光学显微技术范文

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关键词 荧光显微术 课程 教学 思考

中图分类号：G424 文献标识码：A DOI：10.16400/ki.kjdks.2017.05.074

“荧光显微术原理及应用”是一门非常重视实践性的技术基础课。“荧光显微术原理及应用”是基于北京农学院现有研究生课程的基础上拟向农业生产类、生物专业、动物专业以及园林专业的一年级硕士研究生开设的公共选修课，希望通过该课程的开设，为研究生开展学术研究奠定一定的实验技术基础。该课程对于研究生掌握科学研究中的细胞生物学观察方法，培养学生独立进行科学研究的素养和能力具有重要作用。作为新开研究生课程，基于北京农学院的实际情况对“荧光显微术原理及应用”的教学与实验进行了如下设置及思考。

1“荧光显微术原理及应用”课程开设的必要性

1.1研究手段和技术的发展的需要

物质吸收电磁辐射后进入激发态，而受到激发的原子或分子在去激发过程中再发射波长比激发光波长更长的光，这种再发射的光称为荧光。生物体内有些物质有自发荧光，如叶绿素或细胞壁的某些成分，受紫外线照射后发出荧光；生物体内大部分物质本身不能发出荧光，但如果用特异性的荧光染料标记后，经紫外线或其他波长的光照射后也可以发出荧光，这种荧光可以被荧光显微镜捕获，并进行定量分析。因此，荧光显微术就是基于荧光对这类物质进行研究的技术。荧光显微镜依据观察物体大小及原理又可以分为多种。常用的有体式荧光显微镜、荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜等等。

体视荧光显微镜能对微小样品进行快速、清晰的显微观察，并实现完全无漂移的三维立体成像，配有较长的工作距离，不仅能够获得较大的景深和光学细节，还能保证样品的真实色彩；对样品能进行实体测量；具有良好的操控系统，可提供优良的重复性从而使实验过程简化。但是体式荧光显微镜有缺陷性。其放大倍率较低，适合于研究对象的整体观察和活体观察以及一些较大的器官和组织的观察，不适合观察小组织或细胞。

与体式荧光显微镜相比，荧光显微镜放大倍数较高，工作距离较短。可以观察更多的细节。能在组织、细胞和亚细胞的水平上研究细胞内物质的定位、营养成分的吸收、运输，以及化学物质的分布及定位等。可以进行活体或固定材料的观察。

激光扫描共聚焦显微镜是上个世纪80年展起来的一种非常精密的仪器设备。它以光学为基础，将机械、电子、计算机等融为一体。与体式荧光显微镜和荧光显微镜不同，激光共聚焦以激光为光源，可以把标本分成多个光学断层，逐层进行扫描并成像，因此是一种新显微层面的研究手段。此外，由于激光共聚焦显微镜对细胞和组织连续光学切片无损伤，而且能够对活体细胞进行实时的动态观察，使它在生物科学的研究中占有独特的地位。目前，人们已广泛应用该技术来观察和分析细胞内的微细结构和分子在细胞内的分布，例如细胞内游离钙、活性氧、转录因子、表面分子、细胞凋亡、细胞膜流动性、胞内分子的运动、细胞间的缝隙连接、蛋白问的相互作用等方面。

传统的荧光显微镜配备的是胶卷相机，胶卷的冲洗非常复杂、耗时耗力。随着科学技术的发展，数字成像系统也应用到荧光显微术上。其中电荷耦合元件（Charge-coupled Device，CCD）就是与荧光显微镜密切相关的数码摄像产品。它能够将荧光显微镜拍摄的显微摄影产品通过USB接口传输到电脑中，便于图像的采集研究。随着技术的进一步发展，分辨率也越来越高，因此通过CCD，可以拍摄到分辨率更高的图片。

