细胞的生物学特性范文

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篇1

Biological characteristics of placentaderived adherent cells

【Abstract】 AIM: To isolate and culture human placentaderived adherent cells (hPDAC) in vitro and study their biological characteristics involving morphology， phenotype and differentiation. METHODS: Mononuclear cells were harvested after placenta tissue was digested by collagenase IV， seeded and cultured in lowglucose DMEM containing 100 mL/L FBS. Their surface markers were detected by flow cytometry; the growth curve was made; cells of 3 passages were induced to differentiate into osteoblasts with vitamin C， dexamethasone and sodium βglycerophosphate， and the induced cells were observed in the change of matrix mineralization with alizarin red staining; cells of 3 passages were induced to differentiate into lipocytes with dexamethasone and insulin， and the induced cells were observed with oil red O staining. RESULTS: By day 7-14， a few of adherent cells were observed and expanded the same as fibroblasts， and adherent cells were positive for CD29， CD44 and CD105， but negative for CD34， CD45， CD19. After 10day induction， alizarin red staining showed the calcium mineralization and after 7 d， oil red O staining revealed the appearance of fat drops. CONCLUSION: The hPDAC was confirmed to have the osteogenic and adipogenic potentials， indicating that they could be regarded as an alternative source of stem cells.

【Keywords】 placenta; adherent cells; stem cells

【摘要】 目的： 通过体外分离和培养胎盘贴壁细胞，以研究其形态、表型和分化特点. 方法： 采用IV型胶原酶消化人胎盘组织，获得单个核细胞，接种于100 mL/L FBS 低糖DMEM培养基中，贴壁后常规换液、传代，流式细胞仪检测其表面标志，绘制生长曲线. 采用β甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松联合诱导，使胎盘贴壁细胞分化为成骨细胞，诱导后10 d行茜素红染色；采用地塞米松、胰岛素诱导，使胎盘贴壁细胞分化为脂肪细胞，油红O染色鉴定. 结果： 培养7~14 d后有少量贴壁细胞生长，逐渐呈成纤维细胞状，表达CD29，CD44和CD105，不表达CD34，CD45，CD19；在成骨诱导10 d后细胞茜素红染色可见钙盐沉积，成脂肪诱导7 d后油红O染色见脂肪滴形成. 结论： 通过不同方式诱导培养，胎盘贴壁细胞可分化为成骨细胞及脂肪细胞，提示胎盘贴壁细胞可能是新的干细胞来源.

【关键词】 胎盘；贴壁细胞；干细胞

0引言

间充质干细胞（marrow stromal cell， MSC）主要来源于骨髓，可以分化为多种组织细胞：成骨、软骨、脂肪、神经细胞等，但随着年龄增长或合并感染、肿瘤等疾病时骨髓干细胞的分化能力明显下降，因此寻找新的干细胞成为当务之急. 近几年来有学者发现胎盘组织中存在MSC. 为进一步证实这一发现，我们从胎盘中提取贴壁细胞，观察其生物学特性，以探讨其是否具有干细胞特性.

1材料和方法

1.1材料足月剖宫产的胎盘（产妇同意），低糖DMEM（Gibco公司），新生牛血清（FBS，Gibco公司），IV型胶原酶（Sigma公司），胰蛋白酶（Sigma公司），鼠抗人单克隆抗体CD19，CD44，CD45，CD105，CD34，CD29（晶美公司），茜素红（Sigma），油红O（Sigma），倒置显微镜（Olympas），CO2培养箱（Jouan）.

1.2方法

1.2.1胎盘贴壁细胞的分离和培养取足月剖宫产胎盘，剪取胎儿侧胎盘组织，PBS反复冲洗，剪成碎块，以1 g/L IV型胶原酶37℃消化30 min，取上清液，以800 r/min离心5 min，沉淀物重复消化，收集每次离心后的细胞沉淀，PBS冲洗2遍，以1×107/L的密度接种于100 mL/L FBS DMEM培养基中，贴壁后3~5 d换液1次，取传3代以上细胞备用.

1.2.2胎盘贴壁细胞的表型测定取第3代细胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，100 mL/L FBS终止消化，PBS冲洗2遍，调整细胞数为1×104/μL，分别加入鼠抗人单克隆抗体CD19， CD44， CD45， CD105， CD34，流式细胞仪检测细胞表型.

1.2.3生长曲线的绘制取第3代细胞，以2×107/L的密度接种于12孔板中，每日取3复孔，台盼蓝染色计数活细胞，连续培养计数7 d，计算平均值，绘制生长曲线.

1.2.4细胞周期测定取第3代细胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，10 mol/L FBS终止消化，PBS冲洗2遍，调整细胞数为1×106/L，流式细胞仪检测细胞周期.

1.2.5细胞诱导分化及染色取第3代胎盘细胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min， 10 mol/L FBS终止消化，800 r/min离心5 min，PBS冲洗3遍，分为4组分别以1×105/L细胞数接种于6孔板中，1组加入成骨诱导剂（20 mmol/L β甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C，10 mmol/L地塞米松，100 mL/L新生牛血清DMEM培养基），2组加入脂肪诱导剂（10 mmol/L地塞米松、10 mg/L胰岛素、100 mL/L新生牛血清DMEM培养基），3，4组为对照组，采用100 mL/L新生牛血清DMEM培养基培养，置37℃，50 mL/L CO2孵箱培养，每3~5日换液1次. 取培养10 d后的1，3组细胞，倒掉培养液，多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3遍，茜素红染色8 h，显微镜下观察阳性结果. 取培养7 d后的2，4组细胞，多聚甲醛固定后油红O染色.

2结果

2.1胎盘细胞的原代培养消化胎盘组织获得少量的单个核细胞，约7~14 d后贴壁，从不规则形，逐渐变为梭形，呈漩涡状生长，约4 wk后长满瓶底，胞体呈细长，形态类似成纤维细胞（图2），1 wk左右传代1次，可稳定传至10代. 流式细胞仪检测显示低表达CD29，高表达CD44和CD105，不表达CD34，CD45和CD19. 细胞的对数生长期约在第2~4日，其倍增时间为39 h（图1）. 流式细胞仪检测发现G0/G1，S，G2/M期的比例分别为20.15%， 72.54%和6.89%.

图1胎盘贴壁细胞生长曲线（略）

2.2胎盘细胞的诱导分化成骨诱导组细胞在诱导10 d时可见细胞呈漩涡状重叠生长，并聚集成团，茜素红染色可见多个散在分布大小、形态各异的不透明棕红色钙化结节. 对照组少见钙化结节（图3）. 成脂肪诱导组细胞在诱导7 d时油红O染色可见细胞中出现多个染色深红的脂肪滴，而对照组中则偶见脂肪滴（图4）.

A： 培养10 d；B： 培养28 d.

图2胎盘原代细胞×100（略）

A：诱导组; B：对照组.

图3成骨细胞茜素红染色 ×100（略）

A：诱导组；B：对照组.

图4成脂细胞油红O染色 ×100（略）

3讨论

早在2000年即有学者从冻存的胎盘组织中分离培养出贴壁细胞［1］，但胎盘间充质干细胞（MSC）的研究尚处于起步阶段. 我们从形态学、免疫学及分化能力等方面加以研究进一步证实胎盘贴壁细胞的生物学特性. 一般认为大多数MSC培养时贴壁，呈成纤维细胞状，因而采用贴壁法获得MSC的研究较多［2］. 胎盘是实体组织，富含血管和间充质成分，我们采用酶消化法，获取细胞沉淀进行培养，与骨髓贴壁细胞相比较，其贴壁时间较长（1~2 wk），骨髓为72 h［3］，并且胎盘贴壁细胞需28 d左右才能铺满瓶底. 骨髓贴壁细胞大多最初为梭形，7 d左右形成小集落，其后迅速生长，变为均一的长梭形［3］，与胎盘贴壁细胞相似. 另外我们的实验检测到的胎盘贴壁细胞的倍增时间为39 h，文献中为37 h［4］；我们检测细胞周期显示细胞大部分处于分裂期，而以往的报道发现细胞大部分处于静息期［4］，因而胎盘贴壁细胞的特性尚需进一步研究.

目前对于胎盘贴壁细胞的免疫学特点尚无统一的认识，我们的研究发现胎盘贴壁细胞的表型与骨髓MSC相似［5-6］，表达CD29， CD44和CD105，不表达CD34， CD45， CD19， CD44， CD29均为黏附分子，是纤连蛋白和透明质酸盐的受体，在基质细胞中表达较多，这样的结果使我们推测培养的胎盘贴壁细胞中可能包含大量的能表达基质细胞标志的细胞，即MSC，但仅凭细胞形态和少量的表面标志尚不能完全说明贴壁细胞即为MSC，MSC的最重要特性应该是多向分化潜能.

如果胎盘贴壁细胞中含有MSC，理论上讲MSC来源于中胚层，具有向中胚层组织及神经外胚层组织分化的能力［7-8］. 我们的实验证明β甘油磷酸钠和低浓度的地塞米松联合诱导后细胞中钙盐沉积，茜素红染色显示产生大量钙化结节，说明其有成骨能力，只有干细胞才具有这种能力. 在诱导体系中维生素C可以促进体外培养细胞合成胶原，形成钙化，能调节ATP及ALP活性，并影响其合成，β甘油磷酸钠可以提供磷离子作为ALP的底物，地塞米松可以增强ALP活性. 而ALP可以破坏钙化抑制剂，启动钙化［8］形成钙盐，茜素红特异性结合钙剂，阳性表现为棕红色，钙的含量愈高染色愈深，是鉴定成骨细胞特性的特异性指标.

我们的实验由于条件限制，只是初步观察胎盘贴壁细胞的特点，证明其具有干细胞特性，但尚有许多问题如培养的条件、促进生长的因子、传代后是否逐渐衰老、诱导后移植的效果等等，需更深入的研究. 我们的研究提示胎盘贴壁细胞的分离培养具有潜在的临床应用价值.

参考文献

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篇2

[关键词] CIK细胞;扩增;杀伤活性

[中图分类号] R392.12 [文献标识码] A [文章编号]1673-7210（2007）12（c）-019-03

The study of the expansion in vitro and its biological characteristics of cytokine-induced killer cells

WANG Jia-lie, MA Guo-qiang, BAO Li-qing, LIU Yan-ru

(Study Center of Respiratory Disease, Inner Mongolia Hospital, Huhhot010017,China)

[Abstract] Objective: To observe the proliferation ability in vitro and its biological characteristics of cytokine-induced killer cells. Methods: PBMCs were isolated with successive non-adhere method fromvenous blood ,then were induced to be cytokine-induced killer cells by ficoll density gradient centrifugation in the presence of IFN-γ，IL-1β，IL-2 and anti-CD3 antibody. LAK (lymphokine activated killer) cells were prepared as control. The proliferation ability of CIK cells was measured by calculation , the phenotype of CIK cells was analyzed by flow cytometry（FCM）and the killing tumor cell activity of CIK cells was tested with MTT method. Results: After 16 days of induction the proliferation rate of CIK cells reached a high peak, possessing strong proliferate ability with over 100 times expansion after 21 days culture; In comparison with LAK, CIK cells had no difference in early stage, but onday 18,21 the multiplicationability of CIK cells was higher than that of LAK cells markedly (P

[Key words] Cytokine-induced killer cells; Multiplication ability; Killing ability

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)是将人外周血单个核细胞(PBMC)在体外经过多种细胞因子作用后培养获得的一群异质细胞。它同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子[1，2]，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点，被认为是增殖速度最快，杀瘤活性最强，杀瘤谱最广的效应细胞。过继性免疫治疗是治疗恶性肿瘤的一个重要辅助治疗方法，用于过继性免疫治疗的免疫活性细胞必须具有较强的扩增力和杀伤性。本实验通过对CIK细胞的体外培养及其生物学特性的研究，以寻求用于过继免疫治疗的高效免疫活性细胞。

1 材料与方法

1.1实验材料

人外周血样品取自中心血站12例健康成人自愿者的静脉血50 ml。男6名，女6名，年龄20～50岁。人肺腺癌细胞株A-549购自南京凯基生物科技发展公司。

1.2主要试剂和仪器

RPMI1640培养基(美国GIBCO公司)；特级无支原体无热源胎牛血清(美国TBD公司)；人淋巴细胞分离液(密度：1.077 g/cm3 ，TBD生物技术发展中心，天津)；二巯基乙醇(美国TBD公司)；台盼蓝（美国Sigma公司）；二甲亚砜（美国Sigma公司）；青霉素，链霉素（华北制药有限公司）；胰蛋白酶（南京凯基生物科技发展公司）；乙醇、谷氨酰胺、PBS、EDTA等购自北京化学试剂公司；MTT试剂盒（南京凯基生物科技发展公司）；重组人白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)(PEPROTECH公司)、CD3mAb（美国Stem Cell Technologies公司）；CD3-FITC（异硫氰酸荧光素）、CD4-PE（藻红阮荧光素）、CD8-PE、CD3-FITC、CD56-PE和鼠抗人IgG荧光抗体（美国eBioscienc公司）；流式细胞仪(美国BD公司)；550酶标仪（美国Biorad公司）。

