不同微生物菌落特征范文

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关键词：烧烤 微生物 大中型餐厅 小型摊位 污染

中图分类号：R155 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）02-0016-02

“民以食为天，食以洁为先”，食品安全是关系到国计民生的大事[1]。随着经济社会不断进步，人们生活水平的日益增长，人们的饮食种类也越来越多样化，食品的安全问题也随之而来。在食品安全问题中，由于微生物污染所造成的食源性疾病依旧是世界食品安全中最为突出和最为关注的问题，而食品微生物检测是评价食品品质的重要方法之一[2]。按照我国食品卫生标准的规定，绝大多数食品均需要测定菌落总数、大肠菌群、致病菌等微生物指标以评价其卫生状况[3-6]。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。大肠菌群指的是需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，来自于人和温血动物的肠道，直接或间接地来自人和温血动物的粪便，是粪便污染的指示菌，在微生物检测中常见菌落总数很高，但大肠菌数很低的情况。沙门氏菌广泛存在于自然界中，是引起全球人类食物中毒的主要原因之一，在我国细菌性食物中毒的病原菌中约40%为沙门氏菌[7， 8]。近年来，金黄色葡萄球菌所引起的食物中毒日益成为全球性的公共卫生问题，严重危害人类安全与健康[9]。

烧烤，这种人类最原始的烹调方式，逐渐成为受人欢迎的多人聚会休闲娱乐方式。然而烧烤这种食品存在着安全问题，烧烤食材在加工、贮藏、运输等过程中很容易受到微生物污染。烧烤食品包括多种肉类、水产品类等。各类食材自身可能存在不同种类和不同程度的微生物，并且在食材的保存及制作过程中也可能由于操作不当容易造成交叉污染。畜禽在屠宰前若受到微生物感染，其病原微生物在体内可直接污染鲜肉，而在屠宰、加工等过程中鲜肉也可能受到微生物污染。在一般情况下，含水量高的水产类比肉类更容易受到微生物污染[10]，而且像生鲜肉类等食材在贮藏、销售环节中，条件的不适宜也容易造成微生物的滋生；除原料自身的微生物污染以外，烧烤食品的加工处理过程是否规范、经营场所卫生条件是否符合标准、市场监管是否到位等对其卫生状况及质量安全的影响也十分重要。本文通过对不同种类的烧烤食品的微生物污染状况进行分析研究，分析主要的不合格原因，寻找防止烧烤食品微生物的关键环节，为加强食品卫生管理提供科学依据，以保障广大消费者的身体健康。

1 材料与方法

1.1 样品来源

样品来自长沙市烧烤餐厅及小型烧烤摊点，共购买采集样品800份。其中，取自烧烤餐厅的样品400份，小型烧烤摊点样品400份，其中每份中都包括多种水产品类、多种鲜肉类。

1.2 采样

用无菌采样夹将样品放入无菌采样袋内，再将无菌袋放入到有冰袋的采样箱中，2h内送回实验室；部分室温储藏，部分放入冰箱冷藏，以保证与初始储藏条件一致。

1.3 样品检测

分别按照GB/T 4789.2-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》测定、GB/T4789.3-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验 大肠菌群计数》、GB/T4789.10-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》、GB/T4789.4-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》和Filmplate测试片法对所采样品进行检测。

2 数据处理

实验数据是通过sigmaplot11.0软件进行统计分析，2种经营场所各种菌类合格率的比较用Duncan's methods单因素方法进行统计分析；*代表着两种结果对比有显著性差异，**表示两种结果对比有极显著性差异。通过使用Excel软件对比较结果进行作图。

3 结果与分析

3.1 菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌的检测结果

按照GB2726-2005《熟肉制品卫生标准》，GB29921-2013《食品安全国家标准 食品中致病菌限量》对烧烤食品进行比对分析[11-12]。2类经营场所中大中型烧烤餐厅中的食品合格率高些，菌落总数、大肠菌群、金黄色葡糖球菌的合格率分别为78.75%，89.75%，93.5%（表1）。而小型烧烤摊点出售的肉类和水产品类样品合格率比较低，微生物污染状况严重。此外，从小型烧烤摊点采集的样品中，肉类和水产类的菌落总数、大肠菌群、金黄色葡糖球菌的合格率分别为69.5%，75.5%，82.5%（表2）。通过统计分析可知：小型烧烤摊位食品的微生物污染程度显著高于大中型烧烤餐厅（图1）。

3.2 沙门菌检测结果

本实验按照国标法分离出疑似沙门菌10株，接种到三糖铁琼脂得到疑似沙门菌9株，经过进一步生化及血清学实验，结果不足以判定为沙门氏菌。用Filmplate测试片法将分离的疑似沙门菌在（36±1）℃培养15-24h后未发现紫红色菌落。同种样品沙门菌Filmplate测试片的检测结果与国标方法一致。

4 讨论

按照现行各类食品的国家卫生标准和国家安全标准，菌落总数、大肠菌群、致病菌3个指标中任何一个指标不合格均判定为不合格样品。本实验结果表明：大中型烧烤餐厅中的肉类和水产类食品，菌落总数的合格率为78.75%，并且通过检测我们还发现大肠菌群、金黄色葡萄球菌存在超标现象。说明大中型烧烤餐厅的肉类食品存在着微生物污染问题。此外我们通过对小型烧烤摊位的烧烤食品进行检测发现：小型烧烤摊位中肉类和水产类食品中大肠菌群、金黄色葡萄球菌的合格率均低于80%，而且其中的菌落总数合格率仅为69.5%。这表明小型烧烤摊位肉类和水产类食品存在严重的微生物超标。我们推测造成烧烤食品不合格的主要原因是：由于烧烤这类食品在生产加工后没有包装，食品暴露在污浊的空气中，与外界直接接触极易受到环境中微生物的污染[13]，尤其是一些小型烧烤摊位的摊点设在人流量较大的地方，因此受到的影响更为严重。其次烧烤食品的各类原料由于其性质和加工过程不一样，所以在食品加工制造和储运过程中也易造成微生物污染[14]，其次在制备不同种类的食材时，没有注意及时的洗刷砧板，换工具等原因造成了二次污染。除此之外，烧烤食品中各种肉类和水产类由于其自身营养成分含量较高，也有利于微生物生长繁殖[15]。在本次检测中小型烧烤摊点样品大肠菌群超标率24.5%，故其存在肠道致病菌的可能性极大，其引起食源性疾病发生的潜在安全隐患不容忽视。

从菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌的检测结果可以看出，大中型烧烤餐厅的微生物污染状况整体好于小型烧烤摊点类。这可能是因为：大中型烧烤餐厅的肉类，水产类的食材来源可靠，食品质量卫生条件好；其次食材的贮藏，制作过程中条件有保障，还有就是大中型烧烤餐厅的环境卫生也优于小型烧烤摊位。表明正规经营场所、有力监管是食品质量安全的保障。大型经营烧烤餐厅的低温冷藏设施条件基本完善，可以有效减缓细菌增值速度，且食具合格率高。但小型摊点类卫生状况较差，食具、食材暴露在空气中，大部分没有冰柜冷藏食物，就餐者没有安全感，应是监督管理、检测的重点。

在对样品进行沙门氏菌检测时，每一批次样品用国标法检测大约需要7d，而用Filmplate测试片只需要1d，且测试片灵敏度高，在1.5 X 10-8稀释时仍可计算出菌落；另外，Filmplate测试片的阳性检出率高于分离培养法1.84‰，复查准确率提高12%。因此，用Filmplate测试片检测沙门氏菌更准确、快捷。在本研究中沙门氏菌检测结果为阴性，可能与单类食品的样品数相对较少有关。如果增加取样次数及取样数量，可能更能够显示烧烤食品沙门氏菌污染的真实状况。

5 结语

本实验数据显示，不论是大中型的烧烤餐厅还是小型烧烤摊点的烧烤食品均有部分样品的微生物指标超出国家食品安全卫生标准。其中，菌落总数检测显示，在2种经营场所中，大中型烧烤餐厅的菌落总数的不合格率为78.75%；从小型烧烤摊点采集的肉类、水产类的样品中，微生物污染均较为严重，菌落总数的合格率低于70%，小型摊点的经营方式使得烧烤食品无论菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌均比大中型餐厅的样品污染更为严重。因此，在食用烧烤食品时最好选择大中型经营餐厅，并且卫生条件要好的。同时，应对工作人员加强卫生知识教育，督促其规范操作，以减少污染，保障消费者健康。

参考文献

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关键词：微生物多糖；产多糖菌株；发酵条件优化

1 概述

多糖是一类天然大分子物质，由于具备优良的生物活性，大量的活性基团，因此在众多研究领域有广泛的应用[1][2][3]。微生物多糖是由微生物在发酵过程中产生，具备各种不同的生物活性，已经在抗肿瘤，抗感染以及石油化工等领域有了诸多的应用，并可以作为各种化学品，如絮凝剂，保鲜剂等在食品、医药、化工领域等发挥作用[4][5]。从海洋中筛选获得产多糖微生物，目前也是产多糖微生物研究领域的研究热点，在本课题中，以海水和秦皇岛海域野生海藻进行取样，筛选出产多糖的海洋微生物，并对该产多糖微生物的多糖发酵条件进行研究，获得最佳的发酵条件，为多糖微生物的筛选及发酵研究提供了新的研究思路。

2 材料与方法

2.1 培养基

筛选固体培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L。

摇瓶液体培养基：蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，K2HPO3 2g/L。

2.2 试验方法

2.2.1 产多糖菌的筛选

从海水及海藻取样。各自称量约10g海水和海藻块，溶解于无菌水中，磁力搅拌作用得到菌悬液。分别标记为A和B。吸取稀释液均匀涂布到已经灭菌的筛选固体培养基上，进行培养。观察菌落形态，选择粘稠菌落进行划线分离纯化保藏。将活化后的菌种接种到液体摇瓶培养基中，转速为150r/min，震荡培养48小时，选择胞外多糖含量最大的菌种为后续研究菌种。

