纳米抗体技术范文
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篇1
Properties and application of single domain antibody fragments
GU Kai1，ZHANG Juan1，ZHANG Cheng-hai2，WANG Min1
（1 China Pharmaceutical University， Nanjing 210009，Jiangsu，China；2.Shanghai CP Guojian，Shanghai 201203，China）
Abstract：Heavy-chain antibody （HCAb） lacking light chain exists naturally in camel. The variable domain of HCAb， the smallest functional antigen-binding fragment is referred to nanobody， which molecular weight is 15kD. They are well expressed and have a high stability and solubility. As a new type antibody in basic research， drug development and disease diagnosis ， nanobody has a broad application prospects. This mini-review offers an overview of its properties and therapeutic.
Key words：Heavy-chain antibody ；Nanobody ；Diagnose ；Therapy
由于在疾病诊断与治疗方面的广泛应用，近20年来重组抗体技术得到迅速的发展。常规抗体是由两条完全相同的重链和两条完全相同的轻链组成（图1a）。通过分子生物学的技术和手段，将抗体重链可变区和轻链可变区连接组成各种小分子抗体[1]如ScFv、Diabody（图1a），不仅保留了完整的抗原结合部位，而且具有较好的亲和力。但是，这些小分子抗体特别是多价形式的小分子抗体的表达很复杂。
骆驼体内存在的缺失轻链的抗体，只含有重链，因此又叫做重链抗体（图1b）。其N端结构域（VHH或者纳米抗体）能直接识别结合特异性抗原。VHH是可结合抗原的最小功能单位，其相对分子质量仅为传统抗体的1/10左右，大小为15kD，直径2.2nm，高度4.8nm，又被称作纳米抗体。目前，通过噬菌体，酵母和核糖体展示技术，从免疫，非免疫和半合成纳米抗体库[2-4]中筛选抗原特异性纳米抗体的方法已经建立。
图1 抗体的结构示意图
1纳米抗体的结构与性质
1.1纳米抗体的结构 纳米抗体只有一个结构域，没有Fc段，从而避免了Fc段引起的补体反应。与常规抗体的可变区相似，VHH包含4个框架区形成基本骨架，3个互补决定区是抗原结合的主要部位。与常规VH相比，VHH框架区序列的同源性高达80%[5]。
通过序列分析和结构解析，揭示了VHH具有一些独特的特征。VHH中位于FR2的4个氨基酸[6]（F37、E44、R45、G47）与VH中相同位置的氨基酸不一样。这几个在VH中是高度保守的疏水性氨基酸，而在VHH中是亲水性氨基酸，增加了VHH的水溶性。与常规抗体的VH相比，VHH的CDR1可变性更高，CDR3区更长，形成一个突出的环，较长的CDR3环与CDR1或FR2形成一个二硫键来稳定构象[7]。由于VHH只有一个结构域，比常规抗体小很多，所以在很多方面有广泛应用。
1.2热稳定性 1.3特异性 纳米抗体除了可以识别一些常规的表位外，由于其分子量很小，CDR3区较长，形成的环向外延伸，还可以识别常规抗体无法识别的抗原表位，例如酶的活性位点[10]和一些保守的凹陷的表位[11]。然而，一些半抗原和小分子多肽，通常结合在VH-VL的缝隙中，很难和VHH结合。
1.4组织渗透性 纳米抗体的分子量很小，很容易从肾小球滤过，导致VHH很快从血浆中清除，使VHH的半衰期很短。另外，VHH有很高的组织渗透作用，VHH很容易偶联一些毒素进入细胞内，Cortez-Retamozo等[12]利用纳米抗体偶联毒素物质作用于肿瘤细胞，其穿透性好，特异的作用于肿瘤细胞，不会引起其它组织损伤。
1.5表达性 VHH通常在原核系统中表达，氨基酸的差异对表达量有很大的影响。研究发现有几种形式的序列与表达量密切相关。①含有N端糖基化位点的序列，在酵母中的表达量显著提高[13]。②与常规VH相似的VHH，在酵母中的表达量会下降。③C端未形成二硫键的半胱氨酸会降低VHH表达量[14]。④VHH中一些位于FR2区域的一些亲水性氨基酸能够显著增加其在E.coli中的表达量。此外，一些多聚形式的的VHH表达量和单体的表达量相比明显下降[15]。
2纳米抗体的应用
目前，对纳米抗体的应用主要依靠其结构和功能特异性，由于其高的稳定性和亲和力使得其在许多方面具有广泛的应用。本文主要针对纳米抗体在疾病的诊断和治疗方面的应用进行说明。表1[16]显示了一些纳米抗体在相关疾病治疗方面的应用。
2.1构建多价和多特异性抗体 VHH分子量小，结构简单，易于操作，常用于构建多种不同形式的抗体。这些不同形式的抗体在诊断和治疗疾病方面具有许多常规抗体没有的优点：结合同一个抗原上的邻近的多个表位，从而提高对该抗原的亲和力；可以偶联毒性物质，如对细胞有毒药物、放射性物质等。
2.2作为细胞内抗体 抗体作用于细胞内的单位而起作用，对抗体的稳定性提出了更高的要求。由于细胞内是还原性环境，不利于二硫键的形成，所以需要二硫键稳定的常规抗体在在细胞内不能稳定存在而没有功能。纳米抗体的高稳定性，可溶性以及高表达性使其非常适合用作细胞内抗体。Gueorguieva等[17]利用噬菌体展示技术从驼源的纳米抗体库中筛选得到特异性结合介导细胞凋亡的蛋白Bax的抗体，此抗体能够在胞浆中稳定的存在，与Bax结合，抑制氧化应激诱导的细胞凋亡，可用于神经退行性疾病的治疗。
2.3用作肿瘤的诊断和治疗 抗肿瘤研究存在两大难题：①早期诊断、②靶向治疗。此二者不仅要求药物在体内迅速到达疾病部位，而且要求对正常组织损伤降到最低。目前已有多种抗体药物可供治疗肿瘤。但是因为这些抗体属于大型蛋白质，难以穿透肿瘤细胞；并且他们的复杂结构使得大量生产非常困难且昂贵，因此在治疗癌症方面仍有改善空间。纳米抗体远小于常规抗体，且保有对肿瘤具专一性的特性；其稳定，分子量小，属水溶性蛋白质，使生产更容易且便宜。因此，在肿瘤的诊断与治疗方面比其他抗体更具优势。研究表明[18]一种与表皮生长因子竞争的纳米抗体，与表皮生长因子受体结合，以阻碍表皮生长因子与其特异性受体结合，从而阻断其信号通路，抑制肿瘤新生血管的形成。
2.4用于神经性疾病的治疗 药物透过血脑屏障准确到达疾病发生部位，是神经性疾病治疗面临的一大挑战。利用纳米抗体可有效的解决这一问题，将神经性药物连接到特异的纳米抗体，该抗体能将药物运输到大脑的特定部位，使药物发挥疗效。纳米抗体分子量小，稳定性高，组织渗透性强，耐高温、pH、盐等特性，使其在这方面的应用有很大的优越性。Muruganandam等[19]利用噬菌体展示技术成功筛选出两个特异性纳米抗体FC5和FC44，体外体内试验证明这两种抗体能有效透过血脑屏障到达靶部位，为纳米抗体应用于神经性疾病的治疗奠定了基础。
最后，纳米抗体作为一种新型抗体，具有完整的抗原结合能力。其分子量小、特异性强、组织渗透性高以及易于表达等优越性，使其在抗炎、抗感染及风湿性疾病等方面也具有很大的发展前景。
3结论
自1993年重链抗体发现以来，纳米抗体已经取得了快速的发展。在应用方面VHH具有很多常规抗体没有的优势。纳米抗体作为最小的具有完整功能的抗原结合片段，具备亲和力高、稳定性好、相对分子质量小、组织穿透力强、免疫原性低、易于操作等常规抗体所不具备的优越性，在疾病的治疗和诊断以及食品检验等领域等都有着广阔的应用空间[20]。然而，将纳米抗体应用于临床仍有许多问题需要解决，免疫原性是大分子药物用于临床治疗首要需要解决的问题，而且多价多特异性抗体及融合抗体分子量更大，多剂量重复使用将会产生更强的免疫原性，对治疗效果将会产生很大的影响。尽管如此，对于纳米抗体作为小分子治疗抗体的研究仍会不断持续，相信在不久的将来随着临床应用中各种问题的解决，纳米抗体在疾病的诊断和治疗中将发挥巨大功效。
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篇2
【摘要】 采用链霉亲和素包被磁纳米粒子，将生物素标记的特异性抗体偶联在磁纳米粒子上，制备出高特异性的磁纳米探针；利用此探针对人绒毛膜促性腺激素（HCG）进行测定，建立了定量检测蛋白类激素的化学发光分析方法。利用紫外可见分光光度计、透射电镜及动态光散射仪对磁纳米探针进行表征，同时对化学发光实验条件进行优化。在2×10－4 mol/L鲁米诺、8×10－4 mol/L H2O2， pH=13的优化条件下，将磁纳米探针用于HCG的定量检测。结果表明，所测发光强度与待测HCG浓度之间线性相关，相关系数r为0.9924，线性检测范围由常规板式ELISA的5～200 μg/L扩展到0.5～250 μg/L; 相对标准偏差为3.82%。采用本方法和常规ELISA法同时对34份人血清标本HCG进行测试，两者相关性良好。利用制备的磁纳米探针定量测定微量蛋白类激素，具有灵敏、高效、快捷、检测范围宽等优点，有望应用于其它微量蛋白的检测。
【关键词】 化学发光免疫分析法， 磁纳米探针， 动态光散射， 人绒毛膜促性腺激素
1 引言
磁纳米探针技术是以免疫学为基础，利用包被有免疫活性物质的各种磁纳米粒子进行免疫学或生物学分析的一项技术[1，2]。在磁纳米粒子的表面引接具有生物活性的专一性抗体，可制备得到免疫磁纳米探针[3]。该探针因具有比表面积大、可快速移动及单分散性良好等优良性能，可在磁场下定位、富集和分离[4]。化学发光免疫分析法在对免疫物质的定性、定量和生物细胞活性功能检测方面应用较为广泛，常用于超痕量活性物质的测定。该方法具有灵敏度高、检测范围宽，可实现全自动化等的优点。用化学发光免疫标记物代替放射性同位素，避免了使用放射性同位素的危害，操作方法简便快速[5]。
人绒毛膜促性腺激素（Human chorionicgonadotropin，HCG）是一种蛋白类激素，绒毛膜癌、葡萄胎等疾病的治疗均需对HCG进行定量测定[6]。目前，用于定量检测HCG的方法有放射免疫法和酶联免疫法。放射免疫法具有敏感度高、特异性好等优点，但却存在放射性污染的缺点；酶联免疫法不存在放射性污染问题，但灵敏度相对较低， 定量测定范围较窄[7]。本研究采用磁纳米探针检测微量蛋白类激素，综合了化学发光法灵敏度高、线性范围广、测定速度快，以及酶联免疫法的特异性高、准确性好的优点，同时利用磁性微粒在磁场中可控运动的特点，将待测物快速富集，具有更快的检测速度[8]。此种磁纳米探针初步应用于临床标本的检测，取得了良好的效果。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
F4500荧光光谱仪（日本日立公司）； 123.20D DynaMagSpin磁分离器（挪威Dynal公司）； SI0146 VortexGenie旋涡混合器（美国科技仪器有限公司）； 20/20n化学发光多功能光度计（美国Promega公司）； UV2250 PC紫外可见分光光度计（日本岛津公司)； 802型动态激光光散色仪（美国Viscotek公司）； ZHWY2102C恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）； J2010透射电子显微镜（日本电子公司）; BIOTEK Elx808酶标仪（美国BIOTEK公司）。
人绒毛膜促性腺激素(青岛康原药业有限公司)；生物素标记的鼠抗αHCG抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；辣根过氧化酶（HRP）标记的βHCG抗体（天健生物制药有限公司）；鲁米诺试剂与H2O2（北京禾尚友生物技术有限公司）；四甲基联苯胺(TMB，万泰生物药业）；磁性颗粒（陕西北美基因股份有限公司）；其它试剂均为分析纯，实验用水为二次去离子水。
2.2 实验方法