1.3实验方法

1.3.1 PBMC的分离(密度梯度离心法)及LAK、CIK细胞的诱导将人外周抗凝血用淋巴细胞分离，吸取白膜层细胞即PBMC，PBS洗涤3遍，加入含10%无热源胎牛血清RPMI1640（1 mmol/L丙酮酸钠、2 mmol/L谷氨酞胺、10 mmol/L Hepes、89 mmol/L NaHC03、50 μmol/L巯基乙醇、0.1 mg/ml链霉素、100 U/ml青霉素培养基），调整细胞浓度，接种于25 cm2培养瓶中，1.0×107个/（10 ml・瓶)，置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱内静置2 h，可见分为黏附于瓶壁的细胞和非黏附细胞。取非黏附细胞分成2组。LAK组:加入500 U/ml IL-2，每3天换液1次并补加500 U/ml IL-2。CIK组:第1天加入IFN-γ 1 000 U/ml、IL-1β10 U/ml，24 h后加入IL-2 100 U/ml、CD3mAb 50 ng/ml，此后每隔3 d换液1次，并补加IL-2及CD3mAb。

1.3.2LAK、CIK细胞表型的检测在培养1，4，7，10，13，16，19，22 d取培养的细胞，用PBS洗涤两遍，调整细胞浓度为5.0×106个/ml，取100 μl悬液加入流式专用试管中，加入FITC、PE标记的鼠抗人单克隆抗体CD3-FITC、CD4-PE、CD8-FITC、CD3-FITC、CD56-PE，对照为IgG1-FITC、IgG12PE，25℃下避光孵育0.5 h，用PBS液洗涤3遍，洗去多余的抗体。并用同型无关阴性抗体做对照，在流式细胞仪（美国BD公司）上检测分析，至少分析1.0×105个细胞。

1.3.3 LAK、CIK细胞杀伤活性的检测取对数生长期的肺癌细胞A-549作为靶细胞，用RPMI1640培养基稀释成1.0×105个/（100 μl・孔），接种细胞于96孔培养板中，然后取出培养两组效应细胞，把效应细胞加入靶细胞孔中混合，另设单独靶细胞和效应细胞组，每组设3个复孔，放置培养箱中培养24 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)测仪于570 nm处测OD值，按下面公式计算各组LAK的杀伤活性。

1.4统计学处理

数据采用SPSS12.0统计软件包处理，数据以均数±标准差（x±s）表示，多个均数间使用单因素方差分析，两样本均数的比较用t检验，P

2 结果

2.1 CIK细胞的增殖情况

实验表明PBMC在细胞因子作用下均能增殖，镜下可见细胞饱满透亮、聚集成团，呈集落样生长。与LAK比较，在前期无明显差异，至19、22 d时扩增能力显著高于LAK细胞的扩增倍数(P

表1不同培养天数LAK、CIK细胞的增殖情况(x±s，倍)

2.2 CIK细胞的表型分析

用流式细胞仪分析细胞表型，结果显示CIK细胞培养后，其主要效应细胞CD3+CD56+ 细胞较培养前显著增加(P

与培养前比较，*P

2.3 CIK细胞的杀瘤活性

CIK细胞在培养至第13天即有较高的杀瘤活性，为61.17%，显著高于LAK细胞的41.02%(P

与单纯的LAK对照组比较，*P

3 讨论

近年来恶性肿瘤的发病率呈逐年上升的趋势，随着细胞免疫学和分子生物学的发展，细胞免疫治疗成为除化疗、放疗之外的又一重要辅助治疗手段，副作用轻微，安全性较好[3]。过继免疫治疗(ALT)是恶性肿瘤生物治疗的一个重要手段，是通过直接向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫活性细胞，在体内发挥抗肿瘤作用，以此来达到治疗肿瘤的目的。淋巴因子诱导的杀伤细胞（lymphokine activated killer，LAK）是由IL-2激活的杀伤细胞，具有广谱杀伤肿瘤的细胞活性，其较早用于临床肿瘤免疫治疗并取得了一定疗效。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer，CIK)是一种非MHC限制性的高效溶解肿瘤的细胞毒性T细胞，其主要效应细胞表面既有T细胞表面标志CD3，也有NK细胞表面标志CD56[4，5]，因而兼有T淋巴细胞抗瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤的特点。CIK 细胞是一类非主要组织相容性复合物(MHC)和非T细胞受体(TCR)限制性的免疫活性细胞，在培养过程中，一些非活性细胞在多种细胞因子的共同刺激下，激活为有细胞毒作用的CIK 细胞。这些活性细胞发挥抗肿瘤作用的机制很可能是通过黏附分子LFA-1/I、CAM-1相互结合后，能够分泌大量的BLT 酯酶的细胞质颗粒，这些颗粒能够直接穿透封闭的靶细胞膜进行胞吐，从而导致肿瘤细胞的裂解[6]；同时，CIK细胞自身还能分泌IL-2、IL-6、TNF-α和GM-CSF等一些细胞因子，提高细胞毒作用。是目前最新、杀伤肿瘤效果最佳的生物免疫治疗方法。Lanier于1986年首次发现这种异质细胞群(主要是CD3+CD56+细胞)，其在外周血淋巴细胞中的比例为1%～5%[7]。经过多年的实践，科学家们找到了体外大量扩增CIK细胞的方法，即应用细胞因子IL-1β，IL-2，IFN- γ和CD3单抗共同培养产生CIK。我们在实验中采取此方法，在分离外周血单个核细胞中先加IFN-γ，24 h后加入抗CD3单抗、IL-1β与IL-2，培养22 d，每3天换液和补加细胞因子，培养13 d时即有25%左右的细胞是CD3+CD56+细胞，具有典型的CIK细胞形态和生物学性状。CIK具增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、毒副作用小等优点，目前自体及异体外周血CIK细胞已被用于一些实体瘤和恶性血液病的治疗，并取得了较好的疗效。我们的实验结果表明，与LAK 细胞相比，CIK细胞具有更强的增殖能力，培养至22 d时体系中总的细胞数可增加100多倍。用流式细胞仪分析细胞表型， 结果显示CIK细胞培养后， 其主要效应细胞CD3+CD56+ 细胞较培养前显著增加(P

综上所述，本研究采用IFN-γ、抗CD3单抗、IL-1β和IL-2等多种细胞因子成功从健康人非贴壁PBMCs中诱导出大量的具有典型形态和免疫表型的CIK细胞，且具有较高的杀伤活性，为下一步临床治疗肿瘤奠定了基础。

[参考文献]

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篇3

【关键词】干细胞； NF-κB抑制因子α；细胞增殖；细胞分化；细胞因子

Effect of mutated IκBα gene on the biological characteristics of immortalized neural progenitor cell strain

ZHU Chang， LIU Zhi-heng， ZHANG Chuan-han， et al. Department of Anesthesiology，Tongji Hospital of Tongji Medical College， Huazhong University of Science & Technology， Wuhan 430030， China

【Abstract】 Objective To observe the effect of mutated IκBα gene on the proliferation，differentiation and cytokine secretion of immortalized neural progenitor cell strain(INPCs). Methods After the establishment of mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs， MTT staining and flow cytometry were used to draw the growth curve and measure the cell proliferation index. Western blot was carried out to observe the differentiation of the two cell strains after 5% blood serum induced differentiation. The expression of TNF-α、IL-1β and IL-6 was measured by realtime RT-PCR. Results It was established by growth curve and cell proliferation index that the proliferation was slowed down in mutated IκBα gene transfected INPCs compared with blank plasmid transfected INPCs. After blood serum induced differentiation，glial fibrillary acidic protein was highly expressed in the two cell strains. There was no difference in the expression of TNF-α between mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs. The expression of IL-1β and IL-6 was reduced in mutated IκBα gene transfected INPCs. Conclusion Mutated IκBα gene can slow down the proliferation of INPCs， reduce the expression of some cytokines， but didn’t influence the differentiation of INPCs.

【Key words】Stem cells；NF-kappaB inhibitor alpha；Cell proliferation ；Cell differentiation； Cytokines

本实验室成功构建了SV40Tag永生化的大鼠神经前体细胞株（INPCs）[1]，并在此基础上构建了转IκBα突变型基因永生化神经前体细胞株。作为细胞移植治疗的细胞来源和外源基因的载体，INPCs的生物学特性在转入外源基因后有何改变，是进一步研究首先应关注的问题。本研究拟通过比较转IκBα突变型基因及空白对照载体的INPCs在增殖、分化以及细胞因子分泌功能上的差异，为进一步将该转基因细胞用于细胞移植治疗脑缺血等中枢神经系统疾病奠定基础。

材料与方法

材料 转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs由本实验室构建，DMEM/F12培养基、B27无血清培养添加剂（Gibco公司，美国）；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)（Pepro Tech公司，英国）； MTT、碘化丙啶（PI）（Sigma公司，美国）；抗β-actin抗体、抗胶原纤维酸性蛋白（GFAP）抗体、抗微管相关蛋白2（MAP2）抗体（Neomarkers公司，美国）； Trizol试剂（上海华舜公司），SYBR ExScriptTM RT-PCR Kit (Takara，日本)。

细胞培养及传代 转染pcDNA3.1或pcDNA3.1/IκBαM的INPCs在含2%B27、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、0.3μg/ml嘌呤霉素的DMEM/F12培养基中，置37℃、5%CO2培养箱培养，0.25％胰酶消化传代。

细胞生长曲线的绘制 将转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs以每孔5×103的密度接种于96孔板，共种8板，每板每株细胞接种12孔，每24h取出一板，每孔加入0.2％MTT 50μl，继续培养4h后，吸去上清液，每孔加入DMSO 150μl，震荡10 min，在酶标仪（Bio-Rad公司，美国）上测定570nm吸光度值，并绘制生长曲线。

细胞增殖指数的测定 将转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs分别制成单细胞悬液，PBS 洗一次后，加入-20 ℃预冷的80 %乙醇固定， 冰浴30min，固定后的细胞用PBS 洗涤2 次，调整细胞浓度为1 ×106 / ml，加入PI (终浓度为50μg/mL)和RNA酶（终浓度为1μg/ml）， 室温避光孵育1h后上机检测，细胞增殖指数= ( S + G2 /M) / ( G0 /G1 + S +G2 /M) ×100%。

Western blot检测细胞分化 分别提取转pcDNA3.1 INPCs及转pcDNA3.1/IκBαM INPCs的细胞总蛋白，两株细胞以5％血清诱导分化一周后分别提取总蛋白，以β-actin为内参照，取等量的蛋白质经10%聚丙稀酰胺凝胶电泳后，转至硝酸纤维素膜上， 用5%脱脂奶粉封闭1h，加10μg/ml抗GFAP单抗、抗MAP2单抗或抗β-actin单抗，室温孵育1h，漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1h，漂洗后二氨基联苯胺显色2～3 min，水洗后照相。

Realtime RT-PCR 检测细胞因子的表达 用Trizol试剂提取转pcDNA3.1 INPCs及转pcDNA3.1/IκBαM INPCs的总mRNA，8453E型紫外分光光度仪（Agilent公司，美国）测定RNA浓度，参照SYBR ExScriptTM RT-PCR试剂盒说明操作，用等量的总mRNA进行逆转录，然后以逆转录产物为模板在LightCycler real-time PCR仪（罗氏公司，美国）上进行PCR反应，反应条件为：94℃预变性10 s，94℃变性5 s，60℃退火及延伸20s，共反应40个循环后，分析融解曲线，参照Livak等人的方法，以2－σσCT法分析细胞因子的的相对表达量[2]，引物列表见表1。

统计学处理　采用SPSS 12. 0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（ ±s）表示，不同细胞株间比较采用成组t检验，P < 0. 05为差异有统计学意义。

结 果

生长曲线的绘制 采用MTT法绘制的转pcDNA3.1INPCs及转pcDNA3.1/IκBαM INPCs的生长曲线，见图1。除接种后第一天外，各时点转pcDNA3.1/IκBαM INPCs加入MTT后，其570nm吸光度值均较相同时点转pcDNA3.1 INPCs低，同时点两株细胞间比较，差异有统计学意义。

流式细胞仪检测细胞增殖指数 转pcDNA3.1INPCs 及转pcDNA3.1/IκBαM INPCs的细胞增殖指数依次为61.64％±4.25％和46.19％±0.86％，两者比较，差异有统计学意义。

