单细胞研究范文

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篇1

关键词：固态发酵；单细胞蛋白；影响因素；单菌；混合菌

中图分类号 S816.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）19-105-04

Study on the Process of Producing Single Cell Protein Feed by the Skin of Grapefruit

Zhang Haitao1，2 et al.

（1 Hunan Agricultural University，Changsha 41000，China；2 Hunan University of Science and Engineering，Yongzhou 425000，China）

Abstract：Taking grapefruit bran as raw material，koningii，white mold，yeast，geotrichum as fermentation bacteria.through the standard curve with ovalbumin and Biuret reagent. the paper probed the single cell protein content after solid-state fermentation of single strain and mixed strain. It was found that the combination of Geotrichum with koningii has the best fermentation effect，and after 7d fermentation the medium content 8.060g protein，accounting for about 19% of the dry weight of the medium.Fermentation affected by the temperature，pH，inoculum size，medium’s water content. The orthogonal experiment showed that the combination of Geotrichum with koningii ’s best fermentation condition ，the optimum pH value is 5.5，the optimum fermentation temperature is 25℃，the optimum inoculation amount is 15%，the optimum medium moisture content is 65%. The impact of various factors on fermentation is fermentation temperature>medium’s water content> inoculation amount>pH.

Key words： Solid state fermentation；Single cell protein；Influencing factors；Single strain；Mixed strain

传统柚子果实加工后剩下的大量柚子皮往往被随意丢弃或集中作一般处理，对环境造成污染的同时也造成了资源浪费。研究表明，柚子皮中含有5%的果胶，还含有丰富的油皮苷、胡萝卜素、VB、VC、VP以及有机酸和高级醇，并且可以提取精油、柚苷[1]，因此柚子皮可以作为一种发酵基质，为微生物的生长提供丰富的营养成分。单细胞蛋白所含的物质成分丰富，被广泛用于饲料加工中，通过柚子皮渣固态发酵来生产单细胞蛋白，从而提高柚子皮中粗蛋白含量，使柚子皮作为一种饲料供动物食用，同时解决了废弃柚子皮渣对环境的污染，具有良好的社会效益和经济效益。本研究以柚子皮渣为原料，以白地霉、酵母菌、产朊假丝酵母、康宁木霉单菌种以及它们的混合菌种为发酵菌种[2]，筛选出最佳混菌组合以及最佳发酵条件，对提高柚子皮渣固态发酵效率和粗蛋白产量，以及保护生态环境具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基 （1）牛肉膏琼脂培养基：在烧杯内加蒸馏水100mL，放入牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，琼脂1.5g。烧杯外标记，加热溶解后加入琼脂，不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值为5.0～6.5，分装在各个试管内，高压蒸汽锅内121℃灭菌30min，室温后倒入试管制成斜面（8个），冷却后保存备用。（2）液体牛肉膏培养基制备：在烧杯内加蒸馏水100mL，放入牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g。烧杯外标记，加热溶解，补足失水，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值为5.0～6.5，分装于8个三角瓶中，高压蒸汽锅内121℃灭菌30min，冷却至室温后备用。（3）柚子皮渣固体发酵培养基制备：柚皮渣80g，麸皮20g，尿素1.5g，硫酸铵1.5g，磷酸氢二钾0.6g，硫酸镁0.05g，水65～70g，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调pH值为5.0～6.5，高压蒸汽锅内121℃灭菌20min。

1.1.2 主要试剂与仪器 硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁为分析纯，购于上海永叶生物科技有限公司；其它化学试剂均为分析纯。TG16C/TG16台式高速离心机，PHS-802中文台式酸度计，722型分光光度计等。

1.1.3 菌种 4株菌株都为真菌，分别为白地霉（Geotrichum candidum）；产朊假丝酵母（Candida utilis）；康宁木霉（Corning Trichoderma）；酵母菌（Yeast）。从武汉的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）购买，放冰箱冷冻保藏备用。

1.1.4 柚皮渣与麸皮来源 柚子为江永的香柚，将柚子洗干净剥开，取其柚子皮（果实以外的部分）用刀切成小块状，然后放入干燥箱里烘干至恒量，用研钵研碎，过100目筛，放干燥处室温保存备用。所用的麸皮从永州市零陵区的农产品市场购买，然后经过20目筛筛选后保存备用。

1.2 方法

1.2.1 双缩脲试剂的配制 将1g氢氧化钠溶于10mL水中，制成双缩脲试剂A；将0.1g硫酸铜溶于10mL水中，制成双缩脲试剂B。

1.2.2 菌种的活化与保藏 将冷冻保存的4菌株接种于4个斜面培养基上活化，在22～35℃条件下培养48h，再将斜面菌种挑取一环接于液体试管培养基中，22～35℃培养48h，作为一级种子培养基；以10%接种量接入装液量20mL/50mL于三角瓶液体培养基中，于22～35℃ 240r・min-1振荡培养24h，作为二级种子培养基，保存备用。

1.2.3 标准曲线的制作 用卵清蛋白作为标准样品制作标准曲线。准确称取卵清蛋白，以蒸馏水为溶液配制成2.0mg・mL-1的蛋白质溶液，取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL分别注入7支比试管中，先加入双缩脲试剂A再加入双缩脲试剂B，在15～25℃下放置30min，以介质溶液调零，测定标准液在560nm处的吸光度。

1.2.4 单菌种的发酵 用移液枪分别取4种二级种子培养液各4mL接种于4个不同的已灭菌的柚皮渣固态发酵培养基上（每取不同菌种时更换一次枪头），置于22℃培养箱，培养7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒重，以粗蛋白质含量为检测指标，分析各个菌种发酵前后产物中蛋白质含量的变化情况。

1.2.5 组合菌株的发酵 （1）双菌种的发酵。将4菌株分别“两两组合”，同时按1∶1的比例各取2mL二级种子培养液接种于已灭菌的柚皮渣固态发酵培养基上（每取不同菌种时更换一次枪头）置于22℃培养箱，培养7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒重，记录数据。（2）3菌种的发酵。将4菌株分别“三三组合”，同时按1∶1∶1的比例各取1.3mL二级种子培养液接种于已灭菌的柚皮渣固态发酵培养基上（每取不同菌种时更换一次枪头）置于22℃培养箱，培养7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒重，记录数据。（3）4菌种的发酵。将4菌株分别按1∶1∶1∶1的比例各取1mL二级种子培养液接种于已灭菌的柚皮渣固态发酵培养基上（每取不同种菌种时更换一次枪头）置于22℃培养箱，培养7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒量。

1.2.6 粗蛋白质含量的测定 （1）单菌种发酵培养皿中粗蛋白质含量的测定：从单菌种发酵的4个培养皿中取烘干之后的培养物各5g，分别用研钵研碎后倒入试管中，然后滴加95%乙醇，摇晃试管5min，取上清液于离心管中，反复3次，离心完成之后倒掉液体，先加入双缩脲试剂A再加入双缩脲试剂B（共2mL，A∶B=3∶1），摇晃离心管，然后将双缩脲倒入分光光度计玻璃柱中进行检测。（2）组合菌种发酵培养皿中粗蛋白质含量的测定：从组合菌种发酵的4个培养皿中取烘干之后的培养物各5g，分别用研钵研碎后倒入试管当中，然后滴加95%乙醇，摇晃试管5min，取上清液于离心管中，反复3次，离心完成后倒掉液体，先加入双缩脲试剂A再加入双缩脲试剂B（共2mL，A∶B=3∶1），摇晃离心管，然后将双缩脲倒入分光光度计玻璃柱中进行检测。

1.2.7 发酵因子对最佳菌种组合产粗蛋白质量的影响[3-4]

1.2.7.1 发酵温度 按1∶1取相同体积的康宁木霉与白底霉菌溶液各2mL混合，平均加入到7个已灭菌的固态柚子皮渣培养基中，分别放入温度为10、15、20、25、30、35、40℃恒温箱中培养7d，检测不同温度产物中蛋白质含量。

1.2.7.2 发酵pH值 按1∶1取相同体积的康宁木霉与白底霉溶液各2mL混合，平均加入到7个已灭菌的固态柚子皮渣培养基中，分别调节pH值为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5后放入25℃恒温箱中培养7d，检测不同pH值条件下产物中蛋白质含量。

1.2.7.3 接种量 按照1∶1取相同体积的康宁木霉与白底霉溶液分别以接种量10%、15%、20%、25%、30%对固态柚子皮渣培养基进行发酵，调pH值为5.5，放入25℃恒温箱中培养7d，检测产物中蛋白质含量。

1.2.7.4 培养基的含水量 按1∶1取相同体积的康宁木霉与白底霉溶液各2mL，平均加入到7个已灭菌的固态柚子皮渣培养基中（pH值为5.5），分别调节培养中的含水量为50%、55%、60%、65%、70%，放入25℃恒温箱中培养7d，检测产物中蛋白质含量。

1.2.8 正交实验 发酵温度、pH值、接种量、培养基的含水量都对菌种的生长代谢产生影响，通过取4因素（温度、pH、目筛目数、含水量）3水平的正交实验来确定最佳发酵条件组合[5]。

2 结果与分析

2.1 标准曲线 用卵清蛋白作为标准样品来制作标准曲线，通过计算称量后，准确称取卵清蛋白，以蒸馏水为溶液配制成2mg・mL-1的蛋白质溶液，分别取出0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL注入7支比试管中，先加入双缩脲试剂A再加入双缩脲试剂B（共2mL，A∶B=3∶1），在15～25℃下放置30min，调零，测定560nm处的吸光度依次为0、0.182、0.311、0.453、0.581、0.705、0.837，根据数据绘制标准曲线，如图1所示。

[y=0.4556x+0.0284

R2=0.9969][标准蛋白质溶液体积（mL）][吸光度（A）][1

0.8

0.6

0.4

0.2

0][0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.1]

图1 标准曲线

2.2 粗蛋白质的检测结果 根据测得的吸光度通过标准曲线计算出待测液浓度值，经换算可得粗蛋白产量。

2.2.1 单菌种发酵后粗蛋白的检测结果 康宁木霉、产阮假丝酵母、酵母菌、白地霉4菌种分别发酵后的粗蛋白含量为5.377g、4.723g、4.197g、6.316g，白地霉发酵获得的粗蛋白含量最高，达到6.316g。

2.2.2 混合菌种发酵后粗蛋白质含量的检测结果 不同菌种混合在相同条件下发酵后的粗蛋白含量如表1所示，从表1可知，11组混合菌中，白地霉与康宁木霉组合发酵产生的粗蛋白含量最高，达到8.060g。

表1 不同混菌组合发酵后产生的粗蛋白质含量

[菌种组合＼&粗蛋白质含量（g）＼&产阮假丝酵母+酵母菌＼&5.589＼&白地霉+康宁木霉＼&8.060＼&康宁木霉+酵母菌＼&5.786＼&白地霉+产阮假丝酵母＼&7.155＼&白地霉+酵母菌＼&4.098＼&康宁木霉+产阮假丝酵母＼&4.240＼&康宁木霉+产阮假丝酵母+酵母菌＼&4.125＼&康宁木霉+白地霉+酵母菌＼&5.554＼&产阮假丝酵母+酵母菌+白地霉＼&5.506＼&康宁木霉+产阮假丝酵母+白地霉＼&5.272＼&康宁木霉+产阮假丝酵母+白地霉+酵母菌＼&6.650＼&]

2.2.3 白地霉与康宁木霉混合固态发酵所产粗蛋白的影响因子分析 白地霉与康宁木霉组合在同等条件下固态发酵后所产粗蛋白含量最高，取该菌种组合进行影响因子分析，探寻该菌种组合最佳固态发酵条件。

2.2.3.1 不同温度对发酵产物中粗蛋白含量的影响 分别以10、15、20、25、30、35、40℃进行分组发酵试验，发酵后培养基中粗蛋白的含量如图2所示，从图2可知，当温度为10～25℃时，发酵后产物中的蛋白质含量不断增加，且温度为25℃时，产物中粗蛋白含量为最高，达到8.46g；当温度为25～40℃时，发酵后产物中的粗蛋白含量呈下降趋势，且温度在35～40℃范围内下降得最为明显。因此，可认定25℃为康宁木霉与白地霉菌种组合的最佳反应温度。

[粗蛋白含量（g）][10

8

6

4

2

0][0 10 20 30 40 50][温度（℃）][1.331][5.321][7.941][8.460][7.772][7.125][3.125]

图2 温度对白地霉与康宁木霉组合发酵后产物中粗蛋白含量的影响

2.2.3.2 不同pH值对发酵产物中粗蛋白含量的影响 pH值对白地霉与康宁木霉组合发酵产物中粗蛋白含量的影响如图3所示。从图3可知，该菌种组合发酵产物粗蛋白含量在pH值4～4.5以及5.5～7之间出现先增长后减少的趋势，而在pH值为5.5时发酵后的粗蛋白产量最高，达到8.161g。因此，可得出pH5.5为康宁木霉与白地霉组合菌种的最佳反应酸碱度。

