细胞生物学特性范文
时间：2023-12-04 17:58:35
导语：如何才能写好一篇细胞生物学特性，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
【关键词】 红斑狼疮；系统性；骨髓间充质干细胞；生物学特性
骨髓间充质干细胞(Marrow Mesenchymal Stem Cells，MSC)具有高度自我更新和多向分化的潜能，并具有支持造血和免疫负调节作用［1］。大量的体外细胞培养实验［2,3］证明它具有诱导免疫耐受和免疫抑制的特性。MSC移植在SLE治疗中具有较广阔的应用前景。了解SLE患者自身MSC是否异常是判断选择自体或异体MSC移植治疗SLE的重要依据。SLE患者MSC的体外扩增及其生物学特性是协助我们评价SLE患者MSC是否存在缺陷的重要方面。
1 资料与方法
1.1 一般资料 9例SLE患者均符合1997年美国风湿病学会修订的SLE分类诊断标准，SLE疾病活动评分(SLEDAI)判断疾病的活动程度。9例患者的资料见表1。另选5例性别、年龄匹配的健康者作为对照组。
1.2 骨髓MSC分离培养 采用羟基淀粉沉淀联合Ficoll 密度梯度离心法和贴壁筛选法分离培养MSC。具体方法无菌操作下抽取骨髓液 10 ml，以 5×105 U/ml 肝素钠抗凝，先用羟基淀粉按1∶4体积加入，静置20 min，通过自然沉降去除下沉的大量红细胞，剩余的含大量红细胞的下层液体，再用淋巴细胞分离FicollHypaque常规分离单个核细胞。将上述两步分离所得的骨髓单个核细胞充分混匀，悬浮于体积分数为10％的 胎牛血清DMEMLG 培养液中，按约1×106/ml密度接种于25 cm2培养瓶， 置 37 ℃、体积分数为5％的 CO2饱和湿度的培养箱中。当显微镜下观察细胞已达90%融合时，则可传代。用0.5%胰酶/乙二胺四乙酸(EDTA)(Gibco，美国)消化贴壁细胞，收集细胞并悬浮于完全培养液中，按104/cm2的密度接种于新的培养瓶中，置37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养，每3~4天更换1次培养液，约1周待细胞生长密度达90%左右时，进行再次传代。
1.3 MTT法检测MSC的生长情况 MTT比色法检测SLE患者第2代MSC的生长情况，作传代细胞培养的生长曲线分析。
1.4 流式细胞术检测MSC表面分子的表达 细胞培养扩增到第三代时，分别取100 ul细胞悬液与鼠抗人CD29、CD44、CD34、CD45抗体室温反应30 min。流式细胞仪检测。
2 结果
2.1 MSC的传代情况及形态
本实验进行了9例SLE患者和5例健康对照者MSC体外培养。5例健康对照者MSC 均能成功体外扩增。9例患者中，5例MSC能传代扩增，传代率为55.6%。其中女性4例，男性1例，年龄16~26岁，平均年龄21.8岁；病程3~24月，平均病程9.8月；DAI评分为15~21， 平均评分为18.6。5例SLE患者均合并有肾损害，其中1例合并有血液系统损害。MSC体外扩增不成功的4例SLE患者，均为女性，年龄26~45岁，平均年龄38.2岁；病程6~60月，平均病程37.5月；DAI评分为1322， 平均评分为18.5。4例SLE患者均合并有肾损害，其中2例合并有严重血液系统损害。每例患者的临床资料及MSC体外培养基本情况见表1。
2.1.1 体外扩增成功者 5例MSC体外扩增成功的SLE患者，MSC生长情况与健康对照组相比较：原代培养时，细胞形态上与健康对照组相似，但纺锤形、梭形细胞的出现稍晚，一般于2~4 d，健康对照组的一般出现于1~2 d内；随后逐渐见集落形成，原代培养的时间平均为(14.2±1.45)d，与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，细胞呈长梭形旋涡样生长；传代后细胞生长较旺盛，平均传代时间(5.8±0.44)d，与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。消化传代的细胞于24 h内完全贴壁，形态与健康对照组相似。
2.1.2 体外扩增不成功者 MSC生长情况与健康对照组相比较：同等骨髓量分离得到的单个核细胞数量与健康对照组相比明显减少，且贴壁的纺锤形、梭形细胞的出现时间明显较晚，一般于6~7 d，且仅零星分布，不成集落生长，随着培养时间的延长，其中2例可见细胞少量扩增，培养至第15天，约见20％~30％融合的短梭形细胞生长(图3)，至第30天，细胞基本自行凋亡；另2例至第18天，见部分长梭形细胞零星分布，融合少于10％，至第30天细胞基本自行凋亡。
2.2 MSC表面分子的表达
流式细胞术检测BMMSC细胞表面抗原，结果显示体外扩增成功的SLE患者BMMSC均高表达CD29、CD44，而不表达CD34、CD45，第3代BMMSC纯度达95%以上，且各表面标志的表达与健康对照组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。
2.3 MSC的生长情况
SLE患者第2代MSC生长趋势与健康对照组相似，第3~4天生长活跃，第4天后生长渐缓，第56进入生长平台期。
3 讨论
MSC是骨髓中具有高度自我更新和多向分化潜能的一群干细胞，体外培养易纯化、扩增迅速，具有支持造血、免疫调节和诱导免疫耐受的作用。本实验进行了9例SLE患者和5例健康对照者MSC的体外培养。健康对照者MSC 均能成功体外扩增。9例SLE患者中，5例可以传代扩增，传代率为55.6%。有4例SLE患者MSC不能成功传代扩增，说明部分SLE患者MSC存在缺陷。另一方面，我们发现能成功传代的5例SLE患者MSC无论是从细胞形态、原代培养所需时间、平均传代时间及表面特异性分子表达均与健康对照组无明显差异，所培养、扩增的细胞能达到临床应用的要求。提示这部分SLE患者MSC生物学特性基本正常。
对两组扩增情况不同的SLE患者的临床资料进行比较，我们发现未能成功体外扩增的SLE患者具有如下的临床特征：①年龄较大。②病程较长。③合并有较严重的血液系统损害。④长期大剂量应用免疫抑制剂。
大量实验发现，MSC的生物学特性与年龄密切相关。骨髓中MSC的含量、质量以及细胞活性随着年龄的增长而下降［4,5］。骨髓中MSC的克隆数随着年龄的增长而逐渐减少，且BMMSC分泌SCF、FLT3L、IL6、TGFβ1及SDF1等与自我更新密切相关的细胞因子的能力逐渐下降，导致BMMSC的增殖能力逐渐减弱。另外，也有研究者指出［6］，病情较重的SLE患者，从骨髓中可提取的单个核细胞数原本就较少，所含MSC就更少。然而SLE病情轻重、病程长短及不同药物治疗是否会影响SLE患者MSC的体外扩增、生物学特性及功能，目前尚未能明确。
我们实验说明SLE患者MSC存在一定的异质性，因此应用MSC治疗SLE前，了解患者自身MSC是否存在缺陷是必需的。如果患者MSC本身存在缺陷，为避免治疗失败或复发，异体MSC输注为首选；如果MSC本身基本正常，自体MSC输注将是有效的。SLE患者MSC的体外扩增及其生长特性是协助我们评价SLE患者MSC是否存在缺陷的重要方面，为SLE患者MSC移植的治疗方法提供了理论依据。
参 考 文 献
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［3］ Tse WT， Pendleton JD， Beyer et al. Suppression of allogeneic Tcell proliferation by human marrow stromal cells: implications in transplantation. Transplantation, 2003，(75):389397.
［4］ Kotev Emeth S， Savion N， Pri2 chen S， et al. Effect of maturation on the osteogonic response of cultured stromal bone marrow cells to basic fibroblast grow th factor. B one， 2000，27:777783.
篇2
【摘要】 目的 观察不同年龄段大鼠脂肪间充质干细胞(adiposederived stromal cells， ADSCs)生物学特点与年龄的关系，为临床寻找理想的种子细胞并迅速获取所需ADSCs提供实验依据。方法 使用密度梯度离心法分离不同年龄段脂肪间充质干细胞进行培养，保留贴壁细胞传代，分析脂肪间充质干细胞的纯度，观察细胞生长情况，检测其增殖活性、细胞周期。结果 不同年龄段ADSCs均贴壁生长，呈典型ADSCs形态和生长特征，传代细胞的增殖速度比原代细胞快，但随着年龄的增长，原代及传代培养ADSCs的增殖能力下降，生长周期延长。结论 ADSCs的增殖能力和活性随着年龄的增长而降低，但各年龄段ADSCs均可满足临床不同患者组织工程种子细胞的要求。
【关键词】 脂肪间充质干细胞；年龄；大鼠；细胞培养；增殖
ABSTRACT: Objective To investigate biological characteristics of rat adiposederived stromal cells (ADSCs) of different ages. Methods ADSCs were isolated by density gradient centrifugation from different age stages， and cultured in vitro. The adherent cells were preserved to passage， the purity of ADSCs was analyzed by immunocytochemistry method， and cell growth was observed， then proliferation capability and cell cycle were detected. Results All the ADSCs obtained from different age stages grew well and showed good morphology and growth characteristics. The proliferation rate of passage cells was higher than that of primary cells， but the proliferation activity reduced with aging， and cell cycle was prolonged. Conclusion The proliferation capability and activity of ADSCs decreased with aging. However， ADSCs of different age stages can all meet the needs of different patients for tissue engineering seed cells.