Western blot检测细胞分化 血清诱导分化后，两株细胞MAP2的蛋白条带极其微弱，GFAP条带明显，诱导分化前，转pcDNA3.1INPCs 及转pcDNA3.1/IκBαM INPCs均有明显的MAP2条带，而无明显的GFAP条带，两株细胞间比较，MAP2和GFAP条带的明暗程度在分化前及分化后无明显差异。（见图2）

细胞因子的表达 用Realtime RT-PCR的方法检测转pcDNA3.1 INPCs及转pcDNA3.1/IκBαM INPCs细胞因子mRNA的相对表达量，如表2所示。将转pcDNA3.1INPCs相应细胞因子的表达量定义为1，两株细胞TNF-α的mRNA表达差异无统计学意义，转pcDNA3.1/IκBαM INPCs中IL-6 及IL-1β mRNA的表达较转pcDNA3.1的INPCs低，差异有统计学意义。

讨 论

神经前体细胞具有不断分裂增殖、自我更新以及多分化潜能[3]。转pcDNA3.1INPCs 及转pcDNA3.1/IκBαM INPCs的培养和传代证实，转入IκBα突变型基因后，INPCs仍能不断分裂增殖，保持了自我更新的特性。而western blot通过半定量的方式证实，转入的外源基因并未影响INPCs的分化特性，即血清诱导分化后大部分细胞表达作为星形胶质细胞标志的GFAP，分化为星形胶质细胞，仅有少量细胞表达作为神经元标志的MAP2，分化为神经元。增殖和分化潜能的保持即证实了转pcDNA3.1/IκBαM INPCs保持了神经前体细胞的特性，同时也是该细胞株用于细胞移植治疗的基本保证。

篇4

【摘要】 目的 观察RNA 干扰技术沉默Annexin1基因表达对膀胱癌T24细胞增殖能力的影响。方法 针对Annexin1基因不同部位设计并化学合成3对不同的靶向小干扰RNA(siRNA)，脂质体介导瞬时转染膀胱癌T24细胞，转染后应用半定量RTPCR和Western印迹法检测Annexin1 mRNA和蛋白的改变，透射电镜观察细胞凋亡情况，用MTT法检测沉默Annexin1表达对膀胱癌T24细胞增殖的影响。结果 转染siRNA后膀胱癌T24细胞Annexin1 mRNA和蛋白水平显著下降(P

【关键词】 膀胱癌;Annexin1;siRNA

【Abstract】 Objective To explore the effects of Annexin1 gene silencing by small interfering RNA(siRNA) on bladder cancer cells T24 in vitro. Methods Three siRNA targeting three different domains of Annexin1 gene were designed， synthesized， and transfected into bladder cancer T24 cells by lipofectamineTM2000. After transfection， expression of Annexin1 was detected by RTPCR and Western blotting. Transmission electronic microscope(TEM) was applied to observe the apoptosis cellular morphology. The cellular proliferation inhibitory ratio was evaluated by MTT assay. Results Compared with the negative control (siRNANC) groups， transfection of three targeting siRNA in T24 cells decreased the expression of Annexin1 mRNA and protein. Annexin1 gene silencing reduced the proliferative capacity of T24 cells and leaded to tumor cells apoptosis after transfection. Conclusions The chemically synthesized specific siRNA targeting Annexin1 could effectively reduce the expression of Annexin1 gene， reduce the proliferative capacity of T24 cells and induce tumor cells apoptosis.

【Key words】 Bladder cancer; Annexin1; siRNA

膜联蛋白1(Annexin1)增强感染局部的凋亡表明它对肿瘤的诊断和治疗有重要意义，因此该蛋白质与肿瘤细胞的活性调节相关〔1，2〕。目前，Annexin1的表达缺失是否与膀胱癌细胞的异常增殖潜力相关以及对化疗药物的敏感性尚未明了，本研究利用RNA干扰(RNAi)技术通过沉默Annexin1基因直接观察Annexin1表达缺失对膀胱癌细胞体外增殖能力的影响，为进一步揭示该基因促进肿瘤进展的机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 膀胱癌T24细胞株(哈尔滨医科大学附属第四医院中心实验室提供)，RNA干扰试剂盒(SilencerTM siRNA Construction Kit)购自美国Ambion公司。阳离子脂质体转染试剂盒LipofectamineTM2000、Trizol、MMLV购自Invitrogen 生命技术公司。RPMI1640、IMDM、胰蛋白酶购自GIBCO公司。

1.2 小干扰RNA(siRNA)的设计及合成 根据GenBank 中Annexin1基因序列(GenBank Accession No.NM000700)和siRNA设计原则，应用Ambion生物公司的设计软件(siRNA Target Finder and Design Tools)，自Annexin1 mRNA的起始密码子开始，寻找“AA”二连序列，记下其3′端的19个碱基序列作为候选的siRNA靶序列。将候选序列在GenBank中用Blast软件进行同源序列搜索，排除那些和其他基因编码序列或EST同源的候选序列。最终选择了3段21个碱基的siRNA序列(TI、TⅡ、TⅢ)，分别靶向Annexin1基因的240260 (SI) ，435455 (SⅡ)和 506526 (SⅢ)区域(见表1)。另外，根据转染后细胞形态学变化，设计与TI(240siRNA)序列含有同样核苷酸比例的随机对照siRNA(240c1，240c2)做为阴性对照，用Blast验证随机序列与GenBank中其他已知人类基因序列没有同源性。利用针对三磷酸甘油醛脱氢酶(βactin)基因的正、反义寡核苷酸模板作为RNA干扰实验的阳性对照。设计的正反义寡核苷酸模板3′端均加上T7启动子引物5′CCTGTCTC3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 引物的设计与合成 设计1对Annexin1的引物，上游：5′GACCACCTCAACTCAAGGAC3′，下游：5′AGGAAGCTGGATGAAGAGAC3′，长度 546 bp，同时设计1对管家基因βactin引物，上游：5′ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG3′，下游：5′AGAGGTCCTTACGGATGTCAACG3′，长度290 bp，由上海生工合成。

1.4 细胞培养 常规RPMI1640培养，至转染前夜，细胞培养液更换为用无血清和无抗生素的IMDM，置于37℃、 5% CO2孵箱，转染后用20%FBS IMDM培养液，按常规方法培养，取处于对数生长期的细胞用于实验。用OptiMEMⅠ转染液及脂质体LipofectamineTM 2000转染试剂，按试剂盒说明优化转染条件，分别将3对siRNA和阳性对照筛选出的干扰序列的scramble siRNA(siRNAneg)以400 nmol/L的终浓度加入细胞培养液，孵育24、48、72 h后收获细胞进行检测。实验重复3次。表1 靶向Annexin1的siRNA核苷酸序列

1.5 半定量RTPCR检测转染前后膀胱癌T24 细胞Annexin1 mRNA 的表达水平 Trizol试剂盒提取细胞总RNA，用2 μg总RNA进行cDNA的合成，半定量RTPCR方法检测siRNA转染后不同时间点24、48、72 h细胞中Annexin1 mRNA表达水平，βactin作内对照。PCR 扩增条件Annexin1：95℃预变性5 min;94℃变性40 s，58℃复性1 min，72℃延伸1 min，共33个循环;72℃延伸10 min。βactin：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，63℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30个循环;72℃延伸10 min。取适量PCR扩增产物，在2%琼脂糖凝胶电泳(80 V，25 min)，EB染色，紫外灯下观察结果并拍照。

1.6 Western印迹法检测转染前后膀胱癌T24细胞Annexin1蛋白的表达 取状态良好对数生长期细胞5×106个，用PBS洗2遍，于冰上加冷的细胞裂解液，制备细胞总蛋白，Lowry法蛋白定量。将样品置于5×SDS凝胶加样缓冲液中，100℃加热10 min使蛋白质变性，丙烯酰胺凝胶电泳，Western印迹法，按0.1 ml/cm2的量加入封闭液和适量稀释的抗体，于摇床上室温2 h，PBS漂洗滤膜3次，加入辣根过氧化物酶标记二抗，将漂洗过的硝酸纤维素膜移至上述底物溶液中，轻轻摇动，蛋白条带的颜色达到要求，即用水冲洗，滤纸吸干，拍照，保存。内参对照使用小鼠抗人βactin(稀释度为1∶10 000)。

1.7 siRNA和脂质体的细胞毒性检测 细胞用无血清和无抗生素的培养液洗涤重悬，每孔2×104加入96孔板。分别加入用OptiMEMⅠ稀释的siRNA(终浓度为100 nmol/L)或Lipofectamine2000(终浓度为2 ml/L)，6 h后加入含20%血清的培养液补足血清，72 h后分别加入5 mg/ml的MTT，每孔20 μl，37℃置4 h，弃上清，每孔加入100 μl二甲基亚砜，待甲瓒完全溶解后，测定其在570 nm的吸光度，并计算细胞存活率。对照孔细胞中加入等量的OptiMEMⅠ代替脂质体或siRNA，其余培养条件与处理组相同。存活率(%)=(处理孔OD570-空白孔OD570)/(对照孔OD570-空白孔OD570)×100%。

1.8 透射电镜观察细胞凋亡形态 取细胞1×107个，冷PBS洗3遍，预冷2%戊二醛于4℃固定细胞2 h，冷PBS洗3遍，1%四氧化锇酸4℃再固定30 min，常规电镜脱水、包埋并超薄切片，用醋酸双氧铀和铅染液双重染色，观察细胞超微结构。

1.9 MTT法检测细胞增殖能力的改变 对数生长期细胞接种于96孔培养板，每孔接种1×105个细胞，在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，24 h后换用无血清的培养基。实验组设7个不同药物浓度，按相同倍数递增。每组药物浓度设6个复孔，对照组不加药物，继续培养24～96 h后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)孵育4 h后吸弃培养液，每孔加入DMSO 100 μl，振荡溶解10 min，酶联免疫检测仪490 nm波长测吸光度值(A)，细胞增殖抑制率计算公式为：抑制率(%)=(1-实验组A均数/对照组A均数)×100%，绘制生长曲线，重复3次。

1.10 统计学处理 应用SPSS11.0软件对数据进行统计分析，数据结果以x±s表示，两组均数间比较采用双尾Student′s t检验，多组均数间比较采用方差分析(ANOVA)。

2 结 果

2.1 siRNA对膀胱癌T24细胞Annexin1 mRNA表达的影响 经AlphaEaseFCTM(Alpha Innotech)软件分析，以40 nmol/L浓度转染T24细胞24 h后siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ组mRNA表达水平明显降低(图1)，在24 h下调(80.63±0.24)%(t=474.3，P=0.001);在48 h下调(38.9±0.85)%(t=64.833，P=0.01)，72 h恢复正常。

2.2 siRNA对膀胱癌T24细胞Annexin1蛋白表达的影响 与随机对照相比，靶向Annexin1的siRNA转染后细胞内Annexin1蛋白表达明显下降，与RTPCR结果一致。见图2。

1：Marker DL200，2：siRNA 转染24 h，3：siRNA转染48 h，4：siRNA 转染72 h，5：siRNA阴性对照，6：未转染组

图1 siRNA对膀胱癌T24细胞

Annexin1 mRNA表达的影响

2.3 沉默Annexin1基因对T24细胞增殖能力的影响 转染siRNA Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ序列靶向降低Annexin1基因表达后T24细胞的体外增殖能力明显降低(图3)，以未转染的细胞做对照，转染siRNA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ后24、48、72 h细胞增殖抑制率分别是siRNA I：0.98/0.73/0.49倍，siRNA Ⅱ：0.97/0.65/0.41倍，siRNA Ⅲ：0.91/0.55/0.39倍，其中48、72 h组差异有统计学意义。

图2 siRNA对膀胱癌T24细胞Annexin1蛋白表达的影响图3 沉默Annexin1基因对T24细胞增殖能力的影响

2.4 细胞凋亡的形态学观察 对照组肿瘤细胞未发生凋亡，细胞核形态正常，核内异染色质未发生固缩现象，核仁清楚;细胞质中原生质着色均匀;线粒体结构完整;嵴无断裂(图4a)。经过siRNA作用48 h后的T24细胞出现典型凋亡细胞特征(图4b)，凋亡小体形成;异染色质已发生固缩，核仁消失;细胞质中出现空泡;原生质着色不均匀;线粒体扩张;嵴肿胀、断裂。

图4 siRNA作用前后的T24细胞

2.5 siRNA和脂质体的细胞毒性检测结果 T24细胞经靶向Annexin1基因的siRNA或oligo Lipofectamine处理后计算细胞存活率，与未处理的T24细胞相比，没有显著统计学差异，显示siRNA及脂质体本身在实验条件下对细胞基本没有毒性作用。

