，会在如TA克隆试剂、PGEM-T克隆试剂等载体应用下，克隆PCR产物，完成文库构建过程，在此基础上结合16SrRNA基因测序结果，可通过其与文库中的序列做好对比，判断是否有相对应或相似微生物种类。另外，也可对rDNA多样性利用电泳分离进行显示，或直接通过RFLP对扩增产物做好分析。通过这些测序方法的应用，对微生物系统发育的研究可起到重要作用[1]。
1.2核酸技术
核酸技术在分子生物技术中极为常见，可具体细化为PCR-SSCP、PCR-DGGE与PCR-RFLP等技术。以其中PCR-SSCP技术为例，其以往运用中多局限在基因突变方面，是临床医学中的常用方法，经过不断发展被引入到微生物生态学中。从其实现原理看，主要以单链DNA空间折叠构象为基础，若其中有碱基出现变化，空间构象会随之发生变化，配合聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用，使DNA谱带得以生成。以16SrRNA测序在废水生物中的表现为例，便可借助PCR-SSCP，对细菌群落受培养基变化的影响进行分析。再如PCR-DGGE，应用中一般强调将基因组DNA从环境样品内被提取，在此基础上将PCR扩增技术引入，可达到扩增DNA的目标，此时可将聚丙烯酰胺凝胶与扩增产物相结合，通过电泳作用分离双链DN段，最终生成的将为单链DNA谱带。最后便可对谱带中展现的碱基序列与文库内序列做好对比分析，完成微生物种属的界定。由于该技术具有较好的分离效果，操作较为简便，所以在微生物分析中的应用较为常见，如对微生物种群在活性污泥中的情况判断，将该技术引入，可起到良好的效果。另外，在PCR-RFLP技术方面，其主要借助核酸特异位点、DNA识别序列，对双链DNA进行切割，配合溴化乙锭凝胶的应用，无需通过放射性标记形式，便可达到DN段分析目标。如土壤中微生物的判断，便可借助该技术实现。
1.3基因探针
目前分子生物技术中，基因探针的引入主要借助荧光染料、放射性同位素，对样品内核酸进行识别分析。对于该技术，也表现在核酸印迹、荧光原位以及放射性标记探针等技术方面。其中放射性探针应用下，尽管对于寡核苷酸、RNA或单链DNA等都可进行标记，但其涉及的同位素具有较高的成本，很容易危害人体健康，所以使用中受到较大的限制。而对于荧光原位，应用中一般可做好细菌空间位置标识或定量定性判断细菌情况等工作。另外，在核酸印迹方面，其适用对象集中表现在PCR扩增产物方面，对微生物风度、多样性检测都可起到重要作用[2]。
2环境工程微生物领域中分子生物技术的应用分析
2.1微生物群种丰度与多样性的分析
现行环境工程领域中，通常需检测的对象多表现在底泥、土壤、生物膜以及污泥方面。从现行较多实践研究都可发现，若将16SrRNA从菌落中提取出来并开展测序工作，可对微生物种群在活性污泥中的情况被测定，并将聚光激光扫描、荧光显微以及FISH等技术引入，可定位生物膜中的微生物或检测其活性。再以城市地区垃圾填埋细菌的分析，可在ARDRA方法的运用下，使细菌多样性情况以及细菌结构被有效判断。这些都可充分说明微生物丰度、多样性都可在分子微生物技术应用下被有效判断，通过定量或定性检测得到的结果，能够为环境工程中较多工艺操作、构筑物设计提供参考。
2.2指示微生物与致病菌的有效检测
环境工程研究中，可发现在土壤、水体或空气等媒介作用下，致病菌很可能对人体造成较大威胁，如典型的SARS。对此，便可借助分子微生物完成致病菌测定工作，如部分学者将16SrRNA基因、PRC-DGGE技术共同引入，对垃圾场、污水处理厂以及大学校园中的空气环境进行测定，可发现在以往微生物培养下，很难测定气溶胶微生物情况。另外，对于水体内是否有大肠杆菌等DNA存在，也可借助分子微生物技术进行判断。这些都可充分说明，对于指示微生物、致病菌的检测，分子生物技术应用效果都较为明显。
2.3功能微生物的培养
由于当前化工行业发展步伐较快，其带来的过多有机化合物也成为环境工程领域面临的难题，很多有机化合物如含苯环类型，很难实现快速降解目标。对此问题，大多学者通过实验方式，发现分子生物技术应用下可使这种现状得以改变，如对甲苯质粒、降解萘利用DNA印迹杂交形式，可使这两种质粒微生物被判断。此外，对于其他难以降解的有机物，都可采用质粒如工程、基因重组等方式，使功能群被构建，使有机物难以被降解的问题得以解决[3]。
3结论
分子生物技术的应用是现行微生物研究的重要保障。实际引入该技术中，应正确认识分子生物技术的实现原理，包括测序技术、基因探针以及核酸技术等，在此基础上将其融入致病菌检测、功能微生物培养以及微生物多样性分析等方面，能够推动环境工程微生物学的进一步发展。
参考文献
[1]石琛,王璐.环境微生物领域分子生物技术的应用进展[J].中国科技信息,2013,16:135+139.
[2]张凤.在环境工程微生物领域中分子生物技术的应用[J].绿色科技,2013,08:192-194.
篇5
双生子研究是一种经典的流行病学研究方法，主要通过对双生子群体的研究，即比较同卵双生子和异卵双生子性状的相似性来判断遗传和环境哪种对于疾病或性状更为主要的一种方法。同卵双生子（monozygotic twins）具有基本相同的遗传物质，表型特征极为相似。同卵双生子之间的差异可以排除遗传因素的作用，可用以研究不同环境因素对表型的影响。异卵双生子（dizygotic twins）具有50%相同的遗传物质，其在特点上无异于两次不同妊娠的同胞，但双生子同胞之间具有相同的年龄，进行比较时可以避免年龄的混杂，同时也可以排除不同子宫环境对胎儿发育及疾病所带来的影响。通过比较同卵及异卵双生子性状的差异，可以分析遗传和环境两个方面对个体性状的影响。本研究拟通过双生子法，以聚合酶链反应-变性梯度[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]凝胶电泳（polyme-rase chain reaction-denaturing gradient gel electropho-resis，PCR-DGGE）分析双生子儿童口腔微生物群组结构构成的差异，从而观察遗传及环境因素对人口腔微生物群组结构构成的影响。
1 材料和方法
1.1 试验对象
随机选取2011年8月—2012年3月于四川大学华西口腔医院儿童口腔科就诊的双生子儿童20对，年龄3～11岁，根据WHO口腔健康调查基本方法第三版龋病诊断标准，记录龋失补牙面（dmfs/DMFS）指数。其中有龋者17人，无龋者23人。
所有入选双生子儿童为共同生活背景，无全身系统性疾病史，3个月内无全身使用抗生素史，未使用激素类药物及免疫抑制剂，1周内口腔局部未使用抗生素。儿童及其法定监护人知情同意。
根据儿童牙列情况分为乳牙列组以及混合牙列组。乳牙列组双生子共10对，年龄3～6岁，其中无龋（caries free）儿童13人，有龋（caries）儿童7人，dmfs指数为2.29±1.38。混合牙列组双生子共10对，年龄6～11岁，其中无龋儿童10人，有龋儿童10人，dmfs/DMFS指数为7.20±4.42。
1.2 卵形鉴定
用无菌棉签采集儿童口腔黏膜样本，鉴定双生子儿童卵形。采用16个多态标记（D3S1358，vWA，FGA，AMEL，D8S1179，D21S11，D18S51，D5S818，D13S317，D7S820，TH01，PE，D16S539，CSF1P0，PD，TPOX）的基因分型对所有双生子进行卵形鉴定。20对双生子中，同卵双生子10对，异卵双生子10对；乳牙列组中同卵双生子3对，异卵双生子7对；混合牙列组中同卵双生子7对，异卵双生子3对。
1.3 唾液样本采集
进食后2 h取样，清水漱口后采集非刺激性唾液，直接用加样枪从受试者口底采集，采集量为5 mL。采集的唾液放入离心管内，冰浴下2 h内放入-80 ℃冰箱冻存。
1.4 DNA提取
将临床采集的唾液样本在室温下解冻，将唾液样本混合，2 600×g离心10 min，沉淀样本中的残渣及真核细胞，取上清，14 000×g离心5 min，弃上清，收集细菌沉淀用于提取DNA和PCR-DGGE分析，以获得原始唾液细菌谱。利用QIAamp DNA Micro Kit提取全基因组DNA，提取产物使用Pigogreen荧光定量法测定浓度，A260/A280测定DNA纯度。
1.5 16s rRNA基因扩增及PCR-DGGE分析