KEY WORDS: adipose derived stem cell; age; rat; cell culture; proliferation
组织工程的兴起和迅猛发展为临床修复重建带来了新的治疗途径，成为目前最有前景的生理性修复技术[12]。种子细胞的选择是组织工程的基础和关键之一。2001年ZUK等[3]通过脂肪抽吸术获得脂肪间充质干细胞(adiposederived stromal cells， ADSCs)。ADSCs具有来源丰富、易于获取、自体移植可以避免排斥反应以及许多伦理问题等优点。大量研究发现，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs)的含量、质量以及活性随着年龄的增长而下降[4]。但是不同年龄的ADSCs在体外生长及增殖能力是否具有差异，是否能够满足临床修复的需要?ADSCs能否成为组织工程新的最理想的种子细胞?本研究旨在探讨不同年龄阶段ADSCs的生长增殖能力及其机制，为ADSCs的体外培养及临床应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 DMEM、胎牛血清(Gibco)、Ⅰ型胶原酶(Sigma)、EDTA、MTT(Amerison)、CD34、CD44、CD49d、CD106(Sigma)。
1.2 实验动物分组 健康SD大鼠，雌雄不限，按月龄分为幼年组(1月龄)、成年组(12月龄)和老年组(24月龄)。体重分别约为150、400、750g。
1.3 ADSCs的分离培养及传代 取SD大鼠，脱颈处死，消毒，无菌条件下取腹股沟部及肾下1g脂肪组织，去除其他组织，用PBS冲洗3次，将脂肪组织剪成大约1mm3小块，置2g/LⅠ型胶原酶中，消化60min，然后1000r/min，离心10min，弃上清，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液，计数，接种于培养瓶中，常规培养。待细胞融合达80%时1∶2传代、扩增培养。
1.4 细胞形态学观察 每日在倒置显微镜下观察原代及传代细胞的生长情况以及形态特点。
1.5 ADSCs表面标记的检测 取第3代的ADSCs，分为4份，分别滴加兔抗鼠CD34、CD44、CD49d、CD106一抗，4℃反应30min后，PBS洗涤2次，滴加异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗兔IgG，避光固定，经流式细胞仪检测细胞表面CD34、CD44、CD49d、CD106阳性细胞的表达。将第3代ADSCs多聚甲醛固定后，免疫细胞化学方法染色鉴定。
1.6 ADSCs生长周期的测定 取第3代细胞达80%融合时消化制成细胞悬液，滴入4℃预冷的700mL/L乙醇中固定30min，PBS漂洗离心，RNAseA处理30min，离心，加入碘化丙啶0.5mL，4℃避光染色30min，流式细胞仪488nm检测。
1.7 绘制ADSCs的生长曲线 取各年龄组ADSCs以1×104/mL的密度接种于96孔培养板内，每孔200μL，常规培养。每天同一时间随机抽取6孔细胞，加入50g/L MTT 20μL/孔，培养4～6h，DMSO震荡10min，酶联免疫测定仪测定波长490nm处的吸光度。取6孔吸光度的均值，以时间(d)为横坐标，吸收值(A)为纵坐标，绘制生长曲线。
1.8 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。所有数据采用±s表示。组间比较采用单因素方差分析，方差不齐组经数据转换后再进行方差分析；各组细胞生长曲线用重复测量的方差分析(Repeatedmeasures ANOVA)。P
2 结
果
2.1 细胞形态学观察
2.1.1 原代培养ADSCs的形态学观察 通过密度梯度离心获得的ADSCs接种后在悬液中细胞呈圆形，不能辨认细胞核，各年龄组在原代培养24h，可见细胞开始贴壁，细胞呈星形，胞体较小；培养第4天，各组细胞形态无差别，均呈梭形、多角形；幼年组细胞数量多，形成集落明显，克隆性生长(图1A)；成年组细胞数量较多，克隆性生长(图1B)；老年组细胞数量少，散在分布(图1C)。幼年组ADSCs大约5d左右达到80%细胞融合基本铺满瓶底，成年组和老年组ADSCs分别需要6、8d左右才可以达到80%细胞融合，进行传代。
2.1.2 传代培养ADSCs的形态学观察 各年龄组均呈现特征性生长模式，传代培养的ADSCs生长模式与原代培养细胞相似，但细胞增殖速度比原代明显加快(图2)，幼年组、成年组、老年组细胞分别为3、4、5d左右传代，ADSCs多呈短梭形。
2.2 细胞表面标记检测 对各组第3代ADSCs通过流式细胞仪检测了CD34、CD44、CD49d、CD106四个细胞表面标记，各年龄组细胞表面CD44、CD49d阳性表达，免疫细胞化学染色后胞膜为棕色，阳性率均在95%以上；而CD34、CD106为阴性表达，胞膜未着色(图3)。
2.3 ADSCs生长周期的测定 各年龄组周期细胞所占比例见表1。老年组与成年组、幼年组相比，G0/G1期由78.77%增至88.30%；S期比例由15.23%降至8.17%，幼年组S期比例明显高于其他组，与成年组之间的差异有显著性意义(F0.05(1，27)=4.21
2.4 ADSCs的生长曲线 各年龄组的细胞生长曲线呈S型。接种后1～2d为滞留期，第3天左右达对数生长期，第6～7天达到最高峰，此后出现生长抑制状态，进入平台期，数目不再增长。年龄越小细胞增殖速度越快，幼年组高峰值明显大于其他组，但与老年组之间的差异无统计学意义(图4)。图4 不同年龄段ADSCs的生长曲线
3 讨
论
组织工程中种子细胞的选择至关重要。目前，主要的种子细胞有以下几种：胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血间充质干细胞等。胚胎干细胞虽然可以定向诱导分化为各种组织细胞，但是存在伦理问题，限制了其实际应用[5]。一般认为BMSCs是组织工程理想的种子细胞之一，但即使在骨髓中，MSCs的含量也很低，每105～106个单核细胞中大约含一个MSCs，并且随着增龄，MSCs含量逐渐减少[6]，并且骨髓穿刺给患者造成较大的创伤和痛苦，而且采集量有限，每个成人只能抽取10～20mL骨髓，因此不利于临床大规模的培养与应用。脐血间充质干细胞来源有限且分离困难，临床应用潜力较小。ADSCs证实其具有分化为多种中胚层来源细胞的潜能[7]，由于人体脂肪量较多约占体重的13%，所以ADSCs的来源十分丰富，并且自体移植可以避免排斥反应以及许多伦理问题。
本实验中各年龄阶段SD大鼠均能培养出ADSCs，各组细胞均呈梭形或不规则形。幼年组和成年组细胞胞体较小、集落形成较密集、形态规则、细胞密度大；老年组细胞较大并且稀疏、呈散在分布、供体形成集落小、少，幼年组以及成年组细胞提取数量明显高于老年组。
本研究中ADSCs表面表达CD44、CD49d阳性；而CD34、CD106为阴性表达。CD34作为造血干细胞标志性免疫表型，CD34阴性说明ADSCs并非来源于血液循环中的干细胞，同时说明ADSCs未受到脂肪组织中微血管内皮细胞的污染。有研究显示ADSCs与BMSCs都可表达CD44[8]。CD49d在ADSCs中为阳性表达，在BMSCs中则为阴性表达；而与CD106相反；本实验CD106阴性表达，已经排除BMSCs污染的可能。以上结论说明已经得到纯度较高的ADSCs。CD49d是调节造血干细胞和祖细胞定居归巢到骨髓的表面分子，CD106是调节造血干细胞和祖细胞从骨髓中向外迁移的表面分子，CD49d与CD106是ADSCs与BMSCs很好的区别标记，但其本质有待进一步的研究。
不同年龄阶段的ADSCs在细胞周期各时相中的分布趋势为G0+G1期>S期>G2+M期，说明从幼年、成年一直到老年，大多数ADSCs处于G0+G1静止期，各组细胞随供体年龄增加，G0+G1静止期百分比例不断增加，说明衰老使机体内处于静止的ADSCs数量不断增加；S期的细胞比例反映了细胞的增殖程度，幼年组细胞处于S期的百分比例大于其他组，与其他组有显著性差异，呈现随年龄增长而增殖期细胞减少的趋势，说明随着机体的不断衰老，干细胞增殖能力也在不断减弱。
体外培养的ADSCs经历生长滞缓期、对数增殖期和平台期，生长曲线呈S形，这符合干细胞的生长特性。各组均在3d左右出现倍增，7d左右达到增殖高峰，7d以后由于细胞已经基本长满瓶底，出现接触抑制现象，细胞生长反而相对缓慢。由生长曲线可以看出随供体年龄的增长，细胞的增殖能力和活性相应减弱。各年龄段ADSCs均可稳定传至9代，按支架接种细胞数106～107的要求[9]，经过传代培养后各年龄段的ADSCs的数量均可满足临床需要，但是应充分考虑不同年龄段供体脂肪的抽取量以及种子细胞的扩增时间与病情的需要。
综上所述，明确了各年龄段从脂肪组织均可获得ADSCs，并保持稳定增殖力，不同年龄组经过传代能够使ADSCs相对纯化，并且扩增数量能满足临床应用的需要，但应考虑年龄对ADSCs增殖的影响。本实验证实ADSCs能够成为组织工程中新的理想的种子细胞，并为ADSCs的临床应用提供了依据。
参考文献
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[4]KOTEVEMETH S， SAVION N， PRICHEN S， et al. Effect of maturation on the osteogenic response of cultured stromal bone marrow cells to basic fibroblast growth factor [J]. Bone， 2000， 27(6):777783.