2.2.1 磁纳米生物探针的制备 取25 μL生物素标记的鼠抗αHCG抗体（3 g/L），加入350 μL PBS缓冲液（pH 7.4），配制成抗体溶液。采用缩合反应将链霉亲和素偶联在磁纳米粒子上[9～11]，将100 μL链霉亲和素修饰的磁纳米粒子工作液（5 g/L）与该鼠抗αHCG抗体溶液混匀，置于37 ℃，150 r/min 的恒温摇床中反应30 min，利用生物素和链霉亲和素之间的高亲和力将生物素标记的特异性抗体偶联在磁性纳米粒子上，制备成具有高特异性的磁纳米探针。探针洗涤后加入500 μL封闭液（0.05% Proclin 300与10%酪蛋白的TrisHCl缓冲液），在37 ℃，180 r/min恒温摇床中振荡30 min后磁性分离。用PBS缓冲液清洗后，加入PBS缓冲液配制成浓度为1 g/L的磁纳米探针溶液，置于4 ℃避光保存，备用。
2.2.2 磁纳米探针的表征 采用紫外可见分光光度计测定标记前的鼠抗αHCG抗体溶液(Pre)、标记后的上清液(Post)及标记过程中清洗液（Wash）在280 nm处的吸光度，根据公式（1）计算抗体与磁纳米粒子的偶联效率（Coupling efficiency， E）。E＝ODpre－ODpost－∑ODwashODpre×100％（1）
移取适量链霉亲和素修饰的磁纳米粒子与磁纳米探针于两个试剂杯中， 分别加入PBS缓冲液稀释，超声处理5 min，制备成分散悬浮液，使聚集颗粒分散为原始粒子， 并使原始粒子在分散液中保持良好的分散状态。采用动态光散射仪对磁纳米粒子及磁纳米探针的有效粒径及粒径分布进行测量。同时采用透射电子显微镜（TEM）观测磁纳米探针的形貌。
2.2.3 磁纳米探针用于HCG浓度的测定 采用双抗体夹心法，利用制备的磁纳米探针对HCG样品进行定量检测。将HCG磁纳米探针、待测HCG样品溶液、HRP标记的鼠抗人βHCG抗体置于离心管中，使三者充分混合，然后置于37 ℃摇床反应25 min，形成磁纳米探针待测HCG抗原酶标抗体的复合物，在磁性分离区域用PBS缓冲液进行洗涤，并采用单因数法对化学发光体系的实验条件进行优化。在优化实验条件下，在上述复合物中加入化学发光底物液（鲁米诺与H2O2），酶催化底物发光，用20/20n单光子计数仪检测光强，通过光强与待测物浓度的对应关系计算样品中HCG的浓度。
3 结果与讨论
3.1 磁纳米探针的表征
采用紫外可见分光光度计在280 nm处测得标记前的鼠抗αHCG抗体溶液吸光度ODpre(280)=1.755、标记后的上清液吸光度ODpost(280)=0.30、 标记过程中清洗液吸光度∑ODwash(280)=0.1752。按照公式（1）计算得抗体偶联效率为72.9%，表明生物素标记的αHCG抗体与链霉亲和素修饰的磁纳米粒子具有良好的偶联特性，抗体能高效地偶联在修饰后的磁纳米粒子表面，形成磁纳米探针。
图1 磁纳米探针的形貌（略）
Fig.1 TEM image of the magnetic nanoparticle probes
采用透射电子显微镜对磁纳米探针的形貌特征进行描述。如图1所示，合成的磁纳米探针具有良好的单分散性。
使用激光动态光散射仪来测定磁纳米探针制作前后的平均粒度及粒度分布范围，结果分别如图2a和图2b所示，实验数据见表1。
图2 亲和素包被磁纳米粒子(a)和磁性纳米探针（b）的粒径分布（略）
Fig.2 Size distribution of streptavidinlabeled magnetic nanoparticles(a) and magnetic nanoparticle probes(b)
由图2a可知，在探针制作前表面修饰链霉亲和素的磁珠粒径为1066 nm，粒径分散度为7.7%。其中存在粒径为9754 nm的产物，是链霉亲和素修饰的磁纳米颗粒之间的团聚体。这种团聚体会影响良好的磁纳米探针的形成，造成检测误差。为消除这种团聚，通过添加适量的缓冲液（缓冲液中含有阴离子），并采用超声分散，使制作的水相中的磁纳米探针之间存在静电排斥力和空间位阻效应，以达到较佳的分散效果。磁纳米探针的平均粒度及粒度分布范围如图2b所示，磁纳米探针粒径为1295 nm，粒径分散度为8.6%，可见此探针具有较好的粒径分散度；粒径为3.52 nm的粒子为游离出的αHCG抗体单体，粒径为117 nm的粒子为αHCG抗体多聚体或αHCG抗体与链霉亲和素的聚集体。
表1 亲和素包被磁纳米粒子与磁纳米探针的粒径与相对颗粒数分布（略）
Table 1 Distribution of diameters and relative numbers of streptavidinlabeled magnetic nanoparticles and magnetic probes
3.2 化学发光反应的最优实验条件
3.2.1 鲁米诺浓度对发光强度的影响 移取50 μL辣根过氧化酶标记的βHCG抗体（原液浓度为0.66 g/L，用PBS缓冲液按1∶10000稀释），分别考察了4×10－5～6×10－4 mol/L的鲁米诺溶液对体系发光强度的影响，结果如图3a所示。当其它条件不变时，随着鲁米诺浓度增大，体系的化学发光强度也随之增大，当其浓度为2×10－4 mol/L时，相对发光强度达到最大；浓度继续升高时，发光强度开始下降。因此，为保证该体系检测发光强度最高，鲁米诺浓度选为2×10－4 mol/L。
图3 鲁米诺浓度(a)， H2O2浓度(b)和pH值(c)对相对光强的影响（略）
Fig.3 Effect of luminol concentration(a)， H2O2 concentration(b) and pH(c) on chemiluminescence intensity
a，b. 2×10－4 mol/L H2O2; 0.1 mol/L Tris缓冲液(Buffer solution)， pH=11.83。 c. 2×10－4 mol/L鲁米诺(Luminal)；8×10－4 mol/L H2O2； 1.6×10－5 g/L HRPβHCG抗体（Antibody）.
3.2.2 H2O2浓度对光强的影响 移取50 μL辣根过氧化酶标记的βHCG抗体（原液浓度为0.66 g/L，用PBS缓冲液按1∶10000稀释）， 在鲁米诺浓度为2×10－4 mol/L时，考察了H2O2浓度在4×10－5～1×10－3 mol/L范围内对相对光强的影响，如图3b所示。体系光强随着H2O2浓度的增大而增强; 当H2O2浓度为8×10－4 mol/L时，H2O2鲁米诺体系具有最大的化学发光强度; 随着H2O2浓度的继续增大，体系发光强度降低。因此，H2O2最优浓度为8×10－4 mol/L。
3.2.3 pH值对光强的影响 鲁米诺化学发光反应在碱性条件下进行[12]，辐射出最大发射波长为425 nm 的化学发光。因此，采用0.1 mol/L Na2CO3NaHCO3缓冲体系为测定工作液，在反应中，通过改变鲁米诺溶液中NaOH的浓度来改变反应体系的pH值，以提高反应体系的灵敏度，进一步考察了上述最优浓度配比的H2O2鲁米诺体系在pH 8.0～14.0范围内变化时，pH值对H2O2鲁米诺体系发光强度的影响。图3c表明，若pH8.0时，体系发光强度随pH值的增大而缓慢增强；pH =13时体系的发光强度迅速增到最大；当pH>13时，发光强度迅速减小。因此，最优pH值选择pH=13。
3.3 样品测定
3.3.1 干扰实验 考察与HCG有部分类似结构的不同浓度蛋白类激素对10 μg/L HCG标准品测定的干扰情况。结果表明，40 μg/L的促甲状腺激素(TSH)、促黄体生成素(LH)、促卵泡激素（FSH）、雌二醇(E2)对HCG的测定均无影响（RSD＜5%)，证明本磁纳米探针特异性强。
3.3.2 稳定性和重现性 利用同批次制备的磁纳米探针对6份浓度为10 μg/L HCG标准品进行了重复性实验，相对标准偏差为3.82%；利用不同批次制备的磁纳米探针对6份浓度为10 μg/L HCG标准品进行检测，相对标准偏差为3.94%，具有良好的重现性和再现性。采用4 ℃避光保存的同一批次制备的磁纳米探针，每3 d对同一浓度的HCG标准品进行检测，24 d内测定8次，相对标准偏差为4.02%。结果表明，本探针在24 d内具有良好的稳定性，具体有效期仍需进一步研究。
3.3.3 HCG标准曲线测定 在最优实验条件下，依据检测体系中待测物浓度与化学发光强度在一定条件下呈线性关系的原理[13]，利用制备的磁纳米探针，采用化学发光检测仪对不同浓度HCG标准品进行测定。结果表明，HCG浓度在0.5～250 μg/L范围内与相对发光强度具有良好的线性关系。其线性方程为y=32.953x+5390.3，相关系数r=0.9924。
图4 磁纳米探针分析法与ELISA法相关性分析散点图（略）
Fig.4 Scatterplot of correlation analysis between magnetic nanoparticle probe and ELISA
本探针的检测待测样品时间少于40 min，具有检测速度快、特异性高、灵敏度高等特点。
3.3.4 实际样品测定 采用同批次制备的磁纳米探针检测了34例临床血清标本（首都医科大学附属北京佑安医院健康体检人群血清标本），同时采用常规ELISA方法进行平行检测。常规ELISA方法检测HCG时，首先绘制不同浓度的HCG与ELISA吸光度之间的标准曲线，然后将所测样品的OD值换算为浓度。两者结果经线性相关分析后得散点图（图4），结果显示，将特异性磁纳米探针用于检测蛋白类激素与常规ELISA法具有良好的相关性，线性相关方程为y=0.9979x+2.4625， 相关系数r=0.9743。
本研究建立了一种宽范围定量检测蛋白类激素的方法。本方法操作简单，快速，灵敏度高，无放射性污染，具有应用于检测蛋白质类和多肽类抗原的应用前景。
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11 Sun MinLi(孙敏莉)， Zhang Hao(张 皓)， Zhang BaiGen(张柏根). Academic Journal of Shanghai Second Medical University(上海第二医科大学学报)， 2004， 24(2): 40～42
篇3
【关键词】功能性 纳米材料 电化学 免疫传感器
【Abstract】The immune sensor is based on the close cooperation with the selective immune response and is suitable for the signal conversion technology， to monitor antigen - antibody response of biological sensors， gradually get rapid development and extensive application in many fields. In recent years the electrochemical immunosensor main research direction， in general is to improve the sensitivity， accuracy， selectivity， response time， and this article will use the single-walled carbon nanotubes as electrode， using its good conductivity， high surface area ratio， through the modification of carbon nanotubes wall and pipe end and biological molecular bonding， and keep the activity of biological molecules， the electrochemical immunosensor extremely symbolic significance. This paper combines the specific relevant theories and analysis， the application of functional nano materials in electrochemical immunosensor for research.