使用通用引物bal 1（5’-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC GAC TAC GTG CCA GCA GCC-3’）、bal 2（5’-GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC C-3’）扩增DNA样本16s rRNA基因，扩增产物长度约300 bp。PCR反应体系：PCR master mix预混液25 μL，25 mmol·L-1引物各1 μL，100 ng纯化基因组DNA，加去离子水补足50 μL。循环条件：起始步骤94 ℃变性3 min；94 ℃变性1 mi[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]n，56 ℃退火1 min，72 ℃延长2 min，30个循环；72 ℃延长5 min。取PCR扩增产物5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳验证，0.5 μg·mL-1溴化乙锭染色后置长波紫外光下观察。
以8%的聚丙烯酰胺凝胶形成40%（含2.8 mol·L-1尿素及24%甲酰胺）至60%（含4.2 mol·L-1尿素及24%甲酰胺）的线性浓度梯度。每个加样孔中加入约300 ng的PCR产物。将凝胶浸没于装有1×TAE缓冲液（40 mmol·L-1 Tris base，40 mmol·L-1冰醋酸，1 mmol·L-1乙二胺四乙酸）的电泳槽中，使用Bio-Rad Dcode系统恒定60 V电压，58 ℃下电泳17 h。电泳完成后，TAE缓冲液漂洗凝胶，含0.5 μg·mL-1溴化乙锭的1×TAE缓冲液染色15 min后用1×TAE漂洗15 min洗去多余染料。使用Molecular Imager Gel Documentation system获取并记录PCR-DGGE凝胶的数码图像[3]。
1.6 数据分析
使用Quantity one软件标记PCR-DGGE图谱条带，并使用非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）构建系统发育树，得到相似性矩阵（similarity matrix）。使用Quantity one软件导出实验数据后，计算多样性指数（Shannon index）及PCR-DGGE条带数。
采用SPSS 16.0软件进行统计分析。数据服从正态分布者采用独立样本t检验，不服从者采用独立样本t’检验。
2 结果
2.1 PCR-DGGE图谱分析
乳牙列组PCR-DGGE图谱见图1。泳道2～6、8、11为有龋者，7、9、10、12～21为无龋者。
2.2 UPGMA系统发育树
乳牙列组UPGMA系统发育树见图3。2-3、4-5、6-7、10-11、14-15、16-17、18-19为异卵双生子，8-9、12-13、20-21为同卵双生子。除6-7这对双生子外，其余9对双生子之间均出现明显聚类（90%），但同卵双生子和异卵双生子间无统计学差异（P>0.05）。混合牙列组UPGMA系统发育树见图4。1-2、3-4、7-8、9-10、11-12、13-14、19-20为同卵双生子，5-6、15-16、17-18为异卵双生子。6对双生子之间有明显聚类（60%），但同卵双生子和异卵双生子之间无统计学差异（P>0.05）。
在乳牙列组中，同卵双生子的相似性 为75.70±1.70，异卵双生子的相似性为71.83±6.69，两者间无统计学差异（P=0.21）；混合牙列组中，同卵双生子的相似性为58.53±10.37，异卵双生子的相似性为57.87±21.51，两者间无统计学差异（P=0.86）。这说明在乳牙列及混合牙列同卵及异卵双生子中，口腔微生物组成的相似性无明显差异，遗传因素对口腔菌群微生物构成的作用可能小于环境因素。
2.3 口腔微生物多样性分析
双生子儿童口腔微生物PCR-DGGE条带数及多样性指数分析见表1。乳牙列组中，有龋儿童的PCR-
DGGE条带数及多样性指数低于无龋儿童，且两者间均具有统计学差异（P<0.05）。混合牙列组中，有龋儿童的PCR-DGGE条带数及多样性指数低于无龋儿童，但两者间均无统计学差异（P>0.05）。
3 讨论
PCR-DGGE[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]是一种非培养指纹图谱方法，通过PCR-DGGE方法可以在同一块胶上观察不同的细菌种类。利用细菌16S rRNA基因进行PCR特异性扩增结合DGGE分析已成为研究微生物群落多样性的常规方法。本研究发现乳牙列组有龋儿童中，唾液细菌的多样性较低，而无龋儿童唾液细菌的多样性较高。在混合牙列双生子中，虽然无龋与有龋儿童的细菌多样性无统计学差异，但仍能看出患龋后微生物多样性减少的趋势。推测其可能的原因是：有龋儿童口腔内可能有更高比例的产酸菌及耐酸菌[4-5]，且其口腔微环境可能更适合致龋菌的生存，所以致龋菌的比例升高，从而导致细菌整体丰度下降[6-7]。
在本研究中，通过PCR-DGGE聚类分析可以发现，大多数双生子出现明显聚类，其中，乳牙列双生子中有9对出现明显聚类（90%），混合牙列双生子中有6对出现明显聚类（60%），这证明在大部分双生子之间，口腔菌群微生物构成的相似性非常高。但同时可以看到，无论是乳牙列还是混合牙列，同卵双生子和异卵双生子之间的口腔菌群相似性均没有明显差异，说明在口腔微生物菌群构成中，环境因素（共同生活等）的影响可能更大于遗传因素。同时，乳牙列儿童双生子的口腔菌群构成相似程度（90%）与混合牙列双生子的菌群构成相似程度（60%）不同，这与其他学者[8]的研究结果相吻合。
Corby等[9]的研究显示，遗传因素对唾液中的细菌定植有显著影响。其他学者[10]的研究也证实遗传因素对人及动物模型中唾液变异链球菌的定植及龋易感性均有明显影响。本研究结果也显示，有龋儿童及无龋儿童唾液微生物的种类有所不同，有龋儿童的唾液微生物种类减少。在同卵及异卵双生子中，均发现有较高的口腔微生物菌群相似性，而这种相似性在同卵双生子及异卵双生子之间没有发现差异。混合牙列双生子中口腔微生物的相似性低于乳牙列双生子，可以由此推测，在口腔微生物菌群构成中，环境的作用可能大于遗传的作用。
[参考文献]
[1] Peterson SN， Snesrud E， Liu J， et al. The dental plaque mi-crobiome in health and disease[J]. PLoS One， 2013， 8（3）：e58487.
[2] Hughes T， Bockmann M， Mihailidis S， et al. Genetic， epige-netic， and environmental influences on dentofacial structures and oral health： ongoing studies of Australian twins and their families[J]. Twin Res Hum Genet， 2013， 16（1）：43-51.
[3] Du Q， Zou J， Zhou Xd， et al. The genetic profiling of the oral microbiotain twins of primary dentition[J]. J Pure Appl Mi-cro， 2013， 7（3）：2043-2047.
[4] Beighton D. The complex oral microflora of high-risk indi-viduals and groups and its role in the caries process[J]. Com-munity Dent Oral Epidemiol， 2005， 33（4）：248-255.
[5] Lingstr?m P， van Ruyven FO， van Houte J， et al. The pH of dental plaque in its relation to early enamel caries and dental plaque flora in humans[J]. J Dent Res， 2000， 79（2）：770-777.
[6] Babaahmady KG， Challacombe SJ， Marsh PD， et al. Ecolo-gical study of Streptococcus mutans， Streptococcus sobrinus and Lactobacillus spp. at sub-sites from approximal dental plaque from children[J]. Caries Res， 1998， 32（1）：51-58.