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篇3
【关键词】骨髓间充质干细胞；细胞培养；细胞鉴定
【中图分类号】R392.4【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0346-02
骨髓间充质干细胞(bone marrow-drived mes-enchymal stem cells,BMSCs是来源于骨髓的 MSCs，具有采集方便的优点，是理想的组织工程种子细胞［1］具有多向分化和自我复制潜能,易于自体采集、无免疫排斥反应、避免伦理学限制等优点,在细胞治疗方面得到了广泛的应用。但是BMSCs在骨髓微环境中所占比例极少,使用何种简单操作方法快速获取形态均一和纯度较高的BMSCs便成为该研究领域关注的焦点［2］。本实验采用全骨髓贴壁细胞培养法和密度梯度离心法相结合分离、纯化BMSCs，通过体外培养扩增，以及流式细胞术鉴定，建立稳定的BMSCs培养扩增方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物：日本大耳白兔4只，4周龄，雌雄不限，体重250~300g，购于兰州生物制品研究所。
1.2 主要试剂及仪器：二氧化碳培养箱(BB16UV型,德国Heraeus公司)、超净工作台(VS-1300L型,苏净集团苏州安泰空气技术有限责任公司)、倒置相差显微镜、超声波清洗仪、纯净水系统、酸度计、台式高速离心机(北京科伟永鑫实验仪器设备厂)、低糖培养基(GBICO公司)、胎牛血清（杭州四季青）、谷氨酰胺、青链霉素、胰酶、流式细胞抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。
1.3 兔BMSCs的采集： 取4周龄日本大耳白兔一只，雌雄不限，20ml空针空气栓子经耳缘静脉注入，待兔死亡后，将其全部浸泡于75%酒精溶液内8~10分钟，在无菌环境下切开前后肢皮肤，切下兔前后两肢，剃去覆盖于肱骨、胫骨及股骨上的肌肉组织，注意保留骨的完整性，用组织剪分离股骨、胫骨及肱骨，将其置于无菌培养皿中，纵向依次剪开各长骨两端，5ml注射器沿剪开的骨端注入L-DMEM冲洗3次，收集冲洗液约10ml，用筛网过滤冲洗液，加入完全低糖培养基重悬组织冲洗液，吸管反复吹打混匀，1000 r/ min ，4 ℃，离心 5 min ，弃去上清。再次加入适量完全低糖培养基，吹打混匀，分别加入一次性培养皿中，放入37℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养（图1）。
1.4 兔 BMSCs 培养：1.4.1 原代 BMSCs 培养 向分离得到的细胞组织悬液加入 10ml 含 20 %胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的 L-DMEM 培养基重悬细胞，并转移至中号塑料培养皿内。将培养皿置于37 ℃，体积分数为 5 %的 CO2孵箱中培养。培养 72 h后使用含 20 %FBS 的 L-DMEM 完全培养基换液。原代培养 5-7 天后，细胞融合可达 80 %以上。将原代培养的 BMSCs 在倒置相差显微镜下观察细胞集落的形成和细胞形态（图2）。
1.4.2 传代 BMSCs 培养 待原代细胞铺满培养瓶底后，用EDTA胰蛋白酶消化贴壁细胞，FBS 终止消化后将细胞悬液以 1:3 比例接种于新培养瓶中，加入含 10 %FBS 的 L-DMEM完全培养基 5ml 培养，每隔 2 天换液，约 3-4 天后细胞可铺满瓶底。将传代培养的 BMSCs 在倒置相差显微镜下观察细胞形态。以此方法，向后传至三代（图3、4）。
1.5 兔 BMSCs的鉴定
对干细胞的鉴定主要是建立在对细胞表面标记物的识别基础上，采用流式细胞仪特有的细胞分析技术，可在短时间内精确分析出细胞表型以及其所占有的比例，使用间接标记法标记 CD44、CD34。取第3 代 BMSCs 以 2.0×105/mL 重悬，PBS 洗涤细胞 3次，向细胞悬液中加入鼠抗兔CD44、CD34 （稀释 1:100） 为一抗，4 ℃保存 30 min，加入羊抗鼠含 FITC、PE 的二抗，4 ℃避光保存 30min。PBS 洗涤细胞 3 次后放入流式细胞仪中检测。记录数据（图5、6）。
2 讨论
BMSCs具有贴壁性、具有强大的增殖能力和多向分化潜能、具有免疫调节功能、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。
2.1更好地增加BMSCs的贴壁性： 在BMSCs培养中，细胞贴壁培养与传代成功与否是本实验的关键。其中存在很多问题，比如在细胞贴壁方面，用一次性塑料培养皿效果要优于可重复使用的玻璃培养瓶、培养皿。塑料培养皿内壁有一层鼠尾胶原，它可以更好地促使骨髓间充质干细胞贴壁。
2.2 培养基最佳的酸碱度： 培养基中加碳酸氢钠的目的，是为了在二氧化碳培养箱中平衡培养基中的PH值。对于GBICO的DMEM培养基，3.7g是对应二氧化碳培养箱的二氧化碳浓度设定在10%，而5%的则对应的是2g碳酸氢钠。暴露在空气中的培养液，因为大气中二氧化碳的浓度很低，液体中的二氧化碳会气体分压高于大气，因此会逐渐溢出，浓度逐渐降低，液体的PH值也逐渐升高，如果DMEM在空气中存放时间过长，它将有可能变成紫红色。一般新配置的颜色正常，在多次开盖，培养液接触空气的时间较长后，颜色会逐渐变成紫红色，笔者的做法是，配制培养液时加hepes，用小容量的分装瓶分装，及尽量减少培养液与空气的接触时间。配培养基时，将酸碱度调至6.9-7.0，过滤后酸碱度会适当增高。
2.3 传代的注意事项
2.3.1 EDTA-胰酶最佳消化时间：具笔者在试验中的观察，在BMSCs传代过程中，根据培养瓶、培养皿或培养板中贴壁细胞的覆盖率确定，当BMSCs贴壁达到80%-90%就可以传代了，用玻璃尖吸管滴入EDTA-胰酶4-7滴，在倒置相差显微镜下观察，当细胞70%由原来的纺锤状、梭形变化为椭圆形时为最佳时间，一般为1至2分钟。
2.3.2 加入EDTA-胰酶后的吹打时间与次数 ：加入EDTA-胰酶后，静置1分钟，在镜下观察细胞变椭圆或圆形，并有轻度漂浮时，用尖吸管轻轻吹打3-6次即可。
2.3.3 骨髓间充质干细胞特异性标志物： 虽然目前尚未发现骨髓间充质干细胞特异性标志物，Pittenger等认为CD29、CD44、CD105、CD166、SH2、SH3为间充质干细胞的重要标志物［3］。
综上所述，对 BMSCs 的形态学观察和表型分子鉴定实验均证实培养传代的 BMSCs 的生物学特性并未发生明显改变，说明本实验的分离培养扩增方法安全有效。本实验成功的建立了一系列分离、体外培养和扩增兔 BMSCs 的实验方法，为进一步组织工程研究奠定了实验基础。
参考文献
［1］ 兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性观察Progress in Modern Biomedicine Vol.10 NO.17 SEP.2010 3239-3243
［2］骨髓间充质干细胞的分离、培养及生物学特性 陈建梅姚荣伟 李勇 张馥敏 江苏医药2010年10月第36卷第19期2306-2308
篇4
【关键词】 口腔肿瘤;树突状细胞;表型；增殖
Biological characteristics of monocytederived dendritic cells from peripheral blood of patients with oral carcinoma
【Abstract】 AIM: To investigate the morphology， phenotype and functions of dendritic cell (DC) from peripheral blood of the healthy inpiduals and the patients with oral carcinoma. METHODS: Fifteen patients with oral carcinoma at stages of II or above were assigned to study group and 15 healthy volunteers to control group. Monocytes were isolated by density centrifugation， and cultured in the presence of GMCSF， IL4 and TNFα for 7 d in vitro. The morphological change of the cultured cells was observed by light microscopy and electron microscopy. The expressions of CD83， CD1a， CD86， CD80， HLADR were analyzed by flow cytometry. The ability of DC to stimulate the proliferation of lymphocyte in mixed lymphocyte reactions (MLR) was determined with the method of MTT. RESULTS: Morphologically and phenotypically typical DC was obtained in the 2 groups after culture for 7 d. The expression rates of CD83， CD1a on DC from the patients were 49.3±9.5 and 48.1±7.3 respectively，significantly lower than those from healthy volunteers (P0.05). Moreover， the mean fluorescence intensity of CD83， CD1a， CD80， CD86 and HLADR expressed in study group were 4.80±2.13， 3.96±1.15， 19.63±8.12， 12.33±6.75 and 39.44±7.9， respectively， which were lower but not statistically different from the control group (P>0.05). In addition， DC from the study group had the ability to stimulate the proliferation of allogeneic and autogenous lymphocytes in vitro. CONCLUSION: Monocytes in peripheral blood of the patients with oral carcinoma can be induced to differentiate into mature DC with the ability to stimulate the proliferation of lymphocytes， and so these DC might be used in immunotherapy for oral carcinoma.
【Keywords】 mouth neoplasms; dendritic cell; phenotyping; proliferation
【摘要】 目的: 研究口腔癌患者外周血树突状细胞(DC)的形态、表型和功能性变化及其临床意义. 方法： 口腔癌患者（实验组）及正常人（对照组）15例外周血单个核细胞经GMCSF，IL4及TNFα诱导培养， 获取成熟DC， 光镜和电镜观察细胞的形态，流式细胞仪检测细胞表型如CD1a，CD83，CD80，CD86和HLADR等分子的表达变化，用噻唑蓝（MTT）法检测DC与自体和同种异体的混合淋巴细胞反应（MLR）中对淋巴细胞增殖的刺激能力. 结果： 正常人及口腔癌患者的外周血单个核细胞经体外7 d诱导培养，均诱导出具有典型形态和表型的DC，其中实验组细胞的CD83，CD1a表达率分别为49.3±9.5和48.1±7.3，与对照组两者表达率62.1±7.9和60.2±6.8相比，差异有统计学意义(P0.05);实验组DC细胞CD83，CD1a，CD86，CD80和HLADR表达的平均荧光指数(MFI)分别为4.80±2.13，3.96±1.15，12.33±6.75，19.63±8.12和39.44±7.9， 均低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05);口腔癌患者来源的DC在体外具有诱导同种异体和自体外周血T细胞增殖的能力. 结论： 口腔癌患者外周血单核细胞来源可诱导成为具有功能性的成熟DC，该细胞可应用于口腔癌的免疫治疗.
【关键词】 口腔肿瘤;树突状细胞;表型；增殖
0引言
目前，对口腔癌的治疗手段仍以手术为主，由于颌面部能提供的切除面积有限，有时很难实现距肿瘤边缘1.5 cm清除病灶，而且手术本身造成的面部畸形严重破坏了患者的口腔功能和心理健康. 因此，如何缩小手术范围、有效控制临近亚病灶及微小病灶的发展是亟待解决的问题. 树突状细胞（dendritic cells， DC）是已知功能最强的抗原提呈细胞，并被认为是抗肿瘤免疫治疗的一种非常有前途的方法［1-3］，由于DC对T细胞的活化受MHC限制，故临床应用的DC细胞及其疫苗必须使用肿瘤患者自身来源的DC，那么从肿瘤患者的外周血单个核细胞中能否经过体外诱导产生出功能性DC，口腔癌患者与健康人DC细胞的表型及其抗原提呈分子的表达以及刺激淋巴细胞增殖能力有何不同，因此本研究旨在为临床以DC为基础的免疫治疗提供实验依据.