[9

8

7

6

5][粗蛋白含量（g）][4.5 5 5.5 6 6.5 7][pH值][5.321][6.941][8.161][7.027][6.125]

图3 pH值对白地霉与康宁木霉组合发酵后产物中粗蛋白含量的影响

2.2.3.3 不同接种量对发酵产物中粗蛋白含量的影响 通过接种量的改变，来检测不同接种量对发酵产物中粗蛋白含量的影响。从图4可知，该组合菌种固态发酵后产物中粗蛋白产量随着接种量的改变而改变，当接种量为15%时，最有利于发酵产物中粗蛋白的产生。

[8.4

8.2

8

7.8

7.6

7.4][粗蛋白含量（g）][10 15 20 25 30 35][接种量（%）][7.43][8.25][8.11][7.92][7.82]

图4 接种量对白地霉与康宁木霉组合发酵后产物中粗蛋白含量的影响

2.2.3.4 不同培养基含水量对发酵后产物中粗蛋白含量的影响 不同培养基含水量对发酵后产物中粗蛋白含量的影响如图5所示，从图5可知，培养基含水量在50%～70%，该组合菌种发酵后产物中产粗蛋白的量都比较高，当培养基含水量为65%时，发酵后产物中的粗蛋白产量最高，达到8.075g。这是因为影响固态发酵速率的因素与是否有游离水的存在相关，因此基质含水量的变化对微生物的代谢与生长产生重要的影响。戴超[4]在影响固态发酵速率的因素及其控制策略中通过验证实验也证明了这一点，可知培养基含水量在65%为康宁木霉与白地霉组合菌种的最佳反应环境。

[9

8.58

7.5

7

6.5][粗蛋白含量（g）][50 55 60 65 70 75][培养基含水量（%）][6.845][7.883][8.102][8.705][8.012]

图5 培养基含水量对地霉与康宁木霉组合发酵后产物中

粗蛋白含量的影响

2.4 正交实验结果 取4因素3水平的正交实验确定最佳发酵组合如表2所示，从表2可知，最适水平最佳配比组合为A2B2C3D2。从正交表数据可知，温度25℃、pH值5.5、最佳接种量为15%、培养基含水量65%为最佳条件组合，由R值可知，各因素对发酵的影响大小为发酵温度>培养基含水量>接种量>pH。

表2 4因素3水平正交实验结果

[试验号＼&温度

（℃）＼&pH＼&接种量

（%）＼&培养基含

水量（%）＼&粗蛋白质量（g）＼&1＼&1（15）＼&1（4.5）＼&1（10）＼&1（60）＼&6.026＼&2＼&1（15）＼&2（5.5）＼&2（15）＼&2（65）＼&7.161＼&3＼&1（15）＼&3（6.5）＼&3（20）＼&3（70）＼&8.072＼&4＼&2（25）＼&1（4.5）＼&2（15）＼&3（65）＼&8.883＼&5＼&2（25）＼&2（5.5）＼&3（20）＼&1（60）＼&8.436＼&6＼&2（25）＼&3（6.5）＼&1（15）＼&2（65）＼&6.535＼&7＼&3（35）＼&1（4.5）＼&3（20）＼&2（65）＼&4.323＼&8＼&3（35）＼&2（6.5）＼&1（10）＼&3（70）＼&4.251＼&9＼&3（35）＼&3（6.5）＼&2（15）＼&1（60）＼&3.377＼&Ⅰ＼&14.564＼&13.936＼&16.812＼&17.839＼&T=57.064＼&Ⅱ＼&25.391＼&19.232＼&19.421＼&18.019＼&Ⅲ＼&11.911＼&17.984＼&20.831＼&21.206＼&K1＼&4.854＼&4.312＼&5.604＼&4.170＼&K2＼&8.463＼&6.410＼&6.474＼&6.999＼&K3＼&3.970＼&5.995＼&6.944＼&7.069＼&R＼&4.493＼&2.098＼&1.340＼&2.899＼&]

3 结论

（1）白地霉、产朊假丝酵母、康宁木霉与酵母菌分别发酵培养后产生的粗蛋白含量为5.377g、4.723g、4.197g、6.316g，白地霉发酵后产生的粗蛋白质含量最高，达到6.316g。

（2）白地霉、产朊假丝酵母、康宁木霉与酵母菌分别进行2菌种、3菌种以及4菌种混合固态发酵，检测固态发酵产物中发现康宁木霉与白地霉混合柚子皮渣生产蛋白质量高，达到8.060g，占培养基干重的19%左右。

（3）正交实验采用3水平（温度：A1=15℃，A2=25℃，A3=35℃；pH值：B1=4.5，B2=5.5，B3=6.5；接种量：C1=10%，C2=15%，C3=20%；培养基含水量：D1=60%，D2=65%，D3=70%）4因素（发酵温度，pH，接种量，培养基含水量）进行设计，结果发现康宁木霉与白地霉菌种混合组最佳条件组合为A2B2C3D2，即在温度25℃、pH5.5、接种量15%、培养基含水量65%的条件下最有利于柚子皮渣培养基的发酵。

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篇2

摘要：目的：探讨人脐血单个核细胞的分离培养和诱导后神经干细胞标志物mRNA的表达，并观察其致瘤性。方法：使用密度梯度离心法得到脐血单个核细胞，用体外贴壁生长的方法获得脐血间质干细胞(MSCs)。观察培养过程中脐血MSCs形态的变化，通过流式细胞仪检测干细胞表面抗原的表达。使用NGF和RA联合诱导后，用RT―PCR方法鉴定诱导前后神经干细胞(NSCs)标志物巢蛋白(Nestin)及Musashi-1蛋白mRNA的表达；收集培养后7d的MSCs，接种于裸鼠皮下，观察是否有增生物的出现，并观察细胞组织形态学变化。结果：脐血单个核细胞贴壁生长后大部分细胞呈梭形，诱导后可分化为神经元样细胞。流式细胞仪检测该细胞不表达CD34，CDlla和CD11b，强表达CD29，符合MSCs特征。诱导后，NSCs表面标志Nestin及Musshi-1表达明显增强(P＜0.05)，48h达高峰，然后逐渐减弱：细胞接种后12周，在裸鼠皮下不能形成肿瘤，与对照组相比，细胞形态学未出现恶性变化。结论：脐血中存在MSCs。分离后可以体外扩增，诱导后分化为神经元样细胞，并表达NSCs表面标志。在裸鼠体内不具有成瘤性。脐血能够成为NSCs的新来源。

关键词：脐血单个核细胞；神经干细胞；诱导分化；巢蛋白：致瘤性

中图分类号：R741

干细胞是指具有自我更新与多向分化潜能的细胞，它们在细胞疗法、基因治疗、发育学研究、药理及毒理学等研究中己显示出无可比拟的作用和优越性。近年来，神经干细胞fneural stem eells,NSCs)移植治疗中枢神经系统疾病引起人们的普遍关注，在动物实验中获得了较好的疗效，NSCs被认为是治疗神经系统疾病的良好载体。但是，由于来源的局限，NSCs的应用受到限制。成体干细胞是存在于发育成熟个体组织中的可自我更新和分化为原组织所有细胞类型的未分化细胞。根据其发育潜能可分为全能干细胞、多胚层多能干细胞、单胚层多能干细胞和定向专能干细胞。存在于骨髓基质中的间质干细胞(mesenehymal stem cdls,MSCs)是研究最早和最为深入的一类多能干细胞，其来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有广泛的分化潜能，已经有多项研究显示，外源骨髓MSCs移植入脑内，可以分化为神经细胞。表达神经元特异性标志蛋白。因为脐带血来源的MSCs和骨髓MScs有极其一致的生物学特性，且易于采集、制备及保存。免疫反应性低，因此可能更易于在临床上使用。本研究结合密度梯度离心和体外贴壁生长的方法得到脐血MSCs，诱导后检测其NSCs标志物Nesfin及Musashi-I的表达情况，并将培养后的脐血MSCs接种于裸鼠皮下，观察脐血MSCs对裸鼠的致瘤性，为应用于组织及其功能修复中提高该细胞的生物安全性提供新的依据。

1．材料和方法

1．1主垂试剂

高糖IMDM培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；淋巴细胞分层液(Cibco公司)；RNA提取试剂Tfizol(invit-rogen公司)；氯仿、异丙醇为国产分析纯试剂；DEPC水(sigma公司)；RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)；琼脂糖(sigma公司)。

1．2实验方法

1．2．1脐血间质干细胞的体外分离和扩增培养无菌条件下采集健康产妇足月妊娠顺产或剖腹产的婴儿脐带血50～100md肝素抗凝，与0.01moL/pH7.4的PBS按1:1混匀，再与3％的明胶1:1混匀，静置60min沉降红细胞。吸上清离心，弃上清，用PBS制成单细胞悬液，叠加到相对密度1.077的淋巴细胞分离液上，2000dr/min离心20min，取界面层，加PBS制成单细胞悬液，离心洗涤3次，弃上清。所得细胞以1.0x102／cm2(T-25培养瓶)的密度接种于含有15％胎牛血清的IMDM培养液(Hyclone公司，置于37℃、体积分数为5％的cm2、饱和湿度的孵箱内培养，3d后换液，弃去悬浮细胞，贴壁细胞继续培养，用倒置显微镜观察细胞形态的改变并照相。待细胞长到80％融合时，用2.5g/L的胰蛋白酶消化后传代。

收集分离后1h、培养后36、48、72h和5d的细胞，离心洗涤，在显微镜下，台盼蓝染色、计数，调整细胞密度备用。

1．2．2流式细胞仪检测取扩增一代的脐血间质干细胞，PBS洗涤后用2．5 WE的胰蛋白酶消化后制成1:0x106的单细胞悬液，共7管，1号管和2号管为阴性对照，分别加入抗鼠的IgG-FITC和IgG-PE单克隆抗体各5ml，其余5管分别加入抗人的CD34-PE，CD31-FITC，CDl3-PE，CD29-PE，CD44单抗各5m1．室温下孵育20min，流式细胞仪检测。

1．2．3脐血间质干细胞的诱导分化取原代细胞，加入20ng/m1 NGF和RA联合诱导培养，收集诱导前，诱导后36、48、72 h、5d的细胞，调整细胞密度备用。

1．2．4 RNA提取取诱导前，诱导后36、48、72h、5d的细胞各3x106个，融于1 mlTRIZOL试剂中，用吸管反复吹打后室温下孵育5min。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡后室温下10min。4℃，12000r/min离心15min后将上层无色液体移入新的EP管中。加入异丙醇，室温下放置10min，4℃，12000r/min离心10min弃去上清。加入75％乙醇，4℃，7500r/min离心5min，弃去上清液，风干，加入DEPC处理的纯净水40μl溶解后，55℃孵育15min。

1．2．5 RT-PCR采用相关软件设计引物，并由赛百盛生物工程公司合成。Nestin上游引物：5TCCTTTGACTTrCCTTGTC―TACCTCC 3，下游引物：5AAATCTGAAACTCAAGCACCA3：Musashi-l上游引物5TAATTCCTGTCCAGCAGTCTC3：下游引物5GAACCATCCCGTCCTGTATCAT3。对所提RNA进行定量，取1μgRNA转录成cDNA，在EP管中先后加入MgCL2×PCR buffer 1μl，RNase free H2O 3.75μl，dNTP lμ，RNase inhibor0.25μl，AMV逆转录酶0.5μl，oli-．go-dT接头引物0.5μl，RNA样品1μg，按照如下条件进行逆转录反应30℃10min，48℃50min，99℃5min，50℃5min。合成的cDNA进行PCR扩增。在EP管中依次加入下列物质：Taq酶0.25μl，10xPCR buffer10μl，纯净水27.75μl，

特异性上下游引物各0.5μl。内对照GAPDH上下游引物各0.5μl(30 μmol/L)，cDNA产物10μl，按照以下条件进行PCR反应。94℃预变性5min，94℃30s，57℃30s，72℃30s，30个循环后，72℃延伸7min。取5μlPCR扩增产物加样至含溴化乙锭(EB)20g/l的琼脂糖凝胶中，在5V/cm下电泳60min，紫外透视仪下观察结果，并用凝胶扫描成像系统照相，PCR定量分析软件进行分析。