【Key words】Functional； Nano materials； Electrochemical； Immunosensor
免疫传感器的一般工作原理为固定在换能器上的抗体（抗原）对样品介质中的抗原（抗体）进行选择性免疫识别，并且产生随分析物浓度的变化而变化的分析信号。在抗体的不同区域和抗原决定簇之间的高选择性反应主要包括疏水力、静电作用力、凡德瓦尔力和氢键作用力。近年来纳米材料在电化学免疫传感器上的应用也发展得相当迅速。由于纳米材料具有表面积大、表面反应活性高、表面活性中心多、催化效率高和吸附能力强等优异性质，将纳米微粒应用于电化学免疫传感器中，可以提高传感器测量的灵敏度、准确性、减少采血量和检测时间[1]。作为免疫分析技术的一个重要分支，免疫传感器除了具有传统免疫分析方法所共有的性能特点外，还具有高选择性、高灵敏度、可逆性和剂利用的高效率等优点。另外，免疫传感器大都制备简单，便于实现自动化、数字化和微型化，因此可以避免传统免疫分析方法所附带的一系列问题，故在临床分析、环境分析和生物监测过程中显示了强大的应用潜力[2]。因为免疫传感器常用来测量源于分析物和固定的抗体/抗原之间的反应而产生的信号，所以将抗体（抗原）固定在原始换能器表面的固定化过程在免疫传感器制备中有着重要的作用。大量的固定法已用于各种免疫传感器，如静电吸附、包覆法、交联法、共价键结合法等。
1 电化学免疫传感器的工作原理
由于电化学免疫传感器具有高灵敏度、低成本和便携等优点，成为免疫传感器中研究最早、种类最多，也较为成熟的一个分支。电化学免疫传感器的基本工作原理是：采用电化学检测方法来检测标记的免疫剂或一些由酶、金属离子和其它电活性物质标记的标记物，从而对疾病诊断或病人状态监测中复杂系统的多组混合物进行分析提供有力数据[3]。用于电化学免疫传感器检测中的换能器主要分为电位型、电导型、电容型、阻抗型和安培型等装置。电位型传感器现在已经被公认为是一种成熟的传感器，已有大量的商品化产品。对于电位型传感器，当电流流动为临界点时，换能器界面处于平衡状态，此时电极或者表面修饰膜的电位变化与溶液定金属离子活性呈对数比例关系，这就是电位型换能器的基本工作原理。这类生物传感器具备制备简单、操作容易及选择性良好的优点[4]。
2 功能性纳米材料技术
与块状物质相比，金属和金属氧化物纳米粒子由于其新颖的材料特性，近年来已被广泛研究。少于50个金属原子小团簇可以产生像大分子一样的效果，但大于300个原子的大团簇表现出大体积样品的性质，介于这两种极端之间的材料，通常为纳米材料，有许多未知的化学和物理性质，这也是许多研究一直集中于纳米材料的一个原因。纳米材料具有依赖于其尺度的光、电和化学性能[5]。纳米材料可以应用到许多领域，如光学器件、电子器件、催化、感测技术、生物分子标记等。考虑纳米粒子的优点，如大面积、高催化性和良好的亲和性，如今，多种纳米材料已被用来包覆蛋白质。常用的有纳米碳管（CNTs）、金胶体（Au colloidal）、量子点以及纳米二氧化钛。CNTs自从1991年被发现以来，引起了一股研究热潮。纳米直径的圆筒形石墨片状的CNTs具备高电导率、良好的化学稳定性、非常显着的机械强度和成模性。纳米碳管可以与DNA分子自组装（self-assembly）。根据理论预测与实验验证，DNA/CNTs 层可作为新的电子材料[6]。由于DNA溶液可以胶化，混合的DNA/CNTs层能够在金属电极表面保持稳定，可以用来研究一些电化学现象或检测一些蛋白质性质。此外，带正电荷的蛋白质可被固定在带大量负电荷的DNA修饰层上。多壁纳米碳管与DNA混合后，可成功地固定在铂电极表面，更进一步的研究表示，细胞色素C可被强吸附在修饰电极表面形成一种近似的单分子层。
纳米技术的快速发展为纳米粒子在生物传感器和生物分析中的应用开拓了新的方向，由于其独特的物理、化学性质，纳米粒子引起了纳米科学家的极大兴趣，这些性质使其在化学和生物感测方面具有广阔的应用潜力。近年来，组成和空间结构不同的纳米粒子被广泛应用于不同生物分子识别的电学、光学和微量感测中。胶体金（Colloidal gold）和半导体量子点纳米粒子在生物分析中应用得非常广泛。通过与生物识别反应和纳米生物电子的耦合作用，能极大地提高这两种纳米粒子的用途。纳米粒子放大标记以及纳米粒子-生物分子的自组装产生极大的信号增强作用，为制造超灵敏的光学和电学检测奠定了基础，其灵敏度可与聚合物酶链反应（PCR）相比[7]。
纳米材料独特的性质使其在设计具有高灵敏度和选择性的核酸和蛋白质检测方法中具有广阔的应用前景。由于可以制得不同尺寸、组成和形状的纳米材料，调节其物理化学性质，使其在生物感测和生物分析中得到广泛的应用。由于纳米材料的小尺寸效应，其性质很大程度上受到与其结合的生物分子影响。近几年，不同组成的纳米粒子作为多种用途、灵敏的标记物被广泛地应用于识别不同生物分子的电子、光学和微天传感器中。纳米粒子放大标记以及纳米粒子-生物分子的自组装产生极大的信号增强作用，这种技术结合了纳米粒子-生物分子自组装的放大特性和光学或电化学传感器的高灵敏性，将多个基于纳米材料的放大单元和过程结合，也能够设计出多重放大器，满足现代生物分析对更高灵敏度的需求[8]。金属纳米粒子独特的催化性质能在其本身或另一种金属纳米粒子的刺激下实现放大信号的功能。也可以通过将大量的能够产生信号的分子封装在纳米粒子中以提高每个结合过程标记物的数量，达到放大信号的目的。这些基于纳米材料的生物感测和生物分析方法还能够与其它的放大技术结合。如图1所示。
3 基于功能性纳米粒子的电化学免疫传感器与应用
基于抗体和抗原的特异性反应，免疫传感器为免疫剂的分析提供了一种灵敏的选择性的方法。在此方法中，免疫材料被固定在传感器上，通过标记物与其中一种免疫剂的复合物对分析液进行测量[9]。一般是通过测量标记物的特异活性，例如放射性、酶活性、荧光、化学发光或生物发光对分析物进行定量。但是每一种标记物都有自己的优缺点，含有金属标记物免疫检测的金属免疫检测，以克服一般的放射性标记，荧光标记和酶标记的缺点。电化学检测的金属免疫分析具有以下几种优点：如，检测液用量少、样品不用纯化、灵敏度好、仪器设备相对便宜。尽管电化学技术能够检测到nano-mole有机金属化合物或金属离子，与能检测到pico-mole级的荧光检测方法相比，灵敏度还不够高。使每个结合物上含有最大量的金属标记物的理想方法是使用包含上千个金属原子的金属纳米粒子。由于其优越的氧化还原活性，胶体金是电化学免疫感测和免疫标测标记物的最佳选择。现已建立了一种基于金纳米粒子循环累积的新方法，通过阳极溶出技术检测人的免疫球蛋白（IgG）[10]。在生物素存在下，脱巯基生物素和亲合素的解离反应为能够分析最终定量的金纳米粒子的循环累积提供了有效的路线。阳极峰电流随着循环次数的增加而增大。五个循环的累积即可满足该分析方法的需要。这种方法的优点就是背景值很低，从而使人IgG的检测极限可达0.1ng/ml。如图2、图3所示。
4 结语
纳米技术为设计超灵敏的生物传感器和生物分析方法提供了很大的机会。纳米粒子在生物传感器放大和生物分子识别具有巨大的潜力及应用价值。新的纳米粒子感测技术的超强灵敏度，为常规方法检测不到的疾病标记物提供了可行性。这种高灵敏的检测方法还能够实现疾病的早期诊断或预警。纳米粒子标记物在蛋白质检测中的应用还处于起步阶段。但超灵敏的DNA检测中的应用会为蛋白质的检测提供好的起步。
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篇4
【摘要】 近年来纳米材料在各领域已受到人们越来越广泛的关注，尤其是核壳型纳米颗粒的制备技术在不断更新发展，在生物传感器方面有着巨大的应用前景。本文重点介绍了生物传感型核壳颗粒的工作原理、制备方法及其在电化学生物传感器、光学生物传感器以及压电晶体生物传感器上的最新应用进展。
【关键词】 核壳， 纳米颗粒， 制备， 生物传感器， 评述
1 引言
纳米技术是20世纪80年代末崛起的新技术，在材料、光学、化工、医药、环境保护等诸多领域得到广泛的应用[1]。纳米颗粒是指尺寸在1～100 nm之间的粒子，它是由数目极少的原子或分子组成的原子群或分子群，介于宏观物质和微观原子与分子中间的领域，是一种典型的介观系统。其特殊的结构导致它具有许多独特的性质，如表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应等。传感器追求微型化、灵敏度高、响应速度快[2]，纳米颗粒的特点满足了这些要求，而核壳结构的纳米颗粒可以进一步提高纳米材料的性能，广阔的复合空间与纳米粒子独特性能的结合，使粒子复合技术成为材料领域的又一亮点。核壳部分可由多种材料组成，包括高分子、无机物和金属等。包覆在外面的壳层材料可改变颗粒的光、电、磁等物理性质，在生物传感器领域有着广泛的应用前景。
2 生物传感型核壳结构纳米颗粒工作原理
核壳结构的纳米颗粒具有比表面积大、良好的生物相容性以及电催化性等优良的性质，在应用于生物传感器时体现了其优越的适用性。核壳纳米颗粒在生物传感器应用主要有几种形式：构建活性界面用于固定生物材料；作为标记物应用于传感器等。
2.1 构建活性界面固定生物材料
核壳颗粒具有保持生物组分活性的性质，而且能加快生物分子与电极表面之间的电子转移，可提供固定生物材料的活性界面（如图1）。图1中将抗体固定在核壳颗粒上，再与特异性抗原结合。DNA以及酶等生物分子在检测等过程中极易失活，而固定在核壳颗粒上，核壳颗粒结合了不同材料的优点，不仅具有良好的生物相容性，保持其生物活性，且比用其中一种材料修饰的检测信号更强。Feng等[3]将CeO2/壳聚糖组合矩阵首次应用于单链DNA探针的固定，组成的生物传感器具有无毒性以及高的电子传导率，加强了单链DNA探针在电极表面的负载，用于结肠直肠癌基因的检测。Marcos等[4]在核壳颗粒上固定肽核酸（PNA），特异性地与互补DNA杂交。Tang等[5]用磁性核壳纳米颗粒(Fe3O4/SiO2)构建界面固定漆酶，构造电化学生物传感器来检测堆肥中苯磷二酚，核壳颗粒良好地保持了漆酶的活性。Yang等[6]用逐层自组装的方法制备了碳纳米管/壳聚糖复合材料，并将胆固醇氧化酶固定在电极上，设计了一种用来检测胆固醇浓度的生物传感器。纳米复合颗粒大幅度提高了固定化酶的催化活性，增加电极的电流响应灵敏度，改进生物传感器的抗干扰性能。