1材料和方法
1.1材料RPMI培养基(Hyclone USA)， 淋巴细胞分离液(上海恒生公司 )， 重组人单核巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF)，重组人白细胞介素4 (rhIL4)， 肿瘤坏死因子α(TNFα)均使用美国Peprotech Asia公司产品. 取200505/200510来我院口腔科住院治疗的口腔癌患者15例作为实验组，本组病例均经术后病理证实；对照组为健康志愿者15例. 两组人员均排除感染、糖尿病、血液病和自身免疫性疾病.
1.2方法无菌采集外周血50 mL，肝素钠抗凝. 加入等量无钙镁DHanks缓冲液（pH 7.4），充分混匀. 取50 mL离心管加入Ficoll淋巴细胞分离液20 mL后，再沿壁小心加入上述稀释的外周血20 mL，2000 r/min， 20 min离心，分离外周血单个核细胞. 小心吸取中间层细胞，用DHanks洗涤细胞3次，弃上清，用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1×1010个/L，接种于6孔培养板，每孔3 mL. 于50 mL/L CO2，37℃条件下孵育2～3 h后，吸出培养上清和非贴壁细胞（用于其他实验），用预热37℃的培养基清洗板1次，以去除非贴壁细胞，获得贴壁的单核细胞，加入含1 MU/L rhGMCSF和0.5 MU/L rhIL4的RPMI 1640完全培养基于37℃ 50 mL/L CO2进行培养，孵育至第5日时，每孔加入TNFα 0.2 MU/L， 7 d后得到成熟的DC［4］. 诱导培养1，3，5，7 d时用倒置显微镜观察细胞的形态变化及DC形成，在培养的7 d收集DC，调细胞密度为1×107/L，分为两份，一份用10 g/L戊二醛固定30 min，梯度乙醇脱水，叔丁醇干燥，喷金，扫描电镜观察细胞形态. 另一份用25 g/L戊二醛固定， 锇酸后固定， 醋酸钠、 柠檬酸铅双重染色， 透射电镜观察细胞超微结构.
1.2.1FACS测定细胞表型收集体外培养5，7和10 d的外周血单个核细胞，台盼蓝染色，确定细胞活力在95%以上，分别加入直标荧光的，如PE标记的CD1a，CD86，HLADR，IgG1（对照），FITC标记的CD83，CD80，IgG2（对照），充分均匀染色(4℃， 避光， 30 min)后FACS行细胞表型检测.
1.2.2混合淋巴细胞反应非贴壁细胞调整密度为2×109/L，加入96孔培养板中，分别按10∶1， 20∶1和40∶1的比例加入上述培养的两组DC（保持T细胞数为105），该DC先用25 mg/L丝裂霉素于37℃孵育45 min，然后调整细胞密度为2×108/L，加入培养板各孔内，总体积200 μL/孔，各实验组分设3复孔，混匀，同时设对照组. 37℃，50 mL/L CO2培养72 h. 于实验培养终止前4 h，加入MTT液（5 g/L） 20 μL/孔，混匀，继续培养4 h，离心培养板（1000 r/min， 5 min），弃上清，每孔加入DMSO（二甲基亚砜） 150 μL，充分混匀，静置数分钟，检测每孔490 nm的A值，计算细胞培养指数［5］. 增殖指数（SI）=试验孔A均值/对照孔A均值.
统计学处理： 采用SPSS11.0软件包进行统计分析; 两组样本均数的比较用t检验，多样本均数比较用方差分析， P
2结果
2.1培养DC的形态学特点人外周血贴壁细胞经体外诱导培养24 h后，细胞聚集成大小不等的细胞聚体， 3 d可见细胞聚集成团， 少量悬浮生长，部分细胞体积增大. 5 d悬浮细胞数量增多， 细胞表面有细小突起形成. 7 d悬浮细胞或细胞团颜色变深，有明显树突状突起，扫描电镜观察，表面粗糙， 胞体向周围伸出大量树枝状或裙褶状不规则突起. 透射电镜观察， 细胞表面伸出长短不一的突起， 线粒体致密化，粗面内质网扩张成池状，溶酶体较少（图1），呈明显的DC细胞特征.
图1人外周血单个核细胞经体外诱导培养7 d DC形态TEM ×10 000 略
2.2体外诱导DC细胞的表型变化人外周血单个核细胞经体外诱导培养7 d后，实验组（口腔癌患者）DC细胞的CD83和CD1a的表达率较对照组低，差异有统计学意义(P0.05);实验组DC细胞的CD83，CD1a，CD86，CD80和HLADR表达的平均荧光指数(MFI)虽然均低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05，表1）.
表1口腔癌患者外周血DC表面分子的表达比较（略）
2.3DC对淋巴细胞增殖反应的影响在自体和同种异体淋巴细胞反应体系中，随着DC比例增加，实验组和对照组淋巴细胞增殖能力均明显增强，实验组自体AMLR增殖均值由1.8升至3.2，健康人自体AMLR增殖均值由2.2升至4.1，差异有统计学意义（P
图2DC对T细胞增殖的影响 略
3讨论
近年来，对实体瘤的免疫生物治疗称为肿瘤防治的研究热点，免疫防御机制用于头颈部癌的治疗已显示较好疗效［6］，而DC作为体内功能最强的专职性抗原递呈细胞（APC），能刺激未致敏T细胞的增殖和活化、启动机体的特异性免疫应答，在肿瘤免疫治疗中发挥着重要作用. 人体内DC大多处于不成熟状态，激活淋巴细胞反应的能力较低，但具有极强的抗原内吞能力. 在摄取抗原或接受某些刺激因素后DC可以分化成熟，由于体内DC数量少而且分布广泛，难以分离纯化，怎样通过简单有效的方法制备出大量的功能性DC来满足临床需要，是亟待解决的问题.
目前，体外培养的DC主要来源于外周血、骨髓和脐血. 我们应用口腔癌患者和健康人外周血单个核细胞诱导DC的产生. 因为外周血采集方法简单易行，容易获取，而且与骨髓相比不易污染肿瘤细胞. 研究表明，在决定DC是否可以发育成熟的调控因素中，GMCSF，IL4和TNFα是极其重要的诱导因子，其中GMCSF可促进髓系细胞发育，是维持DC发育和分化的最根本的细胞因子；IL4可促进干细胞及单核细胞分化发育成DC，并维持DC于未成熟状态，使其具有很强的处理外源性抗原的能力［7］. 在DC培养过程中加入TNFα可以促进DC成熟，使其具有强的刺激T细胞的活性，并抑制DC凋亡［8-9］.
我们对口腔癌患者及健康人外周血单个核细胞经GMCSF，IL4和TNFα 3种细胞因子体外诱导分化，获得具有典型DC细胞形态特征的DC. 经诱导培养至第7日时两组DC均高表达CD86，CD80，HLADR，差异无显著性，与文献［10］报道一致. 而两组DC之间CD83和CD1a的表达率有明显差异. CD83是目前公认的成熟DC标志分子，我们考虑该差异源于两组PBMC的贴壁率和DC转换率不同. Onishi等［11］认为晚期肿瘤患者的单个核细胞来源的DC中存在一种叫短寿命的亚群，培养超过7 d，较短命的亚群死亡，幸存的DC无论是表面分子表达、MLR和抗原提呈能力均与健康人相似. 本实验结果显示，患者单个核细胞来源的DC在体外同样具有激发自体和同种异体外周血T细胞增殖的作用，并且随着DC数量的增加对淋巴细胞增殖能力刺激作用增强. 我们认为，口腔癌患者来源的MoDC在初始状态可能与健康人有一定的免疫学差异，但是通过合理的因子组合培养后，同样能发挥针对自身疾病的免疫治疗作用，从而避免使用他人血源的排斥反应，怎样针对患者自身来源的DC特性选择更合适的培养手段，发挥它的特异性免疫治疗效果，尚需进一步研究.
参考文献
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篇5
【关键词】 种子细胞
【Abstract】 AIM: To purify and culture human bone marrowderived endothelial progenitor cells (EPCs) in vitro and to observe their biological characteristics. METHODS: Mononuclear cells were isolated from bone marrow suspension by density gradient centrifugation and EPCs were harvested in the endothelial growth medium (EGM2). EPCs were observed under microscope， the cell growth was calculated by cell counting and the cells were identified by electronic microscope examination and immunofluorescence staining for the expression of Ⅷ/vWF， vascular endothelial growth factor receptor2 （VEGFR2）. RESULTS: The culturedishadherent EPCs uniformly had a round or spindle shape and reformed clones with cobblestone morphology. The cells could be identified by the positive staining for VEGFR2 and Ⅷ/vWF. WeibelPaladle bodies could be seen under transmission electron microscope. CONCLUSION: EPCs are one group of stem cells in the bone marrow with the capacity of differentiating into endothelial cells. They can be purified and cultured by density gradient centrifugation and subjected to culture in vitro with endothelial growth medium (EGM2 MV). These findings suggest that EPCs may be a new seed cell of tissue engineering.
【Keywords】 bone marrow; endothelium/cytology; stem cells; tissue engineering; seed cells
【摘要】 目的： 体外分离纯化人骨髓内皮前体干细胞，研究其基本生物学特性. 方法： 利用密度梯度离心法分离成人骨髓得到单个核细胞，再用内皮细胞条件培养基培养得到内皮前体干细胞，观察细胞生长特性，通过检测细胞血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、Ⅷ因子相关抗原抗体表达和透射电镜对培养细胞进行鉴定. 结果： 原代培养后细胞贴壁生长，7~10 d形成集落或融合呈卵石形，免疫组化荧光染色后结果显示VEGFR2， Ⅷ/vWF 阳性，透射电镜显示细胞内具有特征性的WP小体. 结论： 用密度梯度离心法和条件培养可以从骨髓得到高纯度内皮前体干细胞，该细胞具有与血管内皮细胞共同的特征，可以进一步分化为血管内皮细胞，是理想的组织工程种子细胞.