1．2．6致瘤性取18只BALB/C裸鼠，随机分为3组，背部皮下组、颈部皮下组、对照组各6只。收集培养7d的MSCs，用PBS重悬并调整细胞密度为1x107/ml，非麻醉状态下，于裸鼠背部及颈部皮下分别无菌注射细胞悬液0.5ml，每只各4点．注入生理盐水作为对照组。定期观察，于3d、2周和8周取材，制作冰冻切片，HE染色，镜下观察。之后继续观察裸鼠生长情况至12周。

1．3统计学方法

数据以x＋s表示。采用SPSSl2.0软件对数据进行重复测量数据的分析，显著性水准取α=0.05。

2．结果

2．1脐血单个核细胞体外分离、培养后形态改变

培养前，脐血单个核细胞胞体较小，呈大小均一的圆形，直径约17μm，颜色较深，住高倍镜下可见其不停振动；培养后，细胞胞体增大，有破骨样细胞和梭形细胞两种形态。破骨样细胞胞体较大，呈圆形，多个核。梭形细胞大小不等。形态类似于骨髓MSCs，但较骨髓MSCs稍小。随着时间的推移，破骨样细胞减少而梭形细胞增多，即所需要的间质干细胞

2．2脐血干细胞的鉴定

流式细胞仪检测显示，扩增后的脐血MSCs既不表达造血干细胞的特异性表面标志CD34，也不表达内皮细胞的表面标志CD31，而CD29，CDl3，CD44等间质干细胞的表面标志均为阳性。这表明脐血MSCs是脐血中一群区别于造血细胞的处于未分化状态的非定向干细胞。

2．3诱导后NSCs标志物的表达

Nestin和Musashi-1作为NSCs的标志物已经得到广泛应用。通过RT-PCR检测诱导后这两个基因的表达，使用PCR定量分析软件，分析各样本的PCR光密度。将各样本的PCR光密度值除以内参GAPDH的PCR平均光密度值，重复测量5次。结果发现Nestin RNA在诱导前细胞中低表达，诱导后36h逐渐升高(p＜0.05)，72h后开始降低(p＜0.05)：Musashi-1RNA在诱导前细胞中低表达，诱导后48h呈高表达(P＜0.05)。

2．4致瘤性

于注射后3d、2周和8周取材，肉眼观察裸鼠背部无明显增生物形成。组织学观察接种3d局部有细胞团块存在，团块中心细胞部分坏死。2周时，细胞团块不明显，大部分细胞被吸收。8周时，接种区组织结构与未接种区无明显区别。裸鼠存活12周以上，未见有肿瘤形成。与对照组比较，生长情况与皮肤状况无明显差别。

3．讨论

NSCs具有自我更新和多分化潜能，为神经系统疾病如帕金森病、阿尔海默病、卒中的功能重建带来了希望。无论是作为脑组织移植的供体，还是作为体内诱导分化的靶细胞，NSCs都为中枢神经系统功能重建和神经再生提供了一条新的途径。但NSCs来源有限，不适于展开大规模临床应用。如何获取大量的NSC供临床使用已成为当今干细胞研究的热点和难点。近年发现骨髓MSCs和造血干细胞(hematopoldie stem cells，HSCs)可分化成神经细胞。由于脐血MSCs和骨髓MSCs有极其一致的生物学特性，脐血中的干细胞可能更原始，增殖分化能力更强；而且脐血来源广泛、取材方便，所含有的干细胞数量更多。因此使用脐血干细胞定向诱导分化为NSCs用于临床研究有广阔的应前景。

目前国内外学者已经使用多种方法从脐血中分离干细胞，最常用的方法是利用脐血干细胞体外贴壁生长的特性，将其从造血系统细胞中分离。此外，还可利用密度梯度离心、流式细胞仪分离法和免疫磁珠等方法。最近，有学者采用负极免疫筛选及限制性稀释的方法，分离得到脐血干细胞，使用流式细胞仪和免疫磁珠分离干细胞，操作方法复杂，花费高昂而且实验条件要求高。本实验结合使用密度梯度离心和体外贴壁生长的方法获得脐血MSCs，简单有效，成本低廉，对细胞损伤小，既适合各级实验室进行基础研究，也适合大规模将脐血细胞分离纯化，用于脐血干细胞建库㈣，应用于临床。

成功分离脐血干细胞后，使用NGF和RA联合诱导培养，用RT-PCR和免疫组织化学法检测神经干细胞表面标志物巢蛋白(Nestin)和Musashi的表达。NeSin最早由Lendahl等发现，其表达始于神经胚形成时，当神经细胞迁移基本完成后，巢蛋白的表达量逐渐减少，并随神经细胞分化的完成而停止表达。此外，Sakakibara等亦鉴定出一种RNA结合蛋白Musashi，作为神经干细胞的标志物，Nestin和Musashi作为早期原始神经细胞的标志物已被广泛地应用于NSCs的鉴定。本研究发现新鲜分离的脐血干细胞弱表达Nestin.不表达Musashi-I；诱导后，脐血干细胞的Nestin和Musashi-1表达域逐渐增强，48 h达到最强，进而逐渐减少。这表明脐血细胞具有向神经细胞分化的潜能。

篇3

[关键词]甘草酸；甘草总黄酮；细胞因子；抗炎

甘草作为常用中药，活性高、作用广，具有显著的抗炎活性[1-3]，临床用于急慢性肝炎、支气管炎、银屑病和艾滋病的治疗[4-8]。其中甘草酸和甘草总黄酮类化合物是其抗炎、抗变应性炎症的主要活性成分，其抗炎作用与减少巨噬细胞炎症介质生成与释放关系密切 [9]。 常规研究技术如ELISA、免疫组化和Western blotting等多针对于个别蛋白质进行研究，对甘草及其有效成分的抗炎作用机制研究虽然很多，但呈现指标分散和局限的特点，缺少对其抗炎作用的系统认识。

液相蛋白芯片技术是在流式细胞技术、ELISA技术和传统芯片技术基础上研发的新型蛋白质研究平台，具有同步性好、特异性强、通量大和准确性高等特性，可高通量检测多种细胞信号分子的表达水平，非常适合于细胞因子表达的系统研究。因此，本研究利用脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞RAW264.7炎症细胞模型[10]，应用液相蛋白芯片技术[11]，通过测定甘草酸和甘草总黄酮对该模型细胞因子表达谱的影响，对甘草酸和甘草总黄酮的抗炎作用机制进行了较为系统全面的研究。

1 材料

甘草酸（纯度为98%，批号ZL201203010A）和甘草总黄酮（纯度为95%，批号ZL201204010A）购自南京泽朗医药科技有限公司、地塞米松磷酸钠注射液购自天津金耀集团湖北天药药业股份有限公司（国药准字H12020514）、脂多糖（Escherichia coli O111：B4，L2630）购自美国Sigma公司、小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心、Hyclone南美胎牛血清购自美国Thermo公司、DMEM高糖细胞培养基购自美国Gibco公司、Bio-Plex ProTM Mouse Cytokine 23-plex Assay购自美国Bio-Rad公司、Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系统购自美国Bio-Rad公司、小鼠IL-6 ELISA试剂盒购自北京旷博生物技术有限公司。

2 方法

2.1 药品配置 甘草酸、甘草总黄酮和脂多糖分别溶于高糖DMEM培养液中，配置成质量浓度均为1 g・L-1的溶液，溶液用0.2 μm注射器式过滤器过滤，分装保存于15 mL锥型离心管，以上操作均在超净台中进行。

2.2 细胞培养 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7用含10%胎牛血清、100 U・mL-1青霉素和100 mg・L-1链霉素的高糖DMEM培养液，在37 ℃， 5%CO2的培养箱中培养。每2～3 d换液，取对数生长期生长状态良好的RAW264.7细胞进行实验。

2.3 细胞分组及处理 将细胞分为正常对照组、模型组（1 mg・L-1 LPS）、甘草酸高中低剂量组（400，80，16 mg・L-1）、甘草总黄酮高中低剂量组（200，40，8 mg・L-1）和地塞米松组（5 mg・L-1）。取对数生长期生长状态良好的RAW264.7细胞进行实验，弃去原有培养液，加入适量高糖DMEM培养液，反复轻轻吹打制成每mL含1×105个细胞的单细胞悬液。24孔细胞板每孔接种1 mL细胞悬液，培养24 h。依照实验分组分别向细胞板孔加入不同浓度的甘草酸、甘草总黄酮和地塞米松，孵育4 h后再加入LPS（1 mg・L-1）。20 h后收集各组细胞培养上清液，冻存于-80 ℃超低温冰箱中备用。

2.4 Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系统检测细胞因子 待检测细胞上清液样品在室温下完全溶解，1万r・min-1高速冷冻离心10 min，取上清液用缓冲液1∶10稀释。依据试剂盒说明，每孔加入50 μL抗细胞因子抗体检测磁珠，洗涤2次，向相应孔板加入缓冲液、标准曲线样品溶液、待检测细胞上清液样品。室温下避光500 r・min-1摇床上孵育30 min，洗涤3次。依次分别加入检测抗体50 μL和Streptavidin-PE荧光色素50 μL，操作同上。每孔用125 μL缓冲液重悬微珠，放入Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系统读取各孔荧光强度， 并根据标准品的荧光强度计算出样品中白介素类因子IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13，IL-17，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、嗜酸细胞活化趋化因子（Eotaxin）、干扰素-γ（IFN-γ）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1） 、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、巨噬细胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）、巨噬细胞炎性蛋白-1β（MIP-1β）、受调节激活的正常T细胞排泌的因子（RANTES）、小鼠角化细胞源性细胞因子（KC）共23种细胞因子的浓度。

2.5 ELISA法测定IL-6浓度 待检测细胞上清液样品在室温下完全溶解，1万r・min-1高速冷冻离心10 min，取上清液用缓冲液1∶10稀释。按照ELISA试剂盒说明书进行测定，根据标准曲线计算各组培养上清液中IL-6的浓度。

2.6 统计学处理 实验数据用±s表示，组间比较采用单因素方差检测法进行统计学处理，P

3 结果

3.1 LPS对RAW264.7细胞表达细胞因子的影响 在正常RAW264.7细胞中，各种细胞因子均有低表达，经LPS刺激后RAW264.7细胞表达大量的细胞因子（P

3.2 甘草酸对LPS诱导RAW264.7细胞表达细胞因子的影响 甘草酸可以明显下调LPS诱导RAW264.7细胞表达多种细胞因子，其高剂量组的作用效果优于5 mg・L-1地塞米松组。高剂量组对IL-1β，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13，Eotaxin和TNF-α的表达水平有明显的下调作用（P

3.3 甘草总黄酮对LPS诱导RAW264.7细胞表达细胞因子的影响 结果见表1。甘草总黄酮的作用效果接近于5 mg ・L-1地塞米松，对LPS诱导RAW264.7细胞表达的2种细胞因子水平有明显的下调作用：高剂量组能极明显下调IL-6的表达水平 （P

3.4 ELISA法检测药物对LPS诱导RAW264.7细胞表达IL-6的影响 ELISA法测定IL-6的实验结果与Bio-plex液相蛋白芯片的相一致，表明液相蛋白芯片方法的敏感性与商品化ELISA试剂盒相当。甘草酸中、高剂量组和甘草总黄酮高剂量组能极明显下调IL-6的表达水平 （P

4 讨论

液相蛋白芯片技术同步性好、通量大、准确性高等特性能很好的突破传统中药研究中单个散在指标 的局限性，节约珍贵样本，提高中药研究结果的准确性和可靠性，全面把握中药药效作用的多个关键环节，系统地阐明中药多通道、多靶点的作用机制。毛予龙等[12]报道了甘草酸苷能够有效抑制LPS诱导小鼠RAW264.7细胞表达IL-6；王大南等[13]报道了甘草酸苷抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α；杨晓露等[2]报道了甘草黄酮类单体异甘草素能抑制RAW264.7细胞表达IL-1β和IL-6。与以往研究相比，本研究首次应用液相蛋白芯片技术检测了甘草酸和甘草总黄酮对LPS诱导小鼠RAW264.7细胞表达的IL-6，IL-10和TNF-α等23种细胞因子的影响，首次发现了甘草酸能够抑制LPS诱导小鼠RAW264.7细胞表达IL-1β，IL-3，IL-5，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13和Eotaxin，甘草总黄酮够抑制Eotaxin的表达。

甘草酸能降低LPS诱导巨噬细胞产生的IL-1β，IL-3，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13，Eotaxin和TNF-α共10种细胞因子的表达水平，从而抑制了T细胞的活化、B细胞的成熟、嗜酸性粒细胞和自然杀伤细胞的增殖；降低了抗体、前细胞因子、成纤维细胞产生的淋巴因子、集落刺激因子和急性期反应蛋白的表达水平；增强了单核巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达；减轻了机体局部或整体的炎症反应。甘草总黄酮能降低IL-6和Eotaxin的表达水平，从而减少了抗体的表达水平，抑制了嗜酸性粒细胞的增殖和趋化，起到了抗炎作用。甘草酸和甘草总黄酮的抗炎作用可能是通过抑制LPS与巨噬细胞表面TLR4受体结合，降低TLR4受体的活性，阻遏磷酸化的TLR4与MyD88蛋白的结合，抑制NIK蛋白激酶的自身磷酸化激活，阻遏IκB-α，IκB-β激酶的泛素化降解，稳定NF-κB的非活性结构，抑制与炎症反应相关基因的转录来实现的。

本研究显示尽管甘草总黄酮抑制细胞因子的范围不及甘草酸，但两者都能通过有效抑制多种细胞因子的释放，发挥多靶点抗炎效果，减轻系统性炎症反应，起到显著的抗炎作用；蛋白芯片研究技术可对甘草不同有效成分抑制细胞因子的释放水平、抑制范围和作用特点进行同步比较研究，能系统准确地把握中药的抗炎机制作用特点，是适用于中药及其成分药效及分子机制研究的有效蛋白质组学技术。

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[13]王大南， 于淼， 吕昌龙， 等.甘草酸苷调节小鼠腹腔巨噬细胞活性的研究 [J].中国免疫学杂志，2009，25（9）： 805.

