细胞研究范文

导语：如何才能写好一篇细胞研究，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

1成纤维细胞的来源及其生物学特性

成纤维细胞(fibroblast)是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymalcell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。

不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位［2，3］。

成纤维细胞形态多样，常见的有梭形、大多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm(640?)周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。经检测，这两种细胞合成分泌的胶原纤维均是Ⅰ型胶原纤维，在形态和生化结构上完全相同［4,5］。

处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成纤维细胞。

2成纤维细胞在一般创伤修复中的表现

各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。以伤口愈合过程为例，成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖，并从4～5天或6天开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。在伤口愈合中，成纤维细胞主要来源于真皮层的局部成纤维细胞和未分化的间充质细胞，以及血管周围的成纤维细胞和周细胞。内脏损伤时，参与修复过程的成纤维细胞多来自间质和包膜，以及粘膜下或浆膜下层的结缔组织。有人认为创伤愈合过程中伤处聚集的大量成纤维细胞，一方面是由成纤维细胞通过分裂增殖而来，另一方面，更多地是由邻近的间充质细胞、纤维细胞和毛细血管周细胞等演变或游走到伤处。在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建。在某些病理条件下，以成纤维细胞为主要细胞成分的肉芽组织或增生组织块还可以在非骨组织内发生钙化，引起异位骨化(ectopicossification)。但对于异位骨化的参与细胞及其机制尚不十分清楚，未分化间充质细胞、成纤维细胞、内皮细胞和毛细血管周细胞等可划归为诱导性骨祖细胞的细胞都有可能参与这一过程［6，8］。

3成纤维细胞在骨创伤修复过程中的表现

最简单和常见的骨创伤即是骨折，其愈合过程须经过炎性反应、清扫、纤维骨痂和骨性骨痂4个阶段［4］。不同阶段参与的细胞主体不同。成纤维细胞从骨折第3天起就出现于骨折局部血肿中［6］，骨折后5天即在机化血肿及骨折断端的间隙及其周围大量存在，是参与纤维骨痂阶段的主要细胞成分［4，5］。在此阶段成纤维细胞一方面大量分裂增殖，一方面又合成和分泌大量Ⅰ型胶原，使肉芽组织逐步变成疏松的结缔组织，将骨断端包围起来，形成接合两骨折断端的巨大的纤维骨痂。然而，这种由无数成纤维细胞和丰富的肉芽组织为主体构成的纤维结缔组织却不会演变为在其它组织创伤修复时常见的瘢痕组织，而是通过钙盐结晶在其内部不断沉积，逐渐演变为骨性骨痂，使骨折局部的修复达到骨性愈合，恢复骨组织的结构。此时，骨折愈合部只有骨组织而不再存在成纤维细胞［4，5，9～11］。

4成纤维细胞的成骨作用

成纤维细胞在骨折愈合过程中不同于其它组织创伤修复的表现，以及在某些病理条件下可以参与异位骨化［6，7］，使人们对成纤维细胞的分化能力、钙化骨化能力以及在成骨过程中其成骨能力如何发挥、细胞演变的最终归宿如何等等问题产生了浓厚的兴趣。对成纤维细胞成骨能力的研究也正是开始于对骨折愈合过程中成纤维细胞表现的观察。

对骨折局部骨形成区的电镜观察显示，除了成骨细胞在此发挥成骨作用外，成纤维细胞确实也存在着类似的成骨表现［4，5，9～13］。例如，在其线粒体内可清晰见到钙盐颗粒，部分内质网腔内可见成熟的胶原纤维，分泌到其四周的胶原纤维内可见高密度的钙盐结晶沉积。不仅如此，成纤维细胞还能象成骨细胞一样产生基质小泡并引起小泡内的钙盐沉积。钙化的基质小泡形成丛毛球状的钙球，钙球随后合并、融合为骨组织。以上种种现象表明，成纤维细胞与成骨细胞一样具备提供钙盐沉积及骨形成所必需的条件。在从纤维性骨痂到骨性骨痂的演变过程中，成纤维细胞也随之演变为骨细胞，与成骨细胞的归宿相一致。但二者在演变过程中的表现又不尽相同，主要有以下几点可资鉴别［9，13］：①成纤维细胞及其细胞核均呈不规则的椭圆形或长方形，而成骨细胞及其细胞核则为边缘比较光整的椭圆形；②成纤维细胞均单独存在，细胞之间有众多的胶原纤维相隔，成骨细胞则以连续排列的形式出现；③成纤维细胞的细胞质内溶酶体少见，而成骨细胞的细胞质内则常有溶酶体可见；④成纤维细胞四周的骨组织都由丛毛球状钙球或针状钙盐结晶组成，成骨细胞则都有一面紧贴比较成熟与致密的骨组织；⑤成骨细胞是一个一个地被骨组织(类骨质)包围变为骨细胞，而成纤维细胞则可以是两个或两个以上同时被骨组织包围在一个陷窝内，然后再随着细胞之间基质的钙化而分隔为各占一个骨陷窝。

对成纤维细胞的成骨作用，有学者认为这是成纤维细胞的固有特性在骨折这一特定情况下得以表达的结果［9，11］。骨折局部活的和失活的骨组织及软骨组织，以及骨基质中的某些大分子都有可能诱导成纤维细胞表达其成骨作用进而演变为骨细胞［14，15］。较早在骨基质中发现的骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)即对成纤维细胞有一定的诱导作用。对骨折愈合中BMP作用的研究［16，17］，表明创伤使内源性BMP呈阶段性合成与释放，并诱导周围软组织中的间充质细胞或/和成纤维细胞等向成骨方向转化。应用PAP法发现［16］，骨折后第3、5天局部纤维肉芽组织中的成纤维细胞样间充质细胞内以及第14天新生骨小梁间纤维组织中的成纤维细胞样间充质细胞内，都与成骨细胞、软骨细胞和骨基质一样存在BMP，表明这些成纤维细胞样间充质细胞已被诱导为可合成分泌BMP、具有成骨作用的细胞。而Sampath［15］从牛骨基质中分离提纯得到的成骨素对成纤维细胞的骨诱导能力更是超过了BMP和当时已知的其它骨生长因子。

成纤维细胞在其成骨作用得以表达后，可能通过两种方式成骨：①膜内成骨；②在环绕软骨的纤维层内成骨。开始分泌胶原纤维后，参与成骨的成纤维细胞只有两个归宿［4，5，9，13］：①变性、死亡、碎裂直至消失，这种演变发生早、范围广，故从纤维性骨痂形成开始，就逐渐有基质成分发生钙化，进而转变为骨基质；②演变为骨细胞，这一过程出现较晚，并穿插在前一过程之中，故在形成骨组织的细胞成分的同时，还使丰富的纤维骨痂演变为骨性骨痂，形成骨组织。但这种由成纤维细胞演变成的骨细胞，其结局如何、其生物学特性与由成骨细胞演化而来的骨细胞是否相同仍不清楚。例如，骨细胞从骨陷窝脱离后，可恢复为功能活跃的成骨细胞，再次参与骨组织的形成；而由成纤维细胞演变成的骨细胞在脱离骨陷窝后，是成为成骨细胞还是恢复为成纤维细胞、此时是否还具备成骨作用等一系列问题尚缺乏研究。

5成纤维细胞体外培养的生物学特性［18］

成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。

成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍。通常，以酶消化法获得的成纤维细胞悬液在接种后5～10min即可见细胞以伪足初期附着，与底物形成一些接触点；然后细胞逐渐呈放射状伸展，胞体的中心部分亦随之变扁平；最快者大约在接种后30min，细胞贴附底物即较为完全，呈现成纤维细胞的形态。采用组织块法则大约在接种后2～3天［2，3］到1周左右，在接种的皮肤组织块周围长出细胞。待细胞融合成片，铺满培养容器底壁大部分时即可进行传代。一般都采用胰蛋白酶(trypsin)，将成纤维细胞从底壁消化下来后分瓶作传代培养。成纤维细胞在体外培养条件下能保持良好的分裂增殖能力。细胞分裂时变为球形；分裂后又平铺在附着物的表面成为有突起的扁平细胞。体外培养的成纤维细胞，其生命期限与物种等因素有关。例如：人胚成纤维细胞约可培养50代；恒河猴皮肤成纤维细胞能传代超过40代；鸡胚成纤维细胞则只有少数能培养30代；而小鼠成纤维细胞多数只能生长8代左右。另外，从老年个体取得的成纤维细胞的寿命要比取自年轻者短。由于在细胞传代和进行体外培养时，细胞的生物学特性会逐渐发生一些不同于体内的改变，故通常只将前10代视这正常细胞，可在此时将生长旺盛的成纤维细胞冻存起来，以备将来复苏使用，这在将培养的细胞由动物实验向人体实验过渡的过程中必须给予足够的重视。

6成纤维细胞在体外培养中的成骨作用

徐荣辉［2］等通过体外培养家兔皮肤成纤维细胞发现，经传代培养的成纤维细胞至第8天时，其细胞集落中有不透光的骨小结节形成；到37天时，小结节扩大、延伸，形成骨小梁样结构。经活体四环素标记显示，所形成的结构为新生骨组织。他们还注意到，成纤维细胞在参与骨形成的过程中并无分化为成软骨细胞或成骨细胞的明确迹象，故推测并未发生此种分化，而成纤维细胞之所以能发挥成骨作用，很可能是受某些诱导因素作用的缘故。他们认为用以培养成纤维细胞的中厚皮片中混杂存在的上皮细胞(或/与内皮细胞)，可能是诱导成纤维细胞形成骨组织的一种诱导因素。而Friedenstein［6，19］较早的实验则认为，属于诱导性骨祖细胞之一种的成纤维细胞，在上皮细胞(如膀胱上皮)或脱钙骨基质等诱导因子作用下，可以分化为成骨细胞进而形成骨组织。邓廉夫［20］等分离培养取自关节内的损伤性和晚期骨关节炎性的滑膜细胞，发现其中的成纤维细胞样细胞增殖迅速，呈束状或交叉铺展并可形成多层结构，细胞表面有其分泌物形成的不透光结节，经四环素标记、ARS(Alizarinreds)和甲苯胺蓝(Toluidineblue)染色，显示结节为新生骨组织。在缺乏常规的诱导因子——上皮细胞的作用下，取自滑膜的成纤维细胞样细胞也能发生成骨作用，他们推测是在关节损伤后或骨关节炎的发生与发展过程中，改变的关节微环境(如TNF样活性物质增多等)可能会触发滑膜的成纤维细胞与骨形成相关的多基因表达，使其向成骨型细胞分化，这样，滑膜成纤维细胞样细胞在体内时即已具备成骨性能，故在培养条件下可发挥成骨作用。Dodda［21］等的研究则指出，变性滑膜细胞多种细胞因子和生长因子的表达、关节液内多种细胞因子的出现，可能是滑膜成纤维细胞样细胞成骨表型表达的重要始动因素。这些相关的研究表明成纤维细胞成骨表型的表达可能存在着较复杂的调控机制，而其诱导因素也是多样的。