3 讨 论

RNAi是由双链RNA分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达使其沉默的过程，是一种典型的转录后基因调控方法，此时启动子是活跃的，靶基因能够被转录，但不能正常累积mRNA。其优点首先表现在siRNA只引起与其同源的mRNA降解，而其他基因的表达不受影响，因此具有高度的序列专一性。许多实验证实，导入细胞的siRNA只能引起同源基因表达的抑制，而无关基因不受影响〔3〕。在siRNA序列中配对的19～21nt中如果只改变一个核苷酸，就可以使该siRNA序列不对靶mRNA起作用，证明RNAi有明显的特异性。其次RNAi是通过自身放大机制来发挥作用，极少量的dsRNA就能有效地抑制靶基因的表达，因此与反义寡核苷酸等基因封闭技术相比，具有高效性〔4〕。另外RNAi操作简便快捷，利用RNA干扰技术，甚至可以在一周之内可以关闭10个基因。

2001年，Elbashir等首次报道siRNA在哺乳动物体外培养细胞中能够成功的诱导特异基因受阻〔5〕。作为一种有效抑制基因表达的方法，RNA干扰技术在近几年被广泛用于基因的功能研究。双链siRNA的合成是进行RNAi研究的关键〔6〕，本研究采取体外转录法，即在噬菌体RNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶等作用下，以连有噬菌体启动子的线性DNA为模板，直接合成出特异双链siRNA。RNA聚合酶是体外转录合成siRNA的关键酶，除了本实验中用到的T7 RNA聚合酶，其他通用的RNA聚合酶还有T3、SP6 RNA聚合酶，它们均是以DNA为模板的RNA聚合酶。DNA模板必须连有特异的启动子序列，启动子区域是噬菌体RNA聚合酶结合和RNA开始合成的部位，因此本实验在设计寡核苷酸模板的时候，3′端均加上T7启动子引物5′CCTGTCTC3′。在RNA聚合酶结合到双链DNA启动子后，聚合酶分开双链DNA模板，并以3′5′链作为模板合成出互补的5′3′RNA链，合成出的正反义RNA链经杂交即可得双链RNA。在本研究中，以AA开头针对597 bp的Annexin1 cds区的靶序列共有26个，其中GC碱基含量在50%以下的有25个，对其进行Blast分析，最终选择了240260 (SI)，435455 (SⅡ)和 506526 (SⅢ)的3段序列，其中SI SiRNA靶序列的GC含量为43.9%，SⅡ SiRNA靶序列的GC含量为39.2%，SⅢ SiRNA靶序列的GC含量为41.2%。结果表明3段siRNA序列都有抑制Annexin1基因表达的作用，但是SⅡ siRNA抑制作用要更强一些。通过研究3对不同的靶向干扰序列和1对阴性对照序列，发现在mRNA水平3对靶向序列均可抑制Annexin1的表达，在蛋白水平也获得较高的抑制效果。MTT结果发现，与未转染细胞或转染阴性对照细胞相比，转染siRNA可显著抑制T24细胞的生长，增加G0/G1期比例，诱导肿瘤细胞凋亡，与Mariotti〔7〕报道一致。总之，本研究通过siRNA下调Annexin1基因表达，导致细胞周期发生改变使细胞增殖缓慢和凋亡，为Annexin1与膀胱癌临床相关性和治疗新途径提供了实验依据。

参考文献

1 SilistinoSouza R，RodriguesLisoni FC，Cury PM，et al.Annexin 1：differential expression in tumor and mast cells in human larynx cancer〔J〕. Int J Cancer，2007;120(12):25829.

2 Ang EZ，Nguyen HT，Sim HL，et al.Annexin1 regulates growth arrest induced by high levels of estrogen in MCF7 breast cancer cells〔J〕.Mol Cancer Res，2009;7(2):26674.

3 Dalzell JJ，McMaster S，Fleming CC，et al.Short interfering RNAmediated gene silencing in Globodera pallida and Meloidogyne incognita infective stage juveniles〔J〕.Int J Parasitol，2010;40(1):91100.

4 PalBhadra M，Bhadra U，Birchler JA.RNAi related mechanisms affect both transcriptional and posttranscriptional transgene silencing in Drosophila〔J〕.Mol Cell，2002;9(2):31527.

5 Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells〔J〕.Nature，2001;411(6836)：4948.

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关键词：生物科学；核心课程；逻辑关系

中图分类号：G633.91

文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2016）21-0130-03

1 引言

生物化学、遗传学、细胞生物学、分子生物学、基因工程学是生物科学专业的核心课程，由于它们相互联系，交叉渗透，因此存在逻辑关系不清，课程内容重叠较多等问题，例如原核生物和真核生物基因表达调控在生物化学、细胞生物学、分子生物学都有介绍，基因工程原理在分子生物学、基因工程学中都有介绍，导致教师教学内容难以起舍，课程顺序难以安排。要理顺生物化学、遗传学、细胞生物学、分子生物学、基因工程学的逻辑关系，确定各课程教学内容和教学顺序，必须把其定义，研究内容，发展历史动态结合起来。

2 生物科学专业核心课程概述

2.1 生物化学

生物化学是运用化学的理论和方法研究生物分子结构与功能、物质代谢及遗传信息传递与调控规律的科学。

生物化学是生命科学中最古老的学科之一。 随着生命科学的发展，各学科相互渗透。18世纪，一些从事化学研究的科学家转向生物领域，为生物化学的诞生播下了种子。19世纪末，生物化学从生理化学中独立。20世纪中后期又从生物化学分离出部分内容与遗传学部分内容结合为分子生物学，然后，分子生物学基因操作部分独立出来，形成基因工程学。

1920年以前，生物化学研究内容以分析生物体的化学组成、性质和含量为主，称为静态生物化学时期。

1920年-1950年，随着同位素示踪技术、色谱技术等物理学手段的广泛应用，生物化学从单纯的组成分析深入到物质代谢、能量转化，如：光合作用、生物氧化、糖、脂肪、蛋白质代谢等领域。这是生物化学飞速发展的时期，称为动态生物化学时期。

1950年以后，蛋白质化学和和核酸化学进展迅速，生物化学进入了分子生物学时期。分子生物学的发展揭示了生命本质的高度有序性和一致性，是人类在认识的巨大飞跃。根据生物化学的定义和历史，生物化学研究的内容包括以下几个方面。

2.1.1 生物的物质组成

生物是由一定的物质按特定的方式组成的，直到今天，新物质仍不断被发现。如陆续发现的干扰素、环核苷一磷酸、钙调蛋白、粘连蛋白、外源凝集素等都具有重要的生物学功能。另一方面，早已熟知的化合物也发现了新的功能，如20世纪50年代才知道肉碱是一种生长因子，而到60年代又发现其是生物氧化的载体。

2.1.2 物质代谢

生物体内绝大部分物质代谢是在酶催化下进行的，具有高度自动调节能力。一个小小的细胞内，有近2000种酶，在同一时间内，催化各种不同的化学反应。这些化学反应互不干扰，有条不紊地进行。表明生物体内的物质代谢有精确的调节控制系统。

2.1.3 结构与功能

生物大分子的功能与其特定的结构有密切关系。如酶的活性中心的结构决定其催化活性及其特异性；变构酶的活性还与其催化的代谢终末产物的结构有关。

核酸中核苷酸排列顺序的不同，其结构就不同，所含遗传信息不同。这些不同的构象对基因的表达具有调控作用。

生物体的糖包括多糖、寡糖和单糖。由于多糖链结构复杂，具有很大的信息容量，对于细胞专一地识别、相互作用具有重要作用。糖类将与蛋白质、核酸并列成为生物化学的主要研究对象。

在生物化学中，有关结构与功能关系的研究才仅仅开始，尚待大力研究的问题很多，其中重大的有：亚细胞结构中生物大分子间的结合，细胞的相互识别、细胞的接触抑制、细胞间的粘合、抗原与抗体的作用、激素、神经介质与其受体的相互作用等。

2.1.4 繁殖与遗传

生物典型特点是具有繁殖与遗传特性。基因是DNA分子中的一段核苷酸序列，现在DNA分子的核苷酸序列已不难测得，不但能在分子水平上研究遗传，而且还可能改变遗传，从而派生出基因工程学。

2.2 细胞生物学

细胞生物学是从显微水平、亚显微水平和分子水平研究细胞的结构及其生命活动规律的科学。

过去，细胞生物学主要是在光学显微镜下对细胞的形态结构和生活史进行研究，称为细胞学。20 世纪 50 年代以来，由于电子显微镜、放射性同位素、细胞结构组分分离技术、细胞培养等技术的广泛应用，特别是分子生物学的兴起，使细胞生物学研究的广度和深度都有迅猛发展，从宏观到微观、从平面到立体、从定性到定量、从分析到综合；从细胞、亚细胞、分子三个水平研究细胞的结构与功能、分裂与分化、衰老与死亡等生命活动规律及其调控机制，细胞与细胞、细胞与环境之间的相互关系。使原来以形态结构研究为主的细胞学转变成以生理功能研究为主、将结构与功能紧密结合起来的细胞生物学。由于细胞生物学在分子水平上的研究工作取得了深入的进展，因此细胞生物学又称为细胞分子生物学。细胞生物学研究内容如下。

2.2.1 细胞社会学

细胞社会学是细胞生物学中的一个新的领域。它是以系统论的观点研究细胞群体中细胞间的相互关系、细胞群体的社会行为；细胞识别、通讯、相互作用；整体和细胞群对细胞的生长、分化、形态发生和器官形成等活动的调控；细胞外环境对细胞的影响。

2.2.2 细胞的增殖、生长、分化与调控

研究细胞增殖、生长、分化及其调控机制，不仅是控制生物生长和发育的基础，而且是研究细胞癌变和逆转的重要途径。

2.2.3 细胞遗传学

细胞遗传学从细胞学角度来研究染色体的结构和行为以及染色体与细胞器的关系，从而探讨遗传与变异的机制等。

2.2.4 细胞化学

细胞化学：用切片或分离细胞成分，对单个细胞或细胞各个部分进行定性和定量的化学分析，研究细胞结构、化学成分的定位、分布及其生理功能。

2.2.5 分子细胞学

分子细胞学：从分子水平研究细胞与细胞器中蛋白质、核酸等大分子的组成、结构与功能及其遗传性状的表现和调控等，探讨细胞生命活动的分子机理。

2.3 遗传学

遗传学是研究生物遗传和变异规律的科学。孟德尔认为生物性状的遗传是受遗传因子控制的，并提出了遗传因子分离和自由组合的基本遗传规律。1900年，孟德尔的成果得到广泛重视，成为遗传学的基石。

20世纪初，利用光学显微镜发现了细胞有丝分裂和减数分裂过程中染色体及其行为，奠定了遗传的染色体理论基础。1910年左右，美国遗传学家摩尔根及其同事根据对普通果蝇的研究，提出了基因的连锁交换规律，并结合当时的细胞学成就，创立了以染色体遗传为核心的细胞遗传学。

遗传信息在分子水平上研究始于20世纪40年代。随着电子显微镜的发明，人们已能够直接观察遗传物质的结构及其在基因表达过程中的特征，使细胞遗传学的研究进入分子水平。

1953年，沃森和克里克提出了DNA的双螺旋结构模型，为进一步阐明DNA的结构、复制和遗传物质如何保持世代连续的问题奠定了基础，开创了分子遗传学这一新的学科领域。

遗传学研究的领域非常广泛，可划分成经典遗传学、细胞遗传学、分子遗传学和生统遗传学4个分支，各个分支领域相互联系、相互重叠、相互印证，组成了一个不可分割的整体。

经典遗传学研究从亲代到子代的遗传特性，包括遗传的分离规律；独立分配规律；连锁和交换遗传规律及机理；基因互作及其与环境的相互关系；性别决定与伴性遗传；基因及染色体变异；数量性状的特征及其多基因假说，近亲繁殖和杂种优势；细胞质遗传等。

细胞遗传学是通过细胞学手段对遗传物质进行研究。其内容包括细胞的结构和功能；染色体的形态结构；细胞的有丝分裂，减数分裂；配子的形成和受精。

分子遗传学是从分子的水平上研究遗传物质的结构及遗传信息的传递。内容包括DNA复制、转录和翻译，基因突变及修复，原核生物和真核基因表达与调控；基因、基因组及作图，遗传重组。

生统遗传学是用数理统计学方法来研究生物遗传变异规律的学科。根据研究的对象不同，又可分为数量遗传学和群体遗传学。前者研究生物体数量性状即由多基因控制的性状遗传规律，后者是研究基因频率在群体中的变化、群体的遗传结构和物种进化。