Effects of glycyrrhizin acid and licorice flavonoids on LPS-induced

cytokines expression in macrophage

LIU Zhao， ZHONG Ju-ying， GAO Er-ning， YANG Hong*

（Experimental Research Center， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Glycyrrhizin acid and licorice flavonoids are the component of Glycyrrhiza uralensis Fisch root that has been used for various medicinal purposes in traditional oriental medicine for thousands of years. Macrophages as a principal component of immune system play an important role in the initiation， modulation and final activation of immune response against pathogens.In the present study， glycyrrhizin acid and licorice flavonoids was investigated the anti-inflammatory effect on lipopolysaccharide （LPS）-induced macrophage cell line of RAW264.7. Well-grown RAW264.7 cells were collected and randomly divided into the blank control group， the LPS（1 mg・L-1）group， the dexamethasone（5 mg・L-1）with LPS group，the glycyrrhizin acid（400，80，16 mg・L-1）with LPS group and the licorice flavonoids（200，40，8 mg・L-1）with LPS group. RAW264.7 cells were cultured in 24-well plates， pre-incubated for 4 h with different concentrations of dexamethasone， glycyrrhizin acid ，or licorice flavonoids .Then cells were stimulated for 20 h with LPS. The supernatant of culture medium was collected from each well and determinated the concentrations of cytokines by means of Bio-Plex mouse cytokines assay. Compared with the control group， the LPS group could significantly induced relatively high levels of granulocyte colony stimulating factor （G-CSF），granulocyte-macrophage colony stimulating factor（GM-CSF），macrophage inflammatory protein-1 alpha （MIP-1α），macrophage inflammatory protein-1 beta（ MIP-1β），regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor（RANTES），tumor necrosis factor alpha（TNF-α），monocyte chemotactic protein 1（MCP-1），chemokine （C-X-C motif） ligand 1（KC），eotaxin，interleukin（IL）-1α，IL-1β，IL-3，IL-4， IL-5，IL-6，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13， and IL-17 secretion（P

篇4

随着时代的进步以及经济的发展，我国信用担保体系也取得了一定突破。但在飞速发展的同时，信用担保体系依旧面临着一系列问题。本文从实际情况出发，对现存于中小企业信用担保体系中的问题进行了深入分析，并进一步提出了可使我国中小企业信用担保体系得到革新和完善的相关措施。

【关键词】

中小企业；信用担保体系；问题；解决措施

0 引言

为对中小企业的发展进行扶持和帮助，世界各国政府都制定了相关的中小企业信用担保体系。当前，全世界共有50多个国家以及地区对中小企业信用担保机构进行了建立。科学合理的中小企业信用担保体系为中小企业解决了融资困难的问题，并有效地促进了当地中小企业的稳步长效发展。另外，中小企业信用担保体系对一国的经济发展、社会稳定也是有极大促进作用的。

1 现存于我国中小企业信用担保制度中的问题

1.1信用担保体系不具备完善的组织结构

当前，中小企业信用担保结构主要由两大类构成，一类是以美国为主的一级担保结构，其分布在各地的分支机构由中央担保机构设置；第二类是以日本为主的二级担保结构，此类担保结构由地方担保机构和中央担保机构组成。对这两种中小企业信用担保结构进行对比分析可知，其主要出资人都是政府部门，国家信用以及中央政府为其提供了保障。

当前，针对中小企业信用担保体系，我国对“三层”的制度框架进行了确立。“三层”制度框架主要分为中央级、省级、地方市级，地方级主要对管辖范围内受保企业的承保内容进行负责，省级则对地方市级担保机构提供相应的担保，而中央级则为地方级以及省级的小企业信用担保机构提供担保。不过到目前为止，国家级的再担保机制却并未得到建立。因此，担保机制在施行的过程中，就会面临国家财政支撑不足的问题，而中小企业也无法从中得到帮助。

1.2信用担保资金缺乏稳定的供给机制

对于中小企业信用担保体系的稳步运行而言，担保资金补充机制是关键因素。在实际的运行过程中，随着业务量的增大，代偿资金也会随之有所增长，单靠利息收入以及相关的担保费，担保机构是很难进行正常运营的。在我国，政策性担保机构为非营利性组织，在收取担保费时受到了国家的严格制约。商业性担保机构虽然会通过提高担保费来对资金进行补充，但在扣除各种经费以后，所剩的担保资金也是非常少的。因此，受财力以及政策规章等因素的影响，我国中小企业担保机构往往无法获得充足的资金支持。这样一来，担保机构的承保能力就会逐步降低，中小企业的融资需求也得不到相应满足。

1.3风险分散机制以及控制机制的缺乏

在为中小企业提供担保的同时，担保机构也需面临一定的风险。当前，针对担保机构，我国并未制定出科学合理的规章制度进行规范，国家级的信用再担保机构也未得到建立，因此在面对担保风险时，担保机构就无法依靠再担保方式对风险进行分散和控制。为了降低风险，担保机构就不得不依靠反担保措施，但第三担保人的缺失、自身信用低等问题恰好是造成中小企业融资困难的主要因素。从理论层面来说，运用反担保措施，担保机构的风险会有所降低，但中小企业融资难的问题依旧无法得到合理解决。

1.4相关法制规章不具科学合理性

对于信用担保企业的稳步发展而言，法制规章的完善是一大重要保障条件。在我国，与中小企业信用担保行业有关的法律主要有：《担保法》、《公司法》以及《中小企业促进法》等。但针对担保机构，《公司法》并未进行明确规定；《担保法》也没有涉及到信用担保机构；而《中小企业促进法》主要是起理论指导作用，并未对中小企业信用担保体系的完善提供可行的操作方法。由于缺乏完整有效的信用担保法律规章，因此在法律地位、运作规章、服务对象等方面，中小企业信用担保机构都不具备明确的定位，而这也严重阻碍到了中小企业信用担保体系的稳步发展。

2 使我国中小企业信用担保制度得到完善的相关措施

2.1对中小信用担保体系的组织结构进行完善

2.1.1对扶持中小企业发展的中央政府机构进行建设

在西方，针对中小企业信用担保机构，中央政府都设立了相关的管理扶持部门，而这也为中小企业信用担保机制的完善和提升提供了保障。因此，在借鉴国外先进经验的基础之上，我们就需对相关的中央政府机构进行建设，对中小企业的扶持制度进行完善和落实，并对中小企业信用担保结构的各项工作进行管理和帮助。在给予中小企业信用担保机构帮助的同时，中央政府部门还需对中小企业信用担保机构的业务标准、绩效补偿工作、行业监督管理以及运行原则等进行管理。

2.1.2对多层次的再担保机构进行建设

在担保体系里面，对风险进行转移和分散的一大主要方式就是再担保。因此，我国信用担保体系就需结合实际情况对再担保制度进行建立，依靠再担保的方式为中小企业信用担保机构转移部分风险。在我国，再担保机构的建立主要可分为两个层次，分别是省级再担保机构以及全国性再担保机构。对省内各地担保机构的相关问题进行解决为省级再担保机构的主要责任，而对省级再担保机构的再担保问题进行合理解决就是全国性再担保机构的责任了。运用此种担保机制，一方面可使担保机构的担保规模得到扩大，另一方面还能使担保机构的部分风险得到有效减少。

2.2对科学合理的担保资金供给机制进行建立

为了对有效的中小企业信用担保体系进行建立，就需首先解决资金问题，使担保体系拥有充足的资金来源。当前，我国各级政府部门都不具备雄厚的财力，而在收入分配中，居民部门以及实体部门都占据了较大的份额。因此，在对资金来源进行组织时，中小企业信用担保机构需从实际情况出发，依靠多种渠道对担保资金进行筹集。中小企业信用担保机构还可以扩大对邮政储蓄、社会保障基金以及保险基金等的融资力度，进而对资金进行获取。倘若条件允许，一些商业性担保机构还可以运用直接上市融资的方法筹集担保资金。另外，政府可以依据一定比例从财政收入中拿出一部分钱对担保资金进行补充，或者从征得的中小企业税收总额中拿出一部分钱作为担保机构的补偿资金。最后，担保机构可以依据一定比例从年利息收入和担保费中提取一部分钱，用作风险补偿资金。在条件允许的情况下，为了对担保资金的外部补偿进行实现，担保机构还可运用到上市募集以及私募资金的方法。

2.3对风险分散机制以及控制机制进行完善

2.3.1担保机构需和银行之间建立起良好的合作关系

在为中小企业提供担保业务以后，担保机构帮助银行减少了经营成本，使其信贷资金的安全性得到了提升。可见，担保机构的担保工作会为贷款银行带来直接利益。因此，协作银行就需依据一定比例对担保机构的贷款风险进行承担，帮助担保机构分散和避免风险。

2.3.2运用金融衍生品对风险进行分散

在我国，具有发展潜力以及核心竞争力的中小企业是中小企业担保机构的主要服务对象。因此，将合理的衍生工具，例如“担保换期权模式”运用到中小企业信用担保体系中，就可将中小企业的无形资产价值，即高增长潜力开发出来，使担保机构由之前的承担贷款风险变为资本增值承担风险，最终促使中小企业和担保机构完成风险共担。

2.3.3对动态的风险监控机制进行建立

在进行担保之前，担保机构需对相关的担保标准进行严格遵循，并在此基础之上对中小企业的资信情况做出全面审查，审查内容为融资企业的资信状况、偿债能力、贷款申请、经营状况以及反担保措施等。在完成这一系列审查以后，才可决定是否为其提供担保。在担保的过程中，针对受保企业的资金使用情况、项目运行情况等，担保机构需进行跟踪监测，旨在及时了解担保风险的预警信息，并采取科学合理的方法完成风险防范。一旦出现了担保风险，担保机构就可依靠法律途径对受保企业进行追偿。

2.3.4对法制环境进行完善

为了推进中小企业担保体系的完善和顺利施行，我国就需加强法制建设，对相关的法律规章进行完善。另外，我国还需对信用担保机构的相关法律进行调整，例如依据《中小企业促进法》，可对现有的《公司法》以及《担保法》进行整理，进而制定出《中小企业信贷担保法》，旨在对担保机构的补偿机制、性质、税收机制、资本金来源以及风险分担等方面进行明确，使中小企业信用担保机构的顺利施行得到法律上的保障。与此同时，还需对相关的配套法律进行完善，例如制定出中小企业促进法以及中小企业信贷法等，使各级政府所需承担的责任得到明确，帮助信用担保机构在债权保护、企业信息披露等方面获得完整、有效的法律保障。另外，还需对涉及到社会信用体系的法律法规，即资信评估以及信用等级评定进行制定，最终促进中小企业信用担保体系的稳步发展。

3 结语

综上所述，中小企业信用担保制度的建设具有一定的复杂性以及系统性。因此，我们就需从我国的实际情况出发，对国外先进经验进行借鉴，将理论和实践结合起来，使信用担保体系得到革新和完善，进而为我国中小企业的稳步飞速发展提供帮助。这样一来，我国中小企业的发展必定会走上一个新的台阶，并在社会主义现代化建设中发挥巨大作用。

【参考文献】

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篇5

[关键词] 细胞周期蛋白激酶抑制剂；肿瘤；细胞周期

[中图分类号] R979.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）13-44-04

[Abstract] As normally accepted， the cell proliferation is regulated through cell cycle and the occurrence of tumor may lie in deregulation of cell cycle， directly resulted from the abnormal of the complex of cyclin dependent kinase（CDK）.It has become one of the most effective strategies to inhibit the activity of the complex for dealing with tumors.Thus，the study on CDK/Cylclin complex inhibitors is one of hot focuses in antitumor drug discovery.This thesis mainly discusses the types of CDK/Cyclin inhibitors and their clinical issues.