1.2课程设置的需要

根据本校研究生现有课程以及科研工作的需要，特开设“荧光显微术原理及应用”。现有的课程“植物显微技术”注重石蜡切片，尤其是实验环节甚少涉及显微镜；而现有的“电子显微镜”课程主要讲述超薄切片和透射电镜以及扫描电镜的原理及使用。因而“荧光显微术原理及应用”课程的开设，填补了两者之间的空档，能够更好地为广大教师和研究生的科学研究工作服务。

1.3科学研究的需要

随着学校教师科研项目的增多、科学研究的深入，越来越需要使用相应的技术手段，例如研究特定基因功能，需要进行转基因验证，一般加入GFP，YFP等报告基因，此r需在激光扫描共聚焦显微镜下进行观察将基因表达的蛋白进行定位并分析。

1.4现有实验平台的支持

北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室下设三个研究平台，其中显微平台具备体式荧光显微镜、倒置荧光显微镜、正置荧光显微镜和Leiea的激光扫描共聚焦扫描显微镜等大型仪器设备，为本课程的顺利开设提供了物质基础。

1.5教辅人员的配备

开设本课程的教师具有多年教学经验以及多年管理体式荧光显微镜、正置荧光显微镜、倒置荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜等设备的经验，为本课程的顺利开设奠定了理论和实践基础。

2安排合理的教学和实验内容

2.1理论与实践相结合的教学理念

荧光显微术具有非常强的技术性和应用性，但理论知识的学习也是必不可少的。掌握了理论知识，能够促进实践应用。利用荧光进行显微观察的显微镜有许多种，根据本校的设备基础结合教师们的研究需求，重点选择体式荧光显微镜、荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜等内容。首先，要进行相关的理论讲解，使研究生们掌握理论基础，在此基础上设计一些独立、完整的小实验，使学生能够掌握相应仪器的使用方法。例如利用体式荧光显微镜进行转基因材料的鉴定。体式荧光显微镜具有较大的景深，能够非常方便地观察转绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白的转基因材料，如草莓、番茄、板栗、海棠、百合、玉米等。大大简化了原来在显微镜下观察的繁琐的前处理过程。

2.2选择合适的教学内容

根据研究生的研究需求结合学术发展的进展，选择合适的教学内容。理论课程内容主要分为五个部分。第一部分显微镜的发展简史。包括显微镜的发展，荧光的发现、发展、选择及使用、荧光蛋白的发现、发展和使用等等。第二部分为体式荧光显微镜，包括其理论及应用。第三部分为荧光显微镜，包括理论及应用。第四部分为激光扫描共聚焦显微镜的理论和应用。第五部分：其他荧光显微技术，如更为先进的双光子荧光显微镜、转盘激光扫描共聚焦显微镜等内容。

2.3设置合理的实验内容

教学中想尽办法引导学生把理论知识和其自身的科学研究有机结合，提高学生的兴趣和对知识的掌握能力。基于本校农业应用新技术北京市重点实验室显微平台的仪器设备配置情况，结合研究生研究课题的需求，设置相应的较为系统性的小实验。

体式荧光显微镜因其景深较大，可以观察较大的实验材料。例如可以观察本校不同研究团队的转基因材料以及较大的组织块等。前期已经成功观察到了根的转基因荧光。

荧光显微镜观察花粉管内囊泡运输。首先需要选择合适的花粉。不同物种的花粉其萌发时间及生长速度差异巨大，要选择生长速度合适的花粉。首先要培养花粉管，其次用荧光染料FM 4-64标记囊泡，在此过程中需要学生分组合作，配置所需试剂，随后在显微镜下观察花粉萌发及花粉管生长情况。接着选择合适的花粉管，用荧光染料FM 4-64标记囊泡，随后在荧光显微镜下观察囊泡运输情况并采集图像，利用软件对荧光进行定量分析，得出相应结论，撰写实验报告。

利用激光共聚焦显微镜采集花粉管内游离钙离子信号。植物细胞因具细胞壁，钙离子标记较楦丛樱时间较长，能够锻炼研究生的动手能力。花粉管培养完毕后用Fluo 4 AM标记钙离子，用xyt的模式观察钙离子的动态变化，利用软件进行荧光定量分析，得出相应结论，撰写实验报告。