2.4 分子生物学

分子生物学是从分子水平研究核酸与蛋白质的结构与功能、遗传信息传递和调控，阐明生命本质的科学。

从19世纪后期到20世纪50年代初，确定了蛋白质是生命的主要物质基础，DNA是生物遗传的物质的载体，是现代分子生物学诞生的准备和酝酿阶段。

从20世纪50年代初到70年代初，是现代分子生物学的建立和发展阶段，1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型为现代分子生物学诞生的里程碑，确立了核酸作为遗传信息分子的结构基础，提出了硷基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式，为核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了最重要的基础。

70年代后，基因工程技术出现，人类进入认识生命本质并开始改造生命的发展阶段。

分子生物学原来是生物化学的一部分，因其太重要了，20世纪中后期从生物化学中分离出来并与遗传学结合，独立出来成为单独的学科，是生物化学的发展和延续。涉及的部分内容比生物化学更细致深入，并从整体上考虑。

分子生物学从蛋白质、核酸、基因及基因组结构开始，以中心法则为主线，阐述生物大分子在信息传导、基因表达调控中的相互作用和机理。主要内容包括蛋白质、核酸、基因和基因组的结构、DNA的复制、转录、转录后加工、基因突变与修复、蛋白质生物合成和翻译后加工、原核生物基因表达的调控、真核生物基因表达的调控。基因工程技术的原理和应用等。

2.5 基因工程学

20世纪70年代，随着 DNA的内部结构和遗传机制逐渐呈现在人们眼前，生物学家不再仅仅满足于探索、揭示生物遗传的秘密，而是开始设想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。这就像工程设计，按照人类的需要（设计）把这种生物的某个“基因”与那种生物的某个“基因”进行“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物的工程技术被称为“基因工程”。

基因工程包括如下几个主要的内容：①目的基因的合成或提起分离。②载体的构建。③将载体转移到受体细胞并增殖。④重组DNA分子的受体细胞克隆筛选。⑤将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。

3 课程间的逻辑关系，教学内容选择及课程顺序安排

从生物化学、遗传学、细胞生物学、分子生物学、基因工程学的定义，研究内容，发展历史动态可知，各学科的逻辑关系是：理解细胞结构及功能需要一定的生物化学基础，理解遗传物质的结构和功能需要一定的细胞生物学基础，而分子生物学是生物化学、遗传学交叉融合的产物，研究核酸和蛋白质分子结构和功能以及相互关系，而各个分子不能孤立发挥作用，必须依赖于一定的细胞结构，因此，生物化学是细胞生物学的基础；细胞生物学是遗传学和分子生物学的基础。基因工程是利用分子生物学的理论和实验技术进行转基因操作的部分独立出来的，因此分子生物学是基因工程学的基础。所以，高校应按生物化学、细胞生物学、遗传学、分子生物学、基因工程的顺序安排课程教学最为合适。

由以上可知，由于历史的原因，生物化学、细胞生物学、遗传学、分子生物学、基因工程学相互联系，交叉渗透，研究内容重复较多。因此，本研究根据其定义、逻辑关系及发展历史，同时为编写教材和教学的方便，建议生物化学、遗传学、细胞生物学、分子生物学、基因工程学教学内容如下。

（1）生物化学主要教学内容主要有：蛋白质化学、核酸化学；酶学基础；糖代谢与生物氧化；脂类代谢；蛋白质的分解代谢等内容。而将DNA复制、转录、翻译、突变、修复及原核生物和真核生物基因表达调控留在分子生物学讲授。

（2）细胞生物学的教学内容主要有：细胞的基本结构；细胞生物学研究方法；细胞膜的结构与功能及物质跨膜运输；细胞质基质与细胞内膜系统；细胞通讯与信号传递；线粒体和叶绿体；细胞核与染色体；细胞骨架；细胞增殖及其调控；细胞分化、衰老与凋亡。

（3）遗传学的教学内容主要有：遗传的分离规律；独立分配规律；连锁和交换遗传规律；基因互作及其与环境的关系；基因定位与连锁遗传图；性别决定与伴性遗传；基因及染色体变异；染色体畸变；数量性状的特征及其多基因假说；近亲繁殖和杂种优势；细胞质遗传；遗传重组。

（4）分子生物学的教学内容主要有：DNA的复制、转录、转录后加工、基因突变与修复、蛋白质生物合成和翻译后加工、原核生物基因表达的调控、真核生物基因表达的调控。

（5）基因工程学的主要教学内容有：基因工程技术的原理和应用等。

以上各门课的教学内容相对前述和我国现行教材的教学内容作了较大调整，例如；核酸和蛋白质的组成及结构只在生物化学中讲授，细胞信号传递只在细胞生物学中讲授，基因工程原理只在基因工程学中讲授，避免了课程内容的重复。

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篇6

河北大学临床医学院河北省保定市071000【摘　要】关于肿瘤发生机制的研究虽然已有百年的历史，但时至今日依然没有完全解开。随着越来越多的实验结果不能用传统的体细胞突变学说解释，一些新的学说如肿瘤干细胞学说应运而生。本文就肿瘤干细胞的起源、特性与应用作一简要分析。

关键词 肿瘤干细胞；研究；分析

1959年，Makino提出肿瘤干细胞（tumorstemcells，TSC）假说并认为肿瘤细胞是由与正常干细胞相似的一小部分细胞分化而成的，但很长时间此假说并未得到重视。直到1997年Bonnet[1]etal成功分离出并证实了表型为CD34+/CD38-的白血病干细胞，加上人们对体细胞突变理论正确性的逐渐质疑，TSC假说在当时得到了广泛关注，直到今天，TSC的相关研究依然是主流热点之一。

1肿瘤干细胞的起源

关于肿瘤干细胞的起源目前尚无定论。Clark[2]etal认为TSC来自正常干细胞，因为其在生物学特性等方面与正常干细胞相似；国内学者王瑞安[3]提出“干细胞错位学说”并认为浸润癌的产生是由于上皮性干细胞误入结缔组织间质而形成。另有学者认为其起源于分化成熟的细胞去分化所得。但不论如何，肿瘤干细胞与正常干细胞生物学行为的相似性这点毋庸置疑，因此大部分学者认为肿瘤干细胞是通过某种方式由正常干细胞转化而来。

2肿瘤干细胞的特性

TSC与正常组织干细胞在生物学特性上具有较多相似性，比如具有较强增殖的能力，并且能自我克隆出子代TSC和分化出其他肿瘤细胞；TSC也存在正常组织干细胞不具备的生物学特性。一般认为，干细胞对化放疗敏感，而TSC对化放疗具有较强耐受力，且此能力会随着化放疗的进程而加强。Woodward[3]etal研究表明，在对乳腺癌放疗后TSC比例并未下降反而增高；Lagadec[4]etal进行动物实验时发现，放射线照射后的乳腺癌干细胞转化为乳腺癌细胞的能力是原先的30倍，传统的化放疗治疗并未对TSC产生有效作用，反而促进了肿瘤的复发，可能这就是目前积极治疗肿瘤后复发率仍然较高的原因之一。

3肿瘤干细胞的应用

TSC假说的提出使人们逐渐转变了传统治疗恶性肿瘤的思维，并在恶性肿瘤的治疗中把注意力从杀灭肿瘤细胞转移到积极杀灭TSC中去，目前已经有了一些成果：Li[5]etal通过实验研究得出DCLK1是存在于结肠癌干细胞上的表面标识，并为TSC的靶向治疗提供了基础；Liu[6]etal发现Gd@C82(OH)22能够调控肿瘤微环境，有效抑制乳腺癌干细胞自我更新，实现杀灭肿瘤干细胞，并能终止肿瘤发生与转移。越来越多的研究表明，只有真正杀灭肿瘤干细胞，恶性肿瘤才能得到控制，其相关治疗具有较好的应用前景。

4结语

肿瘤干细胞假说可以看做为体细胞突变学说的一个很好的发展或者纠正，虽然目前尚未能从普遍上证明TSC学说的正确性，但越来越多的实验能够证明TSC确实存在并影响肿瘤的发生。相信随着研究的深入，肿瘤干细胞的研究将会取得更多进展并早日应用于临床，从而为肿瘤的治疗提供新的思路。

参考文献

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篇7

【关键词】 耐万古霉素；金黄色葡萄球菌；生物学特征；细菌检测

金黄色葡萄球菌是社区获得性肺炎的常见病菌，2002年首次报道耐万古霉素葡萄球菌，2004年JAMA在职报道毅力患者体内分离出该病菌，临床常用的检测及药敏试验未能检测出耐万古霉素金黄色葡萄球菌[1]，我院采用万古霉素体外诱导方法将1株，异质性万古霉素耐药金黄色葡萄球菌（h-VRSA）诱导为耐万古霉素金黄色葡萄球菌（VRSA），观察其生物学特点，现报告如下：

1资料和方法

1.1一般资料 标准金黄色葡萄球菌（ATCC 29216）和异质性万古霉素耐药金黄色葡萄球菌分离菌株10833来源于我院检验科，血浆凝固酶（+），触媒（+），GPI编码：76134056712。

1.2方法卵磷脂吐温80琼脂，微量生化反应管，万古霉素纸片，盐酸万古霉素、MH琼脂、肉汤、GPI鉴定卡，聚合酶链反应（PCR）试剂、PCR扩增仪、ZF紫外分析仪。按照10827筛选方法操作，确认为h-VRSA，将该菌株接种于万古霉素选择性培养基内，诱导出VRSA，并接种于血琼脂平板、兔血浆、MH肉汤，观察菌落形态、溶血环及色素，应用手工法、仪器法、PCR法测定金黄色葡萄球菌基因序列[2]，采用菌谱分析法，检测对万古霉素的敏感性。

1.3 统计学处理 应用SPSS13．0软件进行统计学处理，计数资料以％表示，计量资料以(x±s)表示，组内和组间比较分别采用t检验和x2检验。P

2结果

2.1 VRSA菌群特点与标准金黄色葡萄球菌比较见表1

表1 VRSA菌群特点与标准金黄色葡萄球菌比较

生物学形态 标准金黄色葡萄球菌 VRSA

菌落形态及大小 均匀 大小不均

溶血环 清晰、宽大 窄小、无

色素 淡黄 灰白

凝固酶 阳性 阴性

金黄色葡萄球菌耐药后色素、溶血环消失，菌落变小，凝固酶阴性。

2.2VRSA实验室检测分析见表2

表2VRSA实验室检测分析

鉴定方法 标准金黄色葡萄球菌 VRSA

手工法 金葡菌 溶血葡萄球菌

仪器法 金葡菌 溶血葡萄球菌

PCR 金葡菌 金葡菌

实验室常用细菌鉴定方法将其鉴定为溶血葡萄球菌或者模仿葡萄球菌，PCR检测方法能正确鉴定VRSA诱导菌。

2.3 VRSA药敏试验结果纸片法和仪器法对于h-VRSA和VRSA均能检测到，微量肉汤对VRSA能检测到，对h-VRSA容易漏诊。

3讨论

万古霉素通过与肽聚糖前体D-D丙氨酸-丙氨酸结合，组织转糖基和转肽作用，抑制细胞壁的合成，发挥杀菌作用，其耐药机制尚未明了，有资料报名，金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐药机制不是单一的。细胞壁增厚是其主要耐药机制，增厚的细胞壁通过阻塞、亲密诱捕引起耐药，万古霉素与丙氨酸残基结合，阻塞其网状结构[3]，阻止万古霉素向细胞质膜渗透，同时细胞壁上增多的肽聚糖单体与万古霉素结合，大部分药物结合在细胞壁上，不能到达细胞质膜。金葡菌分泌一种肽，可以通过信息传导途径把耐药质粒转移到金葡菌体内。本次实验表明，VRSA生物学特性改变主要是细菌菌落变小，色素消失，溶血环消失，凝固酶转阴，细菌菌落变小，提示耐药菌培养时间延长。VRSA生物学特征改变，对细菌鉴定结果也产生影响，手工法和仪器法错误鉴定为溶血葡萄球菌和模仿葡萄球菌，在采用PCR技术检测VRSA的nuc基因[4]，特异性表达于金黄色葡萄球菌，可应用于VRSA和h-VRSA的鉴定，这说明耐药菌生物学特征改变导致仪器法和手工法检测错误，金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药后，生物学发生变化，容易导致细菌鉴定结果错误，应引起临床重视。

参考文献

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篇8

关键词：犬细小病毒；分离；鉴定

中图分类号：S852.65+9.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）20-4576-03

犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）属于细小病毒科细小病毒属，为单股、负义、线形无囊膜的DNA病毒[1]。CPV可引起犬的出血性肠胃炎和心肌炎，并使白细胞大量减少，在幼犬中的发病率和死亡率都很高[2]。CPV对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力，在4～10 ℃存活6个月，37 ℃存活2周，56 ℃存活24 h，80 ℃存活15 min，在粪便中可存活数月至数年[3]；该病毒对乙醚，氯仿和醇类有抵抗力[4]。CPV一年四季均可发病，以冬、春多发[5]，饲养管理条件骤变、长途运输、寒冷、拥挤均可促使该病发生[6]。病犬是主要传染源，其呕吐物、唾液、粪便中均有大量病毒[7]。根据临床症状和血清学反应，可做出准确诊断[8-13]。本研究通过对山东毒株分离，并对其部分生物学特性进行研究，为该病的防治和后续研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 DMEM培养基为Gibco产品；小牛血清、谷氨酸胺、双抗、胰蛋白酶等购自大连宝生物TaKaRa有限公司；其他化学试剂均为分析纯试剂。