[Key words] Inhibitor；Cancer；Cell cycle

细胞周期的调控过程是在检查点的监视下，各种调控因子依次激活或灭活，从而启动细胞完成DNA复制，分裂为2个子代细胞的过程。在诸多细胞周期调控因子中，细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）是处于核心位置，其与细胞周期蛋白Cyclins、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKIs）等组成细胞周期调控的网络系统[1]。CDKs是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，目前有13种包括CDK1～13，分别在细胞周期调控CDKs（1～6）和转录调控CDKs（7～13）起作用。细胞周期的调控事实上就是检查点的调控，其中以G1/S调控点最为重要。细胞周期受到外界信号如生长因子等刺激时，催化亚基CDK4/CDK6与调节亚基CyclinD结合后，CDKs残基被磷酸化/去磷酸化修饰而被激活，CDKs激活后催化Rb蛋白使之磷酸化，Rb基因（retinob lastoma gene）又称为视网膜母细胞瘤基因，是第一个被克隆的抑癌基因，其蛋白磷酸化后与转录因子（如E2F）形成复合物的能力丧失，E2F在细胞周期调控中起重要作用，能诱导CyclinE和CDK2的表达并形成CyclinE/CDK2复合体，后者进一步使Rb蛋白磷酸化，充分释放E2F，随后E2F进入核内激活一系列细胞周期进入S期的必须基因的表达。在S期内DNA复制晚期，CDK2被cyclinA激活，使转录因子E2F及时失活，阻止了由持续激活的E2F导致的细胞凋亡[2-3]。

1 CDK/Cyclin抑制剂的种类

研究统计显示，有超过90%的人类癌症中CDK、Cyclin、CKI和Rb途径中相关基因发生了变异，其中CDK和其相应的调节亚基Cyclin的失常最为频繁[2-3]。此外，细胞周期的波动促进了化疗的抗性，降低了化疗的效果。因此恢复细胞周期正常的CDK/Cyclin活性调控是治疗肿瘤的策略之一。药物研究人员已经把寻找不同类型CDK和Cyclin抑制剂作为前沿的抗肿瘤药物的重点研究方向。目前CDK抑制剂主要有内源性的和外源性的两种。

1.1 内源性小分子抑制剂

1.1.1 小分子量蛋白 内源性小分子抑制剂中最大的一类是低分子量蛋白质，根据结构功能的差异分为两大类：一类称双重特异家族INK4，包括p15，p16，p18，p19，该蛋白家族可抑制cyclin D相关激酶的活性，其抑制作用依赖蛋白与相应的游离CDK4结合，从而阻断CDK4与相应cyclin D结合形成具有催化功能的二聚体复合物。另一类叫Kip家族，包括p21，p27，p57，该蛋白家族可以和cyclin E/CDK2与cyclinA/CDK1组成的二聚体复合物再组成三聚体，通过封闭二聚体的催化活性中心从而发挥其抑制作用这些内源性抑制因子与激酶复合物结合后，可特异性地调节其活性，从而精确调节细胞由G1期向S期的转化过程，内源性CDK调节剂的存在不仅提示细胞本身的分裂、增殖具有精密的调控机制，而且也反应了该信号转导系统在细胞周期调控中的重要作用与地位[1-5]。研究表明，多种肿瘤的发生、发展过程与CDKs/cyclins的过度表达或其内源性抑制因子表达下降有关，如p16的缺失与小细胞和黑色素瘤、肺癌、乳腺癌和结直肠癌的发生密切联系[4-7]；p27蛋白的缺失常见于乳癌，前列腺癌，结肠癌以及消化道肿瘤[8-12]。因此，内源性CDKs抑制因子的缺失或基因突变是肿瘤诊断的重要参考指标。

1.1.2 非编码小RNA 内源性小分子抑制剂还有一类是近年来发现的一类重要的非编码RNA――microRNA，MicroRNA是一种长度在21～23nt的非编码RNA，通过与靶基因mRNA 3’UTR区的靶位点区域相互结合而快速有效地降解mRNA或抑制蛋白的翻译，将蛋白控制在生命活动所需的较低或最佳的水平上。已发现的参与细胞周期调控的microRNA已有10余种，其中miR-1-2与miR-34分别靶向CDK4，细胞周期被停滞于G1期，近而抑制肿瘤细胞增殖[13-15]；miR-22靶向CDK6细胞周期停滞于G1期，诱导乳腺癌细胞衰老。在不同的生物学过程中，这些miRNA通过靶向E2F、CDK、cyclin、p21、p27、DNA多聚酶α等促进或阻滞细胞周期的关键调节因子，进而调控细胞周期的进程。

1.2 外源性小分子抑制剂

外源性的抑制剂包括反义核酸、抗体、小分子RNA干扰（siRNA）和小分子化合物四种。小分子化合物是最主要的一类外源性CDK抑制剂。

1.2.1 小分子化合物 近几年来，由于对晶体结构的了解允许人们进行分子模拟研究，在设计开发高效、有选择性的CDKs化学抑制剂的研究方面取得了突破性进展，可以说这类化合物每天都有新的成员在增加[15-17]。目前小分子CDK抑制剂可分为以下13类：（1）嘌呤类（Roscovitine and Olomoucin）、（2）嘧啶类（PD-033299）、（3）黄酮类（Flavopiridols）、（4）噻唑类（SNS-03）、（5）吲哚类及其衍生物（SU951）、（6）哌酮类（Paullones）、（7）咪唑并吡啶、吡唑并吡啶类（AZ703），（8）吡嗪类（AT751）、（9）丁酸内酯类（butyrolactone-1），（10）十字苞碱类（UCN-01）等13种，其中发展较快的为嘌呤类、嘧啶类、氨基噻唑类、黄酮类、吲哚咔唑类似物、Paullones、靛玉红及其衍生物和吡嗪类。已有13个小分子抑制剂进入临床实验阶段。它们都是平面杂环的小分子化学物，与ATP竞争性地结合在CDK激酶的ATP结合位点上。如Seliciclib[CYC202，（R）-roscovitine]是一个2，6，9-三元取代的嘌呤类似物，选择性抑制CDKs/Cyclins，尤其是对CDK2/cyclinE的抑制作用最强。在体外对激酶活性的影响IC50值分别为CDK1/cyclinB（2.69μM）、CDK2/cyclinA（0.71μM）、CDK2/cyclinE（0.10μM）、CDK4/cyclinD1（14.21μM）、CDK7/cyclinH（0.49μM）、ERK-2（1.17μM）、PKA>50μM、PKC>100μM和SAPK>20μM。在体外，CYC202对多种人肿瘤细胞株的增殖有抑制作用，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等。IC50值范围是7.9～30.2μM，在24h，达到80%凋亡率时，CYC202浓度是20μM。对正常细胞的毒性明显低于对癌细胞的毒性，IC50在22.2～100μM这个范围。CYC202能抑制凋亡抑制基因的表达，通过抑制MDM2的表达，阻滞p53的降解，诱导肿瘤细胞周期停滞G1/S与G2/M期，降低pRb的磷酸化水平，诱导细胞周期各个时相的细胞凋亡。体内实验表明，CYC202耐药性好，口服生理活性良好，对由人结肠癌、子宫癌细胞接种裸鼠体内的实体瘤有明显的抑制作用。CYC202正在进行2个Ib期剂量增加的临床实验，在Ib期研究中发现，10例患有卵巢癌的患者服用CYC2024个月以上，肿瘤没有增加和严重的治疗相关的副作用，其中1个患者的肿瘤缩小了30%以上，治疗1年以上的患者病情稳定。Ⅱ期临床研究发现，CYC202单独应用效果稍差，与其他化疗药物联合应用治疗效果显著。CYC202联合卡培他滨治疗乳腺癌，联合2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷或顺铂治疗肺癌、鼻咽癌的IIb期临床实验也在进行[18-24]。

1.2.2 小分子RNA干扰 小分子RNA干扰技术的发展和应用，使特异性的干预靶分子的基因表达的研究成为可能，有不少科学家开始从基因水平干预CDK/Cyclin的合成。Lima等[25-26]将靶向CyclinE的siRNA转染到肝癌细胞Hep3B、HepG2、SNU449（CyclinE过表达），HuH7（CyclinE没有过表达）后发现，在过表达CyclinE的细胞中，CyclinE的表达下降了90%，DNA合成明显下降，细胞发生凋亡。Galimberti等[27]将分别靶向CyclinE、CDK2、CDK1的siRNA转染鼠肺癌细胞HOP-62、H-522、H-23后，发现CyclinE/CDK2能引起细胞凋亡，抑制肺癌细胞的增殖，而CDK1siRNA对细胞凋亡无影响。CDK1 siRNA干扰导致的CDK1表达降低只引起细胞期阻滞，细胞增殖减慢；而CDK1和CDK2 siRNA的共同干扰作用导致的CDK1、CDK2表达同时降低，引起细胞周期S期和G2/M期的阻滞，同时诱导了细胞的凋亡。曹银芳等[28]成功将靶向CDK2/CyclinE的siRNA重组表达载体转染肝癌HepG2细胞后，发现CDK2和CyclinE mRNA表达显著下降，细胞周期停滞于S期发生阻滞，G1期细胞明显增多，Caspase-3活性增强，HepG2细胞发生了凋亡，并且细胞周期的改变与转染后HepG2细胞体外增殖力下降是一致的。

2 问题与展望

CDK1，CDK2，CDK4，CDK6是热门的抗癌靶标，但由于激酶ATP结合位点高度的保守性，选择性小分子抑制剂的设计与开发是一个公认的难题。因激酶结构的保守性而产生的耐药性和毒副作用，严重阻断了化疗药物的抗肿瘤效应，限制和影响了治疗的效果。研究发现CDKs/Cylcins抑制剂的临床应用出现的最大问题是肿瘤的耐药性导致了肿瘤的复发，疗效明显降低。其抗性的产生与该致癌激酶基因的扩增、补充途径及信号通路的反馈调节相关。此外，其抗性还与药物靶点的单一或群体突变有关，导致了药物与靶点的亲和性差。

siRNA药物诱导的RNAi具有特异性和高效性，是对成瘾性致癌基因实施靶向治疗的理想选择。研究发现，化疗药物与siRNA联合作用于肿瘤细胞，具有协同作用，基因治疗可作为化学治疗药物外的补充途径。Wang等[29]发现，用livin-siRNA表达载体转染肿瘤细胞导致livin基因沉默后，可激活caspase-3并增加肿瘤细胞对紫外线等其他促凋亡刺激信号的敏感性。用RNAi技术下调bcl-2或XIAP基因表达，可增加人乳腺癌细胞MCF-7依托泊苷及阿霉素的敏感性，表现为肿瘤细胞的数量与活性下降、凋亡率增加，较单一化疗药物处理组活性细胞数目明显减少。Chistiane等[30]将针对多药耐药基因MDR1编码的P-gp-siRNA转染人胰腺癌细胞EPP85-181RDB和人胃癌细胞EPG85-257RDB，发现上述细胞对柔红霉素的耐药性分别下降了89%和58%。具有MDR特性的K562细胞经上述siRNA处理后，也观察到类似效果。因此，siRNA干扰技术可能是解决临床上药物抗性的主要手段之一。

CDK及其相关蛋白表达异常与肿瘤的发生和发展密切相关。不少外源性或者是内源性的CDK抑制剂在抑制CDK后，都能很好的抑制肿瘤的发生和发展。然而单独CDK抑制剂治疗，会有肿瘤逃逸的现象，而无法根治肿瘤。因此与其他治疗手段联合的治疗方式，将是CDK抑制剂研究的方向之一。

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篇6

关键词:西瓜；氮肥；钾肥；用量；产量

西瓜是夏季重要的消暑佳品，江苏沿海土壤、气候资源独特，种植的西瓜品质好、口味佳，产品一直畅销大江南北。从上世纪80年代末开始，江苏沿海西瓜种植面积不断扩大，目前东台市每年种植大棚西瓜逾1.33万hm2，种植西瓜成了当地农民发家致富的途经。西瓜需肥量大，但生产中常施用过多，造成浪费或肥害，并污染环境。研究西瓜合理施肥，对于促进西瓜增产和改善品质意义重大。本试验旨在优质高产栽培条件下，研究西瓜氮、钾肥的合理施用水平，为指导生产提供技术依据。

1材料与方法

1.1试验材料

试验安排在江苏省东台市东台镇四灶社区上官村，试验面积1383.75 m2，土种为砂性脱盐土，土壤质地为轻壤。0～20cm土层理化性状为:pH值8.1，有机质含量16.0 g・kg-1，全氮1.01kg-1，碱解氮97mg・kg-1，速效磷15.4 mg・kg-1，缓效钾644mg・kg-1，速效钾90mg・kg