2.2.2 产多糖菌的发酵实验

设定不同的发酵温度，接种量，培养时间，确定最佳发酵条件。

2.2.3 胞外多糖含量的测定：

苯酚硫酸法[6]

2.2.4 菌株生理特征分析：

方法对照手册。

3 结果与讨论

3.1 产多糖菌的筛选

经过前期的培养实验，挑选不同菌落并进行划线分离培养后，本次试验分离纯化出6株菌落粘稠且不同形态的菌种。他们的培养基编号分别是A1号、B1号、B2号、A3号、B3号、B4号。并通过摇瓶发酵，取出发酵液进行观察。经苯酚硫酸法测定后，B1的多糖产率最高，为后续研究菌种。

3.2 菌种生理特征

分析显示B1为革兰氏阳性菌，淀粉水解试验阳性，V-P试验阴性，柠檬酸盐实验阴性，油脂水解实验阴性。

3.3 发酵条件优化

对产多糖菌B1的发酵条件进行优化，以期达到最佳的发酵效果和最大的多糖产量。

本课题中采用的是恒温发酵过程，选择不同的发酵温度，并判断其对产多糖效果的影响，20℃多糖产量为0.77g/L，25℃多糖产量为0.94g/L，30℃多糖产量为0.82g/L，35℃多糖产量为0.71g/L，40℃多糖产量为0.52g/L，多糖产量随着发酵温度的升高，先增加后减少，且当发酵温度为25℃时，多糖产量达到最高，温度高于30℃后，多糖产量明显下降。在最佳的发酵温度条件下，选择不同的接种量，判断海洋产多糖微生物发酵产量随接种量的变化规律，2%接种量时，多糖产量为0.88g/L；5%接种量时，多糖产量为0.94g/L；8%接种量多糖产量为0.76g/L；10%接种量时，多糖产量为0.75g/L；15%接种量时，多糖产量为0.7g/L。接种量为5%时，多糖产率最高，接种量继续增加，多糖的产量有所下降。在确定发酵温度和发酵接种量的基础之上，对发酵时间进行研究。24小时，产物浓度为0.47g/L，发酵产物的浓度随在48小时达到最高为1.04g/L，而发酵36小时的产物浓度为0.94g/L，基本接近最高值，考虑到发酵时间的优化，最终确定发酵36小时为最佳的发酵时间。

4 结束语

本课题筛选一株能产生多糖的海洋微生物B1，对B1菌进行了生理生化特征分析，且对其发酵条件进行了研究，为进一步的应用研究提供了一定的理论基础。

参考文献

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[3]吴东儒.糖类的生物化学[M].北京：高等教育出版社，1987.

[4]郭守东.微生物胞外多糖的结构及其抗氧化活性研究[D].中国海洋大学，2010

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微生物限度检查法及其方法验证的主要特点在于检验对象本身的特殊性。其特殊性为：（1）能繁殖的活细胞生物。该活细胞处于不稳定状态，可随存放时间延长而亡，也可在适宜条件下大量繁殖。而检测条件的状况不一可使其生长情况各异，因而常出现同批样品在不同条件下检测，有不同的结果。但在保存条件相对稳定时，微生物在一定时间内处于动态平衡，在标准化的条件下操作结果仍可予与正确评估。（2）不确定性。药品受微生物的污染，其种类可以多样，污染情况依生产、设备、原料、管理、剂型等条件而定，非药品本身固有。被污染批次中的不合格品是一个随机变量。（3）分布的不均匀性。这种不均匀性源于污染源的复杂性，如原辅料污染，工艺污染，空间污染和操作人员污染。再者，微生物具有簇团性，簇团大小，紧密程度是可遗传的，簇团的分散性差异极大，该特点无疑强化了不均匀性。

除了上述检验对象本身的特殊性外，微生物限度检查法及其方法验证程序繁琐，检验周期长，干扰因素多，容易造成检验结果误差，现将主要原因分析如下。

1 标准菌株的选择和保存不当引起的实验误差

实验中的对照菌株必须为标准菌株，其生物学特性应典型稳定，其细胞群应具有相似性和合适的培养，储存条件。如形态变异、菌落变异、耐药性变异或受损等均可使平板中细菌呈丛集、分散不均或死亡。2005版药典[1]要求所用标准菌株的传代次数不得超过五代。

实验中所用对照菌均为无芽孢杆菌，以菌液状态存活的时间都不长。有研究表明[2]，分别用0.9%无菌氯化钠溶液和氯化钠-蛋白胨缓冲液制备的不同浓度菌液，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌在3天内活菌数下降约40%，5天内下降约70%，用0.9%无菌氯化钠溶液和氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液结果无明显差异（冰箱4℃保藏）。建议采用新鲜培养物。

2 不同供试液制备方法造成的实验误差

应按供试品的理化特性与生物学特性采取适宜的方法制备供液，制备供试液时，力求均匀分散。测定结果与匀质方式及条件极为有关。如有菌，分散充分时菌落生长数多，反之则少。通常药品都有一定的pH值，分散度不同导致供试液不同的pH值而影响微生物的生长，可得到不同的实验结果。应按药典首选匀浆仪法，并注意转速和时间，确保制备均匀的供试液。转速4000 r/min，时间2分钟。试验证明[3]，对8批水丸分别用匀浆仪和振荡器处理后，测定细菌数，其结果后者比前者少一半，经统计学t检验分析，差异有显著性（P

3 培养基的影响

培养基是培养检测微生物的营养物，其质量的好坏，稳定与否直接影响检验结果。通过对电炉直火加热融化培养基及用剩余培养基包扎冷藏后融化再使用的阳性对照实验[5]，发现这两种操作对实验结果造成的误差达21%和18%。多次反复加热培养基，可使其中糖、微生物和氨基酸受破坏，影响质量。而pH值的改变影响更为严重，因各种微生物皆有其适宜生长繁殖的pH值。霉菌和酵母菌的培养基的pH是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH为中性或微碱性的注皿时温度应控制在45℃，过高细菌易受损或致死。注皿量约15 ml，厚度约4 mm，薄水分易散失，不利于微生物生长，过厚需氧菌不利于生长。

一些选择性培养基加入胆盐作为抑菌剂，抑制革兰阳性菌，使革兰阴性菌能良好生长，但有试验发现[6]，胆盐用量过大对大肠埃希菌也有抑制作用，且当加菌量较大时，革兰阳性菌也能生长。针对金黄葡萄球菌能耐高盐而其他菌无此特性，对卵黄高盐培养基中不同浓度的氯化钠作了测试[7]。结果，试验浓度均不能抑制大肠杆菌、枯草杆菌生长，其菌落数未见明显差异。而一些对大肠杆菌抑制作用较强的药品[8]，可将增菌液由胆盐乳糖改为硫乙醇酸盐，结果阳性检出率为88%，大大高于胆盐乳糖25%的检出率。应注意大肠埃希菌MUG培养基其pH值灭菌后不得过7.4，否则pH值偏高，MUG自行分解，产生荧光。

一般情况下[9]，湿热灭菌时，含有糖分的培养基温度需控制在115 ℃ 15～20分钟，不含糖分的培养基温度需控制在121 ℃15～20分钟。虎红培养基灭菌温度在10℃以内的改变，可造成检验结果判断错误[10]。

干粉培养基，易吸潮，如存放不当出现凝块，则其凝固性较差，应避免使用。试验用培养基，需经过质量鉴定，用已知典型反应菌株进行测试，其灵敏度及特征性反应应符合要求。新鲜配制的培养基应在2～20 ℃避光保存，但不得冻结，保存时间不得超过2周。分离平板在使用前应置36 ℃温箱内倒置孵育1～2小时，使其表面温暖湿润，利于分离。培养基最好现用现配。

4 计数、观察的误差

当细菌生长小而密集时，极易发生计数误差。菌落计数时应仔细观察，必要时借助放大镜或低倍显微镜观察，以排除药渣，培养基沉淀物和小气泡等的干扰。如仍难区别，可适当延长培养时间。

菌落蔓延生长成片或发生重叠影响计数。药典规定菌落如蔓延生长成片，不宜计数。这是由于平皿表面湿度过大，有利于动力菌泳动，促使菌落蔓延。某些剂型如密丸、水丸最易成片状菌。防止的方法有: 0.001%TTC琼脂法、开盖干燥法或换陶瓦盖法[11]。

不同的培养时间对计数结果的影响。样品经24小时培养后，细小菌落容易漏掉，培养48小时后，菌落变大且有很多新生菌落，培养72小时后，菌落数增加不多，但菌落明显变大。如细菌平皿有混杂的霉菌，因其生长旺盛，影响细菌的观察计数。而霉菌在培养72小时后蔓延重叠生长严重，应于培养48小时后观察标记，并且观察时应轻拿轻放，忽反复翻转，以免早期形成的孢子散落在平皿的其他部位，又萌生新的菌落，导致计数误差。

控制菌生化反应均需按照规定的试验要求进行，如大肠埃希菌、沙门菌的三糖铁琼脂斜面反应的时间应在（24±2）小时，时间过长过短，都可能出现错误结果判断。所以应在规定的培养环境下，严格遵守培养时间，以便真实的反映计数结果。

5 设备及人员的影响

微生物的生长对温度的要求也较为严格。在实际工作中尽管使用的都是恒温培养箱，但大多数的培养腔内都没有内置电扇，这样便带来温度差异/分层，这种差异带来的结果变化是显著的。

玻璃仪器、容量仪器须效验，保证取样量的一致性，特别在阳性菌加入时显得更为重要。

所用器械应洗涤干净，不残留酸碱及抑菌物质。对实验所用器具根据材料的性质，采取相应的干热灭菌、湿热灭菌或消毒剂擦拭灭菌，且灭菌时间和温度均有明确规定[1]。有实验[12]对市售的12批75%酒精用薄膜过滤法进行微生物限度检查，其中9批检出微生物，经革兰染色为阳性芽孢杆菌。经考证该浓度的乙醇均为供应商采用自制纯化水稀释高浓度医用乙醇而成。由于75%乙醇本身含有细菌，作为消毒剂就会成为新的微生物污染源，建议采用0.2 μm的疏水滤膜过滤，棉球湿热灭菌。

操作环境不合要求也会带来误差，应定期检查无菌室的空气是否符合规定。严格无菌操作，操作马虎、随便易造成供试品再污染及已污染微生物的繁殖或死亡，从而不能真实反映试验结果。

6 抽样、取样误差

微生物污染的不均匀性，势必影响试验结果[13]。遵循随机原则的概率抽样可以保证抽选出代表性较高的样本，使样品具有代表性，保证样本推论总体的可靠性。

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关键词：微生物学实验课程；教学内容；教学方法；改革

Studies and practice for reforms of microbiological experiment in teaching contents and approaches

He Xiaoqing, Li Zhiru

Beijing forestry university, Beijing, 100083, China

Abstract: In this paper we briefly describe a series of reforms and tries in teaching contents and methods on the course of microbiological experiments for students in Beijing forestry university. The overview of reforms in experimental teaching, including course contents, teaching approaches, open experiments are introduced and discussed in details.