3考核方式的探索

根据本门课程注重实验的特点，以及出于对学生基本实验技能、创新意识、创造性思维、科学思想、科学态度等进行全面评价，总成绩评定由三部分组成：（1）上课及参加实验的考勤（占30%）；（2）自己制作并进行显微观察的图片质量（占40%）；（3）实验报告写作及其对实验中出现问题的分析情况（占30%）。课程论文内附有学生自己拍摄的自己制作的切片的显微照片，以及对照片出现的问题分析。

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【摘要】

目的：利用激光共聚焦显微镜评价超声乳化白内障摘除术后角膜的活体组织学改变。方法：随机选择中国医科大学眼科医院30例欲行白内障摘除手术的患者进行超声乳化白内障摘除术。患者于手术前、术后1，7，30d；6mo，利用海德堡Retina Tomograph IIIRostock Cornea Module (HRTIII RCM)激光共聚焦显微镜对角膜各层细胞及神经进行形态学分析。结果：形态学观察发现角膜上皮细胞和前基质细胞在术后无明显改变。角膜基质神经纤维呈不规则的节段状改变，在术后第7d最为显著。中基质及后基质层的角膜细胞同术前相比反射更为明显。角膜内皮细胞的细胞核和细胞质肿胀。结论：超声乳化白内障摘除手术对角膜组织有一定的影响，导致细胞和组织形态的改变，但这些改变是可逆的。

【关键词】 超声乳化白内障手术；角膜；组织学

Abstract　AIM:To define the microscopic cornea changes with in vivo laser scanning confocal microscopy after phacoemulsification.METHODS: Thirty eyes were assigned to undergo cataract extraction by ultrasonic phacoemulsification in China Medical University. The morphologies of corneal layer by layer were evaluated in vivo with the Heidelberg Retina Tomograph IIIRostock Cornea Module (HRTIII RCM) confocal microscope pre and postoperation for up to six months.RESULTS: For morphology， some irregular segments of nerve fiber were most pronounced seven days postoperation. Stroma keratocytes were obvious compared with the preoperative condition. Corneal endothelial cells become obviously swollen in both the cytoplasm and nucleus. At six months， corneal cell and nerve morphology recovered to normal.CONCLUSION: Microstructural abnormalities were identified at each level of the cornea recovery process after phacoemulsification and lead to corneal morphology changes， but these could be recovered to normal in six months.

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KEYWORDS: phacoemulsification; cornea; histology

0　引言

超声乳化白内障吸除术最主要的优点是减小手术切口、减轻组织损伤、使患者视力更快恢复。现代白内障手术技术的进步将手术引起的散光和炎症降到最低，术后视力恢复快［1］。而角膜水肿成为影响术后视力恢复的主要因素。在过去围绕术后角膜并发症的研究多集中在角膜内皮失代偿和观察内皮细胞改变上（例如细胞数、密度和/或形态）［24］。目前还没有活体角膜各层组织改变的观察。新一代海德堡激光共焦显微镜的角膜模块，可以提供高分辨率的眼表组织图像，使我们能够活体动态观察角膜组织改变和角膜界面的形态［5］，分析超声乳化白内障吸除术后角膜组织的改变。我们利用该设备观察超声乳化白内障摘除术后6mo内角膜的组织学改变，包括：角膜上皮细胞、角膜上皮下神经纤维、角膜基质神经纤维束、角膜基质细胞、角膜内皮细胞等。