1.2试验处理

试验设7个处理，3次重复，随机区组排列.大棚栽培。7个处理中氮、钾肥均为4个水平(其中处理3为氮、钾肥交叉)。试验地为南北向3个大棚，每棚安排1个区组，每个小区长10m.宽4.5m，面积45m2。各处理设计及实际施肥量见表1。

1.3栽培管理

2011年3月2日，667m2。用1000kg猪圈粪，均匀撒于麦苗上，耕翻人土。3月5日分小区施用试

验设计的基肥(化肥)。3月31日移栽西瓜苗，株距0.4m，行距2.25m，每小区50株.667m2定植741株。4月23日追肥并考察西瓜叶片数量和主蔓长度。6月21日分小区采收西瓜。

2结果与分析

2.1不同处理对西瓜生长的影响

根据每小区10株考察数据分析，氮、钾肥对西瓜出叶速度的影响并不明显.其中667m2用氮量12、24 kg处理，叶片数量只相差1.2片；但对西瓜主蔓长度的影响比叶片数量大，667m2用氮量12、24k处理，主蔓长度相差4.9cm。钾肥对西瓜营养生长的影响不大(表2)。

2.2不同处理对西瓜产量的影响

为了获得较准确的产量，对21个小区的西瓜分别称质量。从表3可以看出，处理l～3西瓜产量随施肥量增加而增加，处理2比处理1增加227.2 kg，处理3比处理2增加208.1kg。而处理4比处理3减产19.6kg，是因为氮肥供应量较大，西瓜营养生长偏旺，影响了光合产物向果实输送所致。当氮肥供应量能满足西瓜生长需要的时候，钾肥对西瓜产量的影响并不明显，667m2:施K2O15kg的处理7比未施钾肥的处理5产量增加127.1kg，而且施钾区西瓜生长较稳健。试验表明.氮元素对西瓜产量影响大，钾肥影响则较小。至于单果质量，除667m2:施纯氮12kg处理稍小外，其他处理差别不大。

对氮因素试验结果进行新复极差分析，在5％差异水平上，667m:施纯氮20 kg的处理3、施纯氮12kg的处理1和16kg的处理2差异都达显著水平，667m2施纯氮24kg的处理4只与施纯氮12kg的处理1达显著水平，667m2施纯氮16kg的处理2与施纯氮12kg的处理1也达显著水平。在1％差异水平上，处理3、4与处理1差异均达极显著水平(表4)。说明667m2施20kg纯氮的处理3较为合理。

2.3不同处理对西瓜可溶性固形物含量的影响

试验结果表明，不同钾肥用量下西瓜可溶性固形物含量差异较小，中心可溶性固形物含量11％～11.6％.边部9.2％～9.8％.不施钾肥的处理5与667m2施15 kg7处理7相比，西瓜中心可溶性固形物含量只相差0.6百分点(图1)。分析认为这可能与该试验地速效钾含量高、有机肥施肥量大、前茬作物施用钾肥残留量多等因素有关。

3讨论与结论

大棚西瓜氮、钾肥施用效果不同，究其主因，是因为氮素营养主要参与植物体内细胞蛋白质的合成，表现为提高植物体枝、叶、果等器官的生长发育速率，有利于提高产量。而过量的氮素营养会造成西瓜植株旺长，反而不利于果实适时成熟和品质提高。钾素营养主要是促进植物体各器官纤维素的形成，增强细胞浓度，提高植株抗寒能力，还可提高细胞亲水性，提高植株抗旱能力，并能促进果实中淀粉转化成糖，从而提高果实可溶性固形物含量，故称钾素为品质元素。据此认为，这是本试验中增施氮素和钾素表现出不同作用和效果的主因所在。

本试验结果表明:在高产栽培条件下，沿海大棚西瓜667m2纯氮施用水平以20kg较为适宜，增加氮肥用量并不一定能增加产量，甚至可能因氮肥供应过多造成营养生长与生殖生长不协调，产量反而会下降。施用钾肥对西瓜产量和品质影响虽不明显，但从优质高产栽培要求考虑，在当地土壤速效钾已达90mg・kg-1的情况下，667m2氧化钾施用量5～10kg为宜。

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篇7

1　材料与方法

1.1　细胞株及抗体

人结肠癌细胞 DLD-1(colorectal adenocarcinoma cell line，KRASmutantG13D)及 Caco-2(colorectal adenocarcinoma cells line，KRASWT)细胞株均购自中国典型培养物保藏中心，由本实验室传代后液氮保存。用于细胞培养的 RPMI-1640培养基购自 Hyclone，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素、链 霉 素 及 Trypsin-EDTA(0.05%)均 购 自Gibco公司。西妥昔单抗(CETuximab，鼠/人嵌合抗EGFR抗体，IgG1)购于百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)公司。

1.2　方法

1.2.1　CIK细胞的体外扩增及鉴定　肝素抗凝管收集健康志愿者外周静脉血 30mL，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。将分离的 PBMC接种于T25细 胞 培 养 瓶 内，用 GT-T551无 血 清 培 养 基(Takara公司)调整细胞密度为 1109个/L。细胞培养瓶置于 37℃、5% CO2孵育箱中培养，第 1天加入 1000000IU/LIFN-(PeproTech公司)及1%的自体血浆，24h后加入 300000U/L白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2，北京四环生物公司)和50g/L抗 CD3单克隆抗体(RD公司)继续培养，每隔 3～4d补充新鲜培养基，调整细胞密度为1109个/L，同时补加 300000U/LIL-2，第 14～16天时开始收集细胞。

1.2.2　CIK细胞表型和 DLD-1、Caco-2细胞膜表面分子检测　通过流式细胞检测，按照 1106个/样本将 CIK、DLD-1及 Caco-2细胞加入流式管中，洗细胞 2次，震荡混匀后加入 Fc封闭抗体 anti-CD16/CD32封闭作用 30min。分别加入流式抗体FITC-鼠抗人 EGFR单抗(ebioscience)、FITC-鼠抗人 CD3单抗(BD)、PE-鼠抗人 CD56单抗(BD)、APC-鼠抗人 CD8单抗、APC-鼠抗人 CD16单抗或同型对照抗体，混匀后 4℃避光结合 30min，洗细胞 2次 去 除 未 结 合 的 抗 体，PBS重 悬 细 胞。BeckmanFC500型流式细胞仪检测，Flowjo10.0软件分析实验结果，满足 CD3+CD56+20%，CD3+CD8+60%的 CIK细胞用于后续实验。

1.2.3　培养液上清中的细胞因子水平检测　通过ELISA法，分别收集培养第 1天及第 14天的 CIK细胞培养上清液，分装后 -80℃保存备用。细胞因子检测：IFN-及 TGF-测定均采用双抗体夹心ELISA法，按试剂盒说明书操作;以标准品 450nm处的吸光度(OD)值做标准曲线，计算待测样品中细胞因子的含量，每份样本设 3个复孔。

1.2.4　CIK细胞联合西妥昔单抗对人结直肠癌细胞的杀伤作用　通过实时无标记细胞分析仪(real time cellular analysis，RTCA，美国 ACEA公司)检测，向 RTCA检测板的检测孔分别加入 100L完全培养液，放入 RTCA中读取背景数据。取出 RT-CA检测板接种预先制备的细胞悬液，DLD-1及Caco-2细胞分别以 2104及 1.5104个/孔接种，设肿瘤细胞单独组、CIK-肿瘤细胞组及 CIK联合西妥昔单抗-肿瘤细胞组，每组细胞设置 3个复孔，将 RTCA检测板再次放回 RTCA，37℃ 5%CO2培养箱中孵育 24h后加入西妥昔单抗(1mg/L)50L，其余孔补加 50L完全培养基。抗体孵育1h后按照 20∶1效靶比加入 CIK细胞 50L。将RTCA检测板再次放回 RTCA仪，设置每隔 15min监测并记录细胞指数(cellindex，CI)值，连续监测45h，选择实验第 45h数据计算杀伤率。按照下列公式计算：细胞杀伤率% =(对照组 CI值 -实验组 CI值)/对照组 CI值 100%。

1.3　统计学处理

使用 Graph Pad Prism软件来进行数据统计学处理，数据采用均数 标准差(xs)表示，符合正态分布的计量资料比较采用 t检验，P0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　Caco-2及 DLD-1细胞表面的 EGFR表达

本实验中所使用的 Caco-2及 DLD-1细胞表面EGFR均高表达，分别为 81.6%及 82.9%。见图 1。

2.2CIK细胞亚群

倒置显微镜下观察 CIK细胞生长情况，诱导前细胞体积较小，呈圆形散在分布，在诱导培养过程中细胞体积逐渐增大，培养第 5天细胞开始形成细胞集落，随着培养时间延长而集落增多，培养至第 14天时细胞体积明显增大，CIK细胞于培养基中悬浮成团分布，数量显著增多。见图 2。与培养前比较，CIK细胞经过 14d的体外活化扩增后 CIK细胞亚群中 CD8+T、CD3+CD56+NKT及 CD16+CD56+NK细胞比例均显著增高(P0.01或 P0.05)。见表 1。

2.3　CIK细胞培养基上清液中的 IFN-及 TGF-水平

ELISA结果显示，与培养第 1天比较，CIK细胞培养第 14天时，培养基的上清液中 IFN-水平由 34.835.4ng/L增高为 2041.8697.9ng/L(P 0.01)，而 TGF- 的 水 平 由 1 293.8633.9ng/L下降为 116.726.8ng/L(P0.01)。见图 3。

2.4　CIK细胞联合西妥昔单抗对 DLD-1及 Caco-2细胞的杀伤作用

将经过 14d体外扩增培养的 CIK细胞作为效应细胞，结合有抗 EGFR单抗西妥昔单抗的肿瘤细胞作为靶细胞，按照 20∶1的效靶比将效应细胞与靶细胞共培养，RTCA法检测 CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。图 4中显示 CIK细胞对 DLD-1及Caco-2细胞株的杀伤率分别为 16.04% 0.87%及 27.67% 3.10%，而当联合使用 1mg/L抗 EG-FR西妥昔单抗后杀伤率分别增高到 31.56% 3.55%及 35.96% 1.73%。

3　讨论

篇8

〔关键词〕HSV;CDK;细胞周期蛋白;CDK抑制剂

〔中图分类号〕R373〔文献标识码〕A〔文章编号〕1009-6019-(2010)04-81-04

单纯疱疹病毒(herpessimplexviruses,HSV)是最早被发现的疱疹病毒,也是被研究最深入的病毒之一,但对其生物学特性仍然不很清楚。HSV的最主要的特征是其与宿主细胞的相互作用复杂并且为保持长期生存有着双重的生命周期〔1〕。由于其与宿主细胞复杂的相互作用,HSV已成为研究蛋白质的转位、神经系统中突触连接、膜结构、真核基因的表达调节、基因治疗、病毒与宿主细胞相互作用及其他生物学问题的重要模型和工具〔2〕。本文就近年来HSV复制与细胞周期蛋白的关系的研究进展进行综述。

1HSV概况

HSV属于α疱疹病毒科,包括HSV-1和HSV-2两种,以HSV-1为代表(以下简称为HSV)。HSV是大型的有包膜的双螺旋DNA蛋白,基因组全长约152kb,GC含量占68%以上。HSV基因组为一线性双链DNA分子,由共价连接的长片段(L)和短片段(S)组成,两者分别占病毒DNA的82%和18%,每一片段由中间的独特序列(分别称为UL和US)和两端的倒置重复序列(RL和RS)组成。HSV基因组共约含有74个基因,编码近90种蛋白质。根据其动力学性质可将HSV病毒基因分为立即早期基因(immediate-early,IE或α),早期基因(early,E或β)和晚期基因(late,L或γ)3类〔3〕。HSV感染包括增殖性感染和潜伏性感染两种,除引起皮肤和粘膜的疱疹样病变外,还能引起诸如中枢神经系统、呼吸系统、生殖器官以及流产、死胎和肿瘤等多种疾病〔3〕。

2HSV与细胞周期

在正常的情况下,周期中细胞分为分裂期(M期)和分裂间期,分裂间期包括Gl、S、G2等3个时期。细胞仅在S期含有DNA半保留复制所需的代谢底物、酶和蛋白因子,因此不编码大部分DNA复制所需蛋白的DNA病毒纷纷采取独特的策略克服这一变化的核环境问题。小DNA病毒采取的生存策略就是当被感染的细胞进入S期、条件合适时再复制其病毒DNA〔4〕。对比之下,象HSV这样的大DNA病毒,不仅能在分裂细胞中繁殖,而且还能在静止细胞及终末分化的神经细胞中繁殖,因此长期以来一直认为大DNA病毒复制与细胞周期相关蛋白无关。但近年来的研究发现,HSV复制不仅需要细胞周期相关蛋白,而且己进化到能诱导静止细胞产生细胞周期相关蛋白,HSV感染后诱导宿主细胞停滞于细胞周期某一特定时相,抑制宿主细胞DNA合成,抑制细胞凋亡,但支持HSVDNA的复制,完全为HSV服务。