图1 核壳颗粒作为活性界面（略）
Fig.1 Nanoparticle acts as active interface
在将核壳纳米颗粒用于生物传感器构建过程中，关键是如何将生物材料(酶、抗原、抗体、生物组织、细胞、DNA等)稳定地、高活性地固定到传感换能器(基体电极、晶振片、光极等)表面，提高和改善生物传感器的测定重复性、灵敏度、线性范围、检出限及使用寿命等特性。常用于将生物材料固定在传感换能器表面的主要方法有吸附固定法、包埋法、交联法、共价键合法及定向固定法等。
2.2 作为标记物应用于生物传感器
对核壳纳米粒子作为标记物的检测方法主要有分光光度法、荧光分析法和电化学分析法。分光光度法是根据纳米粒子标记DNA探针在分子杂交反应前后最大吸收波长的变化进行测定。由于纳米粒子的激发光谱宽，且连续分布，而发射光谱呈对称分布且宽度窄，颜色可调，即不同大小的纳米粒子能被单一波长的光激发而发出不同颜色的光，并且光稳定性高，不易降解，所以可用荧光分析法对纳米粒子标记物进行测定。电化学分析法是一种新的检测纳米粒子标记物的方法。由于所用纳米粒子多为金属微粒或半导体纳米材料，根据组成纳米粒子的金属不同，其相应的氧化还原电位也不相同，可以通过对纳米粒子标记物中的金属含量的测定，达到对纳米粒子标记物的测定的目的。常用的电化学手段有循环伏安法、溶出伏安法、差分脉冲伏安法等。
Cai等[7]在壳聚糖修饰的电极上修饰ssDNA，与金纳米粒子标记的寡核苷酸探针杂交，加入银纳米的修饰剂，在金表面在线沉积纳米银，得到银包裹的金纳米粒子，利用高灵敏度的微分脉冲伏安法检测银，从而使检测ssDNA的灵敏度提高了2个数量级，检出限可达50 pmol/L。Palecek等[8]在DNA 序列的检测中引入磁性微粒，用磁性微粒标记寡核苷酸作为探针，与待测的DNA分子杂交后，磁场分离杂交分子，利用阴极溶出法进行DNA 的检测，降低了检出限。段菁华等[9]采用油包水的反相微乳液方法，首次以羊抗人免疫球蛋白(IgG) 标记的异硫氰酸荧光素(FITC)为核材料，成功地制备了FITC的核壳荧光纳米颗粒， 克服了采用传统方法制备核壳荧光纳米颗粒中存在的荧光染料泄露的问题。该核壳荧光纳米颗粒比细胞小很多，且具有生物亲和性，可为纳米生物传感器件提供新型材料。基于该核壳荧光纳米颗粒的标记方法也为生物医学提供了一种新型的非同位素分析方法。
Cai等[10] 用低温法制备了一种以Cu为核，Au薄层为壳的核壳型纳米粒子，使之易于与ssDNA进行功能性聚合。这种核壳型Cu/Au纳米粒子与有5′巯基修饰的ssDNA 偶联，制备成纳米标记的DNA 探针，待测ssDNA固定在玻碳电极表面。当它与相对应的纳米Cu/Au核壳型纳米粒子标记DNA 探针杂交后形成含有纳米标记物的DNA 杂交分子。与金纳米探针相比，Cu/Au对DNA的杂交过程所产生的电信号具有明显的放大作用。Huang等[11]使用CdSe/ZnS核壳量子点作为荧光标记检测α人类IgE生物素，达到良好的效果，之后又将量子点作为指示剂对尿素进行定量分析[12]。核壳纳米颗粒的特殊性质使传感器具有好的适应性及高灵敏度。Xu等[13]将抗 单克隆抗体包被功能化的荧光核壳纳米颗粒，作为标记物用于夹心荧光免疫检测中。校准曲线在1.0～75.0 μg/L范围内呈良好的线性关系，检出限达到0.3 μg/L。
核壳纳米颗粒利用其不同于传统材料的优良性质，在作为标记物中体现了其特殊的光学性质、催化性质等，极大提高了生物传感器的各项性能，提高响应灵敏度，提高抗干扰能力。
3 生物传感型核壳颗粒的制备
3.1 溶胶凝胶法
溶胶凝胶法是合成纳米复合颗粒的一种重要方法。在含有聚合物共溶剂体系中，使得烷氧金属或金属盐等前驱物水解和缩合。如果条件控制得当，在凝胶形成与干燥过程中聚合物不发生相分离，即可获得。这种方法具有成本低、工艺简单、组分易于控制等优点。
溶胶凝胶法在半导体/SiO2纳米复合材料的制备与结构控制方面具有重要作用，该方法设备简单、反应温度低，可制备其它方法难以制备的化合物。Jayasankar等[14]用一种简单的溶胶凝胶方法合成氧化铝钛酸铝核壳结构。这种方法在控制复合颗粒的粒径大小、低温合成及烧结等方面效果显著。在氧化铝基中低温合成钛酸铝归因于试剂间大的接触面积。该方法晶粒生长不明显，且具有很好的增浓作用。
3.2 沉积法
沉积法是指将金属快速散射于预定的表面上，而聚合物可以直接加热蒸积到衬底上，也可以是一般单体或聚合物材料经高温热解产生出可聚合性单体散射于衬底聚合而得，可以与金属散射同时聚合，也可以先行聚合再处理。
Sathish等[15]通过沉积法合成AuTiO2复合颗粒。如果用CdS 修饰TiO2纳米管阵列，反应生成的CdS晶粒在衬底上的沉积过程实质是一个表面吸附成核的过程。在光滑的薄膜表面上吸附能力较弱，成核密度较低；反之，表面适当粗糙的衬底，却有较强的活性和吸附能力，成核密度高[16]。Flores等[17]制备了SiO2@Ag核壳纳米颗粒，用直径为(4±2) nm的Ag纳米颗粒包覆直径为(50±10) nm的Si纳米微球。在水/乙醇混合液中，原硅酸四乙酯作为硅源，将AgNO3作为Ag的来源而并未加入交联剂，在制备过程中，将溶液中的Ag+转化为Ag纳米颗粒沉积在Si微球表面，形成了均一的核壳结构纳米微球。Shishkanova等[18]将聚苯胺沉积在聚乙烯表面，用来控制聚合膜的厚度。在聚N乙烯吡咯烷酮存在的条件下，苯胺的氧化是在分散态下进行的。
3.3 原位聚合法
原位聚合法也称就地聚合。即在柔性聚合物或其单体中溶有刚性聚合物单体后，再就地聚合，生成的刚性聚合物分子均匀地分散在柔性聚合物基体中，从而形成分子复合材料。原位聚合在很大程度上提高了纳米粒子在聚合物基体中的分散性，提高了聚合物复合材料的力学性能。
在合成核壳颗粒过程中，壳层的交联剂含量对粒子的尺寸的影响很大。任现文等[19]用原位聚合法成功地制备出不同响应温度的温敏性聚乳酸/聚异丙基丙烯酰胺co丙烯酰胺核壳胶束。实验中当交联剂的摩尔分数从5%提高到15%时，粒子在25 ℃下的流体力学直径从170.2 nm增加到886.5 nm。Liu等[20]用原位聚合法合成了SiO2/聚吡咯核壳颗粒，聚吡咯微球的壳厚度是可以控制的。Jing等[21]采用原位化学氧化聚合法合成了Ag/聚苯胺的核壳结构。Liu等[22]用原位氧化聚合法合成了 @聚苯胺（ATP@PANI）核壳颗粒，并研究了HCl浓度的影响以及ATP@PANI复合颗粒的导电性能。核壳颗粒的壳厚度很容易通过过程参数来控制，如单体浓度和热水温度等。Luo等[23]等将聚苯胺原位聚合到Si纳米颗粒上，形成核壳结构，更容易吸附辣根过氧化物酶，同时也增大了活性电极表面积。
3.4 自组装技术
自组装是指组装单元通过非共价键作用自发形成热力学稳定且具有明确有序结构的聚集体的过程，自组装技术制备的核壳式微球，其壳层形成的驱动力是中心粒子和壳层间所带的相异电荷，或是相邻壳层间相异电荷的静电引力，实现物理吸附。也可以引发层间的化学反应产生交联，提高了壳层的稳定性。
宋秀芹等[24]采用逐层自组装方法在二氧化硅球表面交替组装了十二烷基硫酸钠单分子膜和TiO2纳米粒子膜，该复合多层膜经高温煅烧得到了核壳型纳米结构TiO2/SiO2复合颗粒。利用X射线、扫描电镜、X射线能谱等对复合颗粒进行了表征。结果表明：TiO2在复合颗粒表面排列紧密、均匀，粒径约50 nm，复合颗粒中TiO2的含量随组装层数的增加而均匀增加。Au/C[25]， CdS/聚电解质[26]等核壳颗粒都可通过自组装方式合成。Bizdoaca等[27]用自组装的方法合成核壳颗粒，由640 nm直径聚苯乙烯微球核以及5层12 nm直径Fe3O4纳米晶体组成。Yang等[28]通过层层自组装技术合成生物功能化的荧光微球，用于免疫检测分析。首先将多层荧光标记的聚电解质覆盖在胶体颗粒上，再包覆上蛋白质层，实验结果显示其具有很好的效果。Chen等[29]制备了以聚苯乙烯为核，将4乙烯基吡啶/Au自组装在核表面形成核壳结构，表面组合颗粒具有更高的催化活性和接触反应效率。Wang等[30]采用层层自组装技术形成AuC@SiO2复合物并构造H2O2生物传感器。
4 核壳颗粒在生物传感器的应用
4.1 核壳颗粒在电化学传感器中的应用
电化学生物传感器是以酶、微生物、抗原或抗体、细胞、动植物组织为敏感膜，以将生物量转换为电信号的电化学电极为转换器的装置。图2为原理流程图，首先通过吸附沉积等作用形成核壳颗粒，在电极表面修饰化学基团，利用化学基团与核壳颗粒的作用将核壳颗粒固定，再在颗粒表面连接生物分子，用于电化学检测。
Cai等[7]研究的金银复合纳米粒子在DNA 检测中使灵敏度较一般的单个纳米粒子标记的DNA 探针提高了2个数量级。Liu等[31]将络氨酸酶修饰的磁性核壳颗粒MgFe2O4SiO2利用磁力固定在碳糊电极上，构造苯酚生物传感器，采用循环伏安法等电化学手段对苯酚进行检测。Wang等[32]将Si@Au核壳颗粒（GNSs）通过自组装技术，固定在丙基三甲氧基硅烷（APTES）修饰的氧化铟锡（ITO）电极表面，形成GNSs/APTES/ITO电极。核壳颗粒能提供大的表面积以及具有良好的导电性，促进血色素与电极间的直接电子转移。此外，还据此构筑了高效的H2O2生物传感器。Zhang等[33]利用Fe3O4/SiO2核壳磁性纳米颗粒修饰碳糊电极并用于检测对苯二酚。Qiu等[34]利用二茂铁修饰的磁性核壳Fe3O4/SiO2纳米颗粒合成新型的葡萄糖生物传感器，获得的磁性生物纳米颗粒连接到碳糊电极表面，并作为酶与电极之间电子转移的媒介。此生物传感器可以在1.0×10－5～4.0×10－3mol/L线性范围内检测葡萄糖。Yan等[35]合成银聚苯胺核壳复合物，构造生物传感器，在中性环境中有很好的电化学行为，并对抗坏血酸维生素C的氧化有抑制作用，能在抗坏血酸维生素C浓度为多巴胺5000倍的情况下检测多巴胺。