1.1.2 病料 病料为2009～2011年聊城大学兽医院收集或其他养犬场送检的可疑CPV病料，包括20份粪便样品和10份脏器。

1.1.3 试验动物和细胞 8只40～50日龄的山东细犬幼犬（抗CPV HI抗体效价小于1∶4），健康状况良好；猫肾传代细胞系（F81）和犬肾传代细胞系（MDCK）等由聊城大学农学院实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 试剂的配制

1）1%猪红细胞悬液的制备。用20 mL注射器内吸入阿氏液3～5 mL，于健康猪前腔静脉采血10～15 mL，立即混匀，4 ℃保存备用。使用时用PBS洗涤保存的猪红细胞，1 000 r/min离心5 min，洗涤3次，取红细胞泥1 mL加稀释液100 mL，再加入小牛血清白蛋白0.1 g，即为1%猪红细胞悬液。

2）HA抗原配制。用移液器向V型血凝板每孔加稀释液25 μL，然后吸取25 μL经福尔马林灭活的CPV细胞培养物，在血凝板上倍比稀释，最后1孔不稀释，作为阴性对照；接着每孔加稀释液25 μL和1%猪红细胞悬液50 μL，于振荡器上振荡1 min混匀，于4 ℃冰箱静置1～2 h，待红细胞完全沉淀后判定。判定的方法是以50%红细胞凝集为终点，在对照孔红细胞完全不凝集，呈圆形小点沉于孔底时，凝集终点的稀释倍数即为该抗原的HA效价，将此效价除以8，即是8单位血凝抗原的稀释倍数。

1.2.2 病料的处理

1）粪便样品的处理：将病犬粪便用DMEM培养液稀释（m∶m=1∶9），再加等量的氯仿混匀，4 000 r/min离心10 min，取上清，加入双抗200 μL，4 ℃过夜，再经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20 ℃保存备用。

2）脏器样品的处理。将脏器样品用灭菌后的研磨器进行研磨，并反复冻融3次，同时加入9倍体积的DMEM细胞培养液，5 000 r/min离心25 min，取上清液，经过滤除菌。将处理好的样品置-20 ℃保存，待分离鉴定。

1.2.3 血清样品HI抗体效价的测定 取待检血清0.2 mL，加入猪红细胞悬液1滴，混匀于室温吸收1 h，离心取上清液待检。先用移液器向血凝板每孔加稀释液25 μL，然后吸取待检血清25 μL，在血凝板上倍比稀释，最后2孔不稀释作为对照，每孔加8单位HA抗原25 μL，最后1孔不加，作为血清对照。加完后振荡混匀，于4 ℃冰箱静置1～2 h判定。判定的方法是以完全不凝集为终点，在抗原对照孔完全凝集，血清对照孔完全不凝集的情况下，血清出现终点抑制的稀释倍数，即为该血清的HI效价。

1.2.4 病毒的分离 采用同步接毒法，在F81细胞消化传代后，按培养液量体积的1/10接入处理过的样品，37 ℃静置培养3～5 d，每天观察有无细胞病变。如无细胞病变，则于培养的第4～5 d收取上清，继续按常规传代培养，至第5代仍无病变判为分离结果阴性；若出现细胞病变则分离结果为阳性，反复冻融3次，收毒，-20 ℃保存。

1.2.5 生物学特性鉴定

1）理化特性。按《动物病毒学》[3]规定进行，取分离病毒的F81细胞培养物，分别做以下处理：50 ℃水浴作用60 min；加20%乙醚振荡10 min，放4 ℃过夜，并无菌挥发除去全部乙醚；将病毒液调节pH为3时于4 ℃作用处理1 h，再用0.1 mol/L NaOH调至pH 7.2，进行耐酸性试验，然后分别用F81细胞测定其TCID50变化。

2）红细胞血凝试验。采用微量血凝（HA）试验，分别用0.5%的鸡、猪、大鼠、兔和人（O型）的红细胞悬液测定病毒培养液的HA效价。

3）细胞敏感谱。选用猫肾传代细胞系（F81）、犬肾传代细胞系（MDCK）作为接种对象，分别分离得到HA效价≥1∶128的细胞培养液。按常规方法进行同步接毒，37 ℃静置培养24 h后，换液，每天观察细胞病变（CPE），4～5 d收获冻融，再以同样方法连传5代，以出现CPE作为感染指标。

1.2.6 动物回归试验

用所分离的CPV分离株1，2和3（HA效价均为1∶512～1∶2 048）对试验犬进行人工感染试验。接种途径为口服，剂量为5 mL，设空白对照组和试验组。将幼犬随机分为4组，每组2只。试验Ⅰ组幼犬接种分离株1；试验Ⅱ组幼犬接种分离株2；试验Ⅲ组幼犬接种分离株3；将第4组设为空白对照，接种生理盐水。对4组试验犬进行隔离饲养。接种后，每天观察试验犬的临床变化并进行体温的测量，每3 d进行一次白细胞计数，自接种后5 d开始收集粪便，并进行CPV的HA/HI检测。攻毒后观察15 d，如无眼观临床症状、白细胞总数正常，则视为试验犬健康。

2 结果与分析

2.1 病毒分离结果

将处理后的病料接种F81细胞后，采用同步接毒进行病毒分离。在第一代细胞病变不明显，但盲传至第3～5代时，部分接毒细胞出现细胞圆缩、拉网和脱落等细胞病变，而对照细胞排列紧密，生长旺盛，呈不规则形（见图1～2）。试验共从3份病料中分离出病毒，分别命名为CPV分离株1、分离株2和分离株3。

2.2 生物学特性

1）理化特性。经50 ℃、20%乙醚和酸（pH 3.0）处理后，通过比较处理前后TCID50的变化发现TCID50效价相差都小于2个数量级，变化不大。说明分离毒株能抵抗乙醚、酸（pH 3.0）和热（50 ℃），这与细小病毒理化特性一致。

2）红细胞血凝结果。采用微量血凝试验测定各病毒分离株对鸡、猪、大鼠、兔和人红细胞的HA效价。分离株对猪红细胞的凝集效价达到1∶27～1∶210；而对其他红细胞的血凝效价为20，没有血凝性。与文献记载的CPV血凝谱相符。

3）细胞感染谱。将CPV分离株在多种细胞上同步接毒培养5代，并每天观察CPE。结果表明，有3株CPV分离株连续传代后出现细胞病变现象，分别命名为分离株1、2、3。

2.3 动物回归试验结果

用病毒分离株感染幼犬后第5～6天，试验组均发病。其中试验Ⅲ组即接种CPV分离株3的2只幼犬在接种后第5天开始出现临床症状，精神沉郁，呕吐，排稀粪。随后转为拉血、脱水、食欲废绝，最后死亡。

对病死幼犬病理剖检发现空肠和回肠局部充血、粘膜脱落，肠系膜淋巴结肿胀，肠腔内有血样粪便。其他2组试验组犬接种后第6天表现出精神沉郁，体温增高，食欲下降，拉稀便，但后来自行康复。所有接毒试验犬的白细胞总数均出现不同程度的下降。但对照犬的白细胞总数没有明显变化。

试验组犬在攻毒后5～8 d，幼犬粪便的HA效价为1∶128～1∶512，对照犬的粪便HA检测结果均为阴性。

3 讨论

3.1 病毒分离

本试验通过采集疑似CPV感染犬的粪便和内脏，经处理后接种于猫肾细胞分离病毒，然后通过对分离病毒的生物学特性、血凝抑制试验和动物回归试验等方法对病毒株进行了鉴定。

CPV无囊膜，用氯仿处理粪便可使有囊膜的病毒失活，有利于该病毒的分离和纯化。部分出血很明显的细小病毒样本，反而没有分离出病毒。可能因为在疾病中后期，由于肠道出血，血液中的犬细小病毒抗体和细小病毒形成抗原抗体复合物，造成样品中的病毒量减少，细胞分离呈阴性。粪便中毒素和组织分解代谢产物会对培养细胞产生一定的影响。因此，如何处理粪便，尽量减少对细胞的毒性，成为能否成功分离病毒的关键。可以减少接种样本数量（1/20～1/30），或接种后及时换液，可有效降低粪便中毒素对细胞的毒害作用，提高病毒分离率。CPV的复制须完全依赖宿主细胞DNA的复制机制，复制主要发生在细胞周期的S期晚期和G2早期，病毒的接种最好采用同步接种方式。所以，在试验中采用了同步接毒的办法。但由于样本的毒性，可以在传代后6～8 h再接种，能减少样本对细胞的影响。

3.2 病毒鉴定

通过对分离的病毒进行理化鉴定，发现所分离的病毒具有抗酸、抗脂溶剂和耐热的特性，与文献报道的细小病毒的理化性质一致。通过对不同动物红细胞的血凝谱测定，所分离病毒能够凝集猪的红细胞，不能凝集鸡、兔和人的红细胞，与报道的CPV的血凝谱一致。病毒除了能在F81细胞增殖外，病毒株2还可以在MDCK细胞增殖。病毒血凝抑制试验进一步确认所分离的病毒血凝特性能够被犬特异性细小病毒血清抑制，证明试验中分离到的病毒为犬细小病毒。

3.3 动物回归试验

为了检验所分离犬细小病毒的致病性，进行了动物回归试验，分别将3株病毒人工接种试验犬。动物试验结果显示，试验组均发病，表现为拉稀、脱水、精神沉郁、食欲废绝，对照组健康。

本试验采用F81细胞同步接毒的方式从送检的疑似CPV感染的30份样品中分离出3份CPV阳性样品。并对分离病毒进行了生物学和动物接种试验，检验了分离病毒的致病性。其中分离株3可以引起接种幼犬死亡，表明是一株犬细小病毒的强毒株。本研究为犬细小病毒病的预防和控制提供了理论依据，同时为深入研究该病毒的致病机理奠定了基础。

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篇9

1制造

1．1总体要求

重组DNA技术产品安全有效的保障，不仅需要对目标产品的原液和成品进行质量控制，而且还需要对起始原材料和工艺过程进行充分控制。即应对包括细胞株的来源、鉴别和检测、发酵或细胞培养、生产中使用的其它原材料、验证纯化工艺去除不需要物质的能力(特别是可能存在的病毒污染物、来自连续培养哺乳动物细胞的残余DNA、宿主细胞蛋白等)、生产工艺中的过程控制、因生产工艺的变化对产品质量安全和有效性的潜在影响，以及原液和成品全面的质量分析均给予必须和足够的重视。

1．2起始原材料的控制

重组DNA技术产品须采用经过验证的细胞库系统进行生产，首先应将宿主与载体结合制备主细胞库，再由主细胞库制备工作细胞库。并需建立相关文件，详细描述培养、提取、纯化的步骤以及对细胞库批次的定义。如生产中使用人或动物来源的材料，则应符合病毒安全的有关要求。

1．1．1表达载体和宿主细胞应提供宿主细胞和表达载体起源、来源、遗传背景和历史的描述，包括克隆基因的来源和特性、该基因的构建和鉴别情况，以及表达载体遗传特性和结构等详细信息。同时应提供表达载体来源和各部分功能的说明，如:复制起始位点，启动子，抗性标记，限制性内切酶图谱等。详细描述表达载体扩增、对宿主细胞的转化方法，以及生产用细胞克隆的筛选判定标准。提供表达载体在宿主细胞中的位置和物理状态、如是否整合到染色体上，以及拷贝数和遗传稳定性资料。明确插入克隆基因、表达载体控制区及其两侧的核苷酸序列，与表达有关或与产

品质量相关的核苷酸序列均应详细叙述。同时也应详细描述在生产过程中控制、提高克隆基因在宿主细胞中表达水平的各种措施。1．1．2细胞库系统重组DNA技术产品的生产中，其细胞库系统通常包括主细胞库和生产工作细胞库。主细胞库(maincellbank，MCB)由含目的基因表达载体转化的原始细胞经传代扩增制成的均一悬液，并以等体积分装于单独容器中用于储存(如，在液氮中)。在某些情况下，可能需要分别建立表达载体和宿主细胞的主细胞库。工作细胞库(workingcellbank，WCB)是从主细胞库经有限传代而来的细胞材料的均一悬液，并以等体积分装于单独容器中用于储存(如，在液氮中)。以上两种细胞库，所有的储藏容器应在相同条件下妥善保管，一旦取出使用，不得再返回库内储藏。细胞库类型、容量、在预期使用频率下细胞库的寿命、保存使用的容器和封闭系统、包括冻存剂、培养基、冷冻保存步骤和存储条件等细胞库制备的方法均应详细记录在案，并提供在已优化储存条件下，库存细胞稳定性的证据。