2.1HSV感染引起细胞周期阻滞1988年deBruyn和Knipe用原位杂交技术确凿的证明HSV感染引起细胞DNA合成的抑制〔5〕。人们认为这种DNA合成的阻滞是因为HSV感染使细胞周期阻滞于G1/S期检验点导致的。流式细胞仪分析表明HSV感染的确能引起细胞周期阻滞,G1期细胞增加。Dargan等用无DNA的HSV蛋白感染细胞也能引起细胞周期阻滞,且并不导致细胞凋亡。说明不是因为HSVDNA的合成导致细胞周期阻滞的,是HSV外壳蛋白对细胞周期相关因子起到了抑制作用。多项研究综合表明是HSV中的ICPO和ICP27蛋白的作用引起的细胞周期阻滞〔6〕。

HSV具有高度的易感性,其宿主细胞广泛,能感染分裂期或非分裂期细胞,是较理想的基因治疗载体。HSV能引起细胞周期阻滞某种程度上说是对细胞有一定毒性作用的。鉴于这种细胞周期的阻滞作用是由于ICPO、ICP27引起的,基于ICPO/ICP27的基因表达载体构建对于病毒的基因治疗将有重要意义。

HSV既能在静止细胞也能在周期细胞中繁殖,而且本身还编码DNA聚合酶等复制相关蛋白,HSV感染使细胞周期阻滞是否是为了本身的繁殖目前还不清楚。有报道说细胞组蛋白与HSVDNA结合会抑制病毒DNA的复制和转录〔7〕。也有人认为细胞周期阻滞是宿主对抗病毒的一种平衡。我们更倾向于认为是由于HSV对细胞代谢的改变亦即通过抑制细胞DNA的合成,减少原料、细胞因子的浪费,而使细胞被动的停滞在G1/S期检验点。

2.2HSV复制需要细胞周期相关蛋白的活性曾一度认为HSV复制不需要细胞周期相关蛋白。但研究发现,HSV在周期细胞中的复制效率远远高于静止细胞,HSV虽然编码DNA聚合酶等DNA合成相关蛋白,但不编码拓扑异构酶、DNA连接酶,而且可在病毒复制蛋白缺乏的条件下复制,那么此时HSVDNA复制蛋白只能由宿主细胞来提供。而HSV感染能引起细胞周期阻滞在并不表达这些酶和蛋白的G1期,并且HSVDNA得到复制,说明HSV可能诱导了S期相关蛋白在Gl期的表达。这就促使人们研究HSV细胞周期相关因子在HSV繁殖中的作用。

早在1978年Yanagi等研究发现,HSV不能在非允许温度下阻滞于G1期的温度敏感型幼仓鼠肾细胞(tsBHK)突变株tsAF8中繁殖,但能在允许和非允许温度下阻滞于S期的tsBHK突变株tsHJ4中繁殖。对这一结果最简单的解释就是HSV复制需要S期相关蛋白。后经一系列的实验证实tsAF8中编码细胞周期相关蛋白HCF-l(Themammaliantranscriptionalcoactivatorhostcellfactor-1)的基因发生了突变,亦即细胞周期的重要调节因子HCF是HSV繁殖所必需。现证明HCF与oct-1及间层蛋白V16结合作用于立即早期基因增强子核心序列TATGRAT上促进立早基因的转录〔8〕。

E2F是促进Gl/S期以及S期相关基因转录的主要转录激活因子,关于E2F在HSV感染细胞中活性变化的报道结果不一。有报道说HSV感染后代表GO/G1期特征的抑制性复合物E2F/pRb、E2F/p107增加,许多依赖转录因子E2F的S期相关基因转录下降〔9〕。ICP4、ICP27功能缺陷型HSV感染宿主细胞后不能引起E2F以及S期标志物EZF/p107活性的升高。说明可能是HSV中ICP4、ICP27蛋白起到了诱导宿主细胞E2F基因表达的作用。Song等的结果进一步证明抑制性复合物E2F/pRb和E2F/p107增加是由于HSV中ICP4、ICP27、ICP0的作用结果。因此认为E2F以及S期标志物E2F/p107可能在HSV基因复制和转录中起重要作用。

与正常细胞的Gl期不同,许多S期相关蛋白存在于HSV感染的处于G1期的细胞中。这种HSV能独立于细胞周期而诱导细胞S期基因表达但使细胞呈G1期状态,说明HSV能改变多种细胞周期相关蛋白的活性,为HSV复制服务。HSV与细胞周期有着广泛的相互作用,尽管详细的作用蛋白和作用机理尚未阐明,各家观点不一,但对这些研究进行综合所得出的一般结论是:HSV复制与细胞周期密切相关,细胞周期相关蛋白在HSV复制中起重要作用。其中细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclindependentkinases,CDK)是HSV繁殖所必需。

3CDK在HSV复制中的作用机制

CDK:周期蛋白依赖性蛋白激酶,属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,它只有与相应的细胞周期蛋白(cyclin)结合后才有活性。1998年Shang等对很多抑制细胞周期相关蛋白、细胞某些信号转导途径抑制剂的抗病毒作用的筛选结果表明,只有能抑制CDK1、2、5、7的药理学CDKs抑制剂(pharmacologicalCDKSinhibitors,PCI)Roscovitine能抑制HSV的复制,此抑制作用发生于对细胞周期的抑制之前,且PCI对HSV的抑制程度与其对CDK的抑制程度相关〔10〕。也就是说不是细胞周期的阻滞,而是CDK活性的抑制使HSV基因的转录以及DNA的复制不能进行,说明了CDK在病毒复制中的重要性。

3.1CDK可能通过促进RNA聚合酶ⅡCTD的磷酸化而促进HSV基因转录的起始Roscovitine抑制HSV的转录可能是通过抑制起到转录调节作用的CDK进行的。RNA聚合酶Ⅱ在转录起始前先要形成转录起始前复合物,然后其羧基末端结构域(carboxyl-terminaldomain,CTD)被CDK7等磷酸化从而使RNA聚合酶Ⅱ从转录起始前复合物中释放出来起始转录。在转录过程中RNA聚合酶Ⅱ的CTD进一步被CDK9磷酸化。CDK1、2也参与RNA聚合酶ⅡCTD的磷酸化〔11〕。因此CDK活性的抑制可能影响到RNA聚合酶ⅡCTD的磷酸化从而抑制HSV基因的转录起始。体外提取HSV感染的细胞核,用Run-On实验证明Roscovitine能抑制HSV立即早期基因转录的起始,在转录起始后加入能抑制CDK1、2、5、7的Roscovitine并不影响HSV立即早期转录本的量,说明Roscovitine对转录的延长过程没有作用,只是抑制转录的起始。参与转录延长的是CDK9,CDK5的功能不涉及转录,而CDK1仅在HSV感染后期起作用。那么可能是CDK2、7是HSV转录起始所必需的。

3.2CDK可能通过影响HSV染色体的构象而促进HSV基因转录起始复合物的组装Roscovitine能抑制HSV基因的转录但对细胞基因的转录没有影响,甚至在Roscovitine存在下细胞转录本的量更多。说明可能Roscovitine并不是单纯通过抑制依赖于CDK的RNA聚合酶Ⅱ的CTD而抑制HSV基因的转录的。由于Roscovitine抑制基因的转录与启动子无关〔12〕,我们推论CDK可能通过影响HSV染色体的构象而影响HSV基因的转录。目前支持这一推论的实验还不多。我们的初步实验也发现:未用Roscovitine处理的转录活跃的HSV基因组能被DNA酶水解成弥漫状,而用Roscovitine处理的HSV基因组能够抵抗DNA酶的水解。说明Roscovitine处理和非处理的HSV染色体构象不同,CDK的确对HSV染色体的构象有影响。有学者研究,只要HSV启动子结合了各种转录因子及RNA聚合酶形成了转录起始前复合物,HSV基因的转录就不受Roscovitine的影响。说明Roscovitine并没有作用于HSV转录的起始过程,而是影响了HSV染色体的活化阻止了转录起始前复合物在HSV启动子上的组装从而抑制了HSV基因的转录。亦即CDK可能通过促进HSV染色体的活化而促进了HSV基因的转录。

3.3CDK可能通过使HSv调控蛋白磷酸化而促进HSV基因的转录蛋白质的磷酸化是调控蛋白质生物活性的重要方式。HSV基因组中仅编码两种蛋白激酶(UL13,US13)〔13〕,不能满足HSV调节蛋白磷酸化的需要。因此细胞蛋白激酶在通过磷酸化调控HSV蛋白中起重要作用,其中CDK可能通过促进HSV调控蛋白的磷酸化而促进HSV基因的转录和DNA的复制。

ICPO和ICP4是调控HSV基因转录的主要蛋白。Roizman等发现Roscovitine能抑制ICP0和ICP4的磷酸化。Davido等发现在Roscovitine存在下ICP0的电泳特性不同亦即ICP0的结构有所不同,Roscovitine影响了ICPO的转录后加工过程。进一步发现在Roscovitine存在下ICPO对早期基因ICP6转录激活作用大大下降。这一结果与前述Roscovitine即使在立即早期蛋白得到表达仍然能够抑制HSV早期基因的转录的结果一致,立即早期蛋白必须经过CDK的修饰活化才能促进早期基因的转录。

综上,与小的DNA病毒类似,HSV的复制也与细胞周期密切相关。HSV在周期细胞中的复制速度远远大于静止细胞。HSV感染引起细胞周期阻滞但诱导了细胞周期相关蛋白的表达和活性以促进HSV的的复制。CDK可能通过通过促进RNA聚合酶CTD的磷酸化、影响HSV染色体的构象、使HSV调控蛋白以及细胞蛋白的磷酸化等多种机制促进HSV基因的转录和DNA的复制。

4展望

目前发现能被PCI抑制的病毒越来越多,亦即众多的病毒的复制或转录都需要CDK〔14〕。说明CDK2在病毒复制中作用的普遍性。CDK似乎是病毒与宿主细胞抗衡的的焦点。因此CDK抑制剂正在作为抗病毒药物进行积极的研发中,PCI作为抗肿瘤药已进入临床二期实验阶段。虽然自从1998年首次发现PCI能抑制HSV的繁殖以来,关于PCI抗病毒作用的研究较多,但是具体哪种CDK在HSV繁殖中起作用,在HSV感染的哪一阶段起作用所知不多。正像过去HSV是研究真核生物转录机理及调控的模型一样,目前HSV也成了研究病毒于宿主细胞相互作用以及抗病毒药物研制开发的重要模型。深入研究CDK与HSV复制的关系将会对HSV以及其他重要疾病病毒在细胞内的活动过程有更清晰的认识,同时对PCI作为抗病毒药的研发具有重要意义。

5参考文献

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3FieldsBN,KniPeDM,HowleyPM.Virology〔M〕.3rdeditionvol2Philadelphia:Lippincott-Raven,1996.

4TattersallP.ReplicationoftheparvovirusMVM.Ⅰ.Dependenceofvirusmultiplicationandplaqueformationoncellgrowth.JVirol,1972,10:586-590.

5MuzyczkaNandBernsKIinFieldsVirology(D.M.KnipeandP.M.Howley.Vol.2,pp2327-2359,2001.

6GellerAI.Herpesviruses:expressionofgenesinpostmitoticbraincells.CurrOpinGenetDev,1993,3:81-85.

7SchangLM.Thecellcycle,cyclin-dependentkinases,andviralinfections:newhorizonsandunexpectedconnections.ProgCellCycleRes,2003,5:103-124.

8deBruynKopsA,KipeDM.FormationofDNAreplicationstructuresinherpesvirus-infectedcellsrequiresaviralDNAbindingprotein.Cell,1988,55:857-868.

9HollyoakeM,StuhlerA,FarrellP,GordonJ,SinclairA.ThenormalcellcycleactivationprogramisexploitedduringtheinfectionofquiescentBlymphocytesbyEpstein-Barrvirus.CancerRes,1995,55:4784-4787.

10Rickinson,A.B.andKieff,E.inFieldsVirology(D.M.KniPeandP.MHowley)Vol.2,pp2575-2625,2001.

11DarganDJ,Subak-SharpeJH.TheeffectofherpessimplexvirustypelL-particlesonvirusentry,replication,andtheinfectivityofnakedherpesvirusDNA.Virology,1997,239:378-388.