篇6
【关键词】牙髓病；根尖周病；微生物检测；分子生物学
【中图分类号】R781.3
【文献标志码】A
微生物种类繁多，自然界中仅有极少数微生物得到了鉴定，能够在实验室培养的种类则更少，至多为1％。传统的牙髓感染细菌厌氧分离培养影响因素多，鉴定困难。随着分子生物学技术的发展，更多的微生物在根管中检出。16S rD-NA指纹技术、克隆文库、核酸杂交等技术的应用使人们对牙髓根尖周病微生物组成的认识更加全面，对于进一步分析其协同作用等致病机制有所帮助。
1 16S rDNA指纹技术
指纹技术都是基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）基础上的，其特异性的扩增产物代表着微生态系统中的微生物多样性。传统指纹技术有末端限制性长度多态性（terminal-restric-tion fragment length polymorphism，T-RFLP）、变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel elec-trophoresis，DGGE）和温度梯度凝胶电泳（tem-pe-rature gradient gel electrophoresis，TGGE）。传统指纹技术主要根据扩增产物不同的解链特性，使相同相对分子质量的DNA分子根据碱基组成特点得以分离，已广泛应用于微生物生态系统研究。
T-RFLP以PCR法为基础，扩增的是特定的标志基因（如16S rDNA），用荧光标志引物扩增产生的PCR产物携带荧光标签。扩增产物来源于不同细菌，它们拥有不同的限制性核酸内切酶酶切位点，水解的PCR产物则产生不同的带形和指纹图谱。能检测到先前未鉴定或未能培养的细菌，但该技术比较费时费钱，重复性较差。
2004年，Hommez等将T-RFLP法应用于感染根管细菌组成的研究中；但是没有强大的数据库支持，通用引物扩增存在偏嗜性，酶切后T-RFLP的长度分布也会低估复杂群落的多样性，这些问题使这种实验方法尚没有完全发挥其潜能。
DGGE是在聚丙烯酰胺凝胶中加入线性梯度的DNA变性剂，在不同的变性剂浓度下，DNA分子解链的程度不同，当DNA分子解链到电泳时产生的迁移阻力与电场力相平衡时，便停留在这一特定变性剂浓度的凝胶带中，从而使相同的相对分子质量的DNA分子根据碱基组成特点得以分离。Siqueira等应用DGGE方法比较了挪威及巴西慢性根尖周炎患者感染根管的细菌组成，分别检出了9.2和10.5个细菌条带，由此得出，感染细菌的组成在样本个体间差异明显，同一地区样本的细菌组成具有相似性。
单纯比较条带数及条带位置只能推导出具有相关性的结论，要明确细菌组成则需要联合应用这些检测方法。Yang等用PCR-DGGE结合克隆测序方法研究了急性根尖周脓肿的细菌组成后发现，检出频率由高到低的细菌依次是普雷沃菌、梭杆菌、消化链球菌、卟啉单胞菌、链球菌、真杆菌、乳酸杆菌、弯曲菌、螺旋体、布雷德菌。与培养法研究乳牙急性根尖周炎的根管优势菌为产黑色素普雷沃菌、微小消化链球菌的结果相似。对于难培养的牙密螺旋体和布雷德菌也有27.3％和36.4％的检出率，比以往文献的检出率大大提高，从而提示牙密螺旋体和布雷德菌可能是乳牙急性根尖周脓肿的致病菌。
利用指纹技术研究菌群组成已被证实是可行的，通过比较指纹图谱可以了解不同个体或者不同生境的菌群组成差异。
2 实时荧光定量PCR技术及属、种特异性PCR
实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、无污染、具实时性和准确性等特点，定量PCR技术在牙周致病菌检测等方面已经应用多年。
Saito等利用定量PCR技术检测了32例感染根管中牙龈卟啉单胞菌和福赛斯坦纳菌，发现其检出率分别为28％和66％，两种菌同时出现的样本比例是22％，其范围分别为5.65×10-6～1.20×10-2和5.76×10-6～1.35×10-1；由此得出牙龈卟啉单胞菌和福赛斯坦纳菌与牙髓感染时的临床症状无明显相关性。
Rocas等讨论了粪肠球菌的出现与不同类型根尖炎之间的关系，实验选择扩增特异性高的巢式PCR对样本16S rDN段进行扩增，在原发感染的50例患牙中粪肠球菌的检出为9例，阳性率为18％；而在30例无症状的已经进行根管充填但是伴有慢性根尖病损的患牙中粪肠球菌的检出率为20例，阳性率为66.7％。这个结果表明粪肠球菌在无症状的患牙中检出率高于有症状的患牙，提示粪肠球菌的存在与根尖病持续感染关系密切。
Siqueira等设计了应用特异性探针检测牙髓感染异性细菌存在的实验，分别于2001年、2003年检测到牙髓感染中的产黑色素菌、福赛斯拟杆菌、丙酸丙酸盐杆菌及伴放线放线杆菌的存在。
3 构建16S rDNA克隆文库
Schirrmeister等对于已经进行根管充填却长期伴有慢性根尖病损的患牙进行了细菌组成的鉴定后发现，在18例患牙中有10例存在复杂的微生物环境，大部分的阳性患牙由2～8个菌种混合而成，另有2例患牙只检测到粪肠球菌的存在。并首次在根管中检测到河流漫游球菌。Solobac-terium moorei和具核梭杆菌是最常见的两个菌种，在阳性的7例患牙中，有5例表现为两个菌种的出现具有相关性。另有研究发现，在出现微小微单胞菌和难见戴阿利斯特杆菌的样本中，均可以检测到Solobacterium moorei和具核梭杆菌的存在。
Subramanian等对已切除的34例持续性根尖周炎的根尖及其周围的炎症组织样本进行了实时定量PCR检测，并对其中16例进行了16S rDNA克隆测序，得出以下结论：1）切除的根尖样本中细菌的总量远远高于根尖周炎症组织中的细菌总量；2）根尖样本中含有大量尚未培养的细菌。粪肠球菌及洋葱布克菌在所有样本中占主导地位；纤细弯曲菌和格氏链球菌多见于根尖样本；牙缝奇异菌、微小消化链球菌属、链球菌属C8、小杆菌属E2_20 E1及真菌菌株A35MT多见于根尖周组织样本。
由此可见，采用构建16S rDNA克隆文库的方法所测得的菌群较为全面，敏感性和特异性均较高；但该方法工作量较大，费用高，研究样本量较少。此外，使用该方法分析环境微生物菌群还受到目前基因文库库容量的影响。Kemp等运用多种统计学方法分析比较了文献报道的225个来自多种环境的16S rDNA文库的组成，发现随着库容量的增大，菌群分类单位总是在增加，这一结果说明几乎没有哪一个文库可以完全包括样品中多样性的微生物种类；而且这种实验方法存在16S rDNA通用引物特异性较差以及PCR过程中高浓度模板竞争等问题，导致一些丰度小的菌种可能无法被检测出。
4 核酸杂交及相关技术
4.1基因芯片技术
基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交一致，利用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与半定量的分析。
Rocas等利用基因芯片技术检测持续性根尖周炎患者根管内的微生物群，选取了28种特异性探针与感染根管内细菌扩增产物进行杂交，链球菌属的检出率为47％，乳杆菌属的为35％，小类杆菌属的为29％，其中8个菌属菌量大于105，其中链球菌和齿垢密螺旋体最为常见。特异性探针扩增粪肠球菌及白色假丝酵母菌的阳性率分别为47％和6％。感染多为混合感染，即使检出粪肠球菌的存在，其也不一定是感染的优势菌。
由于采样方法可能造成细菌种类和总量的误差，Rocas等研究了已拔除的无法保留的持续性根尖周炎患牙，将牙根分切为根尖1／2和根管上段1／2，进行低温下研磨并提取总DNA进行了同样的杂交检测，实验同样选用28种特异性探针，检出率分别是：牙龈欧氏菌（76.5％）、保氏普雷沃菌（71％）、牙髓卟啉单胞菌（65％）、具核梭杆菌（53％）、福赛斯坦纳菌（47％）。其中，牙龈欧氏菌、牙髓卟啉单胞菌及痤疮丙酸杆菌在根尖区更为常见，保氏普雷沃菌、福赛斯坦纳菌和具核梭杆菌在根尖段及根管上段的检出率并无差异，而链球菌属在根管上段的检出率则较高。
DeSantis等利用含297851个16S rDNA探针的高密度芯片对3种环境样本的微生物种类进行了分析，并与传统的16S rDNA克隆测序方法进行了比较，结果表明，芯片技术虽然不能鉴定新菌种，但在分析环境样本时比克隆测序方法获得了更多的生物多样性信息。
4.2荧光原位杂交技术及流式细胞技术
荧光原位杂交技术是一种不依赖PCR的分子分析技术，它利用带荧光标记的特异性核酸探针与靶序列杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号来确定靶序列分布的方法。它结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性信息，可以在自然的微生物环境中检测鉴定微生物个体，并对微生物群落进行评价，目前已应用到肠道微生物菌群的研究中。Colombo等通过原位杂交结合激光共聚焦显微镜观察健康成人与慢性牙周炎患者牙龈上皮内细菌聚集情况，发现牙周炎患者牙龈上皮细胞内细菌聚集量显著高于健康成人；但荧光原位杂交技术存在样本自身产生荧光、探针特异性不足等缺点，所以需要结合其他分子生物学技术才能得到更多有用的信息。
流式细胞技术（flow cytometry，FCM）是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞各类性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术，可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选。
用FCM进行DNA指纹图谱分析是快速鉴别和诊断细菌的一种新方法。该法将限制性片段长度多态性分析与FCM相结合，具有快速、可靠性好等优点，利于检测新出现的未知菌。