Key words: microbiological experiments; teaching contents; teaching approaches; reforms

微生物学实验不仅是高等院校微生物学或生物技术专业的基础课，也是生命科学、医学、农学、林学等学科的基础课程[1]。实验教学是理论与实践相结合的纽带，是培养学生实验操作技能和应用技术的场所，对整个教学质量起着举足轻重的作用。一方面，学科高速发展需要现代技术；另一方面，即使基因水平的研究，也离不开微生物学的基础实验方法。自从列文虎克发现细菌以来，认识和研究微生物的方法与技术已经得到了很大发展，包括经典与现代的、个体水平与分子水平的、微生物体内与体外的等。微生物学实验教学的目的之一是使学生在有限的教学时间内掌握和了解微生物学的基本技术与方法。不同的学科领域和院校所选择的实验内容不尽相同，作为一门基础课程，其教学内容应该有一个基本的要求。我们在近几年的微生物学实验教学实践中，创新实验教学内容，并对微生物学实验课程进行重组探索。

1 实验内容的合理设置

微生物学实验是基础课程，实验内容以微生物学基础方法与技术为主。微生物实验基础内容包括：无菌操作(如接种、培养等)与无菌概念的建立，这是微生物学中最重要的基础；几大类微生物的形态特征与个体特征、微生物的基本染色方法、微生物的稀释涂布技术及微生物的生理生化特性测定等。这些基础的微生物学方法与技术作为学生必须掌握。在进行这些基础教学过程中，教师也介绍各种方法与技术的发展与趋势，启发学生创新。只有了解基础才知道“何为新”，只有掌握了基础才明确“怎样创”。近几年的微生物学实验教学内容主要包括以下几个方面：

1.1 自然环境中微生物的检测

尽管微生物的广泛存在性作为相关专业的大学生已有一定的概念，但还不深刻。在微生物学实验中，让学生自己检测实验室、学生宿舍、人体表面与体内气流、不同的水体、食品或饮用品中的微生物。一旦学生在平板上看到各种不同的菌落时，会大吃一惊，这样会留下深刻的印象。

1.2 微生物的接种与培养技术

将微生物接种在不同的培养基中进行培养，是微生物学研究与应用的基础，包括不同的接种工具、接种方法。液体、固体和半固体培养基的接种方法应掌握熟练，特别要强调严格的无菌操作与无菌概念。

1.3 微生物种类的识别

区分不同微生物的方法包括培养特征(液体与固体培养基)、生长特征(斜体、半固体等)、个体特征(显微镜下观察)以及生理生化特性。通过菌落特征识别细菌、放线菌和霉菌三大类群，个体特征主要是选择具有代表性的细菌(革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、杆菌、球菌、弧菌和螺旋菌、产鞭毛细菌等)、放线菌、酵母菌、丝状真菌及其相关的染色方法。例如革兰氏染色法、美兰染色法、死活菌染色法、鞭毛染色法、芽孢染色法等，并能正确使用显微镜观察微生物。生理生化特性的检测，重在了解不同微生物在代谢上的差异，用以进行微生物的鉴定。

1.4 微生物的生长与测定

微生物生长曲线、数量与大小的测定。生长曲线测定中平板活菌计数和光电比色法是学生应掌握的方法。

1.5 环境因素对微生物的影响

这方面主要内容包括不同物理化学与生物因素对微生物的影响。

根据重基础的原则，同时也考虑实验内容或实验方法与技术每年进行更新约25%，开放实验和综合实验分别占学时的12.5 %左右，有利于学生创造性思维的发挥。

2 不断更新实验内容，建立新的实验教学体系

2.1 更新实验内容，实验教学与理论学习有效结合

篇5

资料与方法

一般资料。本次研究所有菌种均采自某市微生物菌种保藏中心，共计15株。其中乳酸杆菌6株，双歧杆菌7株，链球菌2株。

鉴定仪器：（1）API鉴定系统、API 50 CHL板条、API 20A 板条（生产厂家：法生物梅里埃公司）；（2）RP耗材样品制备包（生产厂家：美国杜邦公司）；（3）生化管（生产厂家：杭州滨和微生物）；（4）Riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定系统（生产厂家：美国Dupont公司）；（5）Quantity One紫外成像仪、电泳仪（生产厂家：美国BioRad公司）；（6）Veritii PCR扩增仪（生产厂家：美国ABI公司），体积为50μL[2]。

鉴定试剂：（1）细菌基因组DNA提取试剂盒（生产厂家：北京天根生物）；（2）DNA Marker、PCR缓冲体系（缓冲液5μL，含MgCl2）以及rTaqDNA聚合酶（生产厂家：大连宝生物工程有限公司）0.25μL；（3）正向引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、反向引物1492R（5’-TACGGCTACCTGTTACTT-3’）各200pmol/L。

鉴定方法。染色镜检：根据《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》中乳酸菌的生化反应指标，筛选单菌落革兰染色镜检。根据《食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定》检验双歧杆菌。

API鉴定：乳酸杆菌由API 50 CHL板条进行鉴定，双歧杆菌由API 20A 板条进行鉴定。

分析法鉴定：（1）16S rRNA基因序列分析法鉴定：由DNA提取试剂盒提取单菌落细菌基因组DNA，100℃热盖，95℃持续变性1min，56℃退火30s，72℃延伸90s，PCR循环共30个；72℃延伸10min；采用1.5%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，利用紫外凝胶成像分析仪观察电泳结果，然后通过Clustalw软件对测序结果加以分析，并通过GenBank数据库行BLAST对比。（2）RiboPrinter指纹图谱分析法鉴定：将单菌落悬浮于缓冲液内，并作95℃处理，随即加入裂解液A、B 5μL，然后采用Riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定系统进行鉴定。

结果

染色镜检。鉴定结果显示，1株乳酸杆菌和1株链球菌的生化反应不符合《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》标准，但5株乳酸杆菌和1株链球菌的生化反应符合标准。6株双歧杆菌的生化反应不符合标准，仅1例完全符合。如图所示，所有菌株均为革兰阳性菌，无芽孢。

API鉴定。4株乳杆菌鉴定结果显示“类干酪乳杆菌干酪亚种”，未达到“种”水平。2株双歧杆菌鉴定结果显示“内放线菌”，未达到“属”水平；4株双歧杆菌鉴定结果显示“双歧杆菌1”，未达到“种”水平。2株乳杆菌、2株链球菌以及1株双歧杆菌鉴定结果均达到“种”水平。

分析法鉴定。16S rRNA基因序列分析法鉴定：15株中12株鉴定结果达到“种”或“亚种”水平，但3例未达到。RiboPrinter指纹图谱分析法鉴定：15株中11株鉴定结果达到“种”或“亚种”水平，3例未达到，1例未能鉴定。

讨论

《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》指出，菌株不同，其生理生化特征存在明显差异，因此本文结果显示6株双歧杆菌的生化反应不符合标准，且API鉴定结果显示15株中10株仅达到“属”水平。

篇6

【关键词】职业教育；食品质量检验；岗位能力；课程体系；教学内容

为体现以就业为导向、以能力为本位的办学方向，积极探索“食品质量检验专业与食品企业质检岗位对接、专业课程内容与检验标准对接、教学过程与检验过程对接、学历证书与食品检验工（中级）职业资格证书对接、职业教育与终身学习对接”五对接的模式，在“十二五”期间让中职食品质量检验专业培养的人才能更好地服务区域、服务行业、服务企业，我们就食品质量检验职业岗位能力调研了广西区内85家食品生产企业，食品种类涉及有：糖类（16家）、茶叶（21家）、饮料（12家）、酒（6家）、其他粮食加工品（11家）、糕点（6家）、肉制品（7家）、大米（6家）等8类，具有一定的代表性。

1. 调查结果与分析

食品质量检验职业岗位能力包括文化基础知识和专业技能两方面，其中专业技能指学生拥有感官检验基础知识、理化检验基本操作、微生物检测基本技术、某类食品出厂检验项目的检验技术、其他与食品相关的拓展知识等。

表1 毕业生具备文化基础知识比率表 单位： %

高中初中小学无要求

语文801163

数学722602

英语3234331

化学752500

物理4346011

注 ：分析表中人为设定百分比< 6O%不是很重要，60%≤百分比

1.1 文化基础知识与能力要求。

据统计，企业对检验岗位中检验员的语文、数学、英语、化学、物理等知识与能力须达到高中以上文化基础的比例分别为80%、72%、32%、75%、43%。见表1 。

1.2 专业技能要求。

1.2.1 感官检验基础知识。糖类、饮料、其他粮食加工品、肉制品、糕点、大米等食品生产企业检验岗位对感官检验基础知识与技能要求不高；酒类、茶叶类食品生产企业检验岗位对感官检验基础知识与技能要求较高，在90%以上。见表2。

表2 毕业生具备感官检验基础知识能力表 单位： %

感官检验基础知识感官敏感性（视、嗅、触、味）感官评价方法感官评价描述能力合计

糖类16126438

饮料26286464

其他粮食加工品14225647

肉制品16163439

糕点26256461

大米28164351

酒类3338101091

茶叶3640101096

1.2.2 理化检验基本操作。主要是掌握分析化学原理及应用，如标准溶液的配制、滴定分析、重量分析法的运用；熟练掌握食品检验流程：采样――制样――检验数据处理――报告。除大米、茶叶类食品的出厂检验项目不涉及滴定分析外，其它类食品均涉及，特别是糖类、其他粮食加工品、肉制品类食品的检验岗位上应用广泛，比例在76%以上。见表3。