12Lomonte,P,andR.Everett.Herpessimplexvirustype1immediateearlyproteinVmwl10inhibitsProgressionofcellsthroughmitosisandfromGlintoSPhaseofthecellcycle.JVirol,1999,73:9456-9467.

13Hobbs,WandN.DeLuca.PerturbationofcellcycleprogressionandcellulargeneexpressionasafunctionofherpessimplexvirusICPO.JVirol,1999,73:8245-8255.

篇9

中小企业是与所处行业的大企业相比人员规模、资产规模与经营规模都比较小的经济单位。随着经济的发展,中小企业日益成为国民经济的重要力量。但是,

(三)努力促进商业性担保机构的扩大和发展

从结构上来看,

虽然商业担保是以盈利为目的,而中小企业贷款又呈现风险高和缺少反担保品的特点,但是中小企业贷款担保市场还是有足够的吸引力吸引民间资本的进入。首先,从需求来说中小企业始终存在资金缺口。需要外源性间接融资,但中小企业的资信有限,所以离不开外部的融资担保。中小企业担保市场的需求是客观存在的,市场容量也很大。其次,商业担保机构可以采用多种风险分散机制来规避自身的担保风险。如再担保、参加贷款保险、反担保条款和实行经营多元化等。政府除了积极建立再担保机构外,还应该从工商和财税等方面提供优惠政策,扶持和鼓励民间资本型中小企业担保机构的发展。

(四)建立健全有关法律制度,营造担保业发展的良好的运行环境

完善的法律体系是信用担保业健康、可持续发展的制度保障。综观美国、日本等发达国家的信用担保体系,其共同点之一首先是相应的法律、法规建设非常完善。编辑整理

参考文献:

[1]陈乃醒.中小企业信用担保[m].天津:南开大学出版社,2004.

篇10

一、信息非对称视角下中小企业融资障碍

根据古典经济学理论，在以对称信息、完全竞争、生产要素自由流动为特征完善市场条件下，主要由信贷市场的价格杠杆—利率来调节信贷资金的供给和需求，最终使信贷市场趋于均衡，信贷资源配置实现了帕累托最优。但是，现实中很难具备的这种理想条件，非对称信息现象是处处存在。根据非对称理论不对称信息可以分为事前非对称和事后非对称两类。在信贷市场上，事前非对称信息主要包括有关企业资产运营能力、偿债能力、发展能力、投资项目质量等信息非对称，导致逆向选择。事后信息非对称主要是指经营管理者对投资项目的决策以及经营者本身素质能力等信息非对称，导致道德风险。信息非对称，成为中小企业中融资的主要障碍。

（一）内部治理结构缺陷增加企业边际信用成本 企业内部的信息结构应与其内部治理结构相匹配。多数中小企业是家族式企业，采用集权式管理模式，一般是最高管理层直接指挥操作层的员工进行生产活动，中层管理人员很少甚至不参与。基层信息零碎且分散，通常以不规范的表达形式传递给最高管理层。中小企业的这种信息结构在一定程度上减少内部信息利用成本，却增大了外部投资者、债权人、供应商等外部信息使用者获取和利用信息的成本，减少了信息对外披露的透明度。中小企业融资问题从根本取决于外部投资者和债权人等资金供给者对企业内部各种信息的信任度。因此，中小企业信息披露不规范必然会增加融资的边际信用成本。

（二）中小企业自身特性增加银行的交易成本 一般而言，在利息给定的情况下，影响银行贷款决策的根本因素是银行对客户对象的风险识别和评估。中小企业多为个人或家族管理，规模小、经营周期短，而且基本上不需要由会计师事务所对其财务报表进行审计，一般信息内部化不透明。商业银行贷款决定前，不得不耗费大量的时间来调查企业的财务和信用状况以防范逆向选择问题；发放贷款后，加大对借贷资金使用的监管力度，以防范道德风险问题。此外，中小企业由于缺少符合银行标准要求的抵押品和担保人，银行也很难提供抵押担保贷款。因此，国有银行才能够防范信息非对称可能产生的道德风险，对于中小企业的小规模融资需求需要支付额外的信用评估与监督成本，以此防范信息非对称，导致交易成本增加。

（三）中小企业非国有产权加剧信息非对称风险 我国中小企业主要由乡镇企业、城镇集体企业、个体私营企业等非国有经济组成，约占80%，其非国有产权的特性削弱了银行对其放贷的意愿。由于我国传统的体制因素，国有银行、国有企业和国家财政在产权上都属于中央政府，而中央政府并没有建立有效的权力与约束相对称的国有产权经营管理体制，所以，国有产权在经营管理上呈现出风险的“软约束”。国有银行贷款给国有企业时无须过多考虑国有企业的逆向选择和道德风险问题，因为信息非对称造成的风险最终会由国家财政来化解。所以国有商业银行并不完全按照风险与收益对等的原则来确定贷款对象。当银行贷款给非国有的中小企业时，由于产权归属不同，国有商业银行不能将信息非对称风险转嫁给政府，完全由银行来承担，从而导致国有商业银行在贷款给中小企业时出现“惜贷”现象。

二、信用担保是解决信息非对称的有效途径

在信息非对称的条件下，解决中小企业融资难问题，实质上就是解决信息非对称问题。中小企业信用担保发挥作用，其核心在于直接减少信息非对称或规避和抑制逆向选择和道德风险的发生，使得更多中小企业获得信贷支持，同时分散了银行贷款风险，扩大了银行信贷规模和收益。

（一）信用担保能够提升中小企业信用水平与融资能力 由于自身特性因素，中小企业普遍存在着信用缺失的问题。无论自身资格条件还是抵押担保条件都达不到银行规定要求，中小企业很难直接从银行获得资金支持。管理规范的中小企业信用担保机构具有严密的风险管理措施，在担保对象的准入门槛、融资担保规模的控制、反担保措施的落实、担保运作程序等方面，均有明确的管理规程，并在工作中严格执行。因此，由上述机构提供介入担保，协作银行对其具有较高的信任度，能使中小企业信用得到提升。担保机构除为中小企业提供融资担保服务外，还为中小企业提供创业指导、信息咨询、信用评级等方面服务，促进中小企业加强信用管理，树立信用意识，营造良好企业信用环境。

（二）信用担保有利于银行分散风险、降低管理成本 由于中小企业资产规模较小、经营管理能力较弱、缺乏市场竞争力，另一方面金融机构对中小企业信贷激励机制没有建立起来，商业银行出于资产的质量和贷款的安全性等要求，更倾向于将资金投放于大型企业。管理规范、运作专业的中小企业信用担保机构介入中小企业贷款业务后，对受保中小企业、企业业主和主要经营者从道德、责任、财务、市场、政策、过程等方面实施全方位的考核和监控，与银行注重企业财务报表信贷考核体系形成优势互补，提高了对信贷风险识别、评估和控制能力。同时，信用担保机构方面作为中小企业贷款风险的直接承担者，使银行的信贷风险得到转移，增强了银行贷款的信心。

（三）信用担保促进了政府对中小企业的政策扶持作用 与大企业相比，中小企业在管理、信息、资金、技术、人才等方面都处于弱势地位。由于中小企业在促进地方经济发展和解决就业等方面都发挥着重要作用，国家和地方出台多项优惠政策，从税收、用地、用工等方面对中小企业进行扶持，多面促进和支持中小企业的发展。能够获得足够的资金支持是各项对中小企业扶持政策充分发挥作用的前提条件。信用担保可以缓解中小企业融资难的问题，有利于各项政府政策的扶持功能的充分发挥。

（四）信用担保有利于优化社会信用环境 信用是市场经济的基础。市场化程度越高，对信用的要求就越高。现代金融、商品交换都是构建在信用之上的。企业作为我国市场经济主体的重要组成部分，其信用水平直接影响着市场经济秩序，企业信用等级越高，整个市场经济的信用等级也会越高。信用担保的出现，为企业赢得较高的信用等级获得长期的资金支持，同时对优化社会的信用环境起到了重要的引导作用，是提升整个社会信用水平的必然选择。

三、中小企业信用担保机制构建思路

（一）多层次的信用担保体系 信用担保机构作为市场经济重要的参与主体，是中小企业信用体系建设的重要组成部分。根据我国中小企业自身特点，建立一个多层次、多渠道的信用担保体系。依据《担保法》和有关法律规定，分别建立企业法人、事业法人和社团法人三类法律形式三种担保机构：（1）以政府为主体信用担保基金，在政府机构的监管下实行市场化运作，其基金主要来源于地方政府财政预算拨款、社会发行债券集资、中小企业闲置资金。（2）地方政府、金融机构和本地企业共同出资组建的担保公司。由地方财政部门推荐中小企业，并对金融机构做出承诺保证责任，由担保公司为当地的中小企业提供担保。（3）会员制的担保机构，由若干中小企业联合组成信用共同体，实行封闭式基金运作形式，按“风险共担，利益共享”的原则运作。

（二）多元化的信用评级机制 要建立以中小企业、政府相关部门、担保机构、再担保机构、中介机构和金融机构为主体的信用评级机制，其主要职能为信用登记、信用采集、信用评估和信用。首先，由政府相关部门与再担保公司组织聘请权威评级机构对贷款担保机构实施信用评级，根据评定的等级对担保机构实行差异化管理。其次，政府有关部门组织信用评级机构，每年定期对有信贷需求的中小企业开展信用评级，银行金融机构可以向符合信贷标准的中小企业提供融资服务；对信用等级较低的中小企业，通过信用培育帮助其提高信用水平。最后，在担保机构、再担保公司、银行、企业、政府之间的建立信息互通机制，解决融资中信息非对称问题。

（三）担保机构的资金补偿机制 可以借鉴国外通行做法，建立中小企业信用担保体系风险补偿基金。基金主要来源是政府每年在预算内安排一定的资金设立扶持担保机构发展专项资金，为担保公司对民营及中小企业开展担保业务提供适当的经济补偿。也可以利用自身的发展推动中小企业更大的发展，按照一定比例从征自中小企业税收中提取一部分资金专门用于担保机构的资金补偿。各级政府还可以通过发行专门用于补偿政府中小企业担保资金的专项国债。此外，为促进担保机构规范运作和可持续发展，从担保实力、规范运作、风险控制、无形资产、行业管理评价等方面制定中小企业信用担保机构担保绩效评价指标体系。

（四）分散与规避风险的机制 担保是高风险行业，相关部门应设计了一套风险分散机制，即担保机构、银行和企业在风险共担、利益共享的基础上共同协定责任比例。一是规范担保机构自身运作。按合理的比例提取未到期责任准备金及风险准备金，用于防范担保赔付。同时拓宽业务范围，探索与银行在中小企业贸易融资、融资租赁、票据贴现等业务领域的担保合作，做大做强担保业务，提高自身盈利水平；二是对中小企业实行风险约束，强化业主和管理者的责任，避免道德风险，在担保条款中要求主要股东、管理者提供个人财产抵押；三是建立完善的信息披露机制，中小企业都要向有关部门汇报信贷保证计划执行情况，并审查计划预算执行情况。

（五）外部监管机制 首先，由国有资产监督管理委员会、财政、银行等部门组成担保监督委员会，对担保机构进行监督和政策扶持。担保机构应采取公司制的形式，要规范运作，防范风险。同时将政策性中小企业担保机构统一纳入中小企业信用担保体系，并实行市场化运作。其次，建立信用担保行业协会，加强行业协作与自律。协会要依据有关法律、法规和政策的规定，制定统一的业务准则，规范执业行为，监督担保机构依法运作。同时，协会通过搭建平台，通过培训、研讨等方式加强担保行业协作、信息交流，树立中小企业信用担保机行业的良好社会形象和社会公信力。

（六）法律保障机制 要借鉴国外的成功经验，完善我国中小企业信用担保的法律法规。整合现有的《中小企业促进法》、《担保法》和《公司法》，尽快出台担保行业的专门法律法规，搭建起中小企业信用担保体系的基本框架，确定信用担保活动的基本规则，使其更好地服务于中小企业。同时，完善中小企业信贷法、中小企业促进法等与信用担保有关的配套法律，为信用担保机构处理企业信息披露、债权保护、欺诈处理等方面提供法律依据和诉讼渠道，促进担保机构的整体发展。另外，还应加快有关社会信用体系方面的法律法规建设，内容包括信用等级的评定、资信评估等，以利于中小企业信用担保体系的发展。

参考文献：

[1]沈勇：《我国中小企业融资现状及对策研究》，《当代经济》2009年第8期。

[2]杨胜刚、胡海波：《不对称信息下的中小企业信用担保问题研究》，《金融研究》2006年第11期。

[3]胡宏桥、陈小安：《信息不对称下中小企业融资障碍及解决途径》，《武汉金融》2005年第7期。