分子生物学的实验方法将人们的视野扩展到了不可感知的领域，它的高度敏感性、特异性，操作的标准化、规范化，使人们从依靠培养进行实验的时代大大跨越了一步。人们可以检出更多种的细菌，并可以对其进行定量研究，但是在研究个别可疑致病菌的致病机制的同时，也要注重菌群之间的相互作用，以及从生态学角度分析菌群的组成，回归到它们的整体作用上来，进而全面了解疾病进程并为实施有效的干预提供帮助。
篇7
2002年召开的《生物多样性公约》第六次缔约方大会上通过的VI/7A号决定，要求各缔约方制定关于把与生物多样性相关问题纳入环境影响评估及战略环境评估立法或进程的准则[1]。2006年召开的《生物多样性公约》第八次缔约方大会上通过了“关于涵盖生物多样性各个方面的影响评估的自愿性准则”的第VIII/28号决定[2]。我国是最早签署《生物多样性公约》的国家之一，政府积极采取措施履行公约规定的义务。2003年9月1日起施行《中华人民共和国环境影响评价法》（以下简称《环评法》），首次提出对规划进行环境影响评价。要求“国务院有关部门、设区的市级以上地方人民政府及其有关部门，对其组织编制的土地利用的有关规划，区域、流域、海域的建设、开发利用规划，应当在规划编制过程中组织进行环境影响评价，编写该规划有关环境影响的篇章或者说明”；“对工业、农业、畜牧业、林业、能源、水利、交通、城市建设、旅游、自然资源开发的有关专项规划，应当在该专项规划草案上报审批前，组织进行环境影响评价，并向审批该专项规划的机关提出环境影响报告书”。这就意味着国家正式把针对规划的战略环境评价放在了重要位置[3]。2009年10月1日起施行的《规划环境影响评价条例》（以下简称《条例》），是在《环评法》的法律框架下，从规范管理的角度出发，对法律不明确之处予以明确，对法律的原则规定予以细化，通过进一步完善规划环评程序，明确实施主体，落实相关方的法律责任、权力和义务。《条例》的出台，表明国家对规划环境影响评价的执法力度将进一步加强[4]。其中直接归属农业部门的有农业、畜牧业专项规划，涉农的有土地、区域、流域、海域等有关规划。2010年9月环保部发文“中国生物多样性保护战略与行动计划（2011—2030年）”，在条目五“生物多样性保护优先领域与行动”中设立优先领域二“将生物多样性保护纳入部门和区域规划，促进持续利用”，要求“开展生物多样性影响评价试点”[5]。我国是生物多样性大国，生物多样性居世界第八位。我国又是世界上人口最多、约85%左右的人口在农村的农业大国，对生物多样性具有很强的依赖性。农业部门制定的农业规划以及其他部门制定的涉农规划，绝大部分是在农区实施的。农区是由原本丰富多样的生物地理就界开发而来，农区边际土地仍然是生物多样性相对富集的区域，农区生物多样性也是国家生物多样性的重要组成部分。开展农业规划环评生物多样性影响评价是农区生物多样性保护与管理的基础，也是环评不可缺少的内容。
2生物多样性影响评价基本内涵与主要内容
2.1基本内涵
生物多样性保护是生态和环境保护的核心内容之一，而环境影响评价是从源头保护生物多样性的重要途径。农业规划环评中生物多样性影响评价的基本内涵就是：农业规划实施对规划区域的遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性和景观多样性可能带来的影响进行分析、预测与评估，提出避免、预防或减轻不良影响的对策和措施，建立监测机制并跟踪评价，持续改进达到保护目的。
2.2主要内容
农业规划生物多样性影响评价的主要内容有4方面：
（1）分析预测规划实施可能会影响到实施区域生物多样性的哪些方面。关于生物多样性影响评价的分析尺度，目前比较公认的是遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性。随着景观生态学的发展，将景观生物多样性纳入生物多样性保护的层次；
（2）对影响可能造成的后果加以评价包括短期影响、长期影响、直接影响、间接影响、累积影响等，影响是否有利，是否可恢复等。
（3）针对生物多样性各层次的影响，需要采取哪些预防和保护措施；
（4）建立长期监测生物多样性的机制，跟踪和预测生物多样性的变化趋势。
3农业规划环境影响评价中生物多样性影响评价基本程序
根据农业规划环评中生物多样性影响评价的基本内涵，其基本程序包括规划分析、现状调查与分析、影响要素识别、影响预测与评价、预防和保护措施、监测与跟踪评价等。
3.1规划分析
规划分析首先是规划的协调性分析，规划协调性分析可以帮助了解规划政策背景[6]，分析规划与相关政策法规的一致性、与产业政策的符合性、与国家及地方有关规划的符合性，同时避免不同部门、不同层次间规划缺少衔接以及冲突[7]。包括外部协调性分析和内部协调性分析。外部协调性主要是分析规划目标的合理性与限制性，内部协调性是分析规划界定的主要内容之间是否存在冲突等。其次是分析规划的有关内容，包括规划的编制背景、规划的目标、规划的对象、规划的具体内容、实施方案、实施范围、实施期限等。第三是分析规划的不确定性[8]。各级政府和部门编制的规划其协调与衔接状况对规划的实施具有不确定性、规划本身的远期不确定性、规划的具体项目的不确定性、污染物排放量的不确定性等。
3.2现状调查与分析
根据生物多样性的层次及保护需要，调查农业规划实施区域生物多样性历史演替过程和现状。重点调查分析以下区域的生物多样性：（1）具有生态学意义的保护目标；（2）具有美学意义的保护目标；（3）具有科学文化意义的保护目标；（4）具有经济价值的保护目标；（5）重要生态功能区和具有社会安全意义的保护目标；（6）生态脆弱区；（7）人类建立的各种具有生态环境保护意义的对象等[9]。
3.3影响识别、预测与评估
生物多样性影响识别是在分析农业规划目标及总体方案的基础上，通过一定方法找出农业规划所确定的某个项目或活动对生物多样性影响的各种变化指标，说明生物多样性影响的性质、程度及可能的影响范围。影响识别主要包括以下3方面：（1）影响主体识别。识别农业规划的目标、指标和总体方案及其执行主体，主要是可能给生物多样性带来影响的农业规划活动等具体的规划实施内容以及这些规划实施内容具体的执行主体。（2）影响受体识别。识别规划区域内主要的生物多样性资源：包括遗传多样性与重要农业种质资源、物种与生境多样性、生态系统多样性，如自然保护区、风景名胜区、湿地、农田、水土流失重点治理区等的组成结构、面积和分布等；景观多样性，包括景观类型多样性、斑块多样性、景观异质性和稳定性等。特别应了解该区域农业生产活动的历史与现状、是否产生过或者现在仍然存在一些严重的生态问题，因为这些生态问题往往与生物多样性直接相关。（3）影响效应识别。识别主体（农业规划）与受体（生物多样性）的相互关系，确定农业规划对生物多样性的显著影响及关键影响因子。对生物多样性影响的强度，关注影响发生的背景。影响强度包括影响范围、影响过程和影响性质（包括有利/不利、可逆/不可逆）；影响发生的背景包括产生地点、影响时间以及受影响者的具体情况。在上述影响识别的基础上，结合规划的总体目标及在不同的阶段或期限予以实施的情况，预测规划实施的不同阶段或期限可能造成的生物多样性影响并进行评估。
3.4预防措施与保护方案
由于农业规划实施范围较大，具有宏观性，规划环境影响评价的生物多样性保护也需从大的范围和宏观上进行把握。制定具体的预防措施和保护方案，应依次按照预防措施、最小化措施、减量化措施、修复补救措施、重建措施序列原则进行[9]。物种及其生境（栖息地）是各层次生物多样性表现形式和基础，对于重要物种的保护要以就地保护为主，迁地保护为辅。物种与其生境具有不可分割的联系，保护原生境及其里面的生物资源是保护生物多样性及其资源永存的最符合自然规律的手段，也是“生态系统方法”的基本原理之一。迁地保护措施也很重要，但它是在原生境遭到严重破坏和就地保护已经不可靠的情况下的辅助手段。
3.5监测与跟踪评价
由于生物多样性影响的表现具有滞后性特点，应建立长期监测机制，对生物多样性保护目标动态变化进行跟踪监测，分析生物多样性变化的趋势，预防可能产生不良影响的因素，及时调整保护措施，确保生物多样性保护的有效性。
4农区生物多样性影响评价层次及特点
农业是一种直接利用生物多样性的产业，包括直接利用生物多样性的资源材料以及模拟生态系统的初级生产（植物种植业）和次级生产（动物养殖业）等全部生产过程；而且还包括进一步利用生态系统中的有机物腐解过程使之转化为农业经济作物（食用菌养殖、微生物造肥、生产沼气等）。考虑到农业规划主要是在农区实施，这里的农区不是仅局限于种植业区域的“小农区”，是包括农牧渔业生产活动范围的“大农区”，因此，就农区和农业而言，生物多样性可分为农区遗传多样性、农区物种及生境多样性、农区生态系统多样性、农区景观多样性、农业产业结构多样性几个尺度水平[10-11]。
4.1农区遗传多样性影响评价特点
遗传多样性是生物多样性的基本组成部分，是物种多样性和生态系统多样性的基础。它通常被认为是种内不同群体之间和一个群体内不同个体之间的遗传变异总和。遗传多样性是以物种为载体表现的，可以从形态特征、生理特征、细胞学特征、基因位点及DNA序列等不同方面来体现。农区遗传多样性影响评价应主要关注：
（1）农业活动使得生境破碎、消失引起物种种群缩小、消失导致遗传多样性丧失；
（2）外来物种入侵排挤当地种，使得遗传多样性丧失；
（3）农业新品种发展项目，对遗传多样性产生的影响；
（4）转基因作物可能引起的遗传多样性的变化及丧失[12]。由于受科学研究的限制，在现实中只对少量的物种进行过比较全面的遗传多样性研究，在遗传多样性层次评估生物多样性影响目前还不具有普遍意义。在环评工作中，建议把遗传多样性影响评价的内容与物种多样性、生态多样性影响评价融合在一起描述，更易于操作。
4.2农区物种及生境多样性影响评价特点