为获取大量具有成骨表型的成纤维细胞并了解其转化机制，邓廉夫［22］等将分离纯化的人皮肤成纤维细胞置于加有不同浓度EGF、IL-6、TNF-α、BMP-2的培养液中进行体外培养，采用生物化学、组织化学和电镜观察等方法检测成纤维细胞成骨性标记物的形成状况，发现TNF-α和BMP-2联合应用，可使成纤维细胞分泌碱性磷酸酶、骨钙素及胶原纤维的量增加；成纤维细胞可由梭形向圆形或多突形转化，蛋白分泌旺盛；细胞外基质中，丰富的胶原纤维定向或杂乱排列，其间散在较多的钙颗粒；细胞可重叠交织形成多层结构，其表面有分泌颗粒和钙盐结晶堆积，并不断融合扩大成骨结节，表明TNF-α和BMP-2可以诱导成纤维细胞成骨。但这种完全由成纤维细胞经诱导而形成的骨组织，在缺乏典型的成骨细胞参与下是否能在体外或植入体内后经改建成为成熟的板层骨及其改建过程如何?仍有待进一步研究。

篇2

【关键词】 肿瘤干细胞

作为神经系统常见病，人高级别胶质瘤具有极强的侵袭能力，显微镜下显示其恶性细胞大大超出经造影剂强化的影像学边界，甚至可以在瘤边界以外7cm处发现。这种生物学特征使先进的脑功能显像技术难以达到理想的敏感性和特异性，而以此为支撑手段的微创神经外科技术和三维适形放疗技术也因此失去它们在治疗其它疾病的良好疗效。新近统计结果显示，经过综合治疗间变性星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤中位生存期分别只有18个月和12个月。为提高疗效，人们对其生物学特征进行了深入研究，2003年Sing[1]从脑肿瘤组织中分离到脑肿瘤干细胞(brain tumor stem cell，BTSC)，这种新的研究视角必将对胶质瘤的治疗产生深远的影响。

1 BTSC提出的基础

BTSC的概念是在神经干细胞(neural stem cell，NSC)研究取得一定成果的基础上提出来的。长期以来，人们认为成年后中枢神经系统由成熟的终末分化细胞构成，很难或不能再进行分裂和增殖。1992年Reynolds[2]从成年小鼠纹状体中分离到能够不断增殖、具有多向分化潜能的细胞，并提出了NSC的概念，其后人们又陆续在哺乳动物及人的不同脑区体外分离到了NSC，说明成熟的中枢神经系统确实具有神经再生的潜能。

个别肿瘤干细胞的分离鉴定成功是BTSC提出的另一个前提。白血病的相关研究最先提供证据：Bonnet等[3]报道人类急性髓系白血病起源于原始造血细胞的一个异质群体，它们能在糖尿病免疫缺陷鼠（SOD/SCID鼠）中发生人类白血病，而该细胞群大部分具有与造血干细胞相同的表型，即CD34+CD38-，相反CD34+CD38+表型的白血病细胞绝大多数不能形成人类白血病。这使人联想到白血病具有类似造血干细胞的特殊群体。最早从实体瘤中分离鉴定出肿瘤干细胞的报道来自Muhammad研究小组[4]，他们从乳腺癌中分离鉴定出一类表型特异的小比例细胞群，即ESA+CD44+CD24-/lowLin-。将少至100个此类细胞注射到NOD/ SCID 小鼠皮下乳房垫上即可生成与人原发乳腺癌相似的肿瘤。这群成瘤能力极强的细胞被称为乳腺癌起始细胞。该研究还显示，成瘤细胞和非成瘤细胞的细胞周期分布相似，从形态学上也无明显差异，故肿瘤干细胞表面的分子标志对于其鉴别具有更重要的意义。

2 BTSC的鉴定

证实脑肿瘤具有干细胞的关键问题是找出特异的分子标记，并以此筛选出强致瘤能力的细胞群——肿瘤干细胞。在这方面，Singh 迈出了关键一步。他们以CD133标记分离的脑瘤病人肿瘤细胞，CD133为跨膜蛋白，定位于细胞膜及细胞浆，其表达起始于神经胚胎形成时，随着NSC分化为神经元和胶质细胞而停止表达。观察发现， CD133阳性组分在多形性胶质母细胞瘤中占19%～29%，在髓母细胞瘤中占6%～21%，而这一比例与神经球形成实验的结果具有很好的相关性。将CD133阳性球体分离成单个细胞以不同数目接种于小鼠脑内，即形成肿块并呈浸润性生长。更为特别的是，少至100个这样的细胞即可导致脑瘤形成并连续传代。免疫组化显示，CD133阳性肿瘤细胞同时表达神经前体细胞标志nestin和vimentin。该研究显示，脑肿瘤细胞中存在与正常脑组织类似的等级现象，具有干细胞特征的少数细胞是胶质瘤发展的基础，而CD133是这类细胞的有效鉴别标记。

Galli[5]以原发胶质瘤和髓母细胞瘤术后标本为研究对象，以胎儿NSC作为对照，也发现在高级别胶质瘤及髓母细胞瘤都产生了与NSC同样的神经球，其形成率在胶质瘤为0.5%～31%，在髓母细胞瘤为50%～80%。分离神经球行无血清培养，其中高级别胶质瘤经长期传代形成稳定细胞系。值得注意的是此细胞系中的单个细胞即能够形成克隆。将上述细胞系培养液中的EGF和FGF2去除，加入白血病抑制因子以诱导分化，随后的免疫组化显示细胞带有神经元和神经胶质细胞标记。可见，在高级别胶质瘤及髓母细胞瘤都存在一定比例的干细胞样肿瘤细胞，该类细胞具有很强的自我更新能力，而在分化培养条件下又显示出多向分化能力。同年Yuan[6]也报道了针对胶质母细胞进行的类似体内外实验，并得出相似的结果。

一系列实验结果表明：大部分脑肿瘤细胞失去自我更新和增殖能力，构成肿瘤的表型特征；小部分脑肿瘤细胞具备了正常NSC的自我更新、多向分化能力，而经系列传代及原位接种仍保持其生物学特性。这说明脑肿瘤中确实存干细胞，而CD133可以作为鉴定BTSC的特异分子标记。

3 BTSC的来源

目前多数肿瘤病因学理论都假设细胞分子遗传改变是肿瘤发生的原因。随着BTSC被分离鉴定和NSC研究逐渐深入，人们发现BTSC不只是在分离、扩增、分化和鉴定指标等方面与NSC类同，而且两者在发生学上可能存在渊源关系。

室管膜下区位于侧脑室外侧壁，是一层待分化细胞，即使到成年，仍持续保持神经元增殖分化的潜能，能够不断产生神经母细胞；同时形成吻侧迁移流，迁移到嗅球，替代其中不断更新的中间神经元。有人提出富集于该区的Nestin阳性细胞即NSC，而早在上世纪三四十年代，就有学者提出脑胶质瘤源于室管膜下区的胶质细胞，这使人想到脑肿瘤发生于正常的NSC。据此，Recht等[7]利用ENU(N-乙基-N-亚硝基脲)致瘤模型，并选择Nestin为标记物进行胶质瘤起源细胞的研究。结果发现，幼鼠出生后最早30d即可在室管膜下区附近的脑实质中出现单个或成团的Nestin阳性细胞；随着时间的延长，Nestin阳性细胞团逐渐增大，最终形成实体瘤，而对照组相同部位未发现Nestin阳性细胞及肿瘤发生。

其实，在更早的时间就有人证实NSC具有潜在的致瘤性。Holland等[8]将致癌基因Ras和Akt联合转入小鼠星形细胞和神经前体细胞，结果在后者成功诱发神经胶质瘤。这说明，分化终末期的星形细胞致瘤性减小，而畸变的NSC更易于发生恶变。有学者向小鼠脑内注入携带shh和c-Myc的逆转录病毒，结果在其表达的NSC上也成功诱发髓母细胞瘤[9]。

脑肿瘤源于正常的NSC另外的理论基础是两者具有共同的分化增殖调控通路，前者的发生常常与后者信号通路蛋白的异常表达有关。Shh(Sonic hedgehog)通路、PTEN(phosphotase and tensin homologue deleted on chromosome ten)基因、Wnt的下游基因β-catenin、多聚体转录因子Bmi-1等在保持NSC的自我更新能力中起重要作用。研究表明Shh信号的异常活化依次通过抑癌基因Rb失活和原癌基因n-myc激活促进易感神经祖细胞发展成髓母细胞瘤[10]；在髓母细胞瘤和其它脑肿瘤中β-catenin发生突变[11]，而Bmi-1表达增加[12]。PTEN编码一个调节NSC增殖的磷酸酶，在恶性胶质瘤中是最普遍的基因突变[13]。上述共同通路仅能说明正常干细胞和肿瘤干细胞有着不可分割的渊源关系，但不足以说明正常干细胞就是肿瘤干细胞的起源细胞，要确认肿瘤干细胞的来源还需要更多的直接证据。

近年来，由干细胞和出现一组肿瘤相关基因突变的细胞发生融合而成为肿瘤起源细胞的学说正在形成。该理论认为，在人的成神经管瘤和多形性胶质母细胞瘤的肿瘤干细胞中观察到染色体的紊乱可能是由细胞融合引起的[14]。它解释了肿瘤发生早期——并不一定要后期才出现的染色体紊乱现象，而成熟细胞也可通过细胞融合得到去分化机会并重新获得自我更新能力。总的来说，细胞融合后的去分化或转分化在肿瘤发生的起动、形成和进展期均可发生，但目前仍不清楚干细胞融合理论在肿瘤发生和发展中起到多大的作用。

4 BTSC与NSC的差异

在目前阶段，正常干细胞和肿瘤干细胞的相似性研究占主要地位，但肿瘤学家们最终的任务是确认两者的差异。Singh[1]和Galli[5]都注意到，在所有多形性胶质母细胞瘤分化培养基中一细胞同时具有神经元和胶质细胞标志，而这一现象从未在正常胎儿NSC中出现。令人感兴趣的是，这种双标记细胞在各种胶质瘤细胞中比例不同，其数量与增殖力指数具有相关性。Yuan[6]也发现，充分诱导分化从神经球分离的BTSC，然后转到NSC增殖条件下继续培养，结果这些单个细胞又能重新生成神经小球，而正常NSC则失去这样的能力。

Singh针对上述现象的解释是，肿瘤干细胞错误的分化程序被激活。Galli 对BTSC核型进行了分析，发现在各种细胞中普遍存在染色体数目和结构畸变，同时非整倍体频繁发生。而在正常NSC却不存在这种变化。特别的是，上述细胞的染色体畸变在长期培养条件下仍然保持不变。与正常细胞不同，在几乎所有的肿瘤中都发现非整倍体和染色体数目改变，近期的研究显示染色体过客蛋白的表达调节紊乱是其发生原因之一[15]。细胞恶性转化进而形成永生表型往往与端粒维持机制有关[16]，Galli的研究也显示出BTSC的端粒酶逆转录酶高度表达。总之，BTSC经诱导分化后的逆分化机制尚不明确，其可能原因是染色体不稳定及相关调节蛋白表达失调。

5 对胶质瘤治疗的启示

肿瘤干细胞学说认为肿瘤为非均质群体，其中占少数的干细胞是复发转移的根源。为此，人们对这部分细胞与临床治疗相关的生物学特性进行了深入研究。Liu有关胶质瘤病例耐药的报告显示，在含有替莫唑胺、卡铂、Vp-16和泰素的培养液中CD133阳性细胞较阴性细胞具有更高的活性。耐药基因表达分析显示，CD133阳性细胞与阴性细胞相比，耐药基因（BCRP1和MGMT）和抗凋亡基因（FLIP、Bcl-2和 Bcl-XL）均有显著性升高[17]。研究证实了BTSC对细胞毒药物具有更高的耐药性，也为脑肿瘤较差的化疗疗效提供理论依据，同时强调逆转干细胞耐药对提供脑瘤化疗疗效具有重要作用。