1　对象和方法

1.1　对象

我们随机选取200609/200704我院行年龄相关性白内障吸除术的患者25例30眼，男13例，女12例，平均年龄57.8（52±6.7）岁。纳入标准：散瞳后瞳孔≥7mm，图1 A：术前角膜上皮细胞为大小不一的多角形细胞镶嵌在一起，部分细胞可见细胞核；B：术后第1d部分患者出现片状的翼状细胞边界消失；C：术前角膜神经纤维；D：术后第7d神经纤维呈不规则的节段状；E：正常角膜前弹力层的朗格汉斯细胞；F：手术后朗格汉斯细胞形态没有变化；G：术前基质层的神经纤维；H：术后1mo两例患者出现基质神经不规则弯曲和串珠状改变。

角膜内皮细胞计数＞2000 个/mm2。排除标准：患有眼部其他疾病或影响角膜恢复的全身疾患，如：角膜病变、青光眼、葡萄膜炎、干眼或有内眼手术史、系统疾病如：糖尿病。

1.2　方法

常规术前检查，包括视力检查，双眼裸眼远近视力(UCVA)和最佳矫正远近视力(BCVA)；裂隙灯显微镜检查角膜、前房、晶状体混浊程度；眼底检查；眼压；角膜内皮细胞检查；B超；屈光状态(自动验光仪等)及生物学测量(A超、IOL Master等)测量眼轴长度等。全部手术由同一位有经验的术者进行。使用Infiniti超声乳化仪(Alcon， USA)，全部患者术前接受5g/L盐酸丙美卡因滴眼液(Alcaine， Alcon， USA)表面麻醉，3.0mm透明角膜切口，3g/L透明质酸钠与40g/L硫酸软骨素(Viscoat)（Alcon， USA）保护角膜内皮。行5.5～6.0mm连续环形撕囊，白内障超声乳化吸除，负压500mmHg、流量35mL/min，瓶高95cm。囊内植入Acrysof SN60AT或SA60AT人工晶状体(Alcon， USA)，I/A吸除黏弹剂。术后自第1d起给予典必殊滴眼液3次/眼，疗程4wk，全部患者无术中或术后并发症。利用最新的HRT Ⅲ/RCM共焦显微镜检查全部患者，HRT Ⅲ纵向分辨率约1μm，可以实现活体角膜各层的图2 A：角膜基质；B：术后1mo内，前基质层细胞形态未见明显变化；C：术前的中基质层细胞；D：手术后角膜中基质细胞形态无明显改变；E：手术前后层基质细胞；F：手术后后基质细胞层细胞反射明显且细胞明显肿胀；G：角膜内皮细胞；H：术后1mo的角膜内皮细胞数明显下降，细胞明显肿胀，失去六角形外形而变得不规则，细胞核清晰可见。

研究［5，6］。HRT Ⅲ/RCM的激光光源使用波长670nm的二极管激光。进行活体共焦显微镜检查前，于结膜囊下穹窿部滴1滴5g/L盐酸丙美卡因滴眼液和1滴凝胶型人工泪液2g/L卡波姆（Bausch & Lomb， US）。检查在矢状轴进行，因此检查时，能够精确显示角膜各层结构。对全部患者进行中央角膜各层采集，每个患者在同一检查层面至少采集5张共焦显微镜图片。每眼的检查时间

2　结果

2.1　角膜上皮

术后1mo中央角膜上皮形态无明显改变。术前角膜上皮细胞为大小不一的多角形细胞镶嵌在一起，部分细胞可见细胞核（图1A）。有8例在术后第1d出现片状的翼状细胞边界消失（图1B），在第3d恢复。

2.2　角膜神经纤维

角膜神经纤维位于前弹力层和基底上皮细胞之间。术前可见角膜神经呈清晰的、反射均一的线状结构。局部还观察到一些树枝状或细小神经纤维束(图1C)。手术后神经纤维呈不规则的节段状，于术后第7d最明显(图1D)。部分神经纤维出现异常分支，断续排列，主干神经纤维增粗、弯曲，反射强弱不均。术后30d尚未恢复，于术后6mo形态恢复正常。