在我国几千年的农业栽培和养殖实践过程中，培育了大量食用与经济性能优良的作物、果树、家禽、家畜。我国栽培作物种和亚种有600多个，其中已知约237种为我国自古以来的土生栽培种，位居世界前列，被认为是世界三大农业起源中心之一。其中粮食作物30多种，蔬菜200多种，牧草与饲料作物约400多种。果树约300种，茶品种600多个，桑有15个种，共1000多个品种。家养动物品种和类群包括特种经济动物和家养昆虫在内，品种和类群有2000多个。除了农业经济物种外，在农田、湖泊与河流等湿地生态系统及荒山草坡生态系统中还有大量野生动植物物种和类群。稻田中野生动物主要以两栖类、爬行类动物和某些鸟类为主；重要杂草约有200多种。旱地生态系统中也生长着丰富的农作物伴生物种，如有记录的农田杂草有73科、560多种，对农作物有害的动物与昆虫约1300多种，天敌生物近2000种，其中仅棉田的重要天敌蜘蛛就有21科、89属、205种[11]。这些构成了我国农区物种及生境多样性。在环评实际工作中，对农业规划实施区域内的物种及生境的全部评价是不现实的，也不符合农业规划环评宏观性的特点。在满足农区生物多样性保护要求下，物种及生境多样性影响评价应针对区域关键物种及生境进行重点评价。
（1）保护物种。被国际、国家、地方、部门或保护组织明确列入保护名录的物种。主要评价保护物种分布状态、种群结构及现存数量、保护级别、濒危程度、生境特点、对环境的敏感程度、农业规划实施对保护物种的影响程度、就地保护和迁地保。护实施的可行性等；
（2）地方特有种。其分布范围狭窄、生境条件苛刻，当分布的区域环境改变，有可能造成这些物种灭绝。主要评价特有种的特有性（国际特有、国家特有、地方特有、区域特有）、濒危程度、生境特殊性、受影响程度、就地保护和迁地保护实施的难易程度等；
（3）重要的农业种质资源。是我国农业生产活动的基础，关注其受保护的状态，受影响程度，入库保存情况；
（4）栽培和家养生物的野生近缘种和野生类型。起源于我国的栽培作物不仅种类多，而且具有野生近缘种的也多，它们是农业生物多样性的宝贵遗传资源；家养生物的野生型是潜在进行品种改良的重要遗传资源。这些遗传资源的价值难以估量，在评价中应重点确认这些物种的存在、数量、生境条件、濒危程度、受影响和潜在影响程度、保护措施等；
（5）其他物种，规划实施区域受到较多关注的物种，具有文化及文物特点的物种等。
4.3农区生态系统多样性影响评价特点
我国农区生态系统按其基本类型可以分为6类：农田（水田与旱地）生态系统、种植园（水果、干果、蔬菜、茶叶、桑、药材、花卉和其他特殊经济作物）生态系统、草原与草地生态系统、水产水域生态系统（陆地水域和海洋水域，与湿地生态系统基本类同）、集约化养殖场系统和农区边际土地生态系统[11]。农业规划实施不确定性的特征，在对农区生态系统多样性影响的质（影响性质、影响类型、影响因素）和量（影响程度、时空规律、发生概率）上有更多不确定性。农区生态系统多样性影响评价主要是：
（1）生态系统类型结构和功能完整性；
（2）生态系统的脆弱性和整体变化趋势；
（3）生态系统的服务功能及生态承载力；
（4）农业规划实施可能的影响方式、范围、强度和持续时间；
（5）受影响强度、范围和持续时间，影响的结果是否有利、是否可逆；
（6）生态系统抗干扰的能力、恢复能力和生态系统的功能维系；
（7）预防与保护措施实施的可行性。
4.4农区景观多样性影响评价特点
景观多样性是继遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性被提出的生物多样性研究的第四个主要层次。这4个层次之间的关系依次为遗传多样性产生了物种的多样性，物种多样性与生境多样性构成了生态系统的多样性，多样性的生态系统聚合并相互作用又构成了景观的多样性。农区景观范围多指大农业或是整个农业区域，因此对具有战略定位的农业规划进行景观多样性影响评价是非常重要的。农业规划实施对农区景观多样性影响，主要关注（1）对景观类型多样性影响，景观类型的分布面积和空间结构等发生明显变化、影响强度、指标物种濒危程度、变化是否可恢复；（2）对景观斑块多样性影响，镶嵌地块间生境的异质性、连通性是影响生物多样性的重要因素。农区残存的非农作性生境，包括农田边际土地、岛状野生生境、灌木带、林地、水塘、沟渠、荒地和休耕地等受影响的程度，这些生境破碎化程度，影响强度是否可逆；（3）对景观格局多样性影响，地块内物种的异质性和共生性影响物种多样性丰富程度。农业活动方式变化、人为干扰强度、外源性物质流入（农用化学品等）、外源性遗传物质入侵（转基因种植、外来物种入侵等）的影响。
4.5农业产业结构多样性评价特点
农业产业结构多样性用以描述包括农、林、牧、副、渔各业的组成比例与结构变化，它反映着某一区域农业生产的总体状况，这也是农业规划中重要的篇章。应重点分析农业规划实施区域规划实施前后，农、林、牧、副、渔各业的组成比例与结构可能产生的变化，这一变化对当地生物多样性可能产生的影响，分析影响的范围、强度持续时间、是否有利、是否可逆等，重点评估当地生物多样性变化可能带来的经济价值变化。
篇8
关键词：黄瓜；轮作；大葱；土壤；连作障碍
中图分类号：S642.2 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.008
研究表明，蔬菜连作会导致生长受阻，抗病能力减弱，产品产量和品质下降[1-2]。连作土壤与轮作土壤相比，理化性质变劣[3]，酶活性降低[4]，微生物数目及种群多样性减少[5]。黄瓜是设施主栽蔬菜，连作障碍已成为制约其高产高效和可持续发展的重要因素。试验发现，大葱轮作可显著减轻黄瓜连作土壤障碍，促进生长，提高产量[6]，对此，前人从根区土壤的理化和生物学特性方面进行了探讨[6-8]。根际是植物与土壤进行物质和能量交换最剧烈的区域，根际土壤的理化和生物学特性与非根际土壤明显不同[9]。本试验以黄瓜连作土壤为对象，比较研究了大葱-黄瓜轮作和黄瓜-黄瓜连作两种栽培模式对后茬黄瓜根际土壤理化和生物学性状的影响，以期探讨大葱轮作减轻黄瓜连作障碍的机理，为制定合理栽培制度提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材 料
供试土壤取自山东省泰安市岱岳区房村镇北滕村，为连续种植15年黄瓜的日光温室耕层土壤。土壤类型为棕壤，属砂壤土，土壤理化性状为pH 值6.19，EC值 825 μS·cm-1，碱解氮238.0 mg·kg-1，有效磷151.2 mg·kg-1，速效钾131.2mg·kg-1。
供试黄瓜（Cucumis sativus L.）品种‘新津11号’，大葱（Allium fistulosum L.）品种‘元藏大葱’。
1.2 方 法
1.2.1 试验设计 试验于2011年8月—2012年6月在山东农业大学园艺试验站日光温室内进行，设2个处理：大葱-黄瓜轮作（T），黄瓜-黄瓜连作（CK）。每处理30盆，随机排放。花盆直径30 cm，高25 cm，内装连作土壤10 kg。装盆前向土壤中均匀混入复合肥（N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15）10 g，生育期不再追肥。黄瓜、大葱分期播种育苗，2011年8月29日同时定植，黄瓜每盆1株，大葱每盆5株，12月20日拉秧。
后茬于2012年4月25日全部定植黄瓜，常规方法管理，6月20日拉秧。
分别于5月15日、5月25日、6月5日取样。每处理随机取5盆，利用雷娟利等[10]方法获得根际土样，混合均匀，研磨过2 mm筛，一部分于4 ℃冰箱保存，用于土壤微生物分析；另一部分风干后过1 mm筛，用于土壤酶和理化指标分析。
1.2.2 测定方法
（1）土壤理化性状。pH值按土水比1∶5（W/V）浸提，用雷磁PHBJ-260便携式pH计测定，EC值按土水比1∶5（W/V）浸提，用雷磁DDB-303A便携式电导率仪测定；碱解氮采用碱解扩散法测定，有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定，速效钾采用醋酸铵浸提-火焰光度法测定[11]。
（2）土壤微生物数量。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基培养；放线菌采用改良高氏1号培养基培养（每1 000 mL培养基中加入3%重铬酸钾3.3 mL）；真菌采用马丁氏培养基培养（每1 000 mL培养基中加入1%孟加拉红水溶液3.3 mL，1%链霉素3 mL）。微生物数量均采用系列稀释法计数[12]。
（3） 土壤酶活性。土壤脲酶采用苯酚-次氯酸钠比色法测定；磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法测定；过氧化氢酶采用高锰酸钾滴定法测定[13]。
1.2.3 数据统计与分析 采用DPS软件对数据进行方差分析及最小显著差异性检验。
2 结果与分析
2.1 不同种植模式对黄瓜根际土壤EC值和pH值的影响
伴随生育期推进，黄瓜根际土壤EC值不断降低，生育初期轮作黄瓜的根际土壤EC值大于连作黄瓜，但定植40 d后，EC值开始低于连作黄瓜（图1）。连作和轮作黄瓜根际土壤pH值缓慢升高，轮作黄瓜上升幅度大于连作黄瓜，6月5日轮作黄瓜的根际土壤pH值高于连作黄瓜土壤。
2.2 不同种植模式对黄瓜根际土壤养分含量的影响
由图2可以看出，根际土中速效氮含量呈先升高后降低趋势，有效磷和速效钾含量则持续降低。生育初期，轮作黄瓜根际土壤中的速效氮、有效磷、速效钾含量高于连作土壤，尽管有效磷含量未达显著差异水平，说明前茬大葱吸收的养分较少。随着植株生长，轮作黄瓜根际土壤中有效磷含量迅速降低，以致低于连作土壤，速效氮与连作土壤无显著差异，速效钾含量却始终较高。
2.3 不同种植模式对黄瓜根际土壤酶活性的影响
脲酶是土壤中主要的水解酶之一，与土壤中尿素的水解密切相关，其酶促产物氨是植物氮源之一；磷酸酶可加速有机磷的脱磷速度，对土壤磷素的有效性具有重要作用，其活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标；过氧化氢酶促过氧化氢的分解，有利于防止它对生物体的毒害作用，其活性则可以反应土壤中氧化过程的强度[13]。根际土壤中3种酶活性均随黄瓜生长不断升高，但轮作黄瓜根际土壤酶活性始终高于连作土壤（图3），6月5日轮作土壤中脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶活性分别是轮作土壤的1.24，1.11，1.27倍，说明轮作有利于提高后茬黄瓜根际土壤酶活性。