细胞对DNA损伤做出应答的一个重要过程是检查点活化，当细胞受到照射时检查点激酶CHK1和CHK2使关键蛋白磷酸化，从而阻止正常的细胞周期进行。受到有关间充质干细胞放射敏感性研究的启示[18]，Bao[19]以胶质瘤病人标本和人胶质瘤异种移植物为对象，检测肿瘤干细胞放射敏感性。结果显示，CD133阳性细胞较阴性细胞放射敏感性显著降低，原因是前者更早活化DNA损伤检测点，并且高效修复射线所致损伤。实验进一步采用CHK1和CHK2特异抑制剂，结果明显提高肿瘤干细胞的放射敏感性。该研究从肿瘤干细胞角度分析胶质瘤辐射耐受的产生机理，为脑瘤放疗生物靶区理论提供了有力证据。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins， BMPs)广泛分布于人体多种细胞和组织，调节细胞分裂、凋亡、迁移和分化，进而参与全身多种器官的发育和形成过程[20~23]。其基因表达异常和突变将导致胚胎死亡、组织器官发育异常。来自约翰·霍普金斯和米兰大学的科学家用骨形态发生蛋白4 (BMP4)预处理人恶性胶质瘤细胞，把这些处理细胞注射到小鼠脑内，结果未见肿瘤生长，而对照组可见大片浸润性癌肿生长。随后他们将含有缓慢释放BMP4的粒子直接送达植入恶性胶质瘤细胞的小鼠脑内，发现与对照组相比小鼠生存时间显著延长[24]。证实上述抗瘤作用源于 BMP4与肿瘤干细胞上的受体结合后激发Smad 信号通路，进而阻止后者的分裂能力。利用BTSC与干细胞的相似性，抑制其分裂增生能力，进而控制肿瘤，上述研究对脑瘤治疗具有很好的启示作用。类似的研究也见于Aguado的最新报道[25]：已知大麻可通过诱导转化细胞凋亡和抑制肿瘤血管形成产生抗胶质瘤作用，Aguado以多形性胶质瘤活检组织分离得到的细胞和具有大麻受体的U87MG、U373MG细胞为对象研究大麻的抗肿瘤干细胞作用。结果发现，大麻在体内阻止干细胞增殖、诱导分化，在体外减少神经球形成。研究显示，大麻受体激活后可改变BTSC增殖分化的基因表达，通过加速分化抑制胶质瘤形成。

BTSC理论的提出有着重要意义，使临床脑肿瘤治疗更加具有针对性的同时，也为广为关注肿瘤发生问题提供依据。另外，BTSC与NSC属性上的相似，暗示着BTSC与NSC可能存在着某种必然的联系，对BTSC的研究也必将推动对NSC的研究。

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篇3

福建医科大学学报 2010年6月 第44卷第3期王树岗等：肺癌干细胞研究进展肺癌是当前危害人类生命和健康最严重的恶性肿瘤。据报道，经手术、放化疗等治疗后5年存活率不足15%[1]。随着环境污染的日益加重，1950年代后发病率迅速上升，目前在男性恶性肿瘤中占第一位，女性的发病率也在不断增长，占恶性肿瘤的第二位[2]。肿瘤干细胞（tumor stem cell， TSC）是当前研究的热点，人们希望从肺癌干细胞的角度找到根治肺癌的途径，近年来对肺癌干细胞的研究已经取得了很大进展，笔者就肺癌干细胞的分离、鉴定方法等最新研究进展综述如下。

1 肿瘤干细胞

肿瘤发病率居高不下，但目前肿瘤治疗效果却远不能令人满意，造成这一结果的主要原因在于肿瘤的发病机理至今仍不明确。人们发现肿瘤细胞与干细胞在自我更新、信号传导、耐化疗药物等方面有许多相似之处，人们就二者之间的相似性提出了TSC学说，认为主导肿瘤发生发展、转移复发的关键细胞是TSC[3]。

TSC的最早报道见于白血病。Dick等发现大多数急性粒细胞性白血病中只有CD34+、CD38-细胞能在NOD/SCID小鼠骨髓中形成白血病细胞克隆，而CD34+、CD38+和CD34-细胞则未能形成克隆[4]。由于血液细胞起源于造血干细胞，故与其他实体组织相比具有一定的特殊性。近年来，随着干细胞表面抗原的研究发展，实体TSC的研究也取得了较大发展。

AiHajj等研究后发现，所有接种ESA+、CD44+、CD24-、Lin-乳腺癌细胞的小鼠在12周内均出现明显的肿瘤，而接种CD44-或CD24+细胞的小鼠则少有肿瘤生长。ESA+、CD44+、CD24-、Lin-细胞遂被称为乳腺癌干细胞，首次证明了在实体瘤中同样有TSC的存在[5]。Singh等报道，在脑肿瘤中分离出了TSC，但与乳腺癌干细胞不同的是，脑TSC的分离是以CD133为干细胞膜蛋白标记的[6]。2006年，O'brien等在研究结肠癌时将CD133+细胞接种于NOD/SCID鼠肾被囊中，以鉴定结肠癌起始细胞。发现CD133+结肠癌细胞可以起始肿瘤，因此认为CD133+细胞就是结肠TSC[7]。迄今为止，已成功分离并鉴定的实体TSC还包括前列腺癌、黑色素瘤及胰腺癌等[810]，肺癌TSC的研究也取得了巨大进展。其他肿瘤，如胃癌中是否存在TSC目前尚不清楚[11]。

2 肺癌干细胞

2.1 研究进展

2005年，Kim等从小鼠支气管肺泡导管连接处分离出一群Sca+CD45-Pecam-CD34+细胞，命名为支气管肺泡干细胞(bronchioalveolar stem cells， BASCS)。研究发现，BASCS在支气管、肺泡损伤和上皮细胞体内修复更新时发挥作用，当体内支气管和肺泡损伤时发生增殖；BASCS能够分化为终末细支气管上皮细胞 (Clara细胞)、I型肺泡上皮细胞(AT I细胞)和Ⅱ型肺泡上皮细胞(ATⅡ细胞)，表明其具有自我更新和多向分化潜能，故认为鼠肺末梢支气管癌的发生和BASCS有关[12]。这个结果为人肺TSC的研究提供了一个重要线索。

2006年，黄盛东等将A549单细胞悬液接种到96孔板，观察其克隆形成率、克隆形态及传代情况。结果发现，A549细胞可形成3种类型的克隆集落，其中Holoelone型占总克隆数的4%，克隆体积大，可连续传代20次以上，并可分化为其他2种类型的集落，增殖活性不随时间延长而降低，并表达Sca1+等干细胞标记[13]。2007年，Summer等利用干细胞排斥Hoechst染料的特性，并结合CD45、CD31成功从鼠的肺组织中分离出肺内源的间充质干细胞[14]。同年，Ho等对6种人肺癌细胞株的侧群（side population，SP）细胞进行了一系列实验研究，发现肺癌SP细胞较非SP细胞具有更强的致瘤性，同时人端粒末端转移酶表达增高，说明这部分SP细胞具有TSC特性。同时发现肺癌SP细胞表达乳腺癌耐药蛋白（ABCG2)等多种ATPbinding cassette（ABC）家族膜转运蛋白是其对化疗药物不敏感的主要原因[15]。2008年，国外学者从A549中分离出有干细胞特性的SP细胞，这些SP细胞在总细胞群里约占24%。在增殖实验中，发现SP和非SP细胞均可形成含SP和非SP细胞的异质细胞群落，但SP较非SP细胞增殖的速度明显提高，而且SP较非SP细胞更高表达ABCG2，有更强的抗凋亡能力，从而认为A549中的SP细胞具有干细胞特性[16]。同年，Eramo等报道了肺癌干细胞属于CD133+细胞亚群，他们发现在肺癌中存在小部分表达CD133的未分化细胞，这些CD133+细胞可在无血清培养基中以球体的形式生长，在免疫缺陷小鼠体内注射104个细胞即可很容易的使之产生与原细胞相同性质的肿瘤，认为CD133+细胞拥有TSC特性[17]。

董强刚等采用流式细胞及RTPCR技术检测肺癌细胞株中干细胞相关标志表达，并通过裸鼠移植评估其致瘤性，结果在A549和SPCA肺腺癌细胞株中发现一个新颖的癌细胞亚群，其表型特征为CD24+IGF-1R+，具有高侵袭性和高致瘤性并具有自主生长特性，能够在无血清条件下长期培养，认为其是肺腺癌干细胞[18]。2009年，Tirino等对89例非小细胞肺癌（NSCLC）患者的活体肿瘤组织进行研究，发现89例中有72%表达CD133，其平均表达值为6%，CD133+肺癌细胞在其后的实验中表现了更强的致瘤能力[19]。同年，文加斌等对NCIH446人小细胞肺癌（SCLC）细胞株的干细胞特性进行研究，结果15个单细胞克隆生长形成克隆，形态上大致分为2种克隆，实验说明人SCLC细胞株存在异质性肿瘤细胞克隆，可能来源于TSC的分化[20]。

国外的研究对象较为笼统，如Tirino对NSCLC进行了干细胞方面的研究，Eramo的研究对象包括所有肺癌，但均未针对肺腺癌、鳞癌等具体组织学分型进行细分研究[17，19]。鉴于不同肺癌类型生物学特性的巨大区别，未来还需在不同肺癌组织学分型上进行深入研究。国内对肺癌干细胞的研究虽有很大进展，但同样有其不足之处。国内研究仅停留在体外培养的肺癌细胞株水平，未对活体的新鲜肺癌细胞进行深入研究，而肺癌细胞在体内、体外环境中的生物学特性肯定是有区别的，要使肺癌干细胞理论有效指导临床工作，就必须在体内培养的肺癌细胞领域进行突破。

2.2 肺癌干细胞的分选方法

肺癌干细胞的分选主要采用两种方法，一种是应用细胞表面特异性标记进行分选，另一种是根据SP表型进行TSC的分选。

应用细胞表面特异性标记分选使用的主要仪器有两种，即荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)和磁性激活细胞分选(magnetic activated cell sorting，MACS)。FACS是利用干细胞表面一些膜蛋白，主要是一些CD抗原表达上调和下调的特点，用流式细胞仪分选干细胞，如董强刚等即是采用FACS对A549和SPCA肺腺癌细胞株进行了TSC的研究[18]。MACS则是利用未标记的CD抗原等蛋白的单克隆抗体作为第一抗体与单细胞悬液结合，再用免疫磁珠标记的第二抗体与之结合，利用这种特异性一抗、二抗标记的细胞悬液流过特制的磁场，经柱内洗脱收集干细胞。人们发现造血干细胞具有将荧光染料泵出细胞外的特性，即SP特性[21]。目前利用这一特性进行纯化已成为一种常用的分离方法。如Ho等对6种人肺癌细胞株中提取的SP细胞研究后发现其具有TSC特性[15]。SP细胞表面表达ABCG2等ABC家族膜转运蛋白，因此，同样可以应用ABCG2作为标记分选TSC。