【关键词】 骨髓；内皮/细胞学；干细胞；组织工程；种子细胞
0引言
随着干细胞研究的深入，研究者发现，内皮前体细胞（endothelial progenitor cells， EPCs）是具有活跃分化潜能的干细胞，具有游走特征并能进一步增殖分化为内皮细胞.它不仅参与胚胎期的血管发育，也存在于成年机体的骨髓和外周血中，在成体血管内皮细胞发育中起重要作用，可以作为种子细胞用于人工血管、组织工程瓣膜内皮化的研究与应用［1］. EPCs的研究愈来愈受到关注，但分离相对困难，关于其培养及生物学特性研究少见报道. 为进一步探讨EPCs作为组织工程种子细胞的可能性与优越性，我们进行人骨髓内皮前体细胞的分离培养和生物学特性的研究.
1材料和方法
1.1材料
骨髓取自健康志愿者. 内皮细胞生长培养基（EGM2， Clonetics， USA），内皮细胞生长培养基补充物（EGM2 MV SingleQuots， Clonetics， USA），其中包含有胎牛血清（FBS）、血管内皮生长因子(VEGF）、成纤维细胞生长因子2(FGF2）、胰岛素样生长因子1(IGF1）以及抗生素等，黏连蛋白（FibronectinFn，Sigma），淋巴细胞分离液与PBS液（TBD公司），胰蛋白酶（Gibco），Hanks平衡盐液（Gibco），VEGFR2兔抗（NeoMarkers，USA），第Ⅷ因子鼠抗(北京中山公司），二抗（FITC羊抗鼠与Cy3羊抗兔，Sigma），FITCconjugated CD34鼠抗（R & D公司）.
1.2方法
1.2.1骨髓中单个核细胞的分离［2］无菌条件下，取人骨髓液5 mL，加入肝素，用PBS液充分混匀，转入离心管，轻轻地层加到1077 g/L的淋巴细胞分离液上，2000 r/min离心20 min，收集中间的单个核细胞层，用PBS液1000 r/min离心洗涤2次×10 min以洗除残余淋巴细胞分离液，然后收集细胞备用.
1.2.2EPCs的培养收集骨髓中单个核细胞，用含胎牛血清和多种生长因子的内皮细胞生长培养基混匀，制成细胞悬液，接种于以黏连蛋白（Fn）包被的培养瓶中，置37℃含50 mL/L CO2孵箱中培养，第4日换液，去除非贴壁细胞，此后每3~4 d换液1次. 相差显微镜下观察细胞形态，待细胞长满瓶底的80%，用0.125 g/L胰酶消化，并以2×107/ L细胞数传入24孔培养板中，每日取4孔细胞进行计数并求均数，绘制细胞生长曲线，计算细胞群体倍增时间.
1.2.3流式细胞仪检测取对数生长期骨髓EPCs， 以0.125 g/L胰酶消化后制备单细胞悬液，测定细胞生长周期；同时，检测细胞表面抗原CD34表达，鉴定所得细胞纯度.
1.2.4EPCs细胞表面抗原免疫荧光染色检测培养10 d的细胞进行免疫荧光化学染色，检测细胞表面抗原VEGFR2与Ⅷ/vWF等表达情况，选取培养10 d的成纤维细胞进行免疫荧光化学染色作为对照组. 过程如下： 细胞片用PBS液洗，然后用40 g/L多聚甲醛常温处理30 min，再用含50 mg/L马血清和50 mg/L小牛血清的PBS液浸泡30 min，去除非特异性标记，再加入VEGFR2， Ⅷ因子mAb （1∶100），37℃孵育过夜，用PBS液洗3次，加入荧光标记二抗，37℃摇床孵育1 h，荧光显微镜下拍照.
1.2.5电镜检查体外培养10 d，离心收集EPCs，用3 g/L戊二醛固定过夜，细胞团用PBS 洗3 次×10 min，1 g/L四氧化锇4℃固定30 min， PBS洗3次×10 min，丙酮系列脱水，包埋并制作超薄切片，透射电镜观察拍照.
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2结果
2.1骨髓EPCs体外培养及扩增用梯度密度离心法从骨髓中分离出单个核细胞层后，用内皮细胞生长条件培养基培养，并通过换液去除非贴壁细胞，所得贴壁细胞即为骨髓内皮前体细胞. 原代培养4 d内，细胞呈圆形（Fig 1A）；培养7 d后，细胞铺展呈椭圆形或短梭形，并迅速增殖，10 d后出现细胞融合呈“铺路卵石样”（Fig 1B），约14 d可传代. 传代后细胞于24 h内完全贴壁，接种后第1~3日为潜伏适应期，从第4日起细胞增殖迅速并进入对数生长期，第7日达高峰，此后进入平台期，细胞生长曲线如Fig 2所示. 同时，依据生长曲线计算细胞群体倍增时间约为36 h.
2.2流式细胞仪检测贴壁细胞消化后用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34表达，结果显示细胞均一性较好（阳性表达率72%），说明采用本实验中分离细胞的方法可得到较高纯度的骨髓EPCs. 同时，流式细胞仪测定细胞生长周期，结果显示： G0/G1期细胞为71.1%，G2/M期细胞为14.7%，S期细胞为14.2%，说明EPCs细胞增殖比较活跃.
2.3骨髓EPCs表面标记的检测EPCs细胞均表达Ⅷ/vWF，免疫荧光染色呈阳性，细胞胞质呈绿色，胞核不染色（Fig 3A）；EPCs细胞均表达VEGFR2，免疫荧光染色呈阳性，细胞胞质呈砖红色，胞核不染色（Fig 3B）. 对照组成纤维不表达Ⅷ/vWF与VEGFR2，免疫荧光染色呈阴性，细胞胞质和胞核均不染色.
2.4骨髓EPCs超微结构观察细胞边缘可见较多绒毛状突起，胞质内还见一种短棒状小体，即Weibel Palade氏小体，是内皮细胞特征性的细胞器（Fig 4）.
3讨论
近年来研究发现，EPCs具有游走特征并能进一步增殖分化为内皮细胞，它不仅参与胚胎期的血管发育，也存在于成年机体的骨髓和外周血中，在成体血管内皮细胞发育中起重要作用. 1997年Asahara等［3］成功地在体外将CD34+细胞诱导生成血管内皮细胞，并于体内证明其生血管能力，说明EPCs是CD34+细胞重要亚群. 因此，EPCs有望成为血管组织工程内皮种子细胞的新来源.
EPCs是CD34+细胞重要亚群，多采用吸附单克隆抗体－磁珠分离系统(MACS)进行分离得到，此法所得细胞均一性好，纯度高，但价格昂贵，实用价值欠佳，同时，EPCs吞噬的磁性微粒也必然影响细胞的代谢及功能［4］. 本实验中，根据细胞密度的差异，针对EPCs属于单核类细胞的特点，抽取骨髓后，用密度梯度离心法分离出单个核细胞层，再利用内皮细胞生长条件培养基外加黏连蛋白黏附特性，最终所得贴壁细胞即为EPCs. 同时，我们对所得到的骨髓EPCs用流式细胞仪检测表面抗原表达，结果显示细胞均一性较好，CD34阳性表达率72%，也进一步鉴定了所得到的细胞为较高纯度的骨髓内皮前体细胞. 此方法简单、经济、高效，具用较高的应用价值.
VEGFR2是内皮细胞生长的早期表面受体，主要出现在内皮细胞诱导转化的早期［5］. Ⅷ因子是内皮细胞特异性抗原，可以通过vWF的测定对内皮细胞进行鉴定［6］. 本实验中人骨髓EPCs呈贴壁生长，随体外培养时间延长，其形态由早期圆形铺展呈椭圆形或短梭形，并迅速增殖，出现细胞融合呈“铺路卵石样”. 培养一定时间后，细胞增殖速度由快变慢，胞体变大、胞质疏松，提示EPCs增殖活力下降. 原代培养生长曲线显示，EPCs的体外培养经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，其增生分裂能力活跃，体外培养可以实现快速扩增. 此外，分离得到的骨髓EPCs具有与血管内皮细胞共同的特征，细胞呈鹅卵石状贴壁生长，均表达VEGFR2， Ⅷ/vWF，胞质内还可见内皮细胞特异性标记短棒状小体，即Weibel Palade氏小体.
EPCs存在于成年机体的骨髓和外周血中，可以自体取材，避免新的机体创伤和免疫排斥反应. 同时，EPCs增生分裂能力活跃，体外培养可以实现快速扩增，能进一步分化为内皮细胞，参与成体血管内皮细胞发育、创伤愈合、肿瘤生长等病理生理过程［7］. 因此，EPCs可以作为理想的内皮种子细胞来源，用于人工血管、组织工程瓣膜内皮化研究，具有潜在的临床应用价值.