2.4 不同种植模式对黄瓜根际土壤微生物群落结构的影响
从图4可以看出，随着黄瓜的生长，根际土中细菌、真菌和放线菌数目均不断增加，其中，细菌在土壤微生物群落中占绝对优势。根际土壤中细菌、放线菌和真菌数初期差异不大，后期轮作黄瓜根际土壤中细菌、放线菌数目显著高于连作黄瓜，真菌数则显著低于连作黄瓜。轮作黄瓜根际土壤中真菌数占微生物总量的比例低于连作黄瓜，6月5日土壤真菌所占比例分别为0.28%和0.54%。
3 讨 论
设施连作障碍的一个重要原因是土壤酸化、次生盐渍化和养分失衡[14]。合理轮作可以降低土壤盐分积累，在一定程度上避免次生盐渍化的发生[15]。与连作相比，轮作黄瓜的根际土壤EC值降低速度较大，最后低于连作黄瓜根际土壤，可能与轮作植株生长势较强，吸收土壤中养分较多有关。王柳[16]发现，在不施肥或只施底肥情况下，黄瓜根区土壤pH值总体呈上升趋势。本试验中，伴随黄瓜生育，连作和轮作黄瓜根际土壤pH值均呈升高趋势，可能与只施用了底肥有关。
轮作黄瓜根际土壤中速效氮、有效磷和速效钾含量前期较高，说明前茬大葱吸收养分数量少于黄瓜。伴随生育进程，黄瓜根际土壤中养分含量快速降低，轮作黄瓜根际有效磷含量低于连作黄瓜，可能因为轮作黄瓜生长旺盛，对磷的吸收较多，同时磷在土壤中移动性较差[17]有关。土壤速效氮含量先升高后降低，可能由于根系生理活动使速效氮在根际发生了富集。钦绳武等[18] 对氮素在根际迁移规律的研究中发现，氮素在旱作根际土壤中会出现富集现象。
土壤酶直接参与土壤中物质的转化及养分的释放和固定过程， 与土壤肥力状况密切相关[19]。本试验中，大葱轮作模式下土壤酶活性明显高于黄瓜连作土壤。吴焕涛等[6]也得出相似的结论。土壤酶活性升高是轮作减轻连作障碍的原因之一。
土壤微生物群落结构的多样与稳定不仅可提高土壤微生态的稳定性，也可提高土壤的缓冲能力[20]。本研究结果表明，轮作黄瓜根际土壤中可培养细菌及放线菌数目均高于连作黄瓜，可培养真菌数目则低于连作黄瓜，与杨凤娟[8]、吴凤芝[21]研究结果一致，表明轮作可以改变土壤微生物群落结构，改善土壤的微生态环境。
本试验结果表明，大葱轮作后的黄瓜根际土壤理化及生物学性状得到明显改善，可作为防控设施黄瓜连作障碍的一种有效种植模式。
参考文献：
[1] 吴凤芝，刘德，栾非时. 大棚土壤连作年限对黄瓜产量及品质的影响[J]. 东北农业大学学报，1999， 30 （3）： 245-248.
[2] 吴凤芝，刘德，王东凯，等. 大棚番茄不同连作年限对根系活力及其品质的影响[J]. 东北农业大学学报，1997，28 （1）： 33-38.
[3] 郭红伟，郭世荣，黄保健. 大棚辣椒不同连作年限土壤理化性质研究[J]. 江苏农业科学，2011， 39 （5）： 452 -455.
[4] 吴凤芝，孟立君，王学征. 设施蔬菜轮作和连作土壤酶活性的研究[J]. 植物营养与肥料学报， 2006， 12 （4）： 554-558.
[5] Yao H Y， Jiao X D， Wu F Z. Effects of continuous cucumber cropping and alternative rotations under protected cultivation on soil microbial community diversity[J]. Plant Soil， 2006， 284：195-203.
[6] 吴焕涛，魏珉，杨凤娟，等.轮作和休茬对日光温室黄瓜连作土壤的改良效果[J]. 山东农业科学， 2008（5）： 59-63.
[7] 李元，司力珊，张雪艳，等. 填闲作物对日光温室土壤环境作用效果比较研究[J]. 农业工程学报， 2008， 24 （1）： 224-229.
[8] 杨凤娟，吴焕涛，魏珉，等. 轮作与休茬对日光温室黄瓜连作土壤微生物和酶活性的影响[J]. 应用生态学报， 2009， 20 （12） ：2983-2988.
[9] Wang Z W， Shan X Q， Zhang S Z. Comparison of speciation and bioavailability of rare earth elements between wet rhizosphere soil and air-dried bulk soil[J]. Analytica Chimica Acta， 2001，1（441）：147-156.
[10] 雷娟利， 寿伟松， 董文其，等. 抗感枯萎病西瓜根际微生物比较研究[J].微生物学通报， 2008， 35（7）： 1034-1038.
[11] 鲍士旦. 土壤农化分析[M]. 北京：中国农业出版社， 2000 .
[12] 杜秉海. 微生物学实验[M]. 北京： 北京农业大学出版社， 1994.
[13] 关松荫. 土壤酶及其研究法[M]. 北京： 中国农业出版社， 1986.
[14] 吕卫光，余廷园，诸海涛，等. 黄瓜连作对土壤理化性状及生物活性的影响研究[J]. 中国生态农业学报， 2006， 14 （2）： 119-121.
[15] 吴艳飞，张雪艳，李元，等. 轮作对黄瓜连作土壤环境和产量的影响[J]. 园艺学报， 2008，35（3）：357-362.
[16] 王柳. 京郊日光温室土壤环境特征与黄瓜优质高产相关性的研究[D]. 北京：中国农业大学， 2003.
[17] Mays D A. Forage Fertilization[M]. Madison： American Society of Agronomy， Crop Science Society of America， Soil Science Society of America， 1974.
[18] 钦绳武， 刘芷宇. 土壤-根系微区养分状况的研究Ⅵ.不同形态肥料氮素在根际的迁移规律[J]. 土壤学报， 1989， 26（2）： 117-123.
[19] Diamantidis G， Effosse A， Potier P. Purification and characterization of the first bacterial laccasein the rhizospheric bacterium Azospirillum lipoferum[J]. Soil Biology and Biochemistry， 2000，32：919-927
篇9
自可持续发展理念提出以来，人们越来越重视对生态自然环境的保护。其中，林业的发展为社会经济发展提供所需要的木材。然而，由于不加节制的开采，造成对森林生态环境的破坏。为此，退耕还林政策的实施对于改善生态环境具有重要作用。本文主要研究退耕还林的基本内涵与需要遵循的原则，且深入地研究退耕还林在改善生态环境方面发挥的作用，旨在推动我国社会经济健康可持续发展。
关键词：
退耕还林；改善生态环境；作用；研究
环境是人们赖以生存的基本条件，自然环境质量的好坏，直接影响着人们的生活与经济发展质量。然而，在经济快速发展的同时，向自然界索取大量的林木资源，造成对生态环境不同程度的破坏。为此，通过采取退耕还林的政策，对我国生态环境加以改善，不仅是贯彻落实科学发展观的必然要求，更是践行可持续发展理念的重大举措。
一、退耕还林的内涵
按照我国林业局对于退耕还林所作出的定义可以得知，退耕还林的创立与实施以多个角度为出发点。就环境保护方面而言，通过退耕还林的实施，有步骤性、计划性地改善荒漠化与水土流失严重地区。在加强对自然生态环境保护的同时，更将以各个地区的特点为出发点，适当地种植多样性的植被，对于恢复原有植被以及保护生物多样性都具有重要作用。退耕还林政策实施的过程是一个兼具科学性与系统性的过程。具体表现为以下两个方面：一方面是采取有效的措施以改善存在水土流失问题的地区，相应地增加多样性植被的种植；另一方面，通过造林方式对荒漠山地加以改造。因此，退耕还林政策的实施，既可以改善生态环境，又可以推动经济发展，兼顾好经济效益与生态效益，在满足社会发展需求的同时，加强对生态自然环境的保护，是造福人类的重大举措。
二、退耕还林的原则
在实施退耕还林的过程中，应当严格地遵循以下几点原则，从而实现对生态环境的改善。第一，在改善生态环境时，应当以综合性发展目标为指导，相应地确立合理的实施目标，在推动与促进社会经济建设发展的同时，应当有效地利用好经济变化、资源变化与环境变化；第二，退耕还林政策实施过程中应坚持因地制宜原则，根据各个地区的发展条件与变化因素等，充分地考虑各地区在改善与发展过程中所形成的环境状况的差异性，相应地找出合适的解决方案。为此，相关人员在实施退耕还林之前，应当深入地分析该地区的实际情况与变化因素，合理地实施有效的对策，既要做到因地制宜，又要达到优化生态环境质量的目标；第三，重视植被的多样性，在退耕还林政策实施之前，应当确立明确的改善目标，切实做好防风固沙以及防止水土流失等工作，实现改善生态环境的目的；第四，在实施退耕还林政策时，应当充分地考虑当地的经济发展状况，正确地处理好经济效益与生态效益两者之间的关系，实现两者的相互统一；第五，在退耕还林政策实施过程中，不仅要对生态环境变化加以改善，而且应该对该地区的农业产业结构加以完善，进一步地优化农业产业结构，推动促进经济的发展。如通过挖掘区域的景观优势，大力发展特色旅游业，提升产业结构的多样性，促进生态效益与经济效益两者相互协调发展等。
三、退耕还林对改善生态环境的作用
1加强对水土流失的控制