1．1．3细胞库的控制应对主细胞库包括重组蛋白表达和/或表达载体在内的相应表型和基因型标记进行鉴定。对特定主库细胞基质的检测，可根据细胞的生物学特性和培养的历史背景进行相应调整，并且该鉴定的范围和程度，可能会影响到后期生产阶段细胞基质所需常规检查的类型和级别。应采用分子生物学或其他适合的技术对表达载体基因拷贝数、基因插入或缺失、整合位点数量等情况进行分析。核酸酸序列应与表达载体一致，并与所预期表达的蛋白序列吻合。由于支原体、病毒等外源因子污染动物来源的细胞基质后，可以进行扩增，同时逆转录病毒等内源因子也会引发安全问题，因此对细胞基质内、外源病毒因子的检测十分重要。应制定和建立细胞库微生物有机体检测的策略和方法，并考虑采用适当的检测技术以确认某些特定病毒是否存在。通常受到内、外源因子污染的细胞基质是不适合用于生产的。但也存在例外，例如CHO和其他携带内源逆转录病毒的啮齿类细胞株，已广泛用于重组DNA技术产品的生产。在这种情况下，应纳入风险降低与控制的策略，如在工艺中采用物理、化学或酶解等手段对其进行去除或灭活。应提供建立工作细胞库的规程，每批WCB均应按规定进行一次全面的鉴别和纯度测定，并制定包括分析方法、判定标准的在内的WCB质量标准，新建WCB也应符合该质量标准的要求。

1．1．4细胞基质遗传稳定性应评估培养阶段细胞基质的稳定性，检测项目包括但不仅限于如:形态学特征，生长特征，生化标记，免疫标记，目的产物的表达量，或其他相关的基因型和核型标记。插入的核苷酸序列应至少在每一个主细胞库培养期末进行一次确认。长期发酵的多次收获物会导致一些质量属性的飘移，例如糖基化等。出现的“新”的变体可能会影响产品的质量、安全和有效性。这类飘移的管理应该在工艺验证研究中妥善地处理，明确宿主细胞在长时间培养后，表达产物分子的完整性，并且明确细胞基质的表型和基因型的特征，并综合上述特征提出生产用细胞最高限定代次。

1．3生产过程控制

生物技术药物的生产工艺基础是采用活体表达系统进行目标产品的制备，主要包括细菌、酵母和哺乳动物细胞大规模培养技术等。建议应采用适当的方式、检测频率，证实细胞培养过程中无细菌、酵母和霉菌污染。由于某些生产细胞株可能或含有内源性逆转录病毒，因此应建立相应的工艺和可靠的分析技术，证明在培养过程中有效的将所有病毒清除或灭活。对目标产品质量属性、生产工艺的深入理解和全面的设计，是建立可重复的、可控的工艺，保证稳定地生产出符合原液和成品质量标准的策略的一部分。因此，生产工艺可接受标准的限度，应根据从研发早期到规模化生产的整个工艺生命周期范畴中所获得信息进行调整。在原液和成品的生产中，需在关键决策步骤(criticaldecisionmakingsteps)实施工艺过程控制，其他工艺环节的支持数据可确保工艺的一致性。对那些影响原液质量的工艺参数应制定可接受标准进行控制。适当的工艺过程控制能够减少对原液和/或成品常规检测的需求。

1．3．1细胞培养在生产过程中使用的每种材料(如:溶剂，试剂，酶)都应进行鉴定。应提供对这些原材料来源、质量和控制的资料。应适当提供证明这些原材料(包括生物来源的原料，如:培养基组成物，单克隆抗体，酶)符合既定用途质量标准(包括外来试剂的清除和控制)及物料供应商变更情况的资料。(1)有限传代水平的生产应限定生产过程中的传代或群体倍增的最高传代次数(将从细胞冻融到生产结束的最大允许天数定义为细胞寿命的限度是可接受的)。应提供生产过程中培养、增殖和表达量一致性的数据。确立终止培养、废弃培养物以及摒弃收获物的标准。应提供经过长时间的培养后宿主细胞的表型、基因型特性以及所表达基因的分子完整性、一致性信息。证明上述特征的试验所涉及的传代范围应超过规定的细胞最高限定代次。还应建立生产末期宿主细胞/载体的一致性监测手段，如质粒拷贝数及其在宿主细胞内的状态等。(2)连续培养生产除上述要求外，细胞连续培养生产应根据系统稳定性和培养期间产品一致性的信息，明确连续培养的最长周期，并进行培养周期全过程的监测，监测类型及频率取决于产品和生产系统特点。应提供生产中产品变异体或其它培养参数未超过标准限度的数据。建立适合于收获阶段的微生物污染常规检测，明确收获物后续加工中对“批次”的定义。根据宿主载体系统的稳定性和产品特性等确定对细胞、产品进行再评估的时间间隔。常规生产过程中，无论采用上述哪种培养方法，还均应符合现行版《中华人民共和国药典》“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”的有关规定。

1．3．2纯化(提取回收和纯化extraction，recovery＆purificaiton)从发酵液或细胞培养液中提取、纯化蛋白主要依赖于各种蛋白分离技术。细胞培养或者酵母等真核发酵的优点是其蛋白产物大多都会分泌到培养液中，因此只要去除细胞或酵母就可以初步获得较高纯度的目的蛋白;而对于大肠杆菌等原核生产系统，常需要裂解细菌才能获得目的蛋白。分离纯化中，来自宿主细胞破碎后的微量蛋白酶会破坏蛋白的稳定性，且很难被去除，因此快速纯化目的蛋白十分重要。在采用各种分离纯化方法及任何新技术中，须保证分离纯化手段的稳定，如确保层析柱的柱效等性能一致。并对纯化工艺中可能残存的有害物质进行严格检测，这些组分包括但不仅限于固定相或者流动相中的化学试剂、各类亲和层析柱的脱落抗体或配基、以及可能对目标产品关键质量属性造成影响的各种物质。同时生物技术来源产品含有一些特定杂质，包括病毒、支原体等外源因子、核酸、宿主蛋白、内毒素以及源自培养液的各种其它残余物质，因此需特殊的工艺将其去除或降低至可接受的水平。残留细胞DNA(rcDNA):生产工艺的优化应考虑到对残留宿主DN断的大小、残留量和生物活性的影响。采用适宜的方式将rcDNA总量降至可接受的水平，并就降低rcDN段的大小、或者灭活其生物活性的方式进行说明。通常产品中rcDNA水平应处于小于10ng/剂量至10pg/剂量的范畴。病毒清除:对于人和动物源的细胞基质，病毒去除或灭活工艺均应充分显示能去除/灭活任何污染病毒、确保原液的安全性。该工艺应在小规模研究中验证，并仔细选择所用指示病毒，以评估所选择生产工艺整体去除/灭活病毒的能力，并确定病毒载量下降程度明显达到安全性边界。

1．4生产工艺变更

在重组DNA产品的生命周期中(lifecycle)，通常因工艺改进、规模扩大、场地变换、稳定性改进、或遵循法规要求的变化而进行相应的变更。当生产工艺发生重大变更的时候，应对变更前后生产工艺对重组DNA产品质量、安全性和有效性的影响进行比较和评估。这些可比性研究虽不意味着变更前后质量属性必须完全相同，但须证明它们的高度相似，并且现有知识能充分预测并确保任何质量属性方面的差异对安全性和有效性无负面影响。并应解释重大变更的原因，评估变更对质量、安全和有效性的潜在影响。

2质量控制

生物技术产品的质量控制与产品大小、结构特征、质量属性复杂程度和生产工艺相关。其质量控制体系主要包括:原辅料检验和放行、生产和过程控制及文件、无菌工艺、常规放行检定等。应通过终产品检测、过程控制和工艺验证结合的方法，确保各类杂质已去除或降低至可接受水平。生物技术产品质量控制的基本原则同样包括使用参照物质、用经验证的方法来评估已知和/或潜在产品、工艺相关物质。其和传统药物质控最主要差异是用于产品鉴别，一致性，纯度和杂质检测的分析方法不同。

2．1表征分析在研发阶段以物理、化学和生物学方法对重组DNA产品的理化特性、生物学活性、免疫学特性、纯度和杂质等进行严格的表征分析鉴定是至关重要的，并有助于质量标准的确立。对产品各种属性进行充分鉴定分析的初衷，是为了确保产品安全有效。因此需采用广泛的分析技术来展示目标分子不同的理化性质(分子大小、电荷、等电点、氨基酸组成、疏水性等)。对糖基化等各种翻译后修饰也应充分鉴定，并纳入适当的检测以确认产品具有预期的构象、聚集和/或降解状态及其高级结构。并应在适合的时候或条件下，将各类新型分析技术应用于表征分析。

2．1．1理化特性(1)一级结构一级结构，即包括二硫键连接方式的氨基酸序列。应尽可能使用综合的方法测定目标产品的氨基酸序列，然后与其基因序列推断的理论氨基酸序列进行比较。应注意可能存在的N末端甲硫氨酸(如:大肠杆菌来源的产品)，信号或者前导序列和另外可能的N、C末端修饰(如:乙酰化，酰胺化或者由于外肽酶导致的部分降解)，以及各种因N端和C端氨基酸序列变化导致的末端异质性(如:C端加工、N端焦谷氨酸、脱酰胺化，氧化，异构化，碎片化，二硫键错配，N-连接和O-连接的寡糖，糖基化，聚集)。同时还应确定游离巯基和二硫键，并就二硫键的完整性和正确性进行分析。(2)糖基化修饰应对糖基化修饰进行全面的分析和确定，如糖基化修饰与清除和生物学活性相关，则应确定糖的含量(中性糖，氨基糖和唾液酸)。另外，应尽可能对糖链的结构、糖型(触角、多糖本身的信息及特定位点的多糖分析)以及多肽链的糖基化位点进行深入分析。应特别注意的是，糖型结构可能与不良反应相关(如非人类的糖型结构或其残基)，必要时应进一步就电荷异质性进行检测分析。(3)高级结构应通过适合的物理化学方法表征高级结构并且通过生物学功能来确认。除生物学活性对高级结构的确证以外，体外或体内证实其治疗功能(functionalactivityofthetherapeutic)的活性分析方法，也可作为高级结构确证的补充。聚乙二醇修饰蛋白的分析不仅限于修饰的平均率，还应包括修饰位点及占据位点的分析。

2．1．2生物学活性生物学活性是指产品能实现确定的生物学效应的特定能力或潜力。生物学活性应通过体外、体内、生物化学(包括:免疫化学试验)的方法和/或适合的物理化学分析方法评估。效价测定(如:以单位、或国际单位表示)是与产品生物学特性相关属性为基础的生物学活性定量分析，而含量(以质量/重量表示)是物理化学方法测定的产品含量。对于效价的评价和赋值，在临床情况下，采用反映产品生物学活性的生物测定是较好的方式，但在批放行中未必是可行或者必须的。例如:一些蛋白功能方面的生物学测定或者作用机制评价方法(并不是预期的临床效果)也可作为效价分析和赋值的基础。

2．1．3免疫化学特性需全面说明产品的相关免疫学特性。并应使用纯化的抗原和抗原确定的区域进行结合实验测定。如可能的话，应确定亲合力和免疫反应性(包括与其它类似结构蛋白的交叉反应性)。对目标分子中，与相应表位作用的部分应尽可能的表征确证，如应包括这些结构的生物化学鉴别(如;蛋白质，低聚糖，糖蛋白，糖脂)和相关适合的特征研究(氨基酸序列，糖型)。由于糖基化和聚乙二醇化可能对产品的药理学性质产生影响，并可能影响其免疫原性，因此应进行适当的表征研究。