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篇6
[关键词]医学细胞生物学 教学改革
[中图分类号]G622 [文献标识码]A [文章编号]1009-5349（2015）12-0233-01
临床医学专业是一门实践性很强的应用科学专业。它致力于培养具备基础医学、临床医学的基本理论和医疗预防的基本技能，能在医疗卫生单位、医学科研等部门从事医疗及预防、医学科研等方面工作的医学高级专门人才。该专业学生主要学习医学方面的基础理论和基本知识，人类疾病的诊断、治疗、预防方面的基本训练。要具有对人类疾病的病因、发病机制做出分类鉴别的能力。随着细胞结构及功能的相关知识和理论在医学领域中的应用的不断深入，“细胞生物学”已成为现代医学的重要基础，在医学教育中占有重要的地位。对于现代医科学生来说，具备“细胞生物学”的相关基础知识和基本技能，是进一步学习其他医学课程必不可少的条件。
一、医学细胞生物学课程内容体系和结构
我校医学本科专业自1978年开设以来，在教育部组织的1997年、2006年本科教学工作水平评估中分别达到“优”和“良”的水平。为内蒙古、吉林、辽宁等全国各地区培养了一万多名合格的高级医学专业人才，临床专业毕业生遍布全国各省及美国、日本等国家。所招学生范围逐年扩大，并分为汉班和蒙班，其中蒙班学生为蒙古族，他们主要为蒙古族中小学考上来的，蒙语授课兼修汉语。
医学细胞生物学以细胞生物学和分子生物学为基础，是探索研究人体细胞发生、发育、增殖、衰老、死亡以及细胞结构与功能的异常与人类疾病关系的学科。课程基本内容有13章，包括细胞生物学绪论、细胞膜的化学组成与特性、细胞表面与细胞外基质、细胞膜的功能、细胞的内膜系统、线粒体、核糖体、细胞骨架、细胞核与遗传物质储存、细胞中遗传信息的传递及调控、细胞增殖与细胞周期、细胞分化、细胞衰老与死亡。第1章，引领学生进入医学细胞生物学课程，指导学生如何学习这门课；第2―9章为基础理论知识，学习医学细胞生物学特有的细胞结构与功能及其与疾病关系；第10―13章，主要以细胞为整体，看细胞的“一生”变化。通过这三部分的学习，能够使学生掌握人体细胞的知识，同时把细胞结构与功能的异常与人类疾病关系渗透到各个章节。
二、医学细胞生物学与其他课程的联系
医学细胞生物学在临床专业培养计划中，大一开课，这充分体现了该课程的基础性。其后的课程有生物化学、组织学与胚胎学、生理学、病理学、免疫学等。组织学与胚胎学是相互关联的两门学科，习惯列为一门专业基础课程。组织学是研究机体微细结构及其相关功能的科学。胚胎学主要是研究从受精卵发育为新生个体的过程及其机理的科学，其研究内容包括生殖细胞发生、受精、胚胎发育、胚胎与母体的关系、先天性畸形等。在其内容中涉及细胞的知识较多，比如什么是生殖细胞、细胞分化的原理、细胞分裂产生新的细胞等等。如果没有学习相应的细胞生物学课程，很难理解这些基本概念与原理。生理学是研究机体正常生命活动规律的一门课程，学生能够学习人体各器官的基本功能，认识机能与结构的联系，理解机体的整体统一性及与环境的对立统一关系。其内容包括细胞、组织、器官和系统的基本功能及功能调节。该课与细胞生物学关联紧密，很多人体生理活动，都是以细胞为基础。比如细胞的Na-K离子泵工作原理阐释了物质在细胞两侧的运输，从而调节人体内环境渗透压平衡。
生物化学是运用化学的理论与方法，从分子水平研究生命现象的科学，能够使学生获得生物化学的基本理论、基本知识和基本技能。其内容包括蛋白质与核酸化学、维生素、酶、生物氧化、物质代谢及其调节、肝脏生化和酸碱平衡等。这里提到的核酸是细胞内的遗传信息载体，生物氧化、物质代谢多发生在细胞内，可见，离开了细胞，生物化学这门课程将无法开展。病理学是一门研究疾病的病因、发病机制、病理改变（包括代谢、机能和形态结构的改变）和转归的医学基础学科。其目的是认识和掌握疾病的本质的发生发展的规律，从而为防治疾病提供必要的理论基础和实践依据。人类很多疾病的本质是特定细胞的损伤，比如高胆固醇血症，主要发病原因是细胞膜上的受体缺失或无法识别供体。因此，在介绍这类疾病时，就需要掌握细胞的结构、细胞膜的功能等细胞生物学内容。医学免疫学研究机体免疫系统的组织结构和生理功能的科学，其基本定义概念如抗原、抗体，这些都是细胞内外存在的物质。
因此，随着我校临床专业培养计划的改革发展，医学细胞生物学必定成为必不可少的专业基础课程，需要加以重视。
【参考文献】
[1]吕毅，吴小健，向俊西等.抓好临床医学专业学位人才培养新模式试点工作的探讨[J].西北医学教育，2014（05）：866-868.
[2]白一，龚云辉，刘希婧等.临床医学专业八年制医学教育的现状[J].中华妇幼临床医学杂志（电子版），2014（01）：113-115.
篇7
【关键词】中医；生物学；生物技术；研究
【中图分类号】Q81 【文献标识码】A 【文章编号】1008-6455（2010）11-0248-02
Study of TCM bioengineeing
Ouyang Xuejian
【Abstract】From angle of TCM bioengineering probe into TCM basic theory and way of study, to basis of TCM and clinical research mean much.
【Key words】traditional chinese medicine (TCM); biology; biotechnology; study
随着TCM的不断创新，用现代中医生物学的研究手段，完善TCM的基础理论是必经之路。
1生命之书
1960年首次被破译遗传密码，分子生物学家对复杂的细胞分子进行了分类。人类基因从远古到现代以密码的形式表达出来，展现在科学家面前。常有一种误解基因代表每个特性，这种误解并没有因基因测序而被消除，并被加强了这是因为单基因病被讨论[1]，事实上许多遗传性疾病是由多个基因以某种未知方式相互作用的结果。人类基因组的解译，象征着思想变革的始点走向未来。
2生物学革命
细胞生物学革命并不是基因组的解译，而是基因行为方式和序列间相互作用的发现，但必须通过实验才能得到体现, 即阅读细胞故事要归功于生物学-DNA芯片[2]。它能同时观测许多基因行为的是基因组测序。即一个细胞随时有数千个基因开启，它不仅开启一个或两个基因来完成任务，并在任务完成后再将它们关闭，但其理论的构建并不是轻易获得的。分子和细胞生物学[8]，简洁一流的理论很少见，蛋白质A开启了蛋白质B，然后激活蛋白质C，如果大家能理解将对研究很有帮助。生物学家并引入了物理学概念，寻找简洁一流理论，但是并不表明研究的系统是简洁的。物理学家设计的理论用于解释大量分子行为，如氧的弥散在介质的作用下，个体特性会淹没在团体行为的模式下。基因和蛋白质更具挑战性，因为它们不移动，不随机相互作用，但能选择性的参与某一功能性活动。化学提供了另一组工具，一些非生命系统中的化学过程与生物化学过程一样复杂混乱，但并不妨碍被计算机模型所获取，其结论是使复杂的模型简单化，原因是一些成分可以被忽略。
3计算机模拟艺术
它不仅分析数据也是一种重要工具。物理学家把其艺术带入到了精密状态，天体物理学家能模拟整个星系世界，生物学家就能模拟细胞的微观世界。计算机模拟复杂的真实细胞，预测基因活性与细胞功能变化的基因组，并建立了数据库。研究细胞中多种过程的比较模型，许多蛋白质能同时催化大范围化学反应，不同反应的相对重要性会因基因被激活而产生某种蛋白而再次关闭，来模拟整个细胞行为。工程学认为一个细胞事件不会简单的导致某一事件发生，有时一个过程会影响某个过程发生，用工程学术语描述就是反馈。即角加速时人体向一侧倾倒，此时膜半规管内淋巴液向相反方向流动刺壶腹嵴产生神经冲动，传至平衡中枢维持人体平衡，这就是人置与平衡中枢间的反馈，这种自我调节在工程学中十分常见。即可用“控制论”和“系统论”来描述它，生物学家已应用在细胞中。描述生物学功能包含扩大、改编、加强、绝缘、纠错和一致性检测等概念。描述新的生物学语言将来源于综合科学，即计算机科学或生物工程学等学科[3、4]。
4网络生物学
世界范围互联网中的信息总是最新的，那里有通信、高速公路、铁路、航运等，为网路提供能量、电流、水、物质、友谊等，细胞网络它们是如此相似。细胞中每一类分子都视为网络的组成部分，任何两个分子之间均有联系，共同参与生物化学反应，结论就是细胞网络与许多社会网络一样，有着相同的连通结构。这样的共性对于定义基因间的相互作用很有帮助，但并不是所有网络都相同[5、6]，有时几个连接破坏而迅速瓦解，有时即便有许多连接被破坏，任何两个节点间仍可保持通畅，细胞网络也是如此。理解了生物学网络的特点，为组建细胞自身系统对其研究奠定了基础。
5生物学模块
基因通常结队工作当细胞分解糖产生能量，激活一组基因来产生各自所需要的酶[7]。理论生物学家提示如果能够找出这类“联合作业”，并将其视为独立分子来理解细胞的复杂活动。即一部分制造蛋白质，一部分复制细胞分裂的DNA，其他部分对特殊的酶做出响应等等。但这些分子不是基因简单的组合,它们包括了蛋白质，RNA小信号分子和富含能量的分子，即酶等共同执行其功能, 蛋白质组学显示了它的特殊贡献。即细胞分裂模块包裹在膜内，如线粒体是能量的“工厂”。就像组建大楼一样，模块之间通过一类或几类介质分子相互联系，各部门备有“办公室备忘录”这就解决了每个突发件事的需要。可想象设计一种更精密的特定模块，其小部分分子间相互作用的模块延伸到整个细胞。模块的功能来自其他模块一部分输入，并产生输出影响其他模块。其集体行为的概念类似于生物物理学概念，能表现模块的特性。即模块大部分功能特征，来自于潜在成分的特征与它们之间相互作用集合的特征。这对于生物学家来说是陌生的，但将来会习惯这样的描述。
6TCM生物学