通常情况下，在未实施退耕还林以前，多数陡坡耕地种植条件恶劣，在雨水以及地表水的冲刷作用下，极容易引发水土流失的问题，石漠化现象严重。通过对大部分陡坡耕地进行造林绿化，生态环境不断改善。新种植的地表植被通过发达的根系固定土壤，枯落物逐年累积，降低了地表水的冲刷力度，从而实现对水土流失的有效控制。
2恢复植被多样性
在实施退耕还林政策之前，地表的植被非常稀疏，植被样式以杂草与庄稼为主，种类非常单一。通过退耕还林乔-灌-草结合的多层次立体结构种植，退耕地植物种类丰富各异，不仅科学合理地实现了地表植被的多样性发展，使群落环境相对稳定，最大程度地发挥了生态效益。
3改善空气的质量
在退耕还林政策实施之后，种植了多种植物配置模式的地表植被，成片的森林减少了沙尘天气的发生，降低了危害。种类丰富的植物能够吸收大气中的二氧化碳并释放氧气，对生态系统及大气平衡有着重要的意义。林草植被达到一定面积后，对区域内小气候的影响较为显著，森林在蒸腾作用下，能够降低气温，提高地面湿度，甚至增加降雨，逐渐改善区域生态环境。
4改善土壤的性质
退耕还林实施后，地表累积逐渐增厚的枯落物层形成了天然的保护，有效地截留降雨、减少雨水对地表的侵蚀，减弱了雨水对地表的直接作用。同时枯落物经过微生物分解作用释放有机物，土壤有机质含量增加，土壤质量得到提高、土壤结构得到优化，增强了土壤抵抗冲击、侵蚀以及自我修复的能力。
5旱涝灾害的缓解
在退耕还林政策实施之前，不仅地表植被覆盖率较低，而且存在严重的水土流失问题，甚至会造成河流阻塞以及引发旱涝灾害等。在退耕还林政策实施之后，通过增加地表植被，有效地固定土壤，减少了地表径流对土壤的侵蚀，缓解江河湖库的泥沙淤积，从而实现对洪涝灾害的有效控制。同时，通过森林植被对小气候的改善，地面附近降温增湿，降低了干旱威胁程度。因此，退耕还林政策的实施，是减轻旱涝灾害的重要方式。
6提升生物的多样性
在实施退耕还林政策之前，地表植被较少，缺乏多种生物的生存空间，耕地环境中生物物种也相对单一。退耕还林实施之后，为动物的栖息和繁衍增加了更多空间的同时，也为微生物提供了就地保护的良好场所，对于保护生物的多样性、维持生态环境稳定具有重要意义。结语：综上所述，退耕还林政策的实施，在增加森林覆盖率的同时，减少水土流失，进一步地改善区域小气候，达到净化空气、改善环境的效果。因此，应当重视退耕还林政策实施，这为自然生态环境的质量提供了重要保障。
参考文献：
[1]张海涛.浅谈退耕还林对改善生态环境的作用[J].价值工程,2014,30:312-313.
[2]李智宏.退耕还林对改善生态环境的作用[J].现代园艺,2015,24:172.
[3]许宁.退耕还林对改善生态环境的作用[J].江西农业,2016,03:42.
篇10
关键词 喀斯特；贵州；白三叶；同一花序；形态多样性
中图分类号 S651 文献标识码 A 文章编号 1000-2537（2016）05-0038-06
Abstract By observing the shape index of 19 wild Trifolium repens， we compared the morphological diversity of the same inflorescence at different altitudes. Our results imply that the morphological diversity of 19 wild Trifolium repens on the same inflorescence at different altitudes has a markedly difference. The total coefficient variation of all above indices obeys the following order： leaf area>above-ground biomass>stolon length>growing point>height >leaf length>leaf width> growth habit>V shape stripe. Between different altitudes in Trifolium repens form shape in the group have difference degrees of variations. The clustering analysis found little correlation with the altitude origin.
Key words Karst region； Guizhou； Trifolium repens； the same inflorescence； morphological diversity
基因漂移、遗传漂变、遗传瓶颈、自然选择和地方适应性等因素，可以通过在不同时空尺度上的动态变化来影响并改变生物适应性和多样化的进程[1].目前，花粉污染、基因漂移等问题已经在实验中得到普遍证实，而大部分研究只是针对一些基础性工作，如花粉传播因素、基因漂移距离、杂交亲和性等[2-5].空间分离群体之间的隔离和基因流动的程度决定了遗传差异、生殖隔离和物种形成的潜在能力.遗传漂变和自然选择都会使群体之间的差异增加，而基因流的作用会使群体之间的差异减小[5].研究同一花序水平上植物形态多样性，可以减少以上因素的影响，使其表型性状与其生态适应性的研究更趋于一致.
白三叶（Trifolium repens L.）是多年生草本优质牧草，属异化授粉植物，广泛分布于世界各地，在农牧业中地位重要.贵州是中国发育最典型的喀斯特地貌之一，不仅地势起伏大、切割强、相对高度常达到300～700 m，且喀斯特广泛发育，地貌类型较复杂.其次，贵州具有高原峡谷地貌结构特征，导致水土资源分布不平衡，形成了多种特殊的生态位.白三叶在长期的演化过程中，不断向着适应其生境的方向进化.本研究收集贵州省境内19份白三叶种质为试验材料，比较其不同海拔高度居群间和同一花序水平上的多样性，为下一步选育优质高效白三叶新品种提供指导.
1 材料和方法
1.1 贵州地理与气候
试验在贵州贵阳市贵州牧草推广站温室大棚内进行，种子收集于贵州省不同海拔区域.贵州全省大部分地区气候温和，四季分明.全省平均气温的最高值出现在7月，平均22～25 ℃；最低值出现在1月，平均为4～6 ℃；年平均气温为14～19 ℃.全年极端最高气温为34.0～36.0 ℃，极端最低气温为-6.0～-9.0 ℃.常年雨量充沛，时空分布不均.全省各地多年平均年降水量大部分地区为1 100～1 300 mm，最大值接近1 600 mm，最小值约为850 mm.一年中的大多数雨量集中在夏季.全省大部分地区年日照1 200～1 600 h，气候特点是垂直方向差异较大，立体气候明显.
1.2 材料收集
2013年5～8月在全省范围内采集野生白三叶种子，有效样本19份，见表1.
1.3 栽培与观测
1.3.1 温室栽培 2014年9月20日在贵州省牧草推广站温室大棚播种.从19份材料中各选取一个果实饱满的花序，将来自同一花序的种子播入有32个小格的育苗培养盘，孔穴大小60 mm×60 mm.每小格播2粒种子，覆土1 cm，浇水.培养基质为m（石英砂）∶m（细土）∶m（腐殖质）=3∶4∶3混合而成，高压灭菌冷却后装盘.待长出小苗后留选长势较好的一株苗用于观察研究.
1.3.2 施肥和管理 每隔3个月施复合肥1次，每次施用量0.03 kg/m2，苗期施尿素1次，使用量折合0.012 kg/m2，及时除杂草，适时浇水.
1.3.3 测量指标 2015年5月1日，参照《牧草种质资源描述规范和数据标准》[6]及前人研究方法观测V型斑纹、叶面积、株高、中叶宽、中叶长、匍匐茎长度、生长点个数及地上生物量等指标.为便于分析，将非量化性状特征进行标准化赋值.海拔：1=1 000 m以下，2=1 000～1 500 m，3=1 500～2 000 m，4=2 000 m以上；有无V型斑：有斑=1，无斑=2；生长习性：1=直立生长，2=匍匐分枝生长，3=匍匐不分枝生长.
1.4 数据分析
用Excel和SPSS 16.0对试验数据进行统计，分析不同海拔高度区域白三叶种内、同一花序水平上各个性状的差异程度.各形态变异性以变异系数CV表示，CV（%）=100×S/M（S为标准差，M为平均值）.用Person相关系数分析各个性状之间的相关性，并对各个指标标准化后用算术平均法（UPGMA）聚类分析.
2 结果与分析
2.1 白三叶形态学分析
2.1.1 同一花序白三叶形态学性状差异分析 同一花序水平上和不同种群间白三叶形态存在较大差异（表2）.总变异系数大于300%的有7个居群，其中W16总变异系数最大，高达429.74%，其次是W12，W1，W9，W6，W3，W10；最小的是W7，总变异系数为236.9%.各指标总变异系数从大到小为中叶面积、地上生物量、匍匐茎长度、生长点数、株高、中叶长、中叶宽、生长习性、有无“V”斑.株高变异系数最大的是W10和W18，分别为37.93%和37.51%，W2最小，只有12.63%.地上生物量变异系数最大的是W3和W1，分别为98.48%和81.67%，W14和W7的最小，为38.31%和38.55%.匍匐茎长度的变异范围为30.95%～65.75%，变异系数最大和最小分别是W7和W3.中叶宽的变异范围主要为10.89%～32.11%，只有居群W8的变异系数高达60.61%.中叶长的变异范围为13.33%～32.77%，变异系数最大的为W16，最小为W7.中叶面积的总变异系数比其他指标大，其中W16，W12，W3和W6的变异系数均大于100%，最小的是W11，只有30.33%.生长习性的变异范围为0～35.33%，其中W14，W18和W19的变异系数均为0，即这几个居群都是匍匐分枝生长.有无“V”形斑中只有W1，W5，W11，W13和W19发生了变异，其余居群全都有“V”斑.生长点个数最大变异是W1，为64.09%，其次是W16，W9，W12和W10，最小的是W2，仅为0.75%.