图2 核壳颗粒应用于电化学生物传感器的原理流程图（略）
Fig.2 Principle flow chart of core/shell nanoparticles applied in electrochemical biosensor
4.2 核壳颗粒在光生物传感器中的应用
光生物传感器选择性地识别分子信息，引发光学变化，且把光学变化转换为电信号输出。可利用的光学信号很多，包括光吸收、荧光、表面等离子体共振等。光生物传感器具有灵敏度高、不需要参比、光传播信号不受外界电磁干扰等特点。图3为核壳颗粒应用于光生物传感器的原理图，首先在平板表面组装上底层，再将作为核的纳米颗粒连接在底层上，并在颗粒外覆盖壳层，利用其特殊光学性质进行检测。
图3 核壳颗粒应用于光生物传感器的原理流程图
Fig.3 Principle flow chart of core/shell nanoparticles applied in optical biosensor
Endo等[36]发展了基于表面等离子体共振生物传感器的新型非标记细胞检测方法。他们使用核壳纳米颗粒作为层基片，通过固定在传感器表面的抗体和抗原的特异性反应而产生的折射率变化，检测细胞代谢物。在此表面等离子体生物传感器中，通过光学性质的检测来判断抗体与细胞代谢物之间的特异性反应，固定在传感器上的抗体的检出限为10 ng/L。
Huang等[37]由传统的金纳米棒与Na2S2O3或 Na2S反应生成一类虫状的新型金纳米棒。这种金金硫化物核壳结构的金纳米棒的灵敏度比传统的纳米棒高，这种特性使金纳米棒在生物传感器构造以及生物分子识别研究中有广泛的应用前景。核壳颗粒的特殊光学性质，可将其用于光吸收。Enders等[38]通过表面增强红外吸收（SEIRA）来检测抗体抗原的特异性反应。SEIRA膜是将金纳米颗粒沉积到SiO2/Si晶片表面得来的。在将特异性抗体固定到金纳米颗粒上后，样品暴露在特异性抗原中，然后采用红外光谱检测样品。
4.3 核壳颗粒在压电晶体生物传感器中的应用
压电生物传感器是一种将高灵敏的压电传感器技术与特异的生物反应结合，通过换能器将生物信号转化为易于定性或定量检测的物理或化学信号的新型生物检测分析方法。压电晶体具有高度灵敏性的质量响应特征，其频率变化与结合在其上的物质质量相关。显然，具有生物亲和性质的组分检测，可以构建压电传感器。
高效地将免疫活性材料固定到传感表面是设计生物传感器的关键步骤。Ding等[39]通过将金纳米颗粒自组装到纳米级的羟基磷灰石上，来设计压电免疫传感器的界面，通过检测α胎蛋白抗原抗体系统来研究此传感器的性能，并将此种免疫传感器的免疫反应与抗体单独固定在羟基磷灰石或纳米金上的进行比较。实验发现，用此种传感器的传感界面，抗原抗体活性更高。可以在15.3～600.0 μg/L范围内对胎蛋白进行检测。Jia等[40]将细胞连接到壳聚糖/多壁碳纳米管修饰的金电极上，使用压电石英晶体微量天平来控制，这种组合物的化学性质以及形态学都用扫描电极以及红外光谱表征。实验显示这种纳米组合物与细胞有更好的生物相容性。5 展 望
核壳结构的纳米复合粒子由于其特殊的结构具有许多优异的性质，不同于单一的材料，往往具备核层和壳层材料的性能，有着新的光学、电化学以及光电转换等特性，一直是研究的热点。以前的研究主要集中在核壳聚合物粒子领域，现在的研究深入到内核或外壳为聚合物、氧化物、贵金属等，而且核壳结构的纳米颗粒的组成、形貌和表面性质是可调的，有着重要而广阔的应用前景。生物传感器在免疫学、医学、食品等领域都有着普遍应用，而且已被成功应用于环境中痕量有害物质的分析与检测[41]。生物传感型的核壳粒子作为一种新型的复合材料，它必将受到人们越来越多的重视。如量子点纳米颗粒由于其量子尺寸效应，大小不同或组成材料不同即可发不同颜色的荧光，而且可用单一波长的光激发多种颜色不同的量子点，更适合现今生物大分子的分析检测，近年来被广泛用于生物学标记。生物可降解纳米颗粒的研究也受到越来越多的重视，它们包裹活性物质，使其与周围介质相隔离以避免过快降解，并能在需要时释放活性物质。将核壳纳米颗粒应用于生物传感器的检测，提高了传感器的性能，使其可检测的目标物浓度越来越低，使生物传感器的研究更加深入。但是，部分核壳材料的形成机理及核与壳材料的协同作用机理尚不明确，而且许多制备工艺也完善，制得的纳米复合材料的性能往往无法与期望的完全符合。因此，为了使核壳型纳米复合材料得到更广泛的推广应用， 还需要大量深入的研究。
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篇5
纳米技术的定义是指一些设备，本身或其关键部分是人工的，至少在某个方向上是1~100nm范围。与癌症相关的纳米技术设备可以是携带靶向性治疗药物的纳米载体；生物靶向性的纳米造影剂；也可以是高度特异检测DNA和蛋白质的纳米粒子和纳米设备，将在肿瘤的诊断、治疗领域产生巨大突破。
【关键词】 纳米技术 肿瘤 诊断 治疗
1 癌症纳米技术
纳米技术的正式定义是指一些设备，本身或其关键部分是人工的，至少在某个方向上是1~100nm范围。与癌症相关的纳米技术设备可以是注射的纳米载体；生物靶向性的纳米造影剂，用于手术中显像以区别神经—肿瘤的相互关系；也可以是高度特异检测DNA和蛋白质的磁性纳米粒子。Whitesides[3]在其纳米技术的定义中，对确切的大小没有过分限制，从生物学需要考虑，更强调生物纳米尺寸在实际操作中的合适性。
2 常用的纳米技术工具
2.1 用于药物投递和显像的纳米载体
癌症治疗中的纳米载体是一大类纳米技术装置，可以非侵袭性地发现早期肿瘤分子标志；同时靶向性投给药物。纳米载体一般至少由3部分组成[2]：核心的组成部分；治疗作用和（或）影像功能的有效负荷；生物表面调节分子，以增加纳米粒子在播散时的肿瘤靶向性。
脂质体是原始而简单的纳米载体，可以穿透癌症新生血管增加肿瘤位点的药物浓度。脂质体包埋的阿霉素现在用于乳腺癌或难治性卵巢癌[4]。几种类型的纳米粒子可以增加MRI的对比度，如含钆或氧化铁的纳米粒子；以及多结构纳米造影剂，可以将MRI与生物靶向性和可见光检测相结合。低密度脂性纳米粒子已用于提高超声影像的质量。
注射用的多孔硅纳米载体可以生物降解，比其他可生物降解的聚合体速度更快（几分钟~几小时vs几天~几个月），因此具有以前不可达到的时间特征。金纳米壳（Nanoshell）[5]，由黄金在硅核心上涂布组成，可以通过组织的近红外线被选择性的激活，导致局部治疗性热消融。
2.2 含纳米材料的宏观设备
目前有能力在纳米范围内进行分子沉淀，使信息密度成百万倍的增加，微阵列进步为纳米阵列，直接用于核酸或蛋白组的测定。用于癌症领域的另一个纳米级装置是表面增强的激光解吸附—电离飞行时间（surface?鄄enhanced laser desorption/ionization time?鄄of?鄄flight，SELDI?鄄TOF）质谱技术，应用于癌症的早期诊断[6]。
多通路生物分子传感器，可以同时间对大量不同的分子标志（组织或血清蛋白组）进行检测，目前最有希望的有微悬臂和纳米悬臂阵列。
硅纳米导线或导管已用于小分子分离，控释药物的投给[7]。也可以作为纳米级的场效应生物晶体管，当其表面发生分子结合事件时，变化的导电率可以被检测。将尺寸控制在5~100纳米的通路和小孔已在硅芯片上制成，使体积移动精确到纳米范围。
3 癌症纳米技术的应用
纳米技术的应用包括：早期诊断，如对血标本进行蛋白组分析；其次，在体内对肿瘤的演化过程进行分析或分子显像；提高药物治疗的靶向性，避开体内的生物或生理学屏障；对治疗效果进行实时监测，替代治疗后的随访评估。
3.1 体内癌症生物标志的检测和监测
新的影像学技术使用的造影剂上结合有分子识别物质或靶向性药物（抗体），具有信号增强作用，可以检测更微小更早期的癌细胞。
近来证实，亲淋巴的顺磁性纳米粒子，可对前列腺癌的隐性淋巴结转移进行MRI显像，这为非侵袭性方法难以发现。Meta分析显示[8]，使用纳米粒子造影的MRI对多种癌症的淋巴结转移的诊断具有很高的特异性（96%）和敏感性（88%）。Kobayashi等[9]在乳腺癌小鼠中使用钆纳米载体——聚合状的树状体（dendrimers）可以清晰显示淋巴结和淋巴管的排泄，提示在临床上可以替代前哨淋巴结活检。双峰纳米粒子，携带有近红外的肉眼可见的荧光基团，与MRI造影剂（交联氧化铁）共价结合，可以用于手术前脑肿瘤轮廓的描绘和手术中的病变显示。交联氧化铁纳米粒子与annexin?鄄Y共价结合，用于MRI可识别喜树碱诱导T细胞的凋亡。使用生物精确纳米粒子，端粒酶活性（增殖潜能的标志）也可以在细胞水平由MRI检测。
持续血管生成发生于癌前病变中，是早期诊断中的重要标志。在动物模型中使用改良纳米粒子，以ανβ3?鄄integrin为靶点，可以对血管形成进行了MRI显像。另一个体内分子检测的是植入性传感器，体外设备进行信号接收，但植入性材料存在非特异性吸附血清蛋白——生物污垢，导致传感器对蛋白检测能力迅速下降。
3.2 体外癌症生物标志分子的早期精确检测
临床使用的一些癌症分子标志，如CEA、PSA，由于特异性不是很好，限制其应用于早期诊断。有几个纳米技术是很合适的侯选者，如纳米悬臂，检测蛋白组的SELDI?鄄TOF质谱分析。
生物分子的结合会产生压力和形变[10]，使用合适的选择性纳米结构传感器可以进行检测和识别。主要的例子是微米和纳米悬臂，当其表面发生核酸杂交、分子结合事件，其共振频率会发生偏斜和改变。此偏斜或者直接被激光束探测，或者偏斜转换成可以测量的物理特征，如共振频率发生改变，见图1。值得提出的是，将成千上万个纳米悬臂阵列集成在厘米大小的芯片上，这样可以同时读码蛋白组信息，甚至整个蛋白组。此技术与微电子制作技术存在相同之处，因此提示可以大规模的，低成本可靠的生产。