2.3　前弹力层和朗格汉斯细胞

在正常角膜，前弹力层为无定形的均一的间质层。Patel和McGhee研究发现出现于前弹力层的细胞称为朗格汉斯细胞［6］。本研究观察到手术前朗格汉斯细胞表现为亮的细胞微粒和无突起的细胞体，或细胞树突（图1E）。手术后细胞形态没有变化（图1F）。

2.4　角膜基质层的神经纤维

基质层的神经纤维位于前部和中间基质层之间。术前基质层的神经纤维为粗的、高反射、直线性结构（图1G）。术后1mo，有两例患者出现基质神经不规则弯曲和串珠状改变（图1H）。

2.5　角膜基质

前基质细胞界限清晰、高反射、细胞核呈卵圆形，位于不同位置 （图2A）。在术后1mo内，前基质层细胞形态未见明显变化（图2B）。中基质层细胞为规则的椭圆形，较前基质层细胞密度低（图2C）。手术后角膜中基质细胞形态无明显改变，但细胞较术前反射高（图2D）。手术前，后层基质细胞较前基质层细胞圆（图2E），手术后，后基质细胞层细胞反射明显，且细胞明显肿胀（图2F），至术后6mo恢复。

2.6　角膜内皮细胞

术前角膜内皮细胞呈规则排列的六角形细胞，细胞体高反射、细胞边界低反射，细胞核不明显（图2G）。术后角膜内皮细胞数明显下降，细胞明显肿胀，失去六角形外形而变得不规则，细胞核清晰可见，至术后1mo未恢复（图2H），手术后6mo细胞形态恢复正常，但仍然可见细胞核。

3　讨论

与白内障囊外摘除手术（ECCE）相比，超声乳化白内障吸除术最主要的优点是减轻组织损伤、使视力更快恢复，但是仍然存在术后并发症。研究表明白内障手术后内皮细胞数降低和术后角膜水肿与超声乳化白内障吸除术后角膜内皮细胞的丢失有着密切的关系［7］。目前对术后角膜并发症的研究集中在角膜内皮细胞丢失和角膜厚度方面，其检测设备有角膜厚度测量仪、非接触式角膜内皮镜等，但观察活体角膜各层修复过程的检查方法十分有限。最近活体激光共焦显微镜开始在实验室和临床应用。它可以实现对角膜显微结构更详细的逐层观察，能够提供眼表的高分辨率图像，以供观察角膜组织的改变。

我们利用活体激光共聚焦显微镜观察了超声乳化白内障吸除术后角膜各层的改变。至术后1mo，大部分病例与术前比较，中央角膜上皮细胞的形态无明显变化。部分病例表现为术后第1d翼状细胞边界不清，3d后恢复。在角膜神经方面，我们观察到一些纤维节段不规则增粗。与术前比较，一些神经纤维出现中断、更加迂曲等改变。角膜基质层可以观察到术后角膜基质细胞水肿和细胞密度降低，这种现象多出现于角膜后基质层。对于角膜内皮细胞，与术前比较出现显著的内皮细胞密度减低，且有统计学意义。术后内皮细胞及细胞核水肿明显，至术后6mo细胞形态才恢复正常。以上各层角膜组织的形态改变在术后6mo的复查中均恢复了正常。

根据对术后角膜情况的观察，我们将白内障手术中可能影响角膜的因素归纳为以下4类：（1）对角膜内皮的直接机械损伤包括：切口和手术过程中晶状体碎屑、器械或人工晶状体（IOL）接触角膜；（2）灌注液的影响（化学成分、流速、湍流、渗透压）［810］；（3）超声乳化能够在前房产生羟基，引起组织损伤；（4）针头在切口内前后运动，金属针头振荡压迫袖套，使温度升高引起热损伤。

尽管超声乳化白内障摘除术后利用激光共聚焦显微镜可以观察到角膜组织在显微结构上存在一定的异常改变，但这些损伤在术后很快就能恢复。将来对于各层细胞还应进一步进行定量分析，以指导临床医生对白内障术后角膜恢复过程的全面了解。