2.1.2 不同海拔高度白三叶形态学数量性状分析 不同海拔区域白三叶形态形状居群间存在显著差异，见表3.总体上，随着海拔的提升，白三叶植株越来越高，生长点数越来越多，地上生物量也越来越大；而匍匐茎长度、中叶宽、中叶长和中叶面积则随着海拔的提升而增大，高于2 000 m的区域则有所减小.在低于1 000 m的区域，匍匐茎长度的变异系数最大，高达102.87%，其次是地上生物量、中叶面积，最小的是中叶宽，仅为25.49%.在1 000～1 500 m区域，变异范围为21.43%～80.46%，最大的为匍匐茎长度，其次是地上生物量、生长点个数、中叶面积，最小的是中叶宽.在1 500～2 000 m区域，变异范围是21.29%～49.62%，其中变异最大的为地上生物量，其次是中叶面积，中叶宽变异最小.在大于2 000 m的区域，匍匐茎长度的变异系数最大，为61.37%，其次是地上生物量、中叶面积、株高，最小为中叶长，仅为23.21%.
2.2 形态学形状相关性分析
白三叶的株高与地上生物量、匍匐茎长度、中叶宽、中叶长、中叶面积、生长习性及生长点数呈极显著相关性（见表4），与有无“V”形斑和海拔高度无显著相关；地上生物量与匍匐茎长度、中叶宽、中叶长、中叶面积及生长习性呈极显著相关，与海拔高度呈显著相关；匍匐茎长度与生长点数极显著相关；中叶宽与中叶长、中叶面积、生长习性及生长点数呈极显著相关；中叶长与中叶面积、生长点数及生长习性呈极显著相关；中叶面积与生长习性及生长点数极显著相关；生长习性与生长点数呈极显著相关；生长点数与海拔呈极显著相关性.即随海拔的提高，地上生物量也随之增大，生长习性有由直立生长到匍匐分枝到匍匐不分枝生长的趋势.
2.3 基于白三叶形态性状的聚类分析
根据贵州野生白三叶的形态鉴定数据进行聚类分析，在欧氏距离为14.5截距处，可将19份白三叶划分为3个聚类（图1），3个聚类性状平均值见表5.第Ⅰ类包括8份材料，平均株高最矮，地上生物量、匍匐茎长度、中叶宽、中叶长、中叶面积和生长点数的平均值最小，只有少数无“V”形斑点；第Ⅱ类包括10份材料，其生长点数最多，其余性状指标的平均值介于第Ⅰ、Ⅲ类之间，少数无“V”形斑点，大多是匍匐分枝生长；第Ⅲ类只有材料7（汇川区董公市镇，987 m）独自成一类，除匍匐茎长度最短外，生长点数介于第Ⅰ、Ⅱ类之间，全部有“V”形斑点，均匍匐分枝生长，其余形状指标的平均值均大于第Ⅰ、Ⅱ类.由此可知，聚类分组与海拔高度没有明显的关系.
3 讨论与结论
3.1 岩溶地区不同海拔野生白三叶同一花序形态多样性
种质资源是生物遗传变异和生物多样性遗传的物质基础，运用形态学标记研究植物外部形态，受基因及所处生态环境的共同影响.目前，关于开花植物花序内变异原因的研究有很多[7]，有研究证明，对不同生态环境下的同种植物的形态学研究，可以了解环境对基因表达的影响[8]，而不同海拔区域带来的环境差异会使各类昆虫的活动受到限制或促进，导致不同海拔地区访花者种类和访问比例的差异[9].在同一花序水平上研究不同海拔区域白三叶表型特征，既可以减少基因漂移、花粉污染等外部影响，还可了解由海拔带来的环境差异对其形态的影响，为下一步研究工作提供更精密的数据.本研究结果显示，贵州19份野生白三叶同一花序水平上总变异系数大于300%的有7个居群，其中W16总变异系数最大，无论是居群内还是居群间贵州白三叶形态差异都比新疆[10]白三叶的大；各指标中总变异系数为最大的是中叶面积，其次是地上生物量、匍匐茎长度、生长点数、株高，说明其可塑性较大.贵州因地势起伏较大，生境复杂，蕴藏着丰富的野生植物资源，例如钟理[11]发现贵州野生匐剪股颖各形态学性状均存在较大的变异，形态遗传变异多产生于居群内.本研究材料采集地间海拔跨度较大，小气候类型多样，生境差异明显，为适应不同的生境，白三叶在长期的进化过程中，形态性状也随之改变.
3.2 岩溶地区同一花序野生白三叶的多样性与育种
在育种工作中，借助部分表型性状及其组合，可实现对白三叶目标性状的有效选择.本研究中不同海拔区域甚至同一花序白三叶栽培群体内都存在较丰富的遗传变异，可塑性较大，可为优良类型的选择提供材料.目前，对白三叶形态农艺性状已有较多研究，但主要集中在居群间和居群内水平上[10，12-13]，在花序水平上的研究还未见报道.目前分子生物学技术已成为植物育种研究的有效工具，如李润芳[14]运用细胞学方法和SRAP分子标记技术对8种三叶草的种质资源遗传多样性进行了初步评价，张婧源[15]对来自30个国家的70份野生白三叶从表型性状、SRAP分子标记和SSR分子标记上进行了不同产地白三叶种质资源遗传多样性研究.在花序水平上研究其形态多样性，通过人工选育成的优良品种经济性状整齐、遗传基因稳定.因此，对白三叶进行优良品种选育，最终建立良种繁育体系成为获得质量稳定、可控优质白三叶的必经之路.
3.3 岩溶地区贵州野生白三叶的利用价值和开发前景
贵州地处我国云贵高原，属长江、珠江上游地区，是我国典型喀斯特区域之一，地理位置特殊，其生态环境的优劣将直接影响整个长江、珠江流域的生态环境安全.目前，对喀斯特地区生态系统植物恢复多集中在森林生态系统的恢复研究[16]，对喀斯特山地草地相关研究还比较少[17].对贵州野生白三叶种质资源进行研究，揭示喀斯特地区白三叶种质资源丰富度、多样性、蕴藏量等特征，可为喀斯特石漠化地区草地植被恢复提供支持.本研究通过统计分析白三叶同一花序水平上形态多样性，发现其可塑性较大，在育种工作中可利用差异较大的材料W16和W12作为亲本培育优质高效品种.还可利用白三叶进行矿山植被修复，有研究发现其能同时富集污染土壤中的铜、镉、铅，且富集量大[18]，是很好的矿山修复植被之一.此外，白三叶还是重要的优质豆科牧草之一，影响当地农牧业发展.因此，下一步将全面系统地调查和收集贵州、四川、广西、新疆及云南等地区野生白三叶种质资源，增加其多样性，为充分发挥白三叶资源的生态和经济效益提供支持.
参考文献：
[1]韦祖生，田益农，马崇熙. 作物基因漂移研究综述[J]. 现代农业科技， 2011（13）：13-15.
[2]牟 彤. 白三叶化学诱变后代遗传变异的研究[D].哈尔滨：东北农业大学， 2013.
[3]何 静，陈瑞祥，刘秀峰. 俄罗斯白三叶在贵州南部的引种试验初报[J]. 种子， 2013，32（3）：59-61.
[4]GUSTINE D L， HUFF D R. Genetic variation within and among white clover populations from managed permanent pastures of the Northeastern USA[J]. Crop Sci， 1999，39（2）：524-530.
[5]曲若竹，侯 林，吕红丽，等. 群体遗传结构中的基因流[J].遗传，2004，26（3）：377-382.
[6]李志勇，王宗礼，师文贵，等.牧草种质资源描述规范和数据标准[M].北京：中国农业出版社， 2005.
[7]谢田朋，杜国祯，张格非，等. 黄帚橐吾种子生产的花序位置效应及其对幼苗建植的影响[J].植物生态学报， 2010，34（4）：418-426.
[8]苗佳敏，钟金城，陈智华.披碱草属种质资源研究现状[J].草业与畜牧， 2007，27（11）：2222-2227.
[9]段元文，张挺峰，刘建全.山莨菪（茄科）的传粉生物学[J].生物多样性， 2007，15（5）：584-591.
[10]王玉祥，张 博. 新疆野生白三叶表型性状变异研究[J]. 草地学报， 2012，20（6）：1163-1168.
[11]钟 理. 贵州野生匍匐剪股颖种质资源遗传多样性及越夏生理动态研究[D].成都：四川农业大学， 2008.
[12]李 州，彭 燕，张婧源，等.白三叶种质资源形态变异与地理起源的关系[J].草业科学， 2012，29（11）：1706-1714.
[13]王建丽，申忠宝，潘多锋，等. 白三叶种质资源主要数量性状的变异与相关性研究[J]. 中国农学通报， 2012，28（26）：19-23.
[14]李润芳.三叶草的细胞学、分子标记及多倍体诱导研究[D].武汉：华中农业大学， 2007.
[15]张婧源.世界范围野生白三叶种质资源的遗传多样性研究[D].成都：四川农业大学， 2013.
[16]魏 媛，张金池，俞元春，等.贵州高原退化喀斯特森林恢复过程中土壤微生物生物量碳、微生物熵的变化[J]. 农业现代化研究， 2009，30（4）：487-490.