纳米悬臂、纳米导线和纳米管的阵列是可以将癌症的诊断、预后和治疗的选择从单个生物标志向多个生物标志转化的工具。
此外，携带荧光基团的硅珠已经用于白血病细胞的检测；在人类SY5Y成神经细胞瘤和C6胶质细胞瘤中，荧光纳米粒子可以检测细胞内的钙浓度——细胞死亡的有效标志，因此可定量测量细胞对药物的反应。
纳米粒子比传统的细胞染色方法具有稳定性和可调性的优势。如量子点不会随时间丢失其信号强度，即不存在光漂白作用；而且，偶联不同抗体的纳米粒子与对应的分子靶向性结合后，可以显示不同的颜色 [11]。即使进行单波长光照射，单个细胞或细胞群中的分子标志分布地图将准确而清晰的显示。
纳米粒子已经用于血清蛋白组的检测，重点是痕量的低分子量蛋白水解片段，应用于卵巢癌和其他肿瘤。SELDI?鄄TOF蛋白组分析使用纳米粒子后，可增加单位面积的蛋白吸附能力，进行更多不同样本的分离和检测。
目前已经开始联合使用多个纳米诊断技术。如改良的寡聚核苷酸—金纳米磁性粒子具有500个zepto摩尔（zepto=10-21）的敏感性，用于核酸的检测。因不需要酶扩增，具有超过PCR的优势，而且也用于蛋白质分析[12]。更进一步的方法是改良金纳米粒子探针，与微悬臂结合，可以分析DNA的单个碱基错配。
3.3 药物的靶向性治疗
将具有识别功能的物质（如抗体）与纳米载体结合，使含有活性药物的纳米载体具有分子靶向性功能。与传统的抗体引导的治疗相比，分子靶向性纳米载体至少具有4大优势：在每个靶向性生物识别过程中，可以携带更多有效治疗负荷；能携带多个不同的靶向性药物，增强选择性；能够以整体的方法通过生物屏障；局部可以投给多种药物，导致靶向性的联合治疗。
通过叶酸介导的靶向性纳米粒子已经在移植鼻咽癌的裸鼠的治疗中得到证实。多功能纳米材料——树状多聚体在胞内与叶酸靶向性结合后，选择性的在细胞内投递抗癌药物甲氨蝶呤[13]；若将荧光素结合到纳米载体则可提供可视的影像信号。多种抗原已用于引导纳米粒子识别血管内皮细胞。如将存在于内皮细胞的ανβ3?鄄integrin与全碳氟纳米乳液结合，用于小鼠模型中结肠腺癌和黑色素瘤的抗血管治疗。目前，已将靶向性溶解血管内皮细胞和化疗药物相结合的纳米粒子开发出来，并可以明显提高治疗效果，减少副作用[14]。
另一类靶向性方法由外部能量驱动，激活局部毒性反应。如使用聚焦超声爆破的脂质包裹微囊进行光动力学治疗；通过联合使用金纳米壳和近红外线光学激活，对深层的癌细胞进行局部热消融。其次，非特异的物理化学相互作用也会提高纳米载体的靶向性，如100nm的粒子更趋向于达到内皮细胞的末梢；比此尺寸更大或更小均导致靠边，因此使治疗的药物更容易到达内皮或组织部位。对pH敏感的多聚纳米载体可以生物分解而释放出抗癌药物紫杉醇，所以肿瘤部位特殊的pH水平使治疗作用优先得到靶向性激活[15]。将来的希望是将上述靶向性方法联合起来，使之在治疗上取得最大成功。
获得和维持药物理想的生物分布，需要精确的给药剂量和时间。植入体内的纳米胶囊，没有多次注射和医院使用的不方便，还可以预先编程，使投递具有时间变化规律，或者通过传感器对植入点的微环境刺激作出自调节的反应。目前，从植入渗透泵恒速的投给激素药物醋酸亮丙瑞林已经在临床上用于治疗前列腺癌[16]。
3.4 工程纳米粒子避开生物、生理学屏障
药物和造影剂从投给部位向理想靶点的缓慢移动，充满磨难，纳米载体和传统的方法均如此。生物物理屏障包括上皮细胞之间的紧密联接（血脑屏障）或血管内皮细胞的保护性排出，网状内皮组织系统（reticulo?鄄endothelail system，RES）的捕获，以及供应癌症的脉管系统解剖结构的紊乱和癌症细胞中的高渗透压；延迟药物微粒进入或促进渗出。纳米技术基础的药物投递系统具有穿过屏障的优势，因为其组成的核心材料的独特特征，如使用缓激肽拮抗剂可以增加血管的通透性[1]。
通透性增强剂的局部给药，能可逆性地开启细胞间的联接，使生物分子药物更容易穿透肠道的上皮细胞屏障，进入血液循环。纳米技术具有多功能性，可以同时携带治疗药物、通透性增强剂和肠壁靶向性材料，因此也使药物避免被酶降解，延迟释放时间[17]。同样，尺寸更微小的多功能粒子被静脉注射，可以增加药物从癌症血管透出，或更容易通过血脑屏障。
细胞的RES可以隔离注射的纳米粒子，对纳米粒子包埋的药物是有效的免疫屏障。通过表面覆盖聚乙烯乙二醇，脂质体可以有效避免被RES的吸收，因此药物的半衰从几分钟提高到几小时或几天，增加了脂质体靶向治疗肿瘤的效果。
癌症病变内的高渗透压，导致治疗药物渗透和在肿瘤内扩散相当困难，即使药物直接注射到病变也容易再排除，尤其是晚期癌症。将来解决此麻烦问题的创造性方法是，多阶段、多负荷的投递系统，但目前这仅仅是一个理论上的构思。2005年1月Abraxane被美国FDA批准[18]为治疗转移性乳腺癌，此药物由紫杉醇纳米粒子组成，可以结合到白蛋白分子上。这种纳米粒子不需要治疗前使用甾体类抗炎药物（传统的紫杉类必须使用），白蛋白可以帮助纳米粒子从内皮细胞上穿过，此联合可以将紫杉醇的临床剂量提高50%。
4 纳米技术的安全性和展望
纳米技术对癌症治疗可能是最有希望的手段之一，然而，应该放在安全性考虑之后。这不仅是严格的审批管理的观点，当然也是健康工作者最关注的问题。纳米载体也会触发过敏反应。碳纳米管可以产生抗体，早期的纳米树状体也可导致较弱的抗体反应，但蛋白结合的树状体是很强的免疫原。因此，纳米技术的治疗不可能不导致过敏反应，需要设计合适对抗手段。
纳米粒子主要的优势是其多功能性，能够将多方法，如治疗、诊断和屏障避开制剂进行联合，与药物反应的生物副作用也会增加。Cristini等[19]发现，将靶向性细胞毒药物治疗肿瘤，尤其是抗血管治疗，将癌症病变分割成多个卫星灶，即治疗产生的重新排列（氧和营养支持的来源），使后序治疗的难度增加。
展望将来，对治疗的疗效进行实时评估方法，将替代直接对肿瘤大小、分子表达和靶向性信号通路进行的观察，甚至替代一些传统的终点分析方法，如缓解时间和生存时间。体内分子显像剂的开发，双重的治疗—显像纳米载体技术的建立，体内显微镜技术（通过荧光光子技术对单个细胞进行显像）的出现，将对最优的诊断治疗提供确实的依据[20，21]。
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篇6
最近科学家制造出一种纳米颗粒，就具有这样的潜力，目前体外实验证明效果不错，但是还需要进一步研究。这样的策略也可以用于其他生物毒素的救治，例如对蝎子、蜘蛛、黄蜂、水母等毒素。该最新研究已经在《美国化学学会杂志》上发表。北科罗拉多大学蛇类生物学家麦克西认为，这种救治思路听起来非常好，如果进一步优化该技术，有希望解决多种生物毒素中毒的治疗难题。
传统抗蛇毒方法的困境
由于缺乏有效治疗方法，每年大约450万人被毒蛇咬伤，其中10多万人被咬死，被咬伤致残的数量更多。毒蛇咬人造成严重后果的情况主要发生在非洲和东南亚地区，导致这些危害的关键就是边远地区缺乏足够合适的抗蛇毒药物。
传统抗蛇毒血清的制造方法比较复杂，首先是提取蛇毒，然后给动物（如马）少量注射，动物接受注射后，免疫系统可以产生针对这种蛇毒的多种抗体，这些抗体能结合蛇毒并使之失去毒性。因此，用这种动物的血清给毒蛇咬伤患者注射可以达到解毒的目的。但是传统的抗毒血清存在许多问题，首先制造这种血清需要大量时间和成本，药物公司很难获得很好的利润。其次，抗毒血清也必须放置在低温条件下，存储成本也较高。
如何利用纳米技术解毒
篇7
酶抑制法
这是目前相对成熟的一种快速检测技术。其检测原理是利用有机磷与氨基甲酸酯类农药能够特异性抑制昆虫中枢与周围神经系统乙酰胆碱酶的活性，致使神经正常传导功能受到破坏。这样昆虫就会逐渐中毒而死。在开展果蔬农药残留检测试验时，乙酰胆碱酶会与样品发生反应。若样品无农药残留或仅有少量农药残留，酶的活性一般不会受到抑制；若样品内农药残留量较大，酶的活性就会明显降低。此法在半小时内便能得出果蔬中有机磷农药与氨基甲酸酯的残留结果。
酶抑制法具有操作简单、检测快速等优点，是当前国际上常用的一种检测果蔬农药残留方法。此法主要被应用于多地的蔬菜基地与市场，用于检测果蔬农药残留是否超标。但是此法的不足之处是检测农药种类有限，以检测有机磷与氨基甲酸酯类农药为主。
生物传感器法
该技术是当前农药残留快速检测技术中的研究热点。它是利用生物的相关敏感部件与转换器密切配合所形成的一种分析装置。对某些生物活性物质与特定化学物质具有选择性与可逆响应。通过检测pH、光、热、颜色、电导等物理化学信号的变化来分析农药残留情况。该技术不仅具有较强的灵敏度与选择性，而且体积小、响应迅速、抗干扰能力强、成本低廉。同时，还具有连续检测与在线分析等优点。根据使用生物敏感材料的不同主要分为四类，分别是细胞传感器、酶传感器、免疫传感器、组织传感器。
免疫学技术
目前，用于农药残留检测的免疫学技术有很多，常见的有酶免疫技术、荧光免疫技术、放射免疫技术、化学发光免疫技术等。其中，最常用的就是酶联免疫法（ELISA），其检测原理是利用抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，受检样品与酶标抗原或抗w按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体发生反应。然后，通过洗涤方法将固相载体上面的抗原抗体复合物分离出来，再加入酶反应底物。此时，底物被酶催化后变色，工作人员可根据颜色反应进行定性或定量分析。
该检测方法通过肉眼就能观察到结果，并且成本低廉，试剂能够长时间保存。工作人员无需借助先进的检测设备就能完成定性或定量分析。因此，这是一种极易推广与普及的检测技术。但是ELISA的不足之处在于一种试剂只能检测一种农药，而果蔬中往往残留了数种农药，难以完全检测出来。