TCM生物学家用生物学微观实验手段，即分子与细胞生物学、网络工程、生物学工程、生物物理学等[8-11]，模拟与解释TCM的基本理论。需要生物工程、网络工程与程序工程等共同参与形成综合性科学。TCM把“天体”对生物体的影响都考虑进去了，在疾病诊治基本原则的基础上还考虑了季节变化。即冬天益气活血，温肾助阳；春天滋阴润肺，滋肾柔肝；夏天养心安神，清热解毒；秋天健脾温肾，滋阴补血。TCM早已认识到天体变化对人体的影响，并应用在临床实践中。至于经络到底是什么还没有谁在人体内剖析出来，但临床工作中银针证实了它的存在，并以唯物主义的客观事实传承下来，如何完善它是今后研究的方向。
7TCM诊疗技术
TCM的基础理论与临床诊疗技术是根本，特别是中草药、民间医学很多精髓尚未开发。如西医治疗感冒居高不下的体温(40℃)什么手段都用上了，TCM一付汤药就能控制体温即治愈。肿瘤压迫所致的面神经麻痹，TCM不用开刀减压针灸就能矫正，这说出来好象不可思议但TCM做到了，TCM就是这么神气有待进一步挖掘。TCM不仅应懂得自身的基础理论，并从生物学角度解释出来，让世人相信TCM接受TCM，让TCM走向世界。
参考文献
篇8
【关键词】粮食深加工 生物 教学 课程建设
【中图分类号】G642 【文献标识码】A 【文章编号】1674-4810（2013）22-0005-02
粮食深加工专业，是以发酵工程和酶工程等生物技术为专业知识基础，以淀粉水解制品及其衍生物、氨基酸等淀粉发酵制品、变性淀粉等加工技术方面的知识和能力培养为主的学科。生物基础课程教学始终着眼于专业发展的前沿性和应用性，把培养高素质应用型人才作为教学目标。
一 创新教学理念，明确教学目标
教学理念是人们对教学和学习活动内在规律的认识的集中体现，同时也是人们对教学活动持有的基本态度和观念，是人们从事教学活动的信念。教学理念对教学活动有着极其重要的指导意义。
我校坚持把提高人才培养质量作为教学工作的核心内容，目标是根据吉林省粮食经济的特色与发展对人才的客观需求，培养具备所从事专业的基本理论知识，能在生物技术与工程领域从事设计、生产管理和新技术研究、新产品开发的技术应用型专门人才。在重视学生的智力品质的同时还强调学生良好的非智力品质的培养，重视学生的创新精神以及在实践中解决问题的能力。在教学中注重内容的基础性与先进性的有机结合，把该领域的最新成果和亟待解决的现实问题融化到教学内容中，充分体现学科教学内容的先进性，紧跟学科发展的步伐，增强学生对课程的学习兴趣。
二 调整课程结构，优化教学内容
第一，粮食深加工专业有生物化学、细胞生物学、微生物学等多门重要的专业基础课，内容互有交叉、重复。如何处理好它们之间的逻辑关系，搞好教学衔接是教学实践中的一个难题。为了更好地体现相关课程核心内容，我院进行大胆取舍，使课程内容更加精简、重点更加突出。如蛋白质合成，细胞生物学、生物化学、分子生物学都有涉及；再如对有关淀粉知识，生化教材和淀粉工艺教材等都做了审慎合理的处理。根据学生和学校的实际，坚持基础实、起点高、内容新、知识活的原则，注意处理好基础、前沿和能力三方面的关系。
第二，围绕课程的教学理念，将基础理论知识与学科前沿发展相结合。在理论课中适当地引入一些科技前沿知识，重视相关的科学发展史的介绍，包括学科的研究历史、科学家的成长经历，相关的最新科研成果，如生化课程中在讲授糖化学时，补充介绍相关的诺贝尔奖内容、科学家生平及所做的贡献，从中学习前辈的科学态度、思维方式，拓展学生视野，提高学生的学习兴趣和积极性， 改善教学效果。
三 尊重教育规律，重视教学法研究
好的教学方法是生物教学的有力保障。在教学过程中可以采取启发式、互动式、研讨式的教学方法，充分调动学生的学习主动性，引导学生积极思考，主动参与教学活动。过去许多教师的教学只是单纯以传授学科知识为主，把教材上的全部内容“兜给”学生，学生们疲于被动地接受一大堆结论，而不知道这些结论是如何获取的，这种教学模式不利于学生科学思维能力的提升，因而在重视传授基础知识的同时更要重视教给学生获得科学结论的思路和方法。
在教学中可以组织课堂讨论，安排学生选择某个专题制作PPT，进行课堂小讲座，促进了学生之间及学生与教师之间的专业交流，培养了学生查阅文献、阅读文献的能力，学生自学能力、演讲交流能力明显提高。教学中积累的这些素材和经验，还促进了整个专业基础课程的教学，使更多的学生从中受益。
四 理论与实验并重，提高学生动手能力
生物学是实验性很强的学科，实验课对学习生物基础十分重要。我们十分注重理论教学与实验教学有机结合。教学中既有传统的验证性实验，用于帮助学生理解、巩固所学的生物知识，更多的是探究性实验，即只给出课题研究的要求，在教师指导下，由学生自己思考实验原理、选择实验仪器、制订实验方案，其目的重在培养学生的科学态度、严谨的作风和团结协作的精神，促进学生创新能力的提升。我们还通过开放实验室，创造条件让学生多动手，培养学生的实践能力。今年，生化实验教师指导的学生在吉林省高校生化技能竞赛中荣获一等奖。
五 搞好教学评价，促进教学质量提高
教学评价作为教学系统的重要组成部分，它的内容和形式对教学活动的开展起着重要的促进作用。通过学校、学院、教研室和授课班级的教学管理体系，开展教学质量监控，对任课教师的教学质量做出相应的评价，建立健全教学质量监控体系。一是教师评学，教师通过考勤、课堂讨论、作业等对学生学习过程进行评价，通过期中、期末考试进行终结性评价；二是学生评学，学生通过网络评教对教学过程提供反馈意见，了解教师教学活动的效果；三是督导评学，通过学院各级督导对教师的课堂教学和学生的课堂学习情况进行检查指导，以此评价教师和学生的表现；四是实践评学，注重将理论知识和实践相结合，通过实验参与和操作过程，对教师和学生能力进行评价。
专业基础课教学是一项系统工程，需要持续不断的探索，努力开拓创新，以培养更多基础扎实、素质高、能力强、能为我国的经济建设和社会发展做出贡献的人才。
参考文献
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篇9
关键词 组织工程骨；力学刺激；动态载荷
中图分类号R31 文献标识码A 文章编号 1674-6708（2013）83-0102-02
1 概述
大段骨缺损的修复重建一直是骨科领域中亟待解决的难题，随着研究的深入，其治疗方法逐步从传统的自体骨和异体骨移植等治疗手段深入到组织工程、人工骨材料、基因工程领域。在体外构建组织工程化活性骨有望成为解决上述难题的一种有效方法[1]。组织工程骨的传统构建方法是在体外将具有成骨分化能力的种子细胞与三维骨支架材料静态复合培养一定时间后，植入体内修复骨缺损。在静态培养环境下，由于重力作用造成三维支架内部细胞数量不足，分布不均匀；而且在人体内，细胞是生长在机体提供的微动力学环境中，因此静态培养无法满足组织工程骨构建的要求[2]。研究表明力学刺激能促进成骨和骨再生，是调节细胞生理功能的重要因素。因而组织工程骨的培养需要提供适宜的压应力刺激，适当的力学刺激能诱导和促进种子细胞增殖、增加生长因子分泌和细胞外基质合成。因此采用三维动态培养取代传统的静态培养方法己经成为组织工程骨体外构建的一种新趋势[3]。
为了更好地进行组织工程骨的培养与骨生物力学的研究，我们对前期已研制出的组织工程骨动态载荷培养装置进行改进，设计建立了一套新型的动态载荷培养装置。新装置不仅能提供良好的三维培养条件，而且能在培养过程中进行精确的力学刺激和检测工作，为下一步在体外进行组织工程骨的动态培养和探讨力学刺激对细胞生物学特性的影响提供一种可靠的培养装置与研究平台。
2 系统设计
2.1 设计原理
新、旧装置的设计原理基本相同：通过电机驱动加载压头对种子细胞—三维骨支架复合材料进行压应力刺激，使之作用于附着在支架上的细胞。整个装置由驱动系统、控制系统和细胞培养系统组成。
2.2 驱动系统
新装置驱动系统主要由上横梁、中横梁、下横梁、滚珠丝杆、减速机构、伺服电机及驱动器组成。伺服电机通过连轴器与滚珠丝杠连接，电机旋转动作通过滚珠丝杠和丝杠螺母转换为直线运动，产生周期性的垂直位移运动。通过计算机软件编程设定所需的频率、位移、波形（方波、正弦波、三角波）和工作时间，伺服电机接收到控制指令后产生响应频率、波形和位移的电信号，并转化为加载压头端的垂直位移，最后作用到三维骨支架上产生应力刺激。实际工作信号通过位移传感器采集反馈，在操作界面实时显示所采集到的频率、波形、位移和工作时间等。驱动系统的输出频率为0Hz~10Hz，加载压头端产生的压缩位移为0mm~5mm，精确度达到0.01mm。与旧仪器相比，新装置的位移可控精度更高，采集数据量大、准确。
2.3 控制系统
控制系统分为测试控制单元和微机控制单元。测试控制单元主要有传感器、数字控制器及功率放大器等组成。由负荷传感器、位移传感器和变形传感器将其相应的力学信号转变为微弱的电信号，经放大、A/D转换、接口器将载荷、位移和变形等量转换为数字量。微机控制单元通过编制的软件，采集数据、绘制曲线，按操作界面设定的频率、位移、波形以及工作时间等指令执行，并将产生的动态压缩载荷传递到三维骨支架表面上，及时记录实时数据、实际工作频率和时间。
2.4 细胞培养系统
旧装置中细胞培养系统是开放式的培养环境，力学加载装置和培养系统是放置在一个超净工作台内，以特制的红外线石英加热灯泡作为热源，通过直接辐射加热达到细胞培养所需的温度环境。但这种方法无法保证温度的恒定、增加了光照对细胞的影响因素，而且无法提供细胞培养所需的湿度和CO2浓度的要求。新装置改进后，缩小了力学加载装置，将其和培养系统一起可直接放入37℃、5% CO2的恒温箱内。旧装置中的细胞培养器是用聚乙烯材料制成的。由于聚乙烯弹性模量较低，当机械载荷作用于三维支架时，聚乙烯培养器会随着三维支架一起产生形变，造成较大试验误差。新装置采用聚四氟乙烯材料，弹性模量高，减少了实验误差，而且耐腐蚀，耐高低温，易清洗，适于细胞培养。放置在细胞培养箱中的细胞培养系统部分均可以通过75%酒精擦拭以及紫外灯照射消毒，避免污染。