2.3 肺癌干细胞的鉴别方法

TSC的定义是肿瘤组织中存在的极少量具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能的肿瘤细胞。目前研究认为TSC是一个功能学概念，所以其功能测定有重要意义，单纯利用TSC共有标记物得到的细胞还不能被认为是TSC，必须通过一些经典的干细胞实验进行检验。自我更新是干细胞的三大重要特性之一，是指干细胞进行细胞分裂时，其所产生的后代中至少有一个保持与亲代细胞完全相同的性状，而另一个可以定向分化增殖，即不对称性分裂方式。某些细胞如CD133+肺癌细胞能够在含多种生长因子的无血清培养基内以细胞球的方式悬浮生长，这是鉴定其是否具有自我更新能力的重要步骤，也是鉴定其是否为TSC的重要方法[17]。

致瘤能力是鉴定TSC的最重要环节，目前一般通过裸鼠致瘤实验进行检验，通常做法是将分选的细胞接种于免疫缺陷动物体内，观察其在一定时间内形成移植瘤的情况（如成瘤时间、肿瘤大小等）[22]。目前已经鉴定的TSC均进行了此实验，比如Eramo和Tirino对肺癌干细胞的研究[17，19]。分化潜能也是TSC的重要特征之一。从细胞分化角度来看，从干细胞到成熟细胞要经过全能干细胞、多能干细胞、定向祖细胞、组织特异性干细胞直至终末分化细胞。TSC分化的最终结果也至少会有一种分化细胞，实验中可通过单克隆实验进行检验，以此鉴定其干细胞特性。如黄盛东等对A549细胞株中Holoelone群落的研究[13]。

3 肺癌干细胞研究的临床意义及展望

肿瘤困扰人类的健康已有上千年的历史，其原因可能是现有的治疗主要针对肿瘤组织内的大多数细胞，并没有将那些数量很少但对肿瘤的发生发展、转移复发起决定作用的TSC杀死，即使肿瘤组织消失了，但经过一段时间后仍可以重新形成肿瘤。TSC学说是当前肿瘤研究的前沿，它为肿瘤研究开辟了一个新的视野，这将彻底的颠覆肿瘤的既往治疗策略。在未来的肿瘤治疗中，应该强调针对TSC的治疗，力求将TSC全部清除。

目前肺癌的主要治疗方法即手术加放化疗，但肺癌干细胞比普通肺癌细胞更能耐受放化疗，它的残留是肿瘤复发的根源，寻找更为有效的治疗方法已经是目前的迫切要求。随着干细胞研究技术和应用水平的不断进步，提取和纯化TSC建立细胞库已经成为可能，肺癌干细胞的研究不但有助于了解肺癌的发生发展、复发转移，同时可能对肺癌的临床诊断及治疗带来重大突破。

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篇4

关键词：台灯 模型 可变 细胞

中图分类号：J6 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）01（c）-0097-01

在现在快节奏生活中，一般台灯单一的方向照明已经无法满足人们快速转变的工作环境需求，尤其是在工作中，人们根本无法使用一般台灯照亮整个房间，而为了照亮整个房间，人们也往往需要花费更多的能源及时间。而此设计可以轻松解决此问题，实现由单一方向照明与多方向照明之间的转换，从而避免了人们因上述原因而造成的一些麻烦和能源、时间的损失。

1 功能简介

“细胞台灯”通过一个滑块与一根滑轴进行变化，这特有的机械结构能让人们轻松的实现其功能；从而达到“人们工作时呈现单一方向照明”及“人们需要时呈现多方向照明”的功能。即解决了一系列现实生活中的实际问题。

2 “细胞台灯”的主要结构及视图

如图1～4。

3 “细胞台灯”的物理原理

可变系统原理。

利用转轴组、滑块、滑轴组合成一个可升降装置，模拟了细胞收缩时的空间变化。需将转轴组固定于直线滑轴导轨的滑块上，光源则是安装在各个叶片上，作用时人为给力滑块上下运动，随之改变光的照射角度，从而达可变效果。

4 “细胞台灯”的制作方法

（1）取一根一般台灯高度的滑轴，将其固定于底座上，滑块置于滑轴上。

（2）制作上下灯片，将上下两片用转轴组连接，一端置于滑轴顶部，一端置于滑块。

（3）连接电路。

5 “细胞台灯”的使用说明

（1）安装好后，连接电源，打开开关即可使用。

（2）需获得单一向下方向照明时，可推动滑块向上，直至最顶端。

（3）需获得多方向照明时，可推动滑块向下，直至最底端。

（4）平日以普通灯具对待之。

6 相关拓展

随着我国经济的快速发展，人民生活水平的不断提高，人们对生活品质提出了更高的实用及外观要求。

在造型设计方面，此产品简介大方。当台灯处于闭合状态时，形态接近普通台灯，人们能直观的了解其功能。当台灯处于展开状态时，台灯形成一个内腔，不由让人联想起中国传统文化中的灯笼，作为拥有同样文化底蕴的我们，这将带来一丝亲切的感触，而这种感触又不失时代感。

在使用配置方面，细胞台灯是利用一般的电源供电。使用者通过简单的物理原理，解决人们日常生活中的小问题，即单一方向照明与多方向照明之间的迅速转变。其结构直接暗示功能使用，且不带有复杂的操作，是一件一切从实用主义出发的产品。

在生产成本方面，由于结构的特殊性，导致其比一般台灯成本略有增加，所以产品前期定位面向中高端消费人群。当然随着产品种类的丰富以及产量的增加，成本下降的同时将具有更大的市场竞争力，并逐步在发展中被普通民众接受。

篇5

本文就近几年国内外白细胞介素与骨髓间质干细胞分化为肝细胞的研究进展作一综述。

1 细胞移植干细胞的选择

干细胞最大的特性是可塑性大，对组织再生的肝细胞基本要求是：具有多样性，容易获得，有增殖能力，体外转化率高，可选择细胞移植治疗肝衰竭的干细胞有造血干细胞，成人肝脏干细胞和祖细胞、骨髓间充质干细胞及其他类型的细胞。

1.1造血干细胞 造血干细胞是从骨髓、脐带血、外周血中分离出来的标准的多能干细胞，具有自我更新及分化增殖的能力，但他们在体外很难增殖，并且确定此类细胞的身份和表型主要靠选择过程，但选择的标准是有争议的。

1.2成熟肝脏干细胞和祖细胞 成熟肝脏干细胞大约有四种主要类型：卵圆细胞、小肝细胞、肝上皮细胞和间质样细胞。在肝脏损伤时卵圆细胞来源于排胆汁的细胞，有两种分化潜能，即分化成肝细胞和胆管细胞，在体外能增殖，但是否起源骨髓还不清楚，同种类型在健康的肝脏能分离到。小肝细胞最先是Mitaka T在肝细胞离心方式获得的，这种细胞小，体外有增殖能力，能分化成成熟的肝细胞，肝上皮细胞是Tsao MS最先报道的，在成人的肝脏中含量高[3]，间质样细胞团也来自成人肝脏，这种细胞团能高水平的增殖，巨大的分化潜能。肝脏内的主要细胞形式为成熟的肝细胞。肝细胞是单能干细胞，对有害刺激的反应迅速[4]。成熟肝脏干细胞虽然能分化成肝细胞，但其转化具有诸多不足，如获取肝细胞难度较大、异基因肝细胞可能产生免疫排斥反应、体外培养易失去活性与功能等，因而不能成为满意的治疗细胞。

肝祖细胞在肝脏持续和严重的损伤后仅仅是边缘的扩张，无法补充成熟肝细胞的损伤。因此也难成为首选的治疗细胞。

1.3骨髓间充质干细胞 骨髓间充质干细胞是从骨髓中分离出来的[5]，也可以从其他组织中分离，如脂肪组织，胚胎，羊水，和脐带血液[6，7]。在体内，他们的功能和习性还不十分清楚[8]。在体外，间充质干细胞有高度增殖的特性，容易转染，且在体外展现巨大的分化潜能[9]。骨髓间充质干细胞来源于中胚层的成体干细胞，可以重复利用，释放多种祖细胞，然后分化为各种功能性的细胞，如肝细胞，脂肪细胞，骨细胞及内胚层来源的细胞等[10]。由于它以下的优势，骨髓间充质干细胞被认为是目前细胞治疗中的首选，第一、骨髓间充质干细胞可以辨别各种来源于中胚层的组织细胞，当组织细胞受到损伤时骨髓间充质干细胞可以自我复制用以补充细胞修复组织。第二、最新研究表明骨髓间充质干细胞用来治疗时，可分泌可溶性的细胞因子来调节机体的免疫环境。第三、骨髓间充质干细胞可调节机体内的微环境用以缓解炎症因子及肿瘤因子对机体的损伤。尽管其机制还没有完全的研究透彻，但是骨髓间充质干细胞已被用于多种疾病的治疗如肝衰竭，移植物抗宿主疾病，骨髓移植后，心血管疾病，自身免疫性疾病等[11]。近期研究发现骨髓间充质干细胞具有多向分化及自我增殖的能力，具有分化成肝细胞的潜能，在肝脏损伤修复过程中，能参与修复损伤的肝组织，在肝脏疾病的治疗中有广阔的治疗前景。而且骨髓间充质干细胞作为免疫系统的有效调节剂，与多种免疫细胞间有相互作用关系并可抑制白细胞或使之激活成特异性的抗炎因子[12]。骨髓间充质干细胞能通过旁分泌途径分泌细胞因子和生长因子，从而抑制炎症反应、细胞凋亡、肝星状细胞的激活及促进细胞外基质的降解，改善肝纤维化及促进肝细胞的再生，骨髓间充质干细胞不仅能增强肝脏再生的能力，而且还能抑制肝细胞的凋亡，修复受损肝细胞功能。其中最有利的是他们的免疫特性，即无明显免疫源性，易形成免疫耐受，这就有利于细胞移植[13]。在动物实验中，骨髓间充质干细胞通过门静脉注入，肝动脉注入，周围静脉注射、腹腔内注射或直接注入肝脏或脾脏等发现，其在不同的诱导条件下可分化为肝细胞、胆管细胞、成骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、神经细胞和心肌细胞等[14，15]。骨髓间充质干细胞可在肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子的培养基下分化成成熟肝细胞，分化率在30%～80%。从骨髓间充质干细胞培养获得的肝细胞样细胞能表现出肝细胞的功能，如产生白蛋白，储存糖元，分化尿素，吸收低浓度的脂蛋白等[16]。骨髓间充质干细胞是通过抑制细胞凋亡来促进损伤的肝细胞达到修复作用[17]。它具有免疫抑制及抗炎作用，在慢性肝损伤中是另一种改善机制，可能涉及抗炎细胞因子的分泌（例如IL-10，IL-1Ra，）或者生长因子的分泌（例如肝细胞生长因子，血管内皮生长因子或胰岛素样生长因子结合蛋白）[17]。从骨髓间质干细胞的分离，培养到形成肝细胞样细胞受到很多因素的影响，特别是受到许多细胞因子的影响，主要影响的是各个阶段获得的细胞数量，而细胞的数量对细胞移植治疗肝衰竭尤为重要。一般来说，移植数目越多，治疗肝衰竭就越易成功，相反治疗效果就越差。