红外光谱法
近红外光谱法：这是一种无损检测技术，对人工配制的农药样品需要进一步检测，防止检测过程中样品受到破坏。此法存在诸多缺陷，检测灵敏度不高，误差大，不易建立起合理的模型。即使完成模型构建后仍需不断修正，消除干扰因素。同时，此法无法检测散性样品或痕量样品。
中红外光谱法：与近红外光谱法相比，此法分子振动的基频信号更强，可获取更多的信息。同时，还能与其它多种不同的分析设备联合使用，提高检测准确性。不足之处在于生成的图谱非常复杂，解析难度大，定量分析比较困难。
纳米金技术
纳米金是指直径为1～100nm的微小金颗粒，能够与多种生物大分子相结合，且不会对其生物活性产生影响。纳米金作为显微镜示终物，被广泛用于各类检测技术中，如免疫印记技术、免疫层析技术、流式细胞仪、斑点金免疫渗滤测定技术等。因此，纳米金技术又被称为现代四大标记技术之一，其标记原理是球形状的纳米金颗粒具有极强的吸附性，能够将蛋白质等高分子吸附到自身表面，逐步将自身包被起来。
篇8
【摘要】：随着基因药物、药用辅料、新装置和新的给药技术的发展，脂质体、微球、微囊、纳米球、抗体等作为局部或全身性药物的载体进行肺部给药日益受到重视。
【关键词】：脂质体、微球、微囊、纳米球、抗体
1脂质体脂质体是磷脂质分子在水溶液中排列成封闭式多双分层小球状新型药物载体， 也称类脂小球或人工细胞。脂质体由于对各种化合物的高负荷能力而作为潜在的药物或基因的载体具有多个方面优点被广泛用于肺部给药，包括增溶，缓释，细胞及细胞内定位，减低毒性和促进吸收。[1-5]一些研究结果表明脂质体应用于肺部给药是安全的、有效的，Juliano and Mc Cullough [6]研究包裹在脂质体内的阿糖胞苷，其半衰期是原来的12倍，景恒翠等人[7]制备的穿心莲内酯脂质体在肺部有良好的靶向性。影响脂质体肺靶向给药的因素，粒子大小和表面电荷，直径4-7 μm的大粒子沉积在大气道，直径1-3μm的小粒子沉积在小气道和肺内，通常不带电的中性脂质体比携带正、负电荷的脂质体容易分布在肺内，然而中性脂质体具有非零的Z -电位的离子强度，吸收阴离子或阳离子，导致轻微的负或正的Z -电位[9]。宋金春等人[8]研究的肺靶向羟基喜树碱阳离子脂质体的制备也为肺部肿瘤化疗提供了一个良好的制剂方案。脂质体在感染治疗中的应用，治疗肺部感染所造成的各种病原体是一项艰巨的任务，这是因为药物溶解度（大多数用于治疗肺部感染的药物是疏水性），毒性药物（不溶性药物沉积在肺部造成毒性），以及肺局部化（针对特定领域的肺癌）问题，利用脂质体作为药物载体的克服这些问题。若干项研究进行了测试的安全性和有效性利用脂质体作为药物缓释剂或药物载体[10]。Chimote and Banerjee 研究制备抗结核药利福平，异烟肼和乙胺丁醇的脂质体。肺癌是常见的原发性和转移性恶性疾病。主要是由于诊断晚，肺肿瘤治疗方法一般是减少手术。全身化疗，吸入治疗肺恶性肿瘤已在最近几年的开展研究。巨噬细胞靶向药物和治疗肺动脉高压的肺脂质体靶向药物也引起许多专家的研究。在过去的20年中，脂质体已被应用在肺部给药。在这一领域的研究具有优势，脂质体为载体，第一个和最重要的原因是他们的化学相似的肺表面活性剂。其他包括能够溶解难溶性药物的能力，提供持续释放能力，促进肺泡巨噬细胞，并避免局部刺激肺组织的优点。缺点是其形成稳定骨架的寿命和其雾化后的稳定性。
2微球微球是一种由天然和合成多聚体组成的，粒子大小< 200 μm的球形离子，微球属于基质型骨架微粒，可以包载一种或多种药物，并具有靶向作用的特点。静脉注射的微球，在体内的分布首先取决于微球粒径的大小。通常小于7μm的微球被肝脾中的巨噬细胞摄取；大于7μm-15μm时则被肺部的最小毛细血管床以机械滤过的方式截留。Makino等制备聚苯乙烯微球，研究影响巨噬细胞吞噬摄取能力的微球的大小和表面特性的因素，研究结果显示聚苯乙烯微球比羧基微球更有效的被肺泡巨噬细胞吞噬和摄取。赵志娟、丁红等人对肺靶向阿霉素微球的体外释放度的测定方法的建立，为抗肿瘤治疗提供了良好的研究基础。微球作为载体应用于多种疾病的治疗，首先，抗肿瘤药物，顺铂、卡铂、多西紫杉醇的微球的制备被广泛研究，这些研究结果表明这些药物的微球制剂在肺部拥有理想的浓度，能达到有效的靶向作用。同时还有大量的研究集中在肺部吸入药和抗结核药的微球制备。
3纳米粒纳米粒是在200-300nm范围大小的固态胶体微粒。目前，纳米给药系统多应用于肺癌的治疗，该类型的纳米粒子在研究癌症的治疗应用包括聚合物纳米微粒、胶束、蛋白质纳米粒子、陶瓷纳米粒子、纳米病毒和金属纳米粒，这些功能性纳米微粒提供一个不被血清蛋白粘附的稳定表面，特别时亲水聚合物，可降低网状内皮系统的清除。明胶纳米粒子是基于人血清蛋白的纳米粒子，因此这类粒子适合作为药物载体用于人呼吸道上皮细胞的基因治疗，但是多烷基聚合物的纳米粒子对呼吸道上皮细胞有细胞毒性，它的的毒性主要依赖于烷基链的长度，短链比长链毒性大。纳米气溶胶具有可生物降解的核心，能有效地分布在肺部基因中，带有负电荷的纳米气溶胶比其他带有正电荷的纳米粒子低毒，因为它能表现出与细胞凋亡中产生的潜在负电荷的细胞膜减少的接触。蛋白质纳米粒子用于肺癌的基因治疗，在包载胰岛素形成的纳米粒子对控制血糖也有显著的优势，可延长降糖作用达20-48h。蛋白质纳米粒子还可以封装降钙素，能有效降低豚鼠血钙浓度长达24h。
4.微囊微囊是基于非离子表面活性剂的单层和多层囊泡，是药物载体的一种。一项研究显示在肺癌小鼠治疗中直径为3.72μm的卡铂微囊能提高治疗效果和减少副作用[11]。还有研究结果证实顺铂微囊拥有显著的抗肺部肿瘤次生长活性，比单独应用顺铂毒性低。在抗结核药物方面，直径8 -- 15 μm的利福平微囊，经大鼠口服后65%的药物肺部在肺部。
结论：
脂质体、微球、微囊、纳米球、抗体等微载体给药系统在肺靶向给药起着重要作用，载体能向肺部提供持续的药物，延长给药时间，减少给药剂量，提高患者的依从性和减少高毒性药物的不良反应。最近，生物活性分子例如载体表面结合的抗体提供了肺部靶向给药的一个良好的平台。然而，研究清楚的证明了受体在肺部高表达，还需要证实这样的受体不仅在肺部，在肺的细支气管和肺泡也有其靶向作用。我们应进一步研究长期应用的安全性，对每一个微载体的毒理学和毒代动力学的研究和这些药物的临床应用的研究。肺靶向给药系统的载体研究前景广阔。
参考文献
篇9
关键词 抗肿瘤药物 靶向制剂 进展
脂质体(LIPOSOME)
传统脂质体：①Dauno Xome：系柔红霉素脂质体制剂，由二硬脂酰(DSPC)与胆固酸组成靶向药物传递系统(SUVS)，临床研究证明，脂质体与游离柔红霉素相比，疗效明显增加且毒性降低。②Caelyx：系盐酸多柔比星的立体稳定型脂质体，表面含亲水性的甲氧基聚乙二醇(MPEG)，包封层可延长脂质体在血液中停留时间，在人体中的半衰期为55小时，而游离药物可在几分钟内分布至各组织，并在24小时内从体循环中完全清除。脂质体骨架和内在的缓冲体系使多柔比星完全被包封而使药物不能游离，不良反应低。③Onco Tcs即长春新碱脂质体：以载体系统(TCS)传递，将药物传递至病灶，并以高浓度进入疾病细胞，其作用时间较长，能使对原先化疗无效的晚期非霍奇金淋巴瘤(NH)病人的肿瘤明显缩小，Ⅱ期临床研究结果表明，使用本品治疗评估的NH病人总有效率为45%。
他莫昔芬传递体：是指具有高度变形能力，并能以皮肤水化压力动力，高效穿透比自身小数倍孔道的类脂聚集体。将他莫昔芬制成传递体后，药物主要蓄积于皮肤，对皮肤的穿透率大于普通脂质体，取得了令人满意的结果。
基因药物脂质体：基因脂质体制剂能够将治疗基因导向作用部位，保护DNA或RNA免于灭活或降解，在体内有较高的转染率，与细胞融合后，即被降解，不良反应小。将DNA-脂质体复合物引入皮下肿瘤中，转移的基因表达并定位在注射部位，未见明显的毒性或抗DNA抗体。
自1978年Zamecnik 等首次证明，特异互补的寡核苷酸在体外能有效抑制Rous肉瘤病毒(RSL)的增殖以来，反义寡核苷酸引起人们的广泛兴趣。随着快速基因克隆及自动DNA合成技术的出现，反义核苷酸的研究有了迅猛发展：作用于PKC-α基因的反义化合物ISIS-3521正处于Ⅱ期临床试验阶段，其作用靶点是c-raf激酶，可用于治疗前列腺癌、卵巢癌等。用于治疗晚期黑色素瘤的靶向c-raf基因和靶向bcl-α基因正处于临床研究阶段。但反义核苷酸易受酶的攻击而降解，因此对核酸酶不稳定；另外其摄取率及转运特异性亟待解决，因此抗体导向的反义寡核苷酸的靶向转运成为另一研究方向[1]。
毫微粒和毫微囊
长循环毫微粒：长循环毫微粒即静脉注射给药后，能够躲避网状内皮系统(MPS)的摄取，而在血液循环系统中长时间滞留的毫微粒。作为抗肿瘤制剂，它的最大特点就是具有克服多向性药物耐受性的能力。而且Grislain 等通过实验证明了，聚氰丙烯异丁脂毫微粒具有对肺肿瘤组织的通过性，并认为经过修饰，可降低由于普通毫微粒(NP)在MPS系统的蓄积而造成的抗肿瘤药物对NPS的毒性，但这种应用尚存疑问。宋存先等证明载药的NP制剂能作为血管内靶向定位[2]。
固体脂质纳米粒(SLN)：固体脂质纳米粒是将固态的天然或合成的类脂药物包封于类脂核中制成的，具有控制药物释放，避免药物降解或泄露，以及良好的靶向性等特点。喜树碱(CA)的SLN口服给药后，与CA溶液剂相比，在观察的各器官中，CA的AUC和MTR均有显著提高，其中脑中AUC提高尤其明显，说明SLN作为缓释靶向制剂具有广阔的应用前景。
其他抗肿瘤药物NP制剂：阿霉素A的聚氰基丙烯酸异丁酯NP的体外抗肝细胞瘤效果均明显优于游离的阿霉素A。另外，吸附于聚氰基烯酸烷基酯纳米粒子上的寡核苷酸，已被证实提高了其对核酸酶的稳定性，并形成了更理想的细胞定位。体内和体外实验均证明，把亲脂性免疫调节剂制成NP，其抗转移瘤比游离态制剂更有效，中药提取物紫杉醇毫微球作为热点之一正在研究阶段。
磁性药物制剂