表3 毕业生具备理化检验基本操作能力表 单位： %

分析化学原理及应用标液的配制滴定分析重量分析食品检验流程合计

糖类323081080

饮料203041064

其他粮食加工品283081076

肉制品303081078

糕点202481062

大米00101020

酒类302801068

茶叶040101060

1.2.3 微生物检测基本技术。在食品检验岗位上，对微生物检测基本技术的要求就是熟练掌握微生物学的基本实验技能和食品微生物的检验方法，如灭菌技术、生物显微镜的使用、菌落总数的测定和大肠菌群的测定等，并能通过食品微生物学的基本原理对食品进行质量控制等。除糖类、茶叶、大米类食品出厂检验项目不需要进行微生物项目检测外，其他食品均要进行微生物项目的检测，而大多数需要进行菌落总数和大肠菌群的测定。见表4。

表4 需要微生物检测基本技术的食品岗位表 单位： %

基本实验技能无菌技术显微镜的使用培养基的配制测定项目菌落大肠合计

糖类000000

饮料201010252590

其他粮食加工品2020102525100

肉制品2020102525100

糕点2020102525100

大米000000

酒类（酒精度≤20%vol露酒）2020102525100

茶叶000000

1.2.4 某类食品出厂检验项目的检验技术。食品生产出来后需经检验合格才能出厂销售，食品检验员必须具备相应检验能力和相关的资格证书，如食品检验工。各类食品出厂检验项目不同，对检验中实验仪器的使用以及实验室规则和安全防护、产品标准、检验方法、检验报告会有所不同，对检验人员综合性检验能力要求高。如表5。

表5 部分食品出厂检验项目及检验能力合格率

大米腌腊肉制品酱卤肉制品其他粮食加工品之谷物粉类制成品茶叶糕点其他酒（酒精度≤20%vol露酒）白砂糖蛋白饮料类

加工精度感官感官感官净含量净含量感官净含量感官

水分酸价菌落总数水分感官品质感官酒精度蔗糖分净含量

最大限度杂质总量过氧化值大肠菌群酸度水分水分（或果肉含水率）净含量还原糖分蛋白质

糠粉净含量净含量菌落总数粉末、碎茶菌落总数菌落总数干燥失重可溶性固形物

矿物质大肠菌群茶梗大肠菌群大肠菌群电导灰分菌落总数

带壳稗粒非茶类夹杂物馅料含量总糖色值大肠菌群

稻谷粒滴定酸粒度商业无菌

色泽、气味、口味甲醇浑浊度

杂醇油不容于水杂质

合计检验项目844566997

检验能力合格率364340687860405246

1.2.5 其他与食品相关的拓展知识。食品质量管理原理及实践在300人以上食品企业应用广泛；食品添加剂应用基础知识在100人左右食品企业应用广泛；食品检验实验室建设及管理知识在10人以下小型企业广受欢迎；食品生产许可认证知识在各类型食品企业均需要。如表 6。

表6 毕业生具备与食品相关的拓展知识需求表 单位： %

企业规模食品质量管理原理及实践食品添加剂应用基础知识食品检验实验室建设及管理食品生产许可认证（QS）知识合计

300人以上3412202591

100人左右2028162589

10人以下128302575

2. 小结

通过调查，初步掌握在食品生产企业中，食品质量检验这一职业岗位所需文化基础知识与能力、专业技能基本情况。各类食品生产企业检验岗位要求检验员的文化素质学历须中职毕业，其中语文、化学和数学知识与能力要求应达到高中程度，英语、物理知识与能力达到初中以上程度。食品质量检验专业技能方面，因食品种类不同，技能要求的侧重点也不同。

2.1 同样是执有食品检验工职业资格证的检验员，不同类别的食品专业技能偏重点不同。如茶叶需要更多的感官检验基础知识，检验人员岗位技能主要有理化实验室检验中常规实验仪器使用与安全防护、茶叶水分的测定、毛茶或精茶中粉末与碎末的测定、茶叶审评室的设计与配备、茶叶感官审评技术“五项评茶法”（外形、汤色、香气、滋味、叶底）等。对于茶叶检验岗位的人员需要执有二个方面的职业资格证书：食品检验工证、茶叶审评员证。

2.2 分析化学基础知识在食品检验中得到广泛的应用。如标准溶液的配制、常用仪器（分析天平、容量瓶、移液管、滴定管）的使用、滴定分析法和重量分析法的运用、实验数据的处理等。

2.3 大部分食品都要测定微生物项目，食品微生物检验技术在食品检验中是不可缺的一部分。要求检验人员能够合理规划微生物实验室，会微生物实验室中常规实验仪器的使用，具备微生物实验安全防护知识，掌握灭菌技术，会配制培养基，掌握菌落总数与大肠菌群的测定技术。

2.4 某类食品出厂检验项目的检验技术是一个综合能力的体现，具有很强的职业性。这是一个真实地来自于企业检验岗位的任务，要做好食品的出厂检验，必需明白出厂检验的项目有哪些，清楚产品标准、检验方法标准及标准的有效性，会配制标准溶液，仪器设备的合理布局与正确使用，原始数据记录与处理（科学修约），如何出具出厂检验报告，并对所检验的食品做出评价。

3. 建议

坚持职业教育面向社会的实际发展需要，为企业一线培养技能型技术人才和高素质劳动者，从岗位能力需求入手，有必要及时调整食品质量检验专业课程体系、教学内容及授课方式。

3.1 构建以能力为本位的课程体系。

3.1.1 打破学科研究型体系，按模块化教学模式开发食品质量检验专业的项目课程与综合课程，构建以能力为本位、以专业技能实践活动为主线、以学习者为中心、以项目课程为主体的模块化食品质量检验专业课程体系。

3.1.2 按照“理论够用”、“技能实用”原则，妥善处理文化课与专业课的关系， 强化文化课中的语文应用文写作、数学逻辑推理及计算能力的教学；整合化学与分析化学相关内容，为食品检验专业课程打下牢靠的基础；适当减少英语、物理教学课时，加大与食品检验专业相关的选修课比例，如质量管理、计量、标准化等方面的课程，提高综合素质，增强学生就业竞争力。

3.1.3 积极推行“双证融通” 的专业课程体系，以职业能力培养与中职学历教育相互融通为根本，在课程开发的过程中，“教、学、做”一体化，使学历证书与食品检验工职业资格证书对接、职业教育与终身学习对接，让人才培养质量贴近企业需要。

3.2 根据食品质量检验岗位群的需求改革教学内容。

3.2.1 合理设计理论与实践教学内容，与食品检验岗位实际紧密结合，从理论教学的“学科导向”内容模式向以职业活动内容为基础的“职业导向”内容模式转化，强化学生的动手能力、解决问题的能力。

3.2.2 根据食品检验岗位群的需求，在理论教学内容中可强化数据处理能力的培养，弱化对分析理论的推导论证；在实践教学中将三大操作技能（滴定分析操作技能、重量分析操作技能和基础仪器分析操作技能）分为基本操作、单项实验、综合实训三个层次组织教学内容，在教学内容中体现出食品检验岗位群所要求的基本技能和综合知识。

3.2.3 建立教学内容与行业发展同步、动态运行的理念。在组织教学内容时，及时注意本行业、本专业知识更新与应用，克服教材内容滞后、专业知识与企业需求脱节的现实问题，为实现学生上岗工作能力与岗位要求的零对接提供保障。

3.3 优化授课方式。

3.3.1 将授课场所有针对性地从课堂转移到企业、检验机构的实验室，采取岗位见习认识（职场体验）――教学实训――专项与综合实训（实境训练）――顶岗实习阶段式实践授课方式，强化食品检测机构及食品生产企业检验现场的介入和对接，检验标准有效性和学生的检测能力、分析解决问题能力的对接。

3.3.2 以任务或项目为载体，学生为主体，设置企业岗位情景，项目任务与职业岗位完全对接，学生的职业能力也在项目实施过程中得到增长。从而体现出以职业导向内容模式的特征：能力为主，应用为本。

参考文献

[1] 王希平. 浅谈职教实践教学的内涵[J]. 中国职业技术教育， 2008， （34）

[2] 陈芬. 高职食品分析课程实施项目教学的研究[J]. 中国职业技术教育，2O07， （28）

[3] 夏莹.实习教学中四阶段教学法[J]. 职业技术教育， 2006， （18）

篇7

关键词：培养基质量控制微生物检测

中图分类号：R37文献标识码：A文章编号：1672-5085（2007）12-0098-03

培养基是液体、半固体或固体形式的，含天然或合成成分，用于保证微生物繁殖或保持其活力的物质。培养基的制备和使用是微生物实验室检测工作的重要环节，培养基自身质量的优劣、保存是否得当、配制使用是否正确等都直接影响到检测结果的准确性。本文对微生物实验室在培养基购置、贮存、制备、使用等方面应采取的质量控制措施进行讨论，谈一些观点和看法。希望有助于微生物检测工作的同行们更好的开展工作。

1培养基的购置与验收

1.1购置

从培养基自身的质量来看，不同生产厂家的产品，甚至同一厂家不同批号的产品都会存在差异[1]。依据ISO/IEC17025《检测和校准实验室能力的通用要求》，对培养基的供应企业进行评价后选择合格的供应商，这是培养基购买过程中重要的步骤。应选择产品市场信誉度高、有质量保证能力和服务保证能力的企业；企业是否通过了质量管理体系的认证是较为客观的评价指标。要求生产企业提供：培养基成分名称及产品编号、批号、使用前的pH、储藏信息和有效期、性能评价和所用测试菌株、技术数据清单、质控证书以及必要的安全/危害数据等材料[2]。