1.4其他类型的细胞 最后是其它类型细胞，如胎儿干细胞是体细胞分化的模板，但他的伦理的局限性和可能发生肿瘤而限定临床应用。单核细胞、成纤维细胞是否分化成肝细胞仍在研究中[18]。

2 白细胞介素与肝细胞再生

白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用而得名。目前已经发现了29种白细胞介素，分别命名为白细胞介素1到白细胞介素29，功能复杂，形成一个网络，相互重叠，是非常重要的细胞因子家族，在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥了重要作用，此外它们还参与多种生理及病理反应。Conget等报道骨髓间充质干细胞表面有白细胞介素2、白细胞介素3及白细胞介素6及碱性成纤维细胞生长因子等多种细胞因子受体。目前研究与肝细胞有关的白介素有白介素6、白介素10。

恢复肝脏体积主要在于肝细胞的再生，研究表明肝细胞的再生受IL-6/Jak/STAT3通路的影响，在非病理及静态下肝细胞并不进行细胞的有丝分裂，在各种条件的刺激下，肝细胞能在IL-6或者TNF-α的作用下进行有丝分裂。IL-6/STAT3信号通路是由IL-6受体，Jak激酶，gp130和STAT3共同组成的，IL-6受体形成2个复杂的gp130受体，当其被IL-6识别后，马上将信号传递给肝细胞，Jak激酶主要的责任是激活gp130受体和STAT3。IL-6通过激活STAT3发送有丝分裂信号给肝细胞，并在肝细胞的再生中扮演者重要的角色。STAT3激活是肝细胞再生的促动反应，通过观察IL-6缺失型小鼠肝部分切除后30min～3h STAT3的激活过程，STAT3活化是受抑制的，因此肝细胞再生与IL-6是通过激活STAT3是密切关联的。TNF-α主要表达在库普弗细胞中，主要激活NF-kB，增加IL-6的产生，与IL-6受体结合，激活激活STAT3发送有丝分裂信号给肝细胞，促进肝细胞的再生。

研究表明，巨噬细胞激活和多种细胞因子的分泌在急性肝衰竭的发病机理中起着重要的作用，内毒素，巨噬细胞的激活和促炎细胞因子都可能诱发CD163的表达[19]。而IL-10能上调CD163在单核细胞中的表达，从而减少肝细胞炎症反应。CD163和白介素IL-10在抗炎反应扮演了一个重要的角色。有研究表明，IL-10和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）可能诱导单核细胞分化成巨噬细胞，这可能进一步上调CD163 mRNA和蛋白表达[20]。骨髓间充质干细胞可以通过调控抗炎细胞因子白细胞介素10及分泌白细胞介素1受体拮抗剂，从而减少前炎症细胞因子的产生，减轻肝脏的炎症反应。白细胞介素10可通过减少Bcl-2的表达及促进FasL和Bax的表达促进肝星状细胞的凋亡。

3 展望

近年来随着肝衰竭的发病率的增加，传统的治疗及器官的移植已经不能满足我们对疾病治疗的期望，因此干细胞的移植成为研究的热点。骨髓间充质干细胞具有低免疫源性，自我复制及能够分泌细胞因子或生长因子等多种优势，已经成为我们干细胞移植的首选治疗细胞。但是，骨髓间充质干细胞来源少，并且随着动物年龄的增长逐渐减少，而且骨髓间充质干细胞分化为肝细胞的具体机制尚不明确，因此怎样能够大量获得骨髓间充质干细胞，促进体内骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化及白细胞介素对骨髓间质干细胞分化成肝细胞样细胞的各个阶段的影响，至今还没有弄清楚。通过各种途径对肝细胞特征性蛋白的mRNA转录水平、糖原染色等来分析诱导分化的效果，了解白细胞介素对干细胞生长的可能影响，能够为干细胞移植治疗肝衰竭提供积极的指导意义。

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篇6

【关键词】肌干细胞；肌再生；肌肉修复；肌卫星细胞

【中图分类号】R285.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0141-01

肌卫星细胞Mauro[1]等于1961年首次在蛙骨骼肌中发现。肌卫星细胞是具有增殖和自我更新能力的成肌前体细胞，这种组织特异的祖细胞在出生后骨骼肌的损伤、修复和维持再生中起着重要的作用。Gussoni等[2]用Hoechest/FACS方法从骨骼肌中分离到多能干细胞，有关性质尚不清楚。这些肌源干细胞既能形成再生肌纤维，也能有效重建造血系统。肌源干细胞的这种可塑性，使有关肌卫星细胞的起源、激活与分化的分子调控机制以及肌卫星细胞的干细胞特性等方面的研究成为该领域的热门课题。

1 肌卫星细胞的起源

肌卫星细胞属于肌源性细胞谱系，起源仍不完全清楚，目前有两种假说：体节来源和内皮来源。体节来源假说来自鸡雏鹌鹑异源嵌合体实验，将鹌鹑的胚胎中胚层生肌节移植到宿主鸡的胚胎中，且被移植的鹌鹑细胞有明显的形态特征，可以观察到这些细胞从移植的中胚层生肌节迁徙到胚胎发育的肢体，并组成出生后鸡骨骼肌的肌卫星细胞群。以后，大量的研究也证明了这一假说。De Angelis等认为，卫星细胞也有可能是内皮来源的。从胚胎背侧主动脉分离到的细胞具有与肌卫星细胞相似的形态和基因表达特征，此外，将这种主动脉来源的细胞移植到新生小鼠后，发现这种细胞参与出生后肌肉的生长和再生，并可与中胚层生肌节来源的肌纤维融合。因此，他们认为肌卫星细胞可能起源于胚胎血管祖细胞。

2 肌卫星细胞的分布、形态学特征及自我更新

2.1 肌卫星细胞的分布

肌肉卫星细胞只存在于骨骼肌内，心肌和平滑肌内没有卫星细胞。骨骼肌的肌纤维分为快肌纤维和慢肌纤维，卫星细胞在这两种肌纤维内均有分布，但在慢肌纤维的卫星细胞数量要多于快肌纤维。这种不均匀分布的调节机制仍不清楚。

2.2 肌卫星细胞的形态学特征

肌肉卫星细胞是未分化的单核肌源性细胞群，在哺乳动物、爬行动物、鸟类、两栖动物的骨骼肌内都有发现。Mauro[1]等在蛙的肌肉中首先发现了卫星细胞的存在。电镜观察提示卫星细胞位于骨骼肌纤维的肌细胞膜与基底膜之间，其核较大、胞浆少、细胞器数量少。

2.3 肌肉卫星细胞的自我更新

肌肉卫星细胞具有自我更新的能力，以维持其数量的相对稳定。肌肉卫星细胞的自我更新存在两种机制：一是由于非对称性分裂所造成的；二是肌肉卫星细胞进行对称性分裂。但还无法确定自我更新的确切机制，研究提示，转录因子、Pax7或Notch/ Numb信号途径可能参与其中。

3 肌卫星细胞在骨骼肌组织创伤修复过程中的重要作用

正常肌肉创伤后的修复主要靠肌卫星细胞增殖分化完成。骨骼肌卫星细胞属于组织干细胞，起源于胚胎中胚层，具有增殖分化潜力，正常处于静止状态，呈小圆球形存在于肌细胞基底膜与肌膜之间，因此有人也把它称为静止的肌干细胞。当肌肉受到创伤等刺激条件时，肌卫星细胞被激活进入有丝分裂循环，及时提供肌肉修复的成肌细胞。

不论损伤形式如何，骨骼肌的再生过程大致相同。创伤研究发现，创伤后首先是受损肌纤维出现不同程度坏死，然后在受累区域出现巨噬细胞清除坏死肌纤维，但保留坏死肌纤维周围的基底膜，就像许多中空“管道”样的支架。肌组织受创后约3～12h，肌卫星细胞即有骨骼肌调节因子MyoD/Myf5的表达，此时肌卫星细胞被激活，在伤后1周内迅速分裂、增殖，数量达到高峰，之后仍维持一定的分裂能力，但数量却逐渐减少。减少的卫星细胞沿着残留的基底膜在原肌纤维（已被清除） 部位相互融合，成为肌小管。肌小管不断接受新生的肌卫星细胞，相邻肌小管互相融合而逐渐长大，同时肌小管能合成肌原纤维，这就是幼稚的肌纤维。在局部微环境调节下，幼稚肌纤维逐渐成熟，修复损伤肌组织。

可见，受损骨骼肌再生主要取决于3个方面：（1）基底膜的完整性；（2）受损肌肉的血供重建；（3）受损肌肉的神经支配。其中最为重要的在于卫星细胞被激活，以及激活的卫星细胞在短时间内迅速大量分裂增殖的能力。目前研究的重点之一是该环节中各细胞因子的作用。

4 肌卫星细胞的标志物

自从成体骨骼肌中发现卫星细胞以来，主要利用转基因芯片和基因敲除的方法来研究肌肉损伤修复过程中起重要作用的细胞的分子标记。可作为成体骨骼肌卫星细胞标记的有细胞表面受体，黏着蛋白，生长因子和转录因子等。

4.1 细胞表面受体

c-Met是肝细胞生长因子（HGF）的受体，属多功能细胞因子酪氨酸激酶受体。来源于间质细胞的肝细胞生长因子通过与受体结合，能促进肿瘤及新生血管生成，在肿瘤细胞转移或直接浸润周围组织及肿瘤血管生成过程中发挥重要作用。酪氨酸激酶受体在体节的生肌节和神经脊衍生物的发育期间都有广泛的表达，并集中在成人骨骼肌静止期的卫星细胞群上。假定前体从体节中迁移失败，胚胎就会因缺乏c-Met而死亡并伴有肢带肌组织的缺失。迄今为止，应用原位杂交和RT-PCR 等分子生物学方法研究发现，在肺癌和乳腺癌组织中，c-MetmRNA及蛋白呈高表达，在肌肉损伤组织表达的研究少见报道。

4.2 M钙黏蛋白15

M钙黏蛋白15是一种钙依赖型细胞黏着分子，在静止期卫星细胞的亚群表达，而且在激活的卫星细胞内明显增加。Cdh15可能是对卫星细胞的定位起锚定作用和（或）促进卫星细胞向受伤区域移行修复。当小鼠缺乏M钙黏蛋白时，肌肉的发育和再生仍是正常的，有可能是因为其他的钙黏蛋白替代了M钙黏蛋白的缺失，说明了这些黏着因子在功能上的重复。其他用于肌肉卫星细胞标记的整联蛋白和黏着蛋白包括VCAM-1（血管细胞黏附分子-1）和NCAM（神经细胞黏着因子）。

4.3 生长因子

肝细胞生长因子或者分散因子是在骨骼肌细胞外基质的分子量为90Kd的蛋白，由于机械性的牵拉或者损伤而释放增加。有活性的肝细胞生长因子是c-Met（肝细胞生长因子受体）的配体，是一种在卫星细胞群中通过有效的转导p38 MAPK和PI3K信号通路促进细胞周期（从G0静止状态到G1）兴奋折返的活化剂。关于一氧化氮（NO）介导的HGF的释放即在没有卫星细胞的情况下NO和HGF是否参与肌肉的再生仍然是需要解决的问题。