磁性药物制剂是近年来国内外大力研究的一种新的靶向制剂，其中抗肿瘤药物微球研究得最多。这种磁性微球在体外磁场的作用下，在肿瘤部位滞留，定向释放药物，可以减少用药剂量，提高靶区药物浓度，减少血液循环中药物分布，对肝、脾、肾等器官损害较小。
王氏[3]等用含平阳霉素、甲氨喋呤、阿霉素、丝裂霉素的磁性微球，对58例不同类型的食管癌、口腔癌、直肠癌、舌癌的患者进行了治疗，结果完全缓解22.4%，部分缓解67.2%，总有效率为89.7%。
现已制备的抗肿瘤磁性微球还有：丝裂霉素C、两性霉素B、氟尿嘧啶、肝素、博来霉素等。阿霉素磁性微球是目前研究得最多的抗肿瘤制剂，动物实验证明，该制剂有非常好的靶向性及对肿瘤细胞的杀伤性，但同时也使实验动物体重降低，出现肝、肾组织坏死等症状。虽然磁性微球的剂型仅限于水溶性制剂且存在许多如肝、肾组织毒性等问题尚待解决，但其在离表皮较近的如乳腺癌、膀胱癌、食道癌、皮肤癌等的治疗方面已显出优越性。
微 球
微球作为抗肿瘤药物靶向载体的研究非常引人注目，其中用于肝动脉栓塞的研究较为成熟，已进入临床治疗阶段。白蛋白最主要的应用是将其作为抗肿瘤药物载体，使其疗效提高，不良反应减小。它是以白蛋白为载体，包封或吸附药物，以过固化分离而形成的实心球体，与脂质体和乳剂相比，具有在体内贮存时稳定性好的优点。用白蛋白包封研究的抗癌药已有阿霉素、5-氟尿嘧啶、巯基嘌呤、博来霉素、甲氨蝶呤、长春花碱酰胺硫酸盐等。
抗体靶向酶-前药制剂
该类制剂系指将特异性抗体-酶交联物注入体内，使其与肿瘤细胞表面抗原特异性结合，然后再注入毒性较低的前药，此时结合在肿瘤细胞上的酶特异性地将前药转化成活性药物，作用于肿瘤细胞。该制剂选择性高、局部药物浓度大，毒性相对较低。利用基因工程技术制备的人源化抗体，保存了靶向性的同时又较传统方法制备的鼠源性单抗引起的人抗鼠抗体反应轻，疗效好。常用的活性前药有苯甲酸氮芥、苯酚氮芥、甲氨蝶呤、阿霉素、美德伦、沙海葵素、苯胺氮芥、长春花碱、紫杉醇、柔红霉素、5-FU、表柔比星、足叶乙苷丝裂霉素C、丝裂霉素、氰化物、羟基衍生物等。虽然抗体靶向酶-前药制剂疗效较好，但也存在免疫学和药理学方面的一些缺陷，目前正处于临床前或临床研究阶段。
抗体制剂
首个上市治疗肿瘤的单克隆抗体是1997年经FDA批准的Rituximab(商品名Rituxan)，它是一种靶向B细胞CD20的小鼠人嵌合抗体，用于治疗复发或难治性低度或滤泡型非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；另外，Bexxar 和Zexxar也是治疗该瘤的单抗。首个新抗体靶向化疗药Mylotarg 是一种靶向细胞表面蛋白CD33抗体，用于治疗首次复发的急性髓细胞性白血病(AML)。1999年批准上市的Ontak用于治疗肢体软组织瘤。
治疗癌症疫苗
肿瘤相关抗原能激发特异性的肿瘤应答，并作为癌症疫苗的靶点。全球第一个黑色素治疗疫苗已在加拿大批准上市，M-Vax也成为2000年首个进入澳大利亚市场的黑素瘤疫苗，使用乳腺癌和结肠癌胚抗原(CEA)的疫苗正在研究中。生长因子受体ErbB-2/neu也拟用于乳腺癌和卵巢癌，用于治疗前列腺癌的研究性疫苗PROSTVAC VF进入了Ⅱ期临床，SnET2(GM2神经节苷酯)疫苗已进入Ⅲ期临床试验，对直肠癌、胃癌、及小细胞癌有效。
参考文献
1 邹宗亮，王升启，王志清.靶向技术在反义寡核苷酸中的应用.国外医学・药学分册，2000，27(5)：260-264.
篇10
1实验步骤
1.1CSN的制备采用油包水的反相微乳液法合成CSN[11]。通过正硅酸乙酯(TEOS)的水解和缩聚反应，并以TritonX-100、正己醇、环己烷分别为表面活性剂、助表面活性剂和有机溶剂，氨水作为催化剂，制备二氧化硅纳米微球；为合成彩色微球，在反应过程中分别加入活性大红3G、活性橙黄X-GN、活性蓝绿(活性翠兰KN-G与活性嫩黄4GLN按1∶1调配)等有机活性染料各150μL；为消除二氧化硅纳米微球之间的团聚，加入20μL硅烷偶联剂KH-550在微球表面引入氨基，增大表面电位以促进微球之间的分散度，形成单分散彩色微球。连续反应48h后用丙酮破乳、离心并收集颗粒，将得到的CSN分散在5mL超纯水中备用。
1.2CSN的粒径和形貌表征采用场发射扫描电镜SU-70和Nano2S激光粒度电位仪对各参数下制备的二氧化硅纳米微球的粒径和形貌进行表征。
1.3CSN的活化将合成的CSN用超纯水清洗三次，分散到20mL水中超声10min使微球均匀分散，分别加入1.4mL冰乙酸和0.2mL的APTE搅拌均匀后持续震荡反应1h。将反应后的微球用水清洗3次，分散到10mL琥珀酸酐和DMF的混合溶液中在通氮气条件下持续振荡反应5h，离心、清洗后即可得到富含羧基的活性微球，将其4℃条件下保存备用。
1.4ICSN的制备及反应原理配制pH6.8浓度为0.1mol/L的吗啉乙磺酸缓冲液(MES)，在5mLMES缓冲液中分别加入500mg的N-羟基丁二酰亚胺和500mg的DEHE，加入活化后的CSN室温下反应1h。离心后得到的微球分散到pH7.3浓度0.1mol/LPBS中。取10mL分散的活化微球与10μLE.sakazakii凝集抗体，室温下孵育4h，用PBS清洗、离心后得到ICSN，分散到5mLPBS中，4℃条件下保存备用。
1.5制备抗原制取一定浓度的E.sakazakii菌液，将其用0.4%甲醛溶液灭活，并进行灭活检测，确定灭活后稀释成所需浓度。
1.6不同ICSN凝集试验将不同颜色的ICSN各10μL分别与等量的待测抗原滴加在洁净的凹圆载玻片上，混匀至抗原抗体充分反应，在1min～3min内观察凝集现象，同时设阴性对照，除特别说明以外的其它凝集反应均在室温(22℃±2℃)下进行。
1.7ICSN的特异性将标记E.sakazakii抗体的ICSN分别与浓度相同的E.sakazakii、S.pullorum&gallinarum、E.coli、S.flexneri进行凝集试验，用生理盐水做阴性对照，观察凝集现象。
1.8ICSN的敏感性用ICSN分别与浓度为6×101cfu/mL～6×109cfu/mL的E.sakazakii进行凝集试验，并以生理盐水为阴性对照，观察凝集效果，评价其敏感性。
1.9凝集反应最适温度的选择取10μL蓝色ICSN与10μLE.sakazakii，分别在温度为0℃、22℃、37℃、45℃和60℃条件下进行凝集反应，观察凝集效果，以确定出现明显凝集现象的最适温度。
1.10稳定性将制备的ICSN在4℃条件下放置30d，而后取出室温放置，使其温度达到室温，观察与E.sakazakii的凝集效果，测其储存稳定性。
2结果
2.1CSN的制备研制的单分散彩色二氧化硅纳米活性微球如图2所示。图2A为活性大红3G、活性橙黄X-GN、活性嫩黄4GLN、活性绿(活性翠兰KN-G与活性嫩黄4GLN按1∶1调配)、活性翠兰KN-G、活性芷青GD和活性紫KN-4R染色后的7种颜色的CSN；图2B为合成的CSN的扫描电镜图，由图可知，这些彩色微球的形状规则、大小均一(约70μm)、表面光滑并且具有较好的分散性。
2.2ICSN凝集试验分别用蓝色、黄色和红色3种颜色的ICSN与E.sakazakii菌悬液进行凝集反应，反应结果如图3所示。以3种不同颜色的ICSN分别与E.sakazakii的玻片凝集反应，在1min～3min均出现明显的团状或絮状凝集现象，液滴变得澄清，凝集现象醒目、直观及易于判别(图3A、B、C)。表明ICSN具有很好的免疫凝集特性，并且3种不同颜色的ICSN均具有同样良好的凝集效果，即不同种颜色有机活性染料对ICSN与抗原的凝集反应过程均无可见影响，染料只起显色、醒目的效果。而在ICSN中加入生理盐水可以观察到微球均匀分散在液滴中，无任何凝集块出现，表明包被抗体的ICSN既不与生理盐水发生反应，也无自凝现象。
2.3ICSN的特异性为考察基于ICSN的新型凝集试验的特异性，本研究选用了3种常见致病菌分别与E.sakazakii修饰的ICSN进行凝集试验，并以生理盐水为阴性对照，结果显示，标记E.sakazakii抗体的蓝色ICSN仅与E.sakazakii发生凝集反应，与S.pullorum&S.gallinarum、E.coli、S.flexneri均未发生凝集，用生理盐水做阴性对照，表明ICSN具有良好的特异性。
2.4ICSN敏感性测定采用蓝色ICSN与不同浓度E.sakazakii菌液的凝集结果显示，当菌液浓度为6×109cfu/mL和6×108cfu/mL时，出现粗大凝集块，液滴澄清，凝集现象清晰、醒目，凝集结果判定为++++；当菌液浓度为6×107cfu/mL和6×106cfu/mL时，出现粗大凝集块，液滴有少量浑浊，凝集现象清晰醒目，判定为+++；当菌液浓度为6×105cfu/mL、6×104cfu/mL和6×103cfu/mL时，出现较明显的凝集块，液滴较浑浊，判定为++；当菌液浓度为6×102cfu/mL时，显示肉眼可见的轻微凝集现象出现，液滴浑浊，凝集结果判定为±；浓度为6×101cfu/mL的菌液和生理盐水中未观察到凝集现象(图5)。结果表明，ICSN具有较好的灵敏度，对E.sakazakii的检测范围为6×103cfu/mL～6×109cfu/mL。
2.5凝集反应最适温度的选择凝集试验是基于抗原与抗体之间的特异性反应，其中抗体的活性是凝集试验的效果好坏的关键，在各种因素中反应温度对抗体活性的影响较为明显(图6)。图6结果显示，22℃～37℃的条件下，ICSN与E.sakazakii最先发生明显的凝集反应，出现凝集现象较快，仅为20s～30s，凝集效果清晰、醒目，并且该温度接近室温，便于操作，因此选择22℃～37℃为最佳凝集反应温度。当温度为45℃和60℃时，凝集现象依次减弱，这与常规凝集试验相同。
2.6稳定性试验4℃放置30d后的3种颜色的ICSN的凝集效果与储存前无显著差异，表明ICSN的稳定性好。
3讨论