1.2验收

购买的培养基到货后，应有专人做好接受和验收工作，应仔细核对生产企业提供的资料、培养基名称、规格数量、外观特征、批号、保质期是否符合要求。每批培养基到货物后都应对培养基的质量进行检测，满足检测方法规定的要求后方可投入使用。

2培养基的储存

干粉培养基应保存在阴凉干燥处，要避免阳光直射；未开瓶的培养基在室温下的最长保存2年，开瓶后的干粉培养基易吸湿，应注意防潮并在6个月内用完。应定期对储存中的培养基进行常规检查，如容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查，如果培养基发生结块、颜色异常和其他变质迹象就不能再使用。

3培养基的制备

3.1培养基用水

培养基制备用水应使用电阻率不小于30万Ωcm的蒸馏水或与其同质的水，最好不使用离子交换器生产的去离子水[2]。。

3.2称量

称量时要用专用的角匙，避免交叉污染而影响检验结果；干粉培养基易吸潮，如有条件，尽量在湿度较低的房间称取培养基。

3.3复水

复水时不得用铜锅或铁锅，以防有离子混入培养基中，影响微生物的生长；容器的大小需大于复水后培养基总体积的2倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基溢出；含有琼脂粉的培养基，在加热溶解之前可以浸泡数分钟；加热培养基时一定要进行搅拌，特别是琼脂类培养基。为避免烧焦和沸腾溢出，对于少量的培养基最好使用沸水浴进行加热。烧糊的培养基营养物质被破坏，并可产生有毒物质，如发现焦化，或未溶解均匀前培养基有溢出，该培养基即不能使用，应重新制备。对于琼脂类培养基进行再融化时应使用沸水浴或流动蒸汽进行加热，最多只能加热两次，第二次再融化后仍未用完的培养基应弃去。

3.4灭菌

一般培养基采用湿热灭菌，即高压蒸汽灭菌，通常是121℃15min，含糖或特殊培养基，按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。已配制好的培养基必须立即灭菌，避免微生物生长繁殖而消耗养分，改变培养基的酸碱度。高温可破坏培养基的营养成分，还会使琼脂的凝胶强度下降，因此必须严格控制灭菌温度和时间，并且不可重复灭菌。高压蒸汽灭菌锅的压力表等要定期进行检定，并定期采用生物指示菌法或化学变色纸片对灭菌效果进行验证。

3.5pH测定

微生物必须在适宜的pH范围内才能正常生长繁殖或体现其生物特性。培养基配方要求的pH为灭菌或消毒后的pH值，即培养基使用前的pH，并应在25℃温度下采用精密酸度计进行测量，固体琼脂培养基应以特殊的胶体表面测量电极进行测量。使用过程中，如果需要调整培养基的pH，应用1mol/LNa0H或lmol/LHCL调整，注意不可反复调pH，否则会影响培养基的渗透压[3]。

3.6配制好的培养基保存

灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。所配制的培养基的量，应该是在最长保存期限内正好使用完。含染料的培养基应闭光保存；倒好的琼脂平板如果配制的当天未使用完，应于冷藏保存，如果保存时间超过2天，应将其放入密封的塑料袋中保存；配好的肉汤类培养基如果保存时间超过2个星期，应将其放在带有螺旋盖的试管或其它密闭的试管或容器中防止蒸发[4]。

4培养基的性能测试

4.1外观控制

制备好的培养基应有相应的颜色，一般的培养基应澄清、无浑浊、无沉淀。使用前应检查培养基的颜色是否发生变化，是否蒸发/脱水。

4.2污染控制

从每批制备好的培养基中选取部分进行污染测试（无菌试验），确定无微生物生长方可使用。

4.3性能测试

4.3.1测试菌株选择测试菌株是具有其代表种的稳定特性并能有效证明实验室特定培养基最佳性能的一套菌株，应来自国际/国家标准菌种保藏中心ATCC标准菌株[5]，菌株的选择参考卫生行业标准WS/T232-2002《商业性微生物培养基质量检验规程》。

4.3.2定量测试方法改良Miles-Misra法测试菌株过夜培养物10倍递增稀释；测试平板和参照平板划分为4个区域并标记；从最高稀释度开始，分别滴一滴稀释液于试验平板和对照平板标记好的区域；将稀释液涂满整个1/4区域，37°C培养18小时；对易计数的区域计数，按公式计算生长率（生长率=待测培养基平板上得到的菌落总数/参考培养基平板上获得的菌落总数）。非选择性培养基上目标菌的生长率应不低于0.7，该类培养基应易于目标菌生长；选择性培养基上目标菌的生长率应不低于0.1[6]。

4.3.3半定量测试方法改进的划线法接种法平板分ABCD四区，共划16条线，平行线大概相隔0.5cm，每条有菌落生长的划线记作1分，每个仅一半的线有菌落生长记作0.5分，没有菌落生长或生长量少于划线的一半记作0分，分数加起来得到生长指数G。目标菌在培养基上应呈现典型的生长，而非目标菌的生长应部分或完全被抑制，目标菌的生长指数G大于6时，培养基可接受[6]。

4.3.4定性测试方法平板接种观察法用接种环取测试菌培养物，在测试培养基表面划平行直线。按标准中规定的培养时间和温度对接种后的平板进行培养，目标菌应呈现良好生长，并有典型的菌落外观、大小和形态，非目标菌应是微弱生长或无生长[6]。

5讨论

培养基的质量是微生物实验室检测工作的基础，事关检测工作的准确性、可靠性，在微生物实验室检测工作中举足轻重。如果在工作中忽视任何一个环节的质量问题，都将导致检验结果科学性、客观性的偏离。因此，加强培养基的实验室质量控制，认真地做好培养基的质控工作，不断完善和提高培养基的质控水平，才能为微生物检测实验室提供高质量的培养基。

参考文献

[1]唐细良，史娟，唐紫琳，等.影响卫生微生物检验质量的两个因素研究[J].实用预防医学，2000，7（4）：314-315.

[2]ISO/TS11133-1：2000.Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs-Guidelinesonpreparationandproductionofculturemedia-Part1：Generalguidelinesonqualityassurancefortheprepatationofculturemediainthelaboratory[S].

[3]刘春梅，蔡芷荷，吴清平.食品卫生微生物检验中培养基的质量控制[J].中国卫生检验杂志，2007，17（4）：700-701.

[4]饶红，陈广全，冯骞，等.微生物实验室培养基的质量保证措施[J].检验检疫科学，2006，6（4）：31-33.

篇8

关键词：鸡肉；菌落总数；高光谱成像；图像预处理；偏最小二乘法（PLSR）；无损检测

Rapid Non-Destructive Detection of Total Bacterial Count in Chicken Using Hyperspectral Imaging

LI Wencai1， LIU Fei1， TIAN Hanyou1， ZOU Hao1， WANG Hui1， ZHANG Zhenqi1， ZHENG Xiaochun2， LI Yongyu2，

LI Jiapeng1， QIAO Xiaoling1，*

（1. Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology， China Meat Research Center， Beijing 100068， China；

2.College of Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083， China）

Abstract： In order to develop a rapid and non-destructive method to predict total bacterial count in chicken breasts by using hyperspectral imaging technology， 83 chicken breast samples refrigerated at 4 ℃ were collected from local supermarket and 63 of these were used as calibration samples. The hyperspectral scattering image of each sample was collected by using hyperspectral imaging system in the wavelength range of 400?1 100 nm. Various algorithm combinations were used to preprocess the hyperspectral information of the samples to enhance the performance of the model developed by using partial least square regression （PLSR） algorithm. Based on the predictive accuracy and stability of the model， the efficiency of different algorithm combinations for spectral preprocessing were evaluated and discussed. The results showed that the optimal model performance was achieved by preprocessing of the hyperspectral information with standard normalized variate. The standard error of calibration （sEC） and standard error of prediction （SEP） of the model were 0.40 and 0.57， respectively. The correlation coefficients of calibration （RC） and prediction （RP） were 0.93 and 0.86， respectively. The optimal model allowed effective prediction of distribution maps of total bacterial count in chicken breasts.

Key words： chicken； total bacterial count； hyperspectral imaging； image processing； partial least square regression （PLSR）； non-destructive detection

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201703007

中图分类号：O657.33 文I标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）03-0035-05

引文格式：

李文采， 刘飞， 田寒友， 等. 基于高光谱成像技术的鸡肉菌落总数快速无损检测[J]. 肉类研究， 2017， 31（3）： 35-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201703007. http：//rlyj.pub

LI Wencai， LIU Fei， TIAN Hanyou， et al. Rapid non-destructive detection of total bacterial count in chicken using hyperspectral imagingg[J]. Meat Research， 2017， 31（3）： 35-39. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201703007. http：//rlyj.pub

由于养殖成本、周期等原因，猪、牛、羊肉价格长期高于鸡肉价格，国家统计局数据显示，2010―2016年，鸡肉价格平均低于猪肉和牛羊肉价格约27%和63%，相对较低的价格使得鸡肉消费量大幅增加，统计局数据显示，2005―2012年，城镇居民、农村居民人均猪、牛、羊肉消费分别增加了4.2%、-4.1%，而禽肉消费分别增加了20.0%、45.2%。同时，鸡肉作为重要的禽肉产品之一，肉质细嫩，营养丰富且比例均衡，其食用安全性受到越来越多消费者的重视。鸡肉的质量与安全主要取决于物理、化学和生物指标，其中生物指标最为重要。菌落总数是评判食品被微生物污染程度的一个重要指标[1-2]，可预测肉品的货架期以及判断是否腐败变质，GB 16869―2005《鲜冻禽产品》[3]规定了鲜禽肉中菌落总数的最大值。菌落总数的传统检测方法包括平板计数法、阻抗法、伏安法、流式细胞法、微热量计法、酶联免疫法、多聚酶链式反应等[1，4]，这些方法过程繁琐、检测周期长、效率低、易受温度、pH值等因素影响、肉品破损严重等问题，很难满足肉品检测过程中快速、无损、自动化的需求，严重制约我国肉品产业的发展。