4.4 转录因子

Foxk1转录因子控制级联最终调节细胞群落。Foxkl是叉头/ 翼状螺旋转录因子家族的一员，表达于胚胎晚期、出生后和成熟肌肉内的静止和增殖期卫星细胞群。Foxk1也是肌肉卫星细胞中p21CIP（周期素依赖性蛋白激酶抑制因子） 的逆行调节因子。Foxk1缺陷小鼠发育迟缓并且因为卫星细胞数量的下降和细胞周期动力学的损害引起骨骼肌再生功能严重受损。

Budkingham实验室使用绿色荧光蛋白（GFP） 受体定位了Pax3基因座。这个模型揭示了Pax3和Pax7在胚胎发育期共同表达于大部分成肌节细胞（>87%），对成肌节细胞的增殖发挥重要作用。Pax7突变小鼠可以有正常的肌肉发育，并且最初可以有整个卫星细胞群落，但在出生后却无法维持，有严重的肌肉再生能力损害，说明Pax7在卫星细胞维持方面（或者作为抗凋亡因子）的作用。

5 肌卫星细胞在生物治疗和组织工程中的应用

5.1 应用于遗传性肌病的基因治疗

肌卫星细胞移植较早用于某些遗传性肌病的基因治疗，如杜兴肌营养不良症（DMD），患者肌细胞缺少编码dystrophin蛋白的基因，细胞膜不稳定，最终导致肌纤维坏死，患者常死于呼吸衰竭。目前在肌营养不良对应的动物模型小鼠上进行了大量的肌卫星细胞移植治疗肌营养不良症的动物实验，结果表明，将正常肌卫星细胞移植到MDX小鼠的骨骼肌肉组织后，能与宿主（MDX小鼠）的肌纤维融合，形成杂交肌纤维。dystrophin特异性免疫组织化学染色结果说明，正常肌卫星细胞能与MDX小鼠的肌纤维融合并表达其基因产物dystrophin。

5.2 应用于创伤修复和组织工程

肌卫星细胞是哺乳动物体内唯一能大量分裂、增殖及迁移的肌组织前体细胞，具有与宿主肌纤维融合的能力，可作为一种有效载体广泛用于目的基因的转移。目前已经通过基因工程获得能表达人类Ⅸ因子、红细胞生成素（EPO）及克隆形成刺激因子（CSF21） 等基因产物的肌卫星细胞株。将这些基因工程化的肌卫星细胞移植到相对应疾病的动物模型后，均能在受者的外周血中测得相应的基因产物。

6 展望

尽管对肌卫星细胞的研究已有近半个世纪，且大量研究也揭示了肌卫星细胞在骨骼肌生长、修复和再生中的重要作用，但肌卫星细胞从静止到激活、增殖直到终末分化状态的基因表达特性及其分子调控机理还不甚明了。此外，有关肌卫星细胞的起源和是否是多能干细胞等问题也需要进一步证明。这些问题的解决对包括DMD肌萎缩症和帕金森病在内的多种临床退行性疾病的治疗具有重要的价值。

参考文献：

篇7

1.1一般资料2008年9月~2010年3月在我院妇科门诊就诊的13150例宫颈疾病患者,年龄18~70岁,中位年龄35岁,来自柳州市及郊区各县。患者大多未做过细胞学检查,包括宫颈炎症、宫颈糜烂、宫颈赘生物、阴道不规则流血等,无宫颈椎切和子宫切除史。

1.2标本采集及处理:用宫颈刷收集宫颈及颈管细胞,将收集的细胞洗入细胞保存液中,经美国Cy-tyc公司液基细胞处理器程序化处理制成直径2cm的薄层细胞片,95%酒精固定,巴氏染色。

1.3细胞学分析方法:采用TBS(2001版)诊断标准[1],即:未见上皮内病变或恶性病变(NILM)、意义不明的不典型鳞状细胞(ASC-US)、不典型鳞状上皮细胞不除外高级病变(ASC-H)、低级别鳞状上皮内病变(LSIL,包括HPV感染),高级别鳞状上皮内病变(HSIL)、鳞状细胞癌(SCC)、意义不明的不典型腺细胞(AGC)和腺癌(AC)。

1.4阴道镜检查及活检:对细胞学阳性及临床怀疑宫颈病变的阴性患者共3185例行阴道镜检下多点取材活检术;将活检结果按年龄段分析,即≤29岁组、30~39岁组、40~49岁组、≥50岁组,差异性分析用?2检验,显著性差异界限为P<0.05。

2结果

2.1细胞学结果13150例TCT筛查:未见上皮内病变或恶性病变(NILM)12219例(92.92%)、LSIL(包括HPV感染)240例(1.83%)、HSIL96例(0.73%)、SCC9例(0.06%)、AC4例(0.03%)、ASC-US508例(3.86%)、ASC-H74例(0.06%);微生物感染项中,HPV感染121例(0.92%)、滴虫感染59例(0.45%)、真菌感染232例(1.76%)、线索细胞>20%,提示细菌性阴道病(BV)457例(3.48%)、疱疹病毒感染5例(0.00%)。

2.2SIL的年龄分布筛查发现40岁以下年龄组发病率高于40岁以上年龄组;30~39岁年龄段宫颈上皮内病变的发生率高于其它年龄段,显著性差异有统计学意义(P<0.001)。

2.3组织学对照在活检确诊240例LSIL、96例HSIL、9例SCC及4例AC标本中,TCT阳性305例,敏感性为87.39%;活检2836例阴性者中,TCT阴性2695例,特异性是95.03%。细胞学跟组织学符合率分别为:LSIL84.17%(202/240);HSIL93.75%(90/96);SCC100%(9/9);AC100%(4/4)。

3讨论

3.1近年来,我国宫颈癌的发生有明显上升和年轻化趋势,发病以每年2%~3%的速度增长。宫颈癌是一种感染性疾病(HPV感染),是可预防、可治愈的疾病。据报道,宫颈浸润性癌5年生存率为67%;早期癌为90%;原位癌即CINⅢ为100%。因此对宫颈CIN和早期癌的及时高效筛查和正确处理是防治宫颈癌的关键。本次13150例TCT筛查SIL以上级别病变病例349例(2.65%),对照活检,TCT检测的敏感性为87.39%、特异性是95.03%。SIL检出率跟国内崔彬[2]等用TCT检测4000例(SIL以上病变检出率2.21%)相接近;敏感性较王荣妹[3]等报道的稍偏高,表明TCT的推广应用,提高了筛查的敏感性和特异性,降低了假阴性和假阳性,有助于预防宫颈病变的发病率和降低宫颈癌的死亡率,这亦是防治宫颈癌的关键所在。

3.2本研究发现40岁以下年龄组发病率高于40岁以上年龄组;30~39岁年龄段SIL的发生率高于其它年龄组(P<0.001),与文献报道相同,提示宫颈癌有年轻化趋势[4],也说明了宫颈上皮内病变与生育年龄段妇女有密切关系,提示该年龄段妇女定期进行宫颈细胞学筛查的必要性。

篇8

【关键词】 天然脑活素； 人胚肺成纤维细胞；增殖活度；复制性衰老；延缓

〔Abstract〕

Objective

To explore the effects of Natural Cerebrolysin on cell proliferation activity and replicative senescence of human embryonic lung diploid fibroblasts (MRC-5 cells) and its mechanism. Methods

To observe the changes of senescent phenotype by light microscope， count the passage ages and velocity， detect the potential of cell proliferation by MTT. The changes of cells senescence of Natural Cerebrolysin-effected MRC-5 cells were studied by X-Gal staining method， and the positivecell rates of senescence cells were detected and analyzed.． Results

Natural Cerebrolysin maintainedunaltered cell morphology and increased life span of MRC-5 by at least 18-21 passages. Comparing withthe control senium cells， the proliferation potential of MRC-5 cells incubated with Natural Cerebrolysin was increased obviously (P < 0.05)， and the passage velocity was enhanced double of that of the controlsenium cells (P < 0.01). In addition， the positive cell rate of senescence cells was significantly lower in late passage cells in sequenced multigeneration culture in Natural Cerebrolysin than those of control senium cells (P < 0.01)， and similar to those of young cells.

Conclusion

As a result， we concluded that Natural Cerebrolysin could notably promote the proliferation activity of MRC-5 cells and delay the cells replicative senescence efficiently.

〔Key Words〕

Natural Cerebrolysin; Human embryonic lung diploid fibroblasts; Proliferation activity; Delay; Replicative senescence

衰老（senescence）是细胞的重要生命现象之一，绝大多数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力，当其经过一定的倍增之后，将进入终末增殖状态，称为细胞衰老。一般来讲，人类胚胎的成纤维细胞在达到衰老时，能够复制 50 代左右（Population Doublings， Pds），由于这种衰老是由分裂传代而达到的，故又称之为复制性衰老（replicative senescence）[1]。探讨细胞衰老的分子机理是人类认识自我研究的重要组成部分，从分子水平研究衰老过程中基因及调控变化，已成为目前衰老机理研究的主要方向，同时研究开发延缓衰老的药物将为提高人类生存质量提供重要保证，也为衰老相关疾病的防治提供理论基础和实验依据。

天然脑活素为结合临床经验和现代药效学正交实验优化筛选而成，本研究在以往基础上以人胚肺二倍体成纤维细胞（MRC-5）为研究对象，观察了天然脑活素对 MRC-5 细胞表型、细胞代龄、传代速度、细胞生长增殖能力及衰老相关指标的影响，旨在探讨其延缓 MRC-5 细胞复制性衰老的作用及其机理。

1

材料与方法

1.1

材料

1.1.1

细胞株与动物

MRC-5 细胞是人胚肺成纤维细胞，由美国 ATCC 细胞库提供（ATCC No: CCL-171），并规定 28 代及以下为年轻细胞，50 代及以上为老年细胞，采用含 10% 胎牛血清（FBS）的 EMEM 培养液培养。

新西兰家兔，雄性，体重（1.5±0.2）kg，购自广东省医学实验动物中心，经 1 周的适应性饲养之后进行实验。

1.1.2

药品及试剂

研究用药天然脑活素由深圳市中西医结合临床研究所进行生药鉴定并由西安杨森制药厂制备成临床安全级粉剂，纯度为 98%。

胎牛血清、EMEM 培养基购自美国 Gibco 公司。MTT 购自 Sigma 公司。β- 半乳糖苷酶细胞化学染色试剂盒购自美国 KPL 公司。其他试剂均为国产分析纯级。

1.1.3

主要仪器

BIO-RAD 680 型酶联免疫检测仪（USA），Leica DM16000B 型图象分析系统（Germany），SANYO MCO-15AC 型二氧化碳培养箱（Japan）。

1.2

方法

1.2.1

实验分组

共分 5 组，年轻对照组；空白老龄对照组；天然脑活素低剂量组；天然脑活素中剂量组；天然脑活素高剂量组，年轻对照组和空白老龄对照组以含 10% 正常空白血清的 EMEM 培养，天然脑活素低、中、高剂量组分别以含 2.5%、5%、10% 天然脑活素含药血清的 EMEM 培养液培养，血清含量不足 10% 的用正常空白血清补充。