2．1．4纯度、杂质和污染物生物技术产品异质性的几个来源(如:C-端加工，N-端焦谷氨酸化，脱酰氨化，氧化，异构化，片段化，二硫键错配，N-连接和O-连接的寡糖，糖基化，聚集)通常造成其组成中存在几种分子或变异体，导致了其纯度/杂质情况的复杂性，因此需要通过综合的方法来评估，对于产品相关物质和杂质应建立个体的和/或总体的可接受标准。杂质可能与生产工艺或与产品本身相关。如可能，这些杂质应尽可能地被分析鉴定，并采用适宜的方法评价其对生物学活性的影响。同时应恰当地鉴别、评估潜在的工艺相关杂质(如:宿主细胞蛋白，宿主细胞DNA，细胞培养残留物，下游工艺的残留物)，并对其定性和/或定量分析。污染物，包括所有引入且并非生产过程所需的物质(如:各种微生物，内毒素)。应严格避免引入污染物/或对其进行相应控制。还应考虑采用其他检测方法，对可能的包括肽聚糖等在内的“非内毒素促炎性污染物”进行控制。(1)工艺相关的杂质和污染物工艺相关的杂质来源于生产工艺本身，主要包括细胞基质来源、细胞培养来源和下游工艺来源这三类。过程相关的杂质，并且可以分为三个主要类别:细胞物质衍生，细胞培养衍生和下游衍生。另一方面，例如外源病毒等污染物，因意外引入至生产工艺，并且是对生产工艺无用的材料。(2)产品相关物质和包括降解产物的杂质为了确定各种类型的修饰，可能需要付出相当大的努力对目标产品的各种分子变异体进行分离、鉴别和分析。当这些变异体的活性与目标产品一致时(comparable，一致性?)，这些变异体应被包括在产品的纯度中。但应适当考虑在生产和/或储存期间产品降解产物是否显著增加。3．1．5含量应采用适宜的物理化学和/或免疫化学方法进行含量测定。以适宜的参考品为对照，蛋白含量(以质量/重量表示)可通过合适的方法进行测定(如:HPLC)。蛋白含量也能通过一个绝对定量的方法测定，例如:采用280nm处的消光系数，并以紫外分光光度法测定。建议采用第二种绝对定量的含量测定方法进行溯源和验证，如果偏差太大，应考虑采用其他方法重新测定。

2．2常规放行质量控制在原液和成品的日常放行检定中，并不需要进行所有的表征分析检测。其中一些检测可能仅需在最初和/或定期进行，以建立或验证产品在生产过程的有效性或可接受性，如对生产初期的批次进行全面深入的表征分析，以确认在鉴别、纯度和效价等方面的一致性。而另一些检测要求在常规质量控制中进行。应对某一特定质量属性是否放入常规放行标准予以说明。应对一定数量的连续批次进行分析，以确定分析参数的一致性。任何批间的差异均应得到关注。应根据这些研究中得到的数据，综合临床和非临床研究，以及稳定性评价中收集的数据作为建立产品质量标准的基础。质量标准是一系列包括各种分析方法、及含有具体数值限度、范围可接受标准的综合描述。其目的是为了使原液、成品或原料在其生产的各阶段符合其预期用途所建立的一系列标准。“符合质量标准”意味着当按照列出的分析程序检测原液和成品时，其质量符合可接受标准。质量标准的可接受范围应依据研发过程收集的数据，包括从非临床、临床和稳定性研究得到的数据。可接受标准的范围确定应该考虑到所使用的分析方法的灵敏度。

2．1．1鉴别鉴别实验应高度特异，并应基于分子结构和/或其他专有属性的独特之处进行分析(如:肽图，抗独特型免疫或其他适宜的方法)。根据不同产品，其鉴别试验可能需要不止一种检测(物理化学的、生物和/或免疫化学)，这些检测应具备充分的特异性，以区分在同一生产设施下生产的其它产品。

2．1．2纯度和杂质需采用类似正交组合的方法来评估重组DNA产品纯度/杂质的复杂的情况，并为产品相关的变异体建立单独和/或总体的可接受标准。此外如适用，这些控制可进一步的确保产品的一致性。质量控制计划中包括的对工艺相关杂质的质量控制(如:蛋白A、宿主细胞蛋白、DNA、其他潜在的培养或纯化残留物)是原液质量标准的典型组成部分。在一些情况下，如经充分证明，工艺相关杂质的质量控制可在恰当工艺步骤中的中间产品进行。如经充分验证，生产工艺对工艺相关杂质的去除已达到高水平时，则这些工艺相关杂质的测定并非必须列入常规放行标准。

2．1．3效价效价测定是以产品生物学特性相关属性为基础的生物学活性定量分析，并且只要有可能，效价测定应反映或模拟其作用机制。比活性(每毫克产品具有的生物学活性单位)对证明产品的一致性具有重要的价值。只要有可能，原液和最终制剂的每个批次的效价应该使用适宜的国家或国际参比品，这个参比品的单位生物活性(比活性)通常已经过校准，例如国际单位(IU)。如果没有这样的参比品，经批准的内控参比品也可以用于方法的标准化(saystandardization)。

2．1．4含量采用适宜方法和参考品作为对照，测定原液和成品的含量3．1．5常规检测应该根据相关产品的个论视情况而定。检测可以包括外观(例如，形状、颜色)、溶解度、pH值、摩尔渗透压、装量、无菌、细菌内毒素、稳定剂和水分、可见和亚－可见微粒。

2．3包装及密闭容器系统原液和成品密闭容器系统的描述应包括容器组成成份的说明。如果蛋白质和制剂辅料和/或容器包装系统发生物理化学作用，可能导致潜在的免疫原性复合物形成。应评估但不仅限于容器吸附、产品和包装材料之间的浸出、容器完整性、产品免于污染及保持无菌的适用性，并描述预期用途。

3标签、储存和运输

除按中国药典对药品标签规定的内容外，标签还应标示下列内容:(1)每毫升的国际单位数(如必要);(2)每瓶容器的单抗含量或蛋白含量;(3)每瓶容器中液体样品的体积;(4)冻干粉中;(5)所加复溶液体的名称及体积;(6)复溶后的使用期限，确保该期限内各项检测均应符合规定的标准;(7)使用之前进行适量稀释(如果需要)。运输条件应能确保产品保持在适合的环境条件下。

4讨论及展望

篇10

【关键词】 胃肿瘤 胃癌 生物学特性 病理学分型 化学疗法 生存期

胃癌的腹膜种植转移是胃癌根治术后复发的主要原因［1］，而胃癌的淋巴转移对胃癌的预后有一定的影响。作者对289例胃癌淋巴结转移情况和浆膜脱落细胞进行研究，扩大手术范围，采用术前、术中化疗，以探讨胃癌生物学特性与预后的关系，为预防术后复发、转移，延长生存期，提高生存质量提供理论依据。

1 资料和方法

1．1 一般资料 1990年—1999年我院共施行进展期胃癌手术289例，男210例，女79例。年龄40～77岁，平均65岁。

1．2 方法 胃癌手术开腹后探查前用100～150 ml生理盐水倒入腹腔上部或盆腔，轻轻搅动后收集冲洗液，离心沉淀，吸取有核细胞层涂片4～6张，以瑞氏法和苏木精－伊红染色镜下观察有无脱落细胞，并对冲洗液的有核细胞层悬液进行了台盼蓝染色观察。

1.3 病理学分型及分组 根据病理学分型，分为高分化腺癌组（n＝135）、中分化腺癌组（n＝83），低分化腺癌组（n＝51）和其他病理类型组（n＝20），回顾性分析术后3年和5年生存率、复发及死亡原因。

1.4 术式及化疗方案 根据肿瘤分期、部位、类型选择D2、D3、D4式手术。化疗方案：术前选用FAM方案，术中温生理盐水420 ml+5-Fu 500 mg腹腔灌注冲洗。

1.5 统计学处理 用SPSS 12.0统计软件进行统计学分析，采用行×列表χ2检验，P

2 结 果

2.1 不同分化程度胃腺癌患者不同术式及化疗方案3年生存率的比较 见表1。

2.2 不同分化程度胃腺癌患者不同术式及化疗方案5年生存率的比较 见表2。表1 3种分化胃腺癌患者不同术式及化疗方案3年生存率的比较表2 3种分化胃腺癌患者不同术式及化疗方案5年生存率的比较组内与D2清除及D3、D4清除比较：P＜0.05

2.3 其他病理类型组生存情况 其他3种类型胃癌病例较少，其中印戒细胞癌9例，黏液细胞癌7例，其他类型癌4例（包括未分化癌、不能分类的癌等）。这20例患者亦采用了以上几种手术方式，经统计，无论采用何种术式及术前、术中是否化疗，生存期均未超过1年。

2.4 不同分化胃腺癌患者淋巴结转移率、冲洗液脱落细胞学阳性率、网膜种植转移率情况 见表3。表3 不同病理分型患者淋巴结转移率、冲洗液脱落细胞阳性率和网膜种植转移率情况

2.5 胃癌死亡原因 本组死亡病例共84例，其中腹腔广泛种植转移52例，肝转移22例，其他原因10例。

3 讨 论

胃癌的发病率及死亡率始终居消化系统恶性肿瘤之前列。当今胃癌的淋巴结清除范围，应根据患者的胃癌病期和癌肿的生物学特性加以区别对待。在此原则下，应充分考虑到患者的诸多个体特点，优选出合理的手术方案。对胃癌应根据不同病理类型和不同的病期选择合理的治疗方案，术前对于病理类型的判断尤为重要。很多研究表明新辅助化疗可以提高进展期胃癌的手术切除率及改善预后，因而广受重视。本组结果显示，早期及高分化癌的手术根治率较高，行新辅助化疗的意义不大，中晚期及高恶度胃癌则明显可以看出其作用，故术前对患者进行肿瘤分期和明确病理类型极为重要。

许多文献表明新辅助化疗可以提高进展期胃癌的手术切除率及预后，因而广受重视。早、中期胃癌手术切除治疗率高，行新辅助化疗的意义不大。肿瘤腹腔广泛播散或远处转移者预后太差，也不应纳入其范畴内。所以准确的术前术中分期对病例的术式选择至关重要［2］。从本组可以看出，肿瘤细胞分化程度越低，淋巴结转移越多，腹膜种植转移概率越高，说明其浸润广泛，对术后5年生存率有明显的影响。胃癌新辅助化疗有几个优势：①可以杀灭术区以外的亚临床转移灶，预防医源性肿瘤播散。②杀灭癌细胞，降低临床分期，增加手术切除率或根治性切除的机会。③获得肿瘤的个体药敏资料，为术后选择辅助化疗提供依据。④肿瘤对化疗的效果是判断患者预后的指标之一。

腹膜种植转移是胃癌患者术后最常见的复发形式，由于其早期诊断有一定困难，目前腹膜种植转移复发患者尚无有效的治疗方法［3］。从死因可以看出，患者术后复发主要为腹膜种植转移，术中预防医源性癌细胞脱落尤为重要。术中应注意无瘤操作技术，不用纱布擦拭手术野外的脏器，尽量减少暴露、擦拭、损伤腹膜，以免增加癌细胞的黏附因素；尽量防止血液流入腹腔，去除白细胞、血小板高黏附癌细胞的因素；同时腹腔灌注化疗必不可少，优点是腹腔内药物浓度高，可有效杀灭脱落的癌细胞。术前或术中证实有腹膜转移患者，除术中化疗以外，应于术后辅以腹腔灌注化疗及全身化疗，可望减少术后腹膜种植复发率。

手术范围的选择也极为重要。一些学者认为扩大胃周围淋巴结清除能够提高患者术后5年生存率，并且淋巴结清除及病理学检测对术后的正确分期判断预后、指导术后监测和选择术后治疗方案都有重要的价值［4］。D3术式在高分化癌中，并不比D2能提高生存率，反而增加了手术风险，而对于低度分化癌中，D3术式则是明显提高了5年的生存率，故根据病理切片类型选择术式，对于胃癌的预后也有明显的影响。从本组结果可以看出：高中分化腺癌行D2术式已能完成患者的治疗，而D3术式并不比D2术式生存率高，术前化疗及术中的腹腔化疗并不能提高生存率，反而增加了患者的创伤。低度分化癌单纯的扩大手术范围及单纯的腹腔冲洗、单纯的术前化疗，均能延长患者的生存期，而且联合应用时更明显地增加了疗效。 印戒细胞癌、黏液细胞癌等极高恶度胃癌，无论采取何种术式或是否采用术前术中化疗，均不能明显延长生存期。我们的研究结果表明，胃癌治疗应根据其生物学特性及病理学分型，采用合适的手术范围及术前术中化疗等措施，可明显延长生存期，改善生存质量。

总之，在胃癌治疗过程中，应重视其生物学特性对预后的影响，结合病理诊断及其分期，采取不同的术式，术前术中采用不同的预防措施，可明显延长患者的生存期及改善生存质量。胃癌的治疗选择及预后取决于多种因素，本文仅从病理类型方面作了初步探讨，其他因素的影响还有待深入研究。

【参考文献】

［1］ 张文范.影响胃癌根治切除术后长期生存因素的探讨——附术后生存5年以上88例分析［J］.肿瘤防治研究，1982，9（1）：18-22.

［2］ Fink U， Stein HJ， Schuhmacher C， et al. Neoadjuvant chemotherapy for gastric cancer： update［J］. World J Surg，1995，19(4)：509-516.