在鲜肉贮藏过程中，随着微生物的生长，葡萄糖和其他单糖以及蛋白质水解形成化学团，包括挥发性酯类、醇类、酮类以及含硫化合物，这些物质最终导致了鲜肉的腐败味。针对鲜肉腐败率较高的问题，找到一种较为先进的检测技术来保证它的质量与安全很有必要。高光谱成像技术光谱分辨率高、波段连续，能够在紫外、可见光近红外、红外等范围内获得多而窄、波段数达上百个的连续光谱，其融合了光学、计算机技术、信号处理学等多种学科于一体，是一种较为全面的检测技术[5-7]。高光谱成像技术分析效率高、操作简单、费用低廉，可在线监测，同时无需对样品进行损伤和预处理，已广泛应用于食品、医药、农业、环境、石化、生物技术等领域。近年来，国内外一些学者开始采用高光谱成像技术来研究肉品在流通、贮藏过程中微生物腐败及品质变化的快速检测，并取得了一定的研究成果[8-14]。Kamruzzaman等[15]基于高光谱成像技术，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）对猪肉、牛肉、羊肉进行识别和身份验证，通过二次求导得到的特征波长用于模式识别算法中来对肉品进行分类，模型对校正集样本的分类精度达98.67%。除此之外，该学者还利用高光谱成像技术对红肉的持水力和色泽开展了研究[16-17]，报道了该方法用于在线检测红肉持水力和色泽的可行性。Barbin等[18]基于近红外高光谱成像技术（900～1 700 nm）和偏最小二乘法（partial least squares regression，PLSR）对冷冻猪肉菌落总数和嗜冷菌平板计数进行检测和建模，R2C分别达0.86和0.89。Peng等[19]以牛肉为研究对象，采用高光谱成像技术对其表面菌落总数进行检测，通过不同预处理方法和不同建模方法对其菌落总数进行预测，取得了较好的预测结果。陶斐斐等[20]以冷却猪肉为研究对象，利用高光谱成像系统（400～1 100 nm）对其表面菌落总数进行快速预测，研究其在1～14 d贮藏期间表面菌落总数与高光谱图像的关系，结合多元线性回归和偏最小二乘回归法建立预测模型，模型相关系数为0.886和0.863。鸡肉高光谱成像相关研究中，多集中在挥发性盐基氮、嫩度、颜色、脂类氧化等[21-23]，微生物方面鲜有报道。本研究以鸡胸肉为研究对象，依照GB 4789.2―2010[24]对其菌落总数进行测定，在400～1 100 nm波长范围内，使用感兴趣区域（range of interest，ROI）方法提取鸡胸肉表面高光谱图像的散射光谱，采用PLSR对其菌落总数高光谱信息建模，确立高光谱图像信息与菌落总数之间的关系，实现鸡胸肉菌落总数分布范围的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡胸肉均购于中国农业大学附近超市，半小时内运至实验室，采用统一的保鲜袋包装方式。

氯化钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；平板计数琼脂培养基 北京奥博星生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

高光谱成像系统、SW-CJ-2D超净工作台 苏州净化设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ME204型电子天平（精确度0.000 1 g）

瑞士梅特勒-托利多科学仪器（上海）有限公司；

DHP-9052型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；L28957E、P18156D移液枪 德国Eppendorf股份公司；WD3-1-9CM培养皿 浙江柏美特医用塑料有限公司。

高光谱成像系统组成：Sensicam QE CCD（charge coupled device）数字照相机 德国Kelheim公司；ImSperctor V10E成像光V仪 芬兰Spectral Imaging公司；

卤钨灯直流点光源（Oriel Instruments） 美国

Stratford公司；CD33-120N-422位置传感器 日本Optex公司；Intel core i3-3240计算机 联想有限公司。

该仪器采用的光谱范围为400～1 100 nm，可以采集鸡肉样品表面的散射光谱，其光谱分辨率为2.8 nm。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

实验时从冰箱随机取样，切成厚度大约为1 cm，质量大约为10 g的鸡肉块，每24 h测定1 次，每次测定3 个样品。

1.3.2 样品高光谱信息的采集

每隔24 h从4 ℃冰箱中随机取出鸡胸肉样品，利用实验室构建的高光谱成像系统，采集400～1 100 nm波长范围内的鸡肉样品表面散射光谱，曝光时间为80 ms。由相机软件（Camera control Kit V2.19）完成图像采集过程，为确保样本的一致性，扫描过程中所采集样本的扫描线需与鸡肉样本纤维方向平行，每扫描4 次，自动平均得到一条扫描线。实验过程中对每个样本表面进行全扫描，得到160 个扫描图像。

1.3.3 样品菌落总数的测定

对高光谱图像进行采集后，立即对鸡胸肉样品表面菌落总数进行检测。本实验参考GB 4789.2―2010[24]中的10 倍梯度稀释法进行操作，选取合适的稀释梯度，每个稀释梯度倒3 块平板，37 ℃条件下培养48 h后计数，取菌落总数的对数值作为分析数据，单位为lg（CFU/g）。

1.3.4 数据分析

高光谱图像信息采集后，采用MATLAB2015b（美国Mathworks公司）对数据进行分析。依次提取冷却鸡肉样本高光谱图像感兴趣区域（range of interest，ROI），计算其平均散射光谱值，将其作为鸡肉样本的原始光谱值。对光谱图像特征进行分析后，应用PLSR对光谱数据和菌落总数测定值进行关联，建立鸡胸肉菌落总数预测模型。

1.3.5 模型预处理方法的筛选

选择的预处理方法包括：归一化方法（normalization method，NM）、Savitzky-Golay求导（Savitzky-Golay derivative，SGD）、标准变量变换（standard normalized variate，SNV）、附加散射校正（multiplication scatter correction，MSC）。

对样品高光谱信息进行不同预处理，去除无关干扰信息、降低随机噪声和强化谱带特征，采用PLSR统计方法建模，综合校正标准误差（standard error of calibration，sEC）、验证标准误差（standard error of prediction，sEP）、验证标准差和校正标准误差的比值（sEP/sEC）和差值（sEP-sEC）对模型性能进行评价[25]，筛选出最佳预处理方法。

1.3.6 模型评价原则

sEP 代表高光谱分析的总误差，其中包括可靠性偏差、稳健性偏差和信息处理过程产生的误差，因此可以直接用于评价模型的预测准确性。sEC代表模型在建模样品范围内的分析误差，不包括稳健性偏差，因此sEP-sEC

应大于0。美国谷物化学组织的近红外分析标准中将

sEP/sEC作为评价模型稳健性的参数，规定sEP/sEC应小于1.2，其值大于1.2时则表示模型的稳健性不够[20]。

因此，在筛选性能最佳的模型时，首先模型应同时满足sEP/sEC0，然后在剩余的模型中x取sEP最小的模型，此模型不仅稳健且预测准确性较好，这个模型所对应的算法或算法组合即为最佳预处理方法。

1.3.7 菌落总数分布地图

用高光谱成像技术预测菌落总数，不仅可以提供光谱信息还可以提供菌落总数的空间分布[26-29]。高光谱图像中每个像素点对应一个光谱，因此在每个像素点上可计算出样品菌落总数的预测值，从而构成分布地图。本实验中，利用PLSR模型预测光谱图像中每一个像素点对应的菌落总数，最终构成菌落总数预测值的分布地图。

2 结果与分析

2.1 样品菌落总数化学测量值的测定结果

本实验所用的83 个鸡胸肉样品的菌落总数化学测量值的统计结果如表1所示，涵盖新鲜鸡肉菌落总数（约3.97（lg（CFU/g）））至腐败鸡肉菌落总数（约7.75（lg（CFU/g））），GB 16869―2005[3]对鲜禽产品中菌落总数含量所允许的最大值为6（lg（CFU/g）），3.97～7.75（lg（CFU/g））的范围说明本实验选用的样品具有较强的代表性。从总样品集中选取菌落总数化学测量值分布均匀的样品63 个作为校正集，用于模型的建立；剩余的20 个样品作为验证集，用于验证模型的预测准确性和稳健性，统计结果见表1。

2.2 鸡肉高光谱图像感兴趣区域的确定

利用Matlab2015b分析软件从高光谱图像中提取ROI。图1所示为不同扫描位置的光谱图像，图2所示鸡肉样品不同扫描位置处的光谱曲线，距离扫描线中心0、10、15、20 nm位置处整个波长范围内的散射光谱。

由图2可知，在波长方向上，低于470 nm和高于920 nm位置处形成较大噪音影响，信号较弱；在空间方向上，扫描线中心位置的散射强度最大，距离扫描线中心位置越远，散射强度越弱，因此，将光谱轴[470 nm，920 nm]和空间轴[-20 nm，20 nm]所组成的矩形区域作为ROI。沿着光谱轴在470～920 nm区间计算ROI区域上点的平均散射光谱作为该样本的散射光谱。对所有的图像进行处理，共获得83 条波长曲线如图3所示。

2.3 最佳预处理算法的确定

应用不同算法组合对样品的高光谱信息进行预处理后，菌落总数预测模型的性能评价参数如表2所示。

对光谱信息不进行任何预处理，与其他预处理方法相比，校正集相关系数（correlation coefficient of prediction set，RC）不变，但是验证集相关系数（correlation coefficient of prediction set，RP）较低。对模型进行SNV单独预处理时，由表2可知，各个模型的RC均保持不变，但是RP均有不同程度的增加；光谱数据经SNV单独处理后再建模，与无预处理相比，RC不变，但是RP由0.80上升0.86，且sEP/sEC值为1.08，其值小于1.2，说明经SNV单独处理后，模型的准确性和稳健性均有所增加，将SNV确定为最佳预处理方法。其他不同组合算法的准确性和稳健性均低于SNV算法，在表中未列出。不同预处理方法对模型预测的准确性和稳健性有很大的影响，恰当的预处理方法可以提高模型性能评价参数，但过度的预处理方法会使得模型性能降低，样品光谱信息中大量有效信息丢失，这与邹昊等[30]研究结果相一致。