2.5 装置配套工具
由于对三维骨支架材料施加的力学刺激属于微小应变，如果骨组织支架形状不规则即使通过预加载也无法确保加载压头与支架完全紧密接触，这将影响到应变加载在骨组织支架上的力分布，同时各组材料也缺乏可比性。因此必须对支架材料进行标准化的切割。我们首先采用直径10mm的取芯电钻，将骨组织材料制成10mm直径大小的圆柱体，然后用线锯将骨组织材料切割成表面平整的样本[4]。通过这套工具制作的支架形态大小一致而且表面光滑平整。
3 讨论
骨组织工程化培养必须有合适的力学环境，采用动态培养取代传统的静态培养方法已经成为一种新趋势。目前代表性的组织工程骨生物反应器主要有旋转壁式生物反应器、搅拌式生物反应器、灌流式生物反应器和应力加载式生物反应器等。如何控制好反应器内产生的仿生力学环境是生物反应器研发过程中的技术难点之一[4]。本研究介绍的加载装置在原有基础上做了进一步的改进，本装置操作简便可靠、控制精度高、压应变均一、满足生物力学和细胞生物学试验要求，不易发生污染，可望用于研究三维培养条件下力学载荷对成骨细胞的生物行为的影响和在动态培养条件下构建具有临床应用价值的组织工程骨。
参考文献
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篇10
关键词：草履虫；水体监测；重金属离子；农药
中图分类号： Q959.117 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20150940002
引言
20世纪中叶以来，世界工厂化的生产模式不断扩大，人口总量迅速增加，人们对于自然资源的索取超过了自然界的再生能力，同时过度排放污染物，造成了世界性的资源短缺和严重的环境问题。水污染就是其中之一。水污染可分为两类：一类是自然污染；另一类是人为污染。其中人为污染较为常见，每年排入江河湖海的污水约有4.2×1012m3，污染了数亿立方米的淡水，相当于世界江流总量的14%以上[1]。特别是近年来，随着农药的大量使用以及工厂排放废水的增加，水污染问题变得愈发严重。而水是生命的源泉，是人类赖以生存和发展的不可或缺的最重要的物质之一，所以有效的进行水体污染监测刻不容缓。
草履虫（Paramecium）是原生动物门纤毛纲的代表物种，除了具有灵敏的应激系统外，还具有分布广泛，结构典型，繁殖速度快，便于观察，容易采集培养等特点，因此被广泛应用于水体监测[2]。目前，国内研究人员从重金属离子、农药等污染物质对草履虫应激性及其生殖能力的影响等方面做了大量的研究，研究表明重金属离子、农药等因素对草履虫均会产生相应程度的影响[3]。
1 草履虫简介
1.1 草履虫种类
草履虫是原生动物门纤毛纲的单细胞动物，其形状类似于倒置草鞋底，主要生活在有机质充足、细菌丰富、光线充足的河流池塘或水沟中。目前，世界已知草履虫种类有22种[4]，常见的有大草履虫、双小核草履虫、多小核草履虫、绿草履虫。其中大草履虫最为常见，体长180～300μm；双小核草履虫，体长80～170μm，伸缩泡2个，有2个很小的小核；多小核草履虫，体长180～310μm，有时有3个伸缩泡，小核泡型，有3～12个；绿草履虫，体长80～150μm，细胞质内有绿藻共生，经见光处培养后通体呈绿色，小核2个。
1.2 草履虫的结构
草履虫一般呈长椭圆形，前端较圆，后端宽而略尖，因形状与草鞋相似而得名。其表膜由三层膜组成，具有缓冲和保护作用。膜下机体中生长有近万根纤毛，其排列成的网状结构，更有助于控制草履虫活动[5]。与表膜垂直排列分布在外质中的一排小杆状的囊泡结构，叫做刺丝泡，从而起到防卫和捕食作用。刺丝泡在表膜上开口，虫体在受到外界的刺激时会射出刺丝泡中的内容物，当内容物接触到水就会形成细丝[6]。
1.3 草履虫的生活环境
草履虫生活在水流缓慢、带有腐草的水沟、池塘和稻田中，在有机质丰富、光线充足的水面附近较常见，尤其是在细菌丰富的水中，草履虫种群密度最大[7]。草履虫在水温0～30℃情况下均能正常生活，24～27℃是草履虫生活的最佳水温，当水温低于10℃或高于35 ℃不利于草履虫的繁殖[8]。
1.4 草履虫的应激性
草履虫细胞质内部的水分约占细胞质的75%～85% [9]，采取自旋回波测量的方式对草履虫细胞进行研究，其研究结果表明，细胞内的水呈“结构化”，即草履虫细胞内的水是以液晶态形式存在。液晶态物质具有对热、磁、光、电、声、辐射、应力等变化反应较灵敏的特性。所有包括膜电位在内的应激信息，都会通过其在细胞质内传导，构成草履虫身体内的原始应激系统。由于草履虫应激系统灵敏的特性，使得草履虫无论是在监测农药使用的安全性方面还是重金属离子的监测方面都有着十分重要的意义。
2 草履虫在水体监测中的作用
随着经济的发展，工业化的迅速扩张，人们在面对这一时代到来的同时，还面对着重金属排放和农药过度使用所导致的水污染问题。而草履虫的应激性能够直观的反应水体污染程度，是水体监测中的一种重要的原生动物。
2.1 重金属对草履虫的影响
2.1.1 Cd2+对草履虫的影响
重金属镉对生物和人体均有毒害作用，同时它也是一种水体污染物。由于草履虫等原生动物对镉的毒性作用反应同后生动物相比更加敏感，因此草履虫在监测Cd2+毒性方面具有重要的意义。方卫飞等[10]利用CdSO4、CdCl2、Cd（NO3）2这三种镉化合物对草履虫的生物毒性进行了研究，结果表明对草履虫毒性作用最大的是CdSO4。胡好远等[11]通过对Cd2+24h半致死浓度（LC50）进行了实验，结果表明，在一定范围内，Cd2+的浓度增加，草履虫的种群数量也会随之增长，但Cd2+浓度过高也会降低草履虫的种群增长率。
2.1.2 Pb、Cu对草履虫的影响
近些年来，随着冶金工业的快速发展，部分水体中的沉积物中Pb2+、Cu2+的含量不断积累，Pb、Cu等元素会对生态环境造成破坏，尤其是随着雨水的冲淋，Pb、Cu等元素进入水体环境，造成严重的水体污染。周玉[12]通过在20℃培养条件下Pb、Cu等单一元素对草履虫种群毒性的影响的研究，结果表明，Cu2+、Pb2+24h对草履虫的LC50分别为0.0826mg/L、3.9907mg/L；Pb、Cu等单一元素对草履虫都具有毒害作用，且相同条件下Cu2+对草履虫的毒害作用大于Pb2+。
2.2 农药对草履虫的影响
2.2.1 除草剂对草履虫的影响
2，4-D丁酯是除草剂中的一种，2，4-D丁酯对草履虫的种群增长具有抑制作用，但对草履虫的细胞胁迫变化并不显著。谷艳芳等[13]发现，在水环境中，草履虫对2， 4-D丁酯有明显的驱避作用。捕食行为受到影响会造成生物机体获得资源减少，引起生产量下降或发育繁殖迟缓。所以受到2，4-D丁酯的胁迫会引起草履虫在自然界的自然增长率下降和分布格局的变化。但目前关于2， 4-D丁酯对草履虫影响的生态毒理学机制仍不完善，需要进一步提高。
2.2.2 杀虫剂对草履虫的影响
氯氰菊酯是一种广谱、生物活性较高的拟除虫菊酯类杀虫剂，拥有8个光学异构体，其中有4个生物活性较高的异构体组成的外消旋混合物称为高效氯氰菊酯，在十字花科蔬菜、棉花、果树、茶树等作物害虫的防治中应用广泛[14]。目前，关于拟除虫菊酯类农药对草履虫的毒性研究已有报道。对于氰戊菊酯对原生动物群落48h急性毒性的检测，王莉霞等[15]研究得出LC50为15.830mg/L。李霖等[16]通过三氟氯氰菊酯对草履虫的毒性进行研究，研究表明：三氟氯氰菊酯对草履虫1h的LC50为1.650mg/L。而高效氯氰菊酯对草履虫1h 的LC50为27.536mg/L，可见草履虫对高效氯氰菊酯的反应灵敏度远低于三氟氯氰菊酯。
2.2.3 杀菌剂对草履虫的影响
多菌灵是一种广谱性的苯并咪唑类杀菌剂，学名2-苯并咪唑基氨基甲酸甲酯（MBC），又称作棉萎灵、苯井咪唑44号。对由半知菌、多子囊菌引起的多种作物病害有防治效果[17]。在叶面喷雾、种子处理和土壤处理中有很多应用。李霖等[18]在进行杀菌剂多菌灵对草履虫的急慢性毒性作用研究，结果表明，草履虫的生长与多菌灵溶液的浓度有关，多菌灵浓度越高，毒性作用越大。
2.2.4 草履用于水体监测的优势
草履虫对毒性的应激反应与多细胞动物相比更为敏锐，并且对于反映环境化学毒性物质的毒理效应相比单纯的化学手段也更为生动、直观。因此，草履虫在毒性监测方面具有着重要的研究价值。同时草履虫更是一种良好的水体监测材料，是水体质量监测的重要指示生物之一。近些年来，国内外研究人员以草履虫为实验材料进行毒性实验，研究水体环境中的重金属污染和农药污染等问题，为农药的使用安全、重金属污染的监测以及生态环境保护等方面提供了更多有价值的参考。
3 问题与展望
目前关于草履虫的毒理研究很多，并且对于草履虫在环境方面的监测实验也取得了长足的进展。而在实验室和水体污染监测中采用的草履虫基本是从野外采集回来，进行简单纯化培养，完全达不到模式生物的要求标准。对于从不同水体中采集的草履虫，因为自身的生长环境影响对某些污染物具有一定的适应性，如果不能妥善解决，将会严重影响监测的准确性。而且处于不同生长阶段的草履虫对外界的刺激所产生的反应也是有所差异的，这些都将会影响实验的平行性和可信度。
目前，草履虫的培养方法简单，而且培养出的草履虫生长阶段、生长速度不一致。因此，为了能够在实际应用中胜任精确的监测工作，培养无背景处于同一生长阶段的模式生物草履虫是现在迫切需要解决的问题。对于无背景草履虫的培养，可以在最适温度和pH条件下使用单一营养物质进行培养，保证草履虫在生长过程中不受外界污染源的影响。而对于单一营养物质的选择，根据草履虫的食物摄取情况，可以选择某一种纯培养的细菌，也可以选用一种或多种氨基酸配制无菌培养液。
参考文献
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