1.2.2

实验含药血清的制备

含药血清的制备：将雄性新西兰家兔随机分为天然脑活素灌胃组、空白对照灌胃组，每组 6 只，根据成人治疗量换算为家兔用量灌胃。每个家兔每天灌药量相当于上述配成的成药液 2~3 mL 。连续灌胃 1 个月，末次给药后 2 h 内后行颈动脉采血，离心分离血清，无菌过滤，56℃ 灭活补体，即为含药血清，10 mL分装后 -70℃保存备用。正常对照空白血清的制取是在灌胃相同体积的生理盐水及相同的时间后，用同样方式提取分离保存。

1.2.3

细胞培养

人胚肺二倍体成纤维细胞 MRC-5 采用加入双抗的含 10% 胎牛血清（FBS）的 EMEM 培养液培养，在饱和湿度、37℃ 、5% CO2 常规培养条件下培养，当细胞融合度约 90% 时，按照 1:3 或 1:4 传代。

1.2.4

细胞计数和细胞形态学检查

从第 30 代起，天然脑活素低、中、高剂量组、及空白老龄对照组细胞分别以含 2.5%、5%、10% 天然脑活素含药血清及 10% 正常空白血清 EMEM 培养液代替含 10% FBS 的 EMEM 培养液继续培养传代。光镜下跟踪观察细胞形态大小、胞浆折光性、浆内颗粒大小和密度以及细胞排列情况。

细胞总传代次数按 ∑log 2（ D/Do/R）计算，D、Do 分别为收获和接种时的细胞密度，R 为细胞贴壁率； 细胞平均传代速度按公式（传代次数-28）/周数计算，细胞传代后如 3 周内不能融合，定义为细胞复制性衰老终末。

1.2.5

细胞增殖活度的检测——MTT 法测定

将第 52 代 MRC-5 细胞以每孔 1.0×104/mL 的密度接种于 96 孔板，200 L / 孔，常规培养 20 h，待细胞贴壁后，更换不同含药血清培养液 200 L / 孔，分别于培养 48 h 后，加 入 0.5% MTT 溶液 50 L，置 37℃ ，5 % CO2 条件下 4 h，出现蓝色结晶后，弃上清，PBS 洗 1~2 次，加入 DMSO 150 L / 孔，室温轻柔震摇 2~3 min 以充分溶解结晶，用酶标仪于 490 nm 测 A（OD） 值。

1.2.6

衰老细胞数的检测

将各组 MRC-5 细胞接种于盖玻片上，经干预处理后，PBS 洗 1 次，用 40 g/L 多聚醛固定细胞 45 min，用 X - 半乳糖苷酶（X-Gal）染液（含 20 mmol/L X-gal、40 mmol/L 醋酸-磷酸钠（pH 6.0）、5 mmol/L 铁氰化钾、5 mmol/L 亚铁氰化钾、150 mmol/L 氯化钠、2 mmol/L 氯化镁），37℃ 保温 4~8 h，然后用双蒸水冲洗 2 次，再固定 4 min（固定液：体积分数为 70% 乙醇、福尔马林、冰醋酸按 20:2:1 比例混合），流水轻轻冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。细胞胞浆染成青绿色的为衰老的阳性细胞，每张片子镜下计数 400 个细胞，确定 X-Gal 染色阳性衰老细胞数的百分比。

1.3

统计学处理

实验结果以数据和图表表示，测定值以均数±标准差（x±s）表示，采用 SPSS 8.0 软件包分析，两组比较采用 student t 检验，多组间均数比较用单因素方差分析，以 P < 0.0 5 为存在统计学显著性差异。

2

结

果

2.1

天然脑活素对细胞表型的影响

由图 1 可见，年轻组细胞呈梭性或长梭形，核仁清晰，胞浆折光性强，细胞融合速度快，细胞排列整齐有序；复制性衰老细胞形态变异，胞体扁平宽大不规则，核仁不明显，细胞排列凌乱无序，胞浆内颗粒累积，出现空泡，细胞融合速度减慢；天然脑活素处理组细胞老龄化程度不明显，细胞形态变化不大，而与年轻细胞相似。将已经出现衰老表型的老龄细胞转入含天然脑活素的 EMEM 中继续培养 24~72 h，细胞的衰老表型出现一定程度的改善，但未见完全逆转。

2.2

天然脑活素对 MRC-5 细胞代龄和传代速度的影响

含天然脑活素血清的培养基连续培养 MRC-5 细胞，与用含同体积空白对照血清的培养基培养的 MRC-5 细胞进行对比，结果发现天然脑活素低、中、高剂量组细胞的代龄显著高于空白老龄对照组细胞。天然脑活素培养的细胞传代速度亦明显快于老龄对照细胞（见表 1）。

2.3

天然脑活素对细胞增殖活度（MTT 值）的影响

分别用空白对照血清和天然脑活素血清培养第 50 代 MRC-5 细胞 48 h 后，应用 MTT 法检测细胞的增殖能力。结果发现天然脑活素培养的细胞增殖活度明显高于空白老龄对照组细胞（P < 0.05），且随浓度增加而升高；与年轻细胞无显著性差异（P > 0.05） 。 提示，天然脑活素可促进 MRC-5 细胞的生长增殖（见表 2）。

2.4

天然脑活素对 MRC-5 细胞衰老细胞数目的影响

天然脑活素作用于衰老成纤维细胞一定时间，固定后用 X-gal 染色检测其 β- 半乳糖苷酶活性。 SA-β- 半乳糖苷酶染色阳性细胞的胞浆染为青绿色，空白老龄对照组细胞 SA-β- 半乳糖苷酶染色阳性细胞数远远高于年轻组细胞，而天然脑活素处理细胞组阳性细胞数较空白老龄对照组显著降低（P < 0.01），见表 2。提示，天然脑活素可下调 MRC-5 细胞 SA-β-半乳糖苷酶的表达，抑制细胞衰老，延长细胞寿命。

3

讨

论

绝大多数正常人类细胞在体外组织培养的序列传代过程中，逐渐丧失其增殖传代的能力，最终达到一种不可逆的增殖停滞状态，并可保持代谢活力的稳定，能够维持数月甚至数年。这种似乎是无限期的增殖停滞状态被命名为衰老（senescence），而细胞达到衰老状态时的传代次数称为寿限[1，2]。衰老是由细胞所经历的传代次数决定的，而与时间无关。体外细胞的衰老与体内组织的衰老有直接的相关性[3，4]

人二倍体成纤维细胞（human diploid fibroblasts， HDFs）一般没有端粒酶活性，所以当端粒 DNA 长度丢失达到临界长度时，染色体变形急剧增加，染色体间发生融合， 细胞不再增殖，从而导致细胞衰老、死亡[5]，故常常被作为衰老研究的理想模型。衰老细胞除了不能复制传代之外，还表现出一系列生理学、形态学和多种分子生物学的改变，如形态大小不规则，胞浆内颗粒性物质累积，细胞排列散乱，培养基中多见细胞碎片，细胞失去融合能力、缝隙连接减少等[6-8]。

笔者以在体外只能进行有限次数分裂的人胚肺成纤维细胞（MRC-5）制备复制性衰老细胞模型，研究天然脑活素延缓衰老的作用及机理。实验发现，天然脑活素培养的细胞在老年阶段未见上述衰老表型，将已出现衰老样改变的细胞转入天然脑活素培养基中继续培养，细胞的衰老表型出现一定程度的改善，但尚未见完全逆转，上述结果提示：天然脑活素能够维持 MRC-5 的非衰老表型。

细胞寿命常以体外培养时细胞传代次数表示。本研究结果显示，低剂量、中剂量、高剂量天然脑活素的 EMEM 培养的 MRC-5 细胞平均传代次数，显著高于老龄对照细胞；天然脑活素培养的 MRC-5 细胞传代速度也快于老龄对照细胞。提示天然脑活素可显著增加细胞寿命，其可能促进了细胞的增殖速度，这一结论被 MTT 实验进一步证实。

天然脑活素作用于正常衰老型成纤维细胞，通过测定衰老细胞的百分比，与老龄对照组细胞相比衰老细胞数目明显减少，衰老细胞百分比显著降低，提示天然脑活素可延缓衰老细胞的群体死亡的发生，从而延长细胞的体外寿命。

总之，本研究通过对细胞形态学、细胞寿命、细胞增殖活度、衰老细胞百分比等指标的研究，初步证实天然脑活素可通过促进细胞增殖速度，进而延缓 MRC-5 细胞的复制性衰老，为中药延缓衰老开辟了新的研究途径。关于天然脑活素对端粒酶活性、细胞端区缩短速率、基因损伤与修复能力以及衰老主导基因的表达的影响，本室正在进一步研究中。

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1.1参加培训人员所属医院级别及工作岗位来自三级医院占45%（72/160），二级医院占51.3%（82/160），一级医院占0.6%（1/160），其他医疗机构占3.1%（5/160）；本人所属工作岗位（可多选），在临床检验室的占60.6%（97/160），在骨髓细胞形态室的占28.1%（45/160），在输血科（室）的占3.8%（6/160），在生化室的占13.1%（21/160），在免疫室的占10.6%（17/160），在微生物室的占7.5%（12/234），在止血与凝血岗位的占8.8%（14/160），在PCR室的占1.3%（2/160）。

1.2各医院骨髓细胞学检验设置骨髓细胞形态学检验归属于临检室的占48.8%（78/160），归属于骨髓细胞形态室的占21.9%（35/160），归属于其他部门的占15%（24/160），归属于血液科的占11.8%（19/160）。

1.3血液分析仪检测结果的复片率在0%~5%占37.5%（60/160），5%~10%占41.3%（66/160），10%~15%占14.4%（23/160），15%~25%占3.7%（6/160），>25%占5%（3.1/160）。

1.4关于培训内容与培训方式的调查在对希望了解的培训内容调查中（可多选），外周血异常细胞形态占78.1%（125/160）；骨髓细胞学检验占61.3%（98/160）；脱落细胞形态学检验占56.3%（90/160）；尿液检验占55%（88/160）；脑积液检验占37.5%（60/160）；疑难病例分析占33.8%（54/160）；室间质控答疑占31.9%（51/160）。在培训方式的调查中，认为理论授课与实践操作比例为2∶1占48.1%（77/160）；为1∶1占34.4%（55/160）；为1∶2占17.5%（28/160）；认为纯理论授课或纯实践操作培训的人数均为0。

2讨论

2.1健全体制机制调查结果表明，参加本次培训的检验人员绝大多数来自二级以上医疗机构（占96.3%）。各医院骨髓细胞形态学检验的设置不统一，归属于临检室的占48.8%，归属于骨髓细胞室的占21.9%，归属于检验科其他部门的占15%，归属于血液科的占11.8%。可见，多数医院将血液和骨髓细胞形态学分类检验归属检验科临床检验室承担；部分三级医院检验科设立专门的骨髓细胞形态室；有的医院将骨髓细胞形态学检验归属血液病研究所。有专家建议应给细胞形态学检验岗位提供充分的人力与物力支持，建立健全细胞形态学检验的激励机制和约束机制，建立形态学检验人员评价认可制度，对从事细胞形态学检验的技术人员给予充分的鼓励。