2.4 最佳预处理算法条件下菌落总数的预测

以校正集和验证集样品的菌落总数化学测量值为横坐标，模型的预测值为纵坐标作图，结果如图4所示。

由图4可知，校正集中样品的菌落总数化学测量值紧密地分布在回归线两侧，模型的预测值与校正集样品的菌落总数化学测量值吻合度较高，模型的sEC为0.40，RC为0.93，说明建模前对样品光谱信息进行SNV预处理后，模型较好地拟合了光谱信息中反映样品菌落总数含量的信息。验证集中，样品的菌落总数化学测量值和模型的预测值相关性较高，sEP为0.57，RP为0.86，说明模型对验证集样品中的菌落总数含量有较好的预测准确性。

2.5 鸡肉菌落总数分布地图的生成

图5表示鸡胸肉样品菌落总数的分布图，颜色条RGB值由0到7.75（由灰到白），表示菌落总数值由小到大。在预测分布地图中，光谱性质相同的像素点拥有相同的预测值，用相同的颜色比例分配表示，所以，分布地图中不同的颜色表示不同的菌落总数分布。

由图5可知，A样品和B样品菌落总数预测对数值分别为4.00 （lg（CFU/g））和6.77 （lg（CFU/g）），依照GB 4789.2―2010所测值为3.99 （lg（CFU/g））和6.79 （lg（CFU/g））。不同菌落总数的鸡胸肉，菌落总数含量和分布预测地图存在明显差异，白色越多，表示菌落总数预测值越大。与传统技术相比，高光谱成像技术可用于更大的样品，甚至整个动物胴体，生鲜肉微生物检测已成为屠宰厂建立和实施危害分析和关键控制点（hazard analysis critical control point，HACCP）体系重要的信息来源。高光谱成像技术已成为肉类工业中微生物检测的一个可行、简单、快速有效的方法。

3 结 论

高光谱成像技术具有费用低、无损检测等特点，它在肉类在线质量控制系统中实现了快速化、准确化和简单化。为了快速检测鸡胸肉菌落总数，本实验在400～1 100 nm波长范围内，使用ROI方法提取鸡胸肉表面高光谱图像的散射光谱。其中，用于建立菌落总数预测模型校正集的样品共63 个，用于验证集的样品共20 个。使用不同算法和算法组合对样品的高光谱信息进行预处理后利用PLSR进行建模。通过模型评价参数对预处理方法进行筛选后发现，经SNV对样品进行预处理后，模型性能较好，模型sEC和sEP分别为0.40和0.57，sC和RP分e为0.93和0.86，且sEP/sEC值为1.08，其值小于1.2，模型的准确性和稳健性为最佳。通过每个像素点对应的光谱可预测得到菌落总数分布地图，通过分布地图可看出，不同样品菌落总数预测值的大小以及菌落总数在样品中的分布情况。高光谱成像技术有望成为鸡肉产业中微生物快速检测的一个行之有效的方法。

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关键词 食品；菌落总数；大肠菌群；基本要求

中图分类号TS251 文献标识码A 文章编号 1674-6708（2013）85-0101-02

食品从生产到销售需要经过各个环节，在这些环节中很可能受到微生物的污染，从而造成腐败、产生毒性，为了能够保证人们能够吃到健康的食品，就需要对食品中菌落总数以及大肠菌群作为其主要的检测项目。只有对其检测进行严格的把控，才能保证食品的安全，才能确保消费者的健康，才能更好地促进经济的发展。

1 质量控制的基本要求

要确保对菌落总数和大肠菌群的检验能够更加准确，就需要对一些基本要求进行确保。

1.1 检验人员

为了能够对食品的菌落总数和大肠菌群进行有效的检验，就需要检验人员具备相关的技术知识，这样才能确保检测结构更加准确。作为食品的检验，首先就要求检验人员能够对食品微生物学理念以及相关的检验技术能够有比较深入的了解，并且在其参加工作之前需要对其进行必要的考核。其次就是要了解相关的法律法规，我国的食品法对相关的标准有明确的规定，只有了解这些才能有更好地执行检验。最后就是要了解计量学的内容，因为检验工作十分精细，只有了解计量学的基本知识才能更好地进行实验。

1.2 仪器设备

为了能够保证检验能够正常的进行，需要准备好必要的仪器和设备，这样才能为检验的进行提供必要的基础。

1.3 药品与培养基

对菌落总数和大肠菌群的检验需要利用必要的培养基、染色体以及一些必备的试剂，并严格按照相关的标准进行相关的操作。

1.4 检验环境

由于空气中本身就存在着细菌和微生物，为了能够对菌落总数和大肠菌群进行有效的检测，需要在无菌室进行检验。为了达到理想的检测效果，工作人员应该进行良好的卫生处理，这样才能达到很好的效果。

1.5 采样

食品的量往往是非常大的，对所有的食品进行检验实行起来不太现实，成本也难以负担，因此，在进行检验的时候就需要进行采样。在采样环节，要对卫生状况、采集方法、检验标准、标签等进行充分的认识，这样才能使检验结构更加准确。

1.6 样本预处理

相关部门在接到检验单据以及样本后，要及时进行检测前的预处理，一般将其放在冰箱进行储存，并保证并向处于冷冻的状态，这样才能为检验做好基础工作。

2 菌落总数检验的质量控制

根据国家标准方法，对菌落总数的检验实行标准平板培养法。

2.1 关于稀释度的选择

不同食品的检测的稀释度并不相同，一般都将稀释度保持在2个～3个连续稀释度上，但是这里需要的注意的是，为了能够达到检验的有效性，需要至少保证其中一个的稀释度中菌落的数量在30个～300个。对于那些细菌含量比较高的食品稀释度可以适当的加大，诸如酱油、肉制品等。而对于那些细菌含量比较低的食品不需要很高稀释度，这样的食品可以选择原样，或是较低的稀释度，诸如纯净水、糕点等。

2.2 接种和培养

取一毫升的稀释液放入到培养皿中，并在尽可能快的时间内向其中倒入营养琼脂，倒入之后随即进行推旋操作，促进其混合。这里需要注意的是动作的幅度不能太大，否则将很难保证结果的准确。等到该混合液凝固的时候，需要将其放入培养箱进行培养，在这个过程中需要检验是否存在污染的情况，以确保检验的实效。

2.3 原始记录

当样品在36±1℃的培养箱中经过了48小时的培养之后，就可以进行计数操作。在这个过程中需要做好原始数据的记录，对样品的名称、检验日期等相关信息要做好相关记录，在计算菌量的时候，应严格按照相关标准，如果均量在100以内的话，那么就进行如实报告，如果菌量大于100，则需要利用科学技术法表示，诸如N×10n，一般来说保留两位有效数字。

3 大肠菌群检验的质量控制

大肠菌群的检验主要可以分为以下三个步骤，首先进行乳糖胆盐发酵试验，其次进行分离培养，最后进行证实实验，经过这三个步骤就能达到很好的质量控制。

3.1 乳糖胆盐发酵试验

检测之前，需要依据产品的标准选择所需要检测样品的量。在试验结果的判定环节，如果其不产生酸也不产生气体才可以被判定为达成菌群阴性，任何一个方面存在着差别，都不能将其当作阴性。在起初发酵的时候，不能草率的将显示的阳性管判定为大肠菌群阳性，而需要进行一系列的分离和证实实验，才能下结论。

3.2 分离培养和证实试验

为了进行培养和证实实验，需要利用伊红美兰平板，只有通过其进行必要的分离培养，才能得到需要的菌源，从而进行证实实验。在培养的时候要控制好实践，在24小时内要对菌落的特征进行很好的观察，其主要可以有四种菌群，只有对这些菌群的可疑程度进行必要的检测，这样才能避免出现假阴性。

3.3 原始记录

根据以上实验的结果，根据MPN检索表就可以指导大肠菌群的最可能的数量，在进行检索的时候，应该注意该检索表一栏的阳性管数下面所列出的mL（g）是原样品的mL（g）。如果检测量大于1 mL（g）的话，需要按照表内的数字降低10倍报告，如果检测量小于1 mL（g）的话，则用表内数字报告。

3.4 结果质量控制

相关的检验人员要根据实验的整个过程以及最后的记录编制检验报告，并且在编制的时候对相关的内容进行复查，这样才能达到理想的效果。并根据国家食品卫生的相关标准对食品菌落总数以及大肠菌群进行必要的评价和审定。待这些步骤都进行完毕之后，还需要送到相关主管人员进行核实，如通过核实，还需要主管人员签字并盖章，这样报告才能生效。

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[1]郭涛，孙香彬，侯君，曹铁建，刘飞，张彩霞，姜明，卢行安.食品微生物检验中菌落总数测定的注意事项[J].微生物学杂志，2007（3）.

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膜是处理系统发挥作用的主体，研究淹没式除磷反应器中生物膜的特性和主要微生物组成、探讨究竟是哪些微生物在生物膜除磷过程中起主要作用，是探明淹没式生物膜除磷机理的重要课题。

1 序批式生物膜除磷反应器中生物量的测定

1．1　测定方法

(1) 从笔者稳态试验运行的淹没序批式生物膜法除磷反应器中[1]取出有代表性的填料，将填料放入容器中加入一定量的蒸馏水搓洗，把含洗脱膜的水转入2000mL量筒中，将填料再重复搓洗3～5次，直至膜全部洗脱下来而填料变成白色为止，再往盛洗脱膜的量筒中加蒸馏水至满刻度。

(2) 取混匀的洗脱液200mL，测定在103～105℃下烘干的总残渣;取混匀的洗脱液200mL，用定量滤纸抽滤，然后取所得滤液，测定在103～105℃下烘干的总可滤残渣，得悬浮固体m′s=总残渣-总可滤残渣。

(3) 把经过(2)测得的总残渣和总可滤残渣分别在550℃的马福炉中灼烧30min，取出在干燥器内冷却后称量至恒重，得总残渣和总可滤残渣的灼烧残渣，则挥发性悬浮固体m′vs=(总残渣-总残渣的灼烧残渣)-(总可滤残渣-总可滤残渣的灼烧残渣)。