2.2加强质量管理随着高新技术的日新月异，血液分析仪所提供的测量参数也不断增多，给临床医学提供的信息量越来越丰富。但值得一提的是，血涂片的镜检分类可提供许多重要的信息（尤其是可以观察血小板分布、识别血液寄生虫与各种异常血细胞），这些信息都是仪器分类所无法替代的。因此，自动化仪器只能充当血液细胞检查的“镜检筛选”角色。2005年，世界卫生组织WHO涂片复检协作组调查复检结果时发现，每天有25%~30%的临床血液标本需要进行血细胞形态学的显微镜检查。因此，自动化仪器具有其自身无法克服的局限性，具有临床意义的细胞形态改变均必须经镜检才能得以确认。有文献报道只有形态学观察才是最重要和最关键的复核，是一项重要的质控内容。从调查结果显示，各医院检验科血液分析仪检测结果的复片率>15%的不足10%。因此，各实验室应建立已经过验证的筛选标准，发出报告前应有一个复核机制，尤其要强调显微镜检查，杜绝由于忽视形态学观察而造成临床的漏检或误诊，以避免给患者带来不良影响。

2.3细胞形态学检验岗位需要高素质的检验人员有文献报道：细胞形态学检验是检验科工作中难度最大的一项检验技术，因此，必须重视从事血细胞形态学检验人员的岗前培训，强化基本功训练，不断提高其业务能力。调查的结果表明，我省检验人员对有关细胞形态方面培训表现出浓厚兴趣。通过本次调查，我们对参加培训者细胞形态学识别的总体水平和存在的问题有了整体了解。在后续的培训中，我们将更有针对性地进行专项培训，建立“点菜式”培训机制，做到临床需要什么，我们培训什么。同时，结合血细胞形态学检验的特点，探索适宜的培训方法。在调查中显示：100%参加培训的人员认为需要采用理论讲授与实践操作镜检相结合的方式，而51.9%的人认为实践操作比例要≥50%，所有参训人员都不建议采取纯理论授课或纯实践操作的培训方式。可见要改变以往纯理论授课的培训模式，应在理论讲授的同时增加实践操作训练，使讲授者和学员能进行有效互动，或讲讲做做、做做讲讲，或先讲后做、先做后讲，做到有的放矢，确保培训学习收到实效。

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[关键词] 胚胎干细胞；绿色荧光蛋白；分化；角膜上皮细胞；诱导

[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）03（b）-0013-03

角膜上皮位于眼角膜表面，是维持眼表正常生理功能的重要条件。健全的角膜上皮细胞是角膜抵御外界各种有害因素损伤的重要条件。人的角膜自我更新由位于角膜缘区域的角膜缘干细胞来维持，结构与功能健全的角膜缘干细胞是角膜上皮再生的主要来源，当角膜受到化学及热烧伤，以及患有Stevens-Johnson syndrome等疾病时，角膜缘上皮细胞将会缺失，导致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危险[1]。因此，重建完整的角膜上皮就显得异常重要。

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）是从早期胚胎内细胞团分离获得的，具有体外增殖和全能性两大特点。近年来随着ES细胞研究的不断深入，其逐渐应用于细胞、组织的修复和移植[2]。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因是一种新型的报告基因，用GFP作为标志物来标记ES细胞，可用来追踪ES细胞在体内的分化[3]。本研究利用质粒pEGFP-N1脂质体复合体转染鼠ES细胞，并在体外诱导鼠ES细胞向角膜上皮细胞分化，为治疗角膜损伤及重建角膜上皮提供细胞组织来源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鼠ES细胞由北京大学深圳研究生院分子生物学实验室提供。DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、B-巯基乙醇、非必需氨基酸，购自Sigma公司；丝裂霉素C，购自Kogyo公司；脂质体Lipofectamine 2000、G418，均购自Invitrogen公司；白血病抑制因子（1eukemia inhibitory factor，LIF）、L-谷氨酰胺，购自Sigma公司；质粒pEGFP-N1，购自Clontech公司；明胶、TaqDNA 聚合酶，购自博大泰克公司；CK14、CK12、CD44引物，委托宝生物工程公司合成；免疫组化二抗试剂盒、DAB显色试剂盒，购自武汉博士德公司；其余为国产分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 ES细胞的培养 ES细胞复苏后，经丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）做饲养层培养，加入预先铺有明胶（Ⅳ型胶原）的培养皿中，37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养，每日更换ES细胞培养液为高糖DMEM（内含0.1 mol/L β-巯基乙醇、2 mmol/L谷氨酰胺、150 mL/L胎牛血清、1 000 U/mL LIF、15 g/L非必需氨基酸）。2～3 d传代1次。

1.2.2 转染及诱导ES细胞 将真核细胞表达载体pEGFP-N1转染ES细胞作为实验组，空载质粒转染ES细胞作为对照组。在转染前2 h改为无血清的DMEM培养液；含载体pEGFP-N1质粒的无血清DMEM 培养液与含脂质体Lipofectamine 2000的无血清DMEM培养液混合，加入ES细胞培养皿中，置37℃的CO2培养箱中培养，换液，培养基为不含LIF的ES细胞培养基。G418筛选GFP阳性细胞克隆，接种在丝裂霉素C处理的MEF饲养层上，继续扩增培养，获得稳定的转染细胞系。ES细胞诱导前去除饲养层细胞，接种于涂抹明胶（Ⅳ型胶原）的培养皿中，加入无LIF的ES细胞培养液，隔日换液，传3～4代，诱导ES细胞分化成角膜上皮细胞。

1.2.3 形态学和免疫组织化学鉴定 显微镜下观察ES细胞形态，诱导培养7 d后，细胞基本融合，将培养分化的ES细胞用PBS洗涤3次后，冷4%多聚甲醛固定30 min，正常山羊血清封闭30 min，滴加K14、K12及CD44单抗，4℃过夜，0.02% Triton-PBS洗涤，加人生物素标记的二抗，室温下孵育40 min，PBS洗涤数次后，加入链亲和素一过氧化物酶溶液，放置于室温下10 min，0.02% Triton-PBS洗涤，最后DAB显色，显微镜下观察。

1.2.4 RT-PCR检测 Trizol R试剂盒提取ES细胞总RNA，具体过程参照Trizol Reagent说明书。引物序列分别为：CD44 正义链5'-atcaacctgcctatgcaacc-3'，反义链5'-cttggacgggaactgacact-3'（248 bp）； K12正义链5'-cgagagtggtatgaaaca-3'， 反义链5'-tgggctctcatttcattg-3'（218 bp）； K14正义链5'-ggtcgatttgatggatttgg-3'，反义链5'-gttcagtgttggcctcttcc-3'（192 bp）；内参照β-actin 正义链5'-gatgacgatatcgctgcgctg-3'， 反义链5'-gtccgaccagaggcatacagg-3'（512 bp）。每个周期参数如下：94℃ 30 s， 60℃ 35 s， 72℃ 60 s，共30个循环周期。采用小鼠角膜上皮细胞做阳性对照，每组PCR反应均设一个阴性对照。取RT-PCR产物20 μL行琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪观察结果，凝胶成像系统拍照。

2 结果

2.1 ES细胞的形态

在饲养层上培养的ES细胞生长旺盛，边界光滑，呈现巢状生长，集落大多呈多角形或椭圆形，集落内细胞排列紧密，边界不清；细胞边界清，胞浆较丰富，细胞核大，核仁大。GFP阳性ES细胞在荧光显微镜下可观察到细胞内有微弱的绿色荧光（图1～2）。

2.2 诱导分化的角膜上皮细胞形态

GFP阳性ES细胞经Ⅳ型胶原诱导培养1周，可见在细胞集落中爬出上皮样细胞， 贴壁生长，增殖迅速，逐渐呈集落式生长，生长胞体多为扁平，呈多角型或不规则形态生长，表现出典型的上皮细胞形态，在荧光显微镜下可观察到细胞内有很强的绿色荧光（图3～4）。

2.3 K12、K14及CD44表达情况

RT-PCR检测发现：诱导分化的ES细胞中有K12及CD44表达，而K14则无表达，证实转染后ES细胞向角膜上皮细胞方向分化（图5）；免疫组化结果显示：角膜上皮样细胞K14的表达很少，而K12及CD44的免疫细胞化学染色阳性（图6）。

3 讨论

严重的角膜损伤一直是眼科治疗的难题。一些严重的化学或热烧伤，以及Stevens-Johnson syndrome等疾病，常导致角膜上皮的大量缺失。传统的移植方法虽有一定疗效，但由于供体缺乏、移植免疫及伦理等问题，在临床上的应用发展受到很大限制[4]。重建角膜的关键是获得足够的角膜上皮材料。本研究探索采用诱导有多向分化潜能的ES细胞向角膜上皮细胞分化，为角膜上皮移植提供无限的供体来源。

ES细胞是一种具有全能性、可无限增殖和多向分化潜能的未分化细胞，具有两个重要特性：①自我更新潜能。干细胞在未分化状态下可不断增殖，从而可自我更新。②多向分化潜能。在体内外ES细胞均有分化成许多特定细胞类型的能力。它能迁移到不同部位分化成相应的细胞类型，恢复受损细胞的功能，成为一种新型细胞替代治疗和基因治疗的途径。经丝裂霉素C处理的含LIF的MEF作为饲养层，能够抑制ES细胞的分化和促进其增殖，并使其保持未分化状态以及多向分化潜能[5]。本研究将Ⅳ型胶原作为诱导剂，加入不含LIF的培养板中，诱导体外培养的ES细胞向角膜上皮细胞分化。

GFP是一种由238个氨基酸组成的蛋白，作为荧光标记分子，在研究细胞的分化、细胞移植中具有重要作用[6]。本研究用脂质体方法将含有GFP的质粒转染至小鼠ES细胞中，选择G418筛选并纯化后的GFP阳性ES细胞。将这些能够持续表达GFP的ES细胞在诱导条件下分化成角膜上皮样细胞，并稳定表达GFP，证明GFP基因已完全整合到ES细胞基因组中，这对ES细胞在体内的分化、迁移及整合具有重要意义。

本研究对诱导分化后的ES细胞进行了形态学观察，发现分化后的细胞符合具有典型上皮细胞的形态学特征。细胞呈集落式生长，排列紧密，边界不清；细胞边界清，胞浆较丰富，细胞核大，核仁大。对于眼表上皮而言，区分角膜上皮细胞与结膜上皮细胞是非常重要的，因为它们在功能上有很大区别，影响角膜上皮组织的移植。细胞角蛋白（cytokeratin）是细胞骨架成分中间丝的重要组成部分，是一类在上皮细胞中表达丰富的蛋白质，也是某些上皮细胞重要的标志物，其中，K14主要在结膜上皮表达而不在角膜上皮表达，K12则是在角膜上皮细胞表达的角蛋白，是特异性角膜上皮细胞标志物。而CD44也存在于角膜上皮细胞中，功能与组织修复有关，它可以促进角膜上皮的愈合。本实验诱导分化的上皮细胞CD44和K12表达阳性，而表达K14阴性，说明诱导分化的细胞是角膜上皮细胞，而非结膜上皮细胞。提示ES细胞能在体外定向诱导分化为角膜上皮样细胞。本研究应用RT-PCR技术检测ES细胞及分化的角膜上皮样细胞中均有K12及CD44的表达，而结膜上皮标志物K14则无表达，证实转染GFP后的ES细胞向角膜上皮细胞方向分化。

总之，通过以上实验本研究成功建立了转染GFP基因的ES细胞系，并利用Ⅳ型胶原体外诱导ES细胞定向分化为角膜上皮样细胞，为临床治疗角膜损伤提供新的材料来源。

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