(4) 在取走填料的反应器中立即取混合液200mL，同步骤(2)，(3)分别测出反应器中混合液的悬浮固体ms″和挥发性悬浮固体mvs″，则得反应器中悬浮固体ms和挥发性悬浮固体mvs的计算公式:

ms=10∑ni=1nim′si+1000vm〃s/200=10∑ni=1nim′si+5vm〃smvs=10∑ni=1nim′vsi+5vm〃vs

式中ms———反应器中悬浮固体总量，g;mvs———反应器中挥发性悬浮固体总量，g;m′si———第i种代表性填料的悬浮固体，g;m′vsi———第i种代表性填料的挥发性悬浮固体，g;ni———第i种代表性填料相同或相似的填料数;n———代表性填料的种类数;m〃s———混合液的悬浮固体，g;m〃vs———混合液挥发性悬浮固体，g;v———反应器容积，22L。反应器中mLss和mLvss的表达式:mLss=1000ms/v，mg/L;mLvss=1000mvs/v，mg/L。

1．2　测定过程及结果将所取代表性填料分成上下两段，每段长度均为55cm，然后把每段作为单独的有代表性的填料，按上述测定方法进行测定，反应器中有8根相同填料，结果见表1。

由表1知，sbr生物膜反应器中生物量非常大，超过淹没式软填料生物膜工艺、sbr除磷活性污泥系统和a/o活性污泥系统中的生物量，反应器中上部生物膜活性高于下部。

2 生物膜污泥产率及污泥含磷量

2．1 污泥产率

由于sbr生物膜除磷工艺的特殊性，可较方便地测出运行1个周期后的污泥产量。在进水负荷为1．00kgcod/(m·d)时，将1周期后脱落的污泥取出，过滤后在103～105℃下烘干，称得1．0733g，产泥率为0．1996kgds/kgcod，介于传统生物膜法和传统活性污泥法的产泥率之间，与以消化为目的的延时曝气活性污泥法的产泥率接近[4]。

2．2 污泥含磷量

准确称取污泥风干样品0．0744g，在样品上下各铺一层naoh于镍坩埚中，将坩埚放在酒精喷灯上到样品处于熔融状态，用铁夹将坩埚取出在水中急冷，用蒸馏水多次洗涤坩埚，用h2so4(1∶1)中和至ph

将上述溶液再稀释20倍后取50mL于比色管中，加入5mL钼酸铵溶液混匀，加入0．25mL氯化亚锡溶液，充分混匀，室温放置15min后，于700nm波长处以零浓度空白为参比，测定吸光度，在标准曲线上查得相应的含磷量为0．2108mg/L，污泥中磷含量为5．67%。

3 生物膜沉降特性

计时进行静止沉淀。把量筒中洗脱液混匀，然后静置沉淀，分别记下静沉时间及污泥沉淀层容积。结果见图1。由图1可见纤维填料的上、下部生物膜都具有良好的沉降性。

4 除磷微生物特性研究

4．1 试验材料

生物膜样品:生物膜混合液取自笔者试验中稳态运行的淹没式生物膜反应器中填料载体上的生物膜。检样1为生物膜反应器除磷试验的前期(反应器运行第4个月)样品，检样2为中期(反应器运行第6个月)样品。

培养基:牛肉膏蛋白胨培养基(营养琼脂)。

4．2 试验方法

(1) 检样处理。

无菌操作取出生物膜，测量表面积。检样1为0．2217cm，检样2为0．2165cm。然后用灭菌剪刀将生物膜剪碎，放入装有灭菌生理盐水和玻璃珠的三角烧瓶中，充分振荡，将生物膜上的细菌洗下，以此生理盐水悬液作为菌落总数测定细菌计数按标准平板法进行。

(2) 菌落总数确定。

将上述生理盐水悬液进行(2)菌落总数确定。将上述生理盐水悬液进行适当的10倍递增稀释，然后取各稀释度悬液0．1mL放入营养琼脂平皿上，用灭菌“L”形玻璃棒将其涂布均匀，放入36℃恒温箱中培养24h，然后连续观察3d。

(3) 菌相分析。

取上述各稀释度菌悬液0．1mL放入普通营养琼脂平皿上，用“L”玻璃棒将涂布均匀的一组放在36℃温箱培养，另一组放入厌氧罐中，36℃培养，连续培养72h后取出并观察结果，选有30～300个菌落的平皿，进行菌相分析，选取菌落形态一致的菌为一组菌，然后进行革兰氏染色，做抗酸染色、形态、芽孢试验、动力、需氧生长、厌氧生长、接触酶、氧化酶、葡萄糖利用试验、of试验以确定其为哪个菌属的细菌。试验结果根据《伯杰氏系统细菌鉴定手册》所述的方法进行处理。

4．3 试验结果

(1) 菌落总数。

由表1得知:检样1的菌落总数为2．52×108个/mL，检样2的菌落总数为1．56×10个/mL。

(2) 菌相分析结果。

普通营养琼脂平板在36℃下培养24h。需氧培养:检样1在10-4稀释度平板上长出210株菌落;检样2在10-5稀释度平板上长出127株菌落。厌氧培养:检样1，检样2均无细菌生长。菌相分析结果见表2。由表2可见优势菌属为假单胞菌属，其次依顺序为气单胞菌属、芽孢杆菌属、微球菌属、硝化杆菌属。

4．4 讨论

4．4．1 淹没式生物膜反应器不同运行期生物比较

(1) 细菌总数。

在除磷试验的中期生物膜中细菌数量远超过初期，约为初期的5倍，这是因为生物膜不断驯化培养后，逐步成熟的原因。

(2) 菌相组成。

由表2知，在运行中期假单胞菌属的构成比例超过初期。同时，气单胞菌属、芽孢杆菌属的构成比却低于初期。这说明，假单胞菌属为本系统的优势菌属，且随着运行时间的延长而更加稳定。另外，硝化杆菌属的比例在运行中期也高于初期。说明，随着运行时间的延长，本系统的硝化功能趋于提高。

4．4．2 与除磷工艺中活性污泥混合液菌相构成比较

以往人们认为不动杆菌属在活性污泥除磷过程中起着最主要的作用。但是，在本试验中却没有发现不动杆菌属。hascoet[8]发现，运行良好的间歇式生物除磷脱氮试验装置的污泥混合液中几乎找不到不动杆菌，清华大学周溪岳[3]、华东师范大学朱怀兰[9]的间歇式污泥除磷试验装置中，也没有找到不动杆菌。此外，即使在一些装置中，不动杆菌属相当多，但它在除磷过程中所起的作用都不大。当然由于所采取工艺、原水水质、运行条件不同，活性污泥混合液内微生物组成和数量会有差异，但是这说明了以往的废水生物除磷主要是由不动杆菌属完成的观点是不够全面的。

另外，同样是间歇式除磷工艺，本试验采用的淹没式生物膜与间歇式活性污泥的菌相构成有相似也有不同，其比较见表3。由表3知，两者最大的不同是在淹没式生物膜除磷系统中有硝化杆菌属，而间歇式活性污泥系统中没有。

4．4．3 主要菌群的功能

cLoete等人的研究认为，假单胞菌属、气单胞菌属、不动杆菌属等都不仅能有效地降解有机物，而且能过量摄取废水中的磷以聚磷酸盐颗粒的形式贮存于细胞内，同时还能还原硝酸盐进行反硝化脱氮。另外芽孢杆菌属、微球菌属、肠杆菌属等，也具备上述功能，这与本试验研究是基本一致的。气单胞菌的另一主要功能是发酵产酸作用，即在厌氧段将合成废水中的蛋白质之类的大分子物质发酵成小分子的挥发性脂肪酸，而一般硝化杆菌的作用是进行硝化。本试验在稳定运行期有很好的硝化以及去除cod和氮、磷的效果[1，11]，从而进一步验证了上述观点。

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5 除磷生物膜生物相

5．1　原生动物和后生动物的特征淹没式生物膜反应器从进水到出水，有机物浓度变化很大，然而其中的微生物相却比较稳定，而且在数量上也没有出现大起大落的情况。原生动物主要为纤毛虫类，其中出现频率最多的是固着型纤毛虫类，有钟虫、累枝虫和盖虫;其次是游泳型纤毛虫，有草履虫(主要在进水时出现)、肾形虫和漫游虫。另外，生物膜中也有少量的绿眼虫和变形虫。生物膜中出现的后生动物有线虫类、轮虫类、甲壳虫类等。甲壳虫动物主要为水蚤类。值得指出的是淹没式反应器生物膜上的生物相并没有象传统的生物膜法那样，随着从进水到出水而改变，相反在整个处理过程中，钟虫、累枝虫、线虫等一直生长良好，而且在数量上没有太大变化，这些适于在低污染度条件生活的微生物仍能存活，只是随环境条件的改变，原生动物和后生动物的形态也随之变化。因此，在同一周期内，淹没式生物膜反应器中的原生动物和后生动物种属不宜用来指示水质，而只能从原生动物的形态来指示水质。

5．2　原生动物和后生动物的作用原生动物可直接利用水中有机物质，对水中有机物的净化起一定的积极作用，更主要的是原生动物是以吃细菌为主，而后生生物是以细菌、小的原生动物和有机颗粒等为食物，从而形成食物链和不同营养级的消费者生物，与反应器环境形成一个生态系统。细菌、原生动物和后生动物的活性在好氧条件下要比无氧条件下大大提高，所以淹没式生物膜除磷反应器在从厌氧转为好氧时，除磷菌的繁殖速度将大大加快，而原生动物、后生动物的捕食能力也逐渐增强，而这时被吞食的除磷菌大都是过量摄取了磷的细菌，因此，原生动物、后生动物在体内富集了磷，而这些磷将随同其死亡尸体转入污泥，从而有利于提高淹没式生物膜反应器中脱落污泥的磷含量;其次，在好氧段由于原生动物、后生动物的活动可软化生物膜，促使生物膜松动、脱落，并提高氧转移率，从而能使生物膜经常保持活性和良好的净化功能，既有利于去除有机物，也有利于除磷。

6　结论

(1) 淹没式生物膜除磷反应器中，生物量大，mLvss达5531．7mg/L;细菌总数多，为1．56×109个/mL，从而为生物除磷在菌数上奠定了基础。

(2) 脱落污泥沉降性好、含磷量高，污泥产率为0．1996kgds/kgcod。