参考文献

1　Borasio E， Mehta JS， Maurino V. Surgically induced astigmatism after phacoemulsification in eyes with mild to moderate corneal astigmatism temporal versus onaxis clear corneal incisions. J Cataract Refract Surg 2006; 32:565572

2　Fine IH， Packer M， Hoffman RS. New phacoemulsification technologies. J Cataract Refract Surg2002; 28:10541060

3　Suzuki H， Takahashi H， Hori J， et al. Phacoemulsification associated corneal damage evaluated by corneal volume. Am J Ophthalmol2006; 142:525528

4　Lundberg B， Jonsson M， Behndig A. Postoperative corneal swelling correlates strongly to corneal endothelial cell loss after phacoemulsification cataract surgery. Am J Ophthalmol 2005;139:10351041

5　Eckard A， Stave J， Guthoff RF. In vivo investigations of the corneal epithelium with the confocal Rostock Laser Scanning Microscope (RLSM). Cornea 2006;25:127131

6　Patel DV， McGhee CN. Contemporary in vivo confocal microscopy of the living human cornea using white light and laser scanning techniques: a major review. Clinic Experimental Ophthalmol 2007;35:7188

7　Claesson M， Amnitage WJ， Stenevi U. Corneal oedema after cataract surgery: predisposing factors and corneal graft outcome. Acta Ophthalmol 2008;5 Epub ahead of print

8　Behndig A， Lundberg B. Transient corneal edema after phacoemulsification: Comparison of 3 viscoelastic regimens. J Cataract Refract Surg 2002;28:151155

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关键词： 显微测量； 超分辨图像复原； 圆孔边缘判据； 核孔膜

中图分类号： O 439 文献标志码： A doi： 10.3969/j.issn.1005-5630.2016.05.002

文章编号： 1005-5630（2016）05-0383-05

引 言

数字显微图像测量是重要的微结构横向尺寸非接触测量方法[1]。目前用于显微测量的主要设备有扫描隧道显微镜、电子显微镜、原子力显微镜、光学共焦显微镜和普通光学显微镜。其中，扫描隧道显微镜、原子力显微镜、电子显微镜横向分辨力具有纳米级横向分辨力，其图像能够直接用于微结构的横向尺寸测量，但这些设备造价昂贵、操作复杂、测量时间长，适于计量标定使用。光学共焦显微镜横向分辨力比普通光学显微镜提高了1.4倍，且具有独特的三维成像能力，是重要的微结构三维尺寸测量仪器，但光学共焦显微镜属于相干成像系统，其图像不能直接采用超分辨复原等处理方法，横向分辨力难以进一步提高，加之扫描成像速度较慢，造价较高，也不适于用作在线实时工业测量设备[2]。普通光学显微镜成像速度快，图像处理算法丰富，成本低廉，特别适合在线实时工业测量设备。但是，受卷积效应影响，微结构的光学边缘与微结构的物理边缘不一致[3-4]。建立准确的微结构边缘判据，依据光学图像精确确定微结构的边缘是普通光学显微成像测量的关键[5]。常规的边缘检测方法首先采用固定阈值或动态阈值对图像进行分割，然后再通过二值化来确定边缘，或者利用边缘检测算法求取数字图像梯度来确定边缘。但受显微镜分辨力影响，直接采用原始图像测量，精度难以满足需求[6]。

本文利用0.550 μm单色光作为照明光源对圆孔结构显微成像，然后利用超分辨复原算法处理原始图像，消除衍射效应影响，提高圆孔结构图像分辨力，并依据超分辨后图像建立圆孔图像的边缘判据，探测圆孔边缘，进而测量直径，提高了对微米级圆孔直径的光学显微测量精度。该方法能够实现对圆孔结构快速、准确的显微图像测量。

由图5可见，测量误差随着采样间隔的变大而变大，为保证测量结果准确性，应采用小的采样间隔。当图像归一化采样间隔小于1（当λ=0.550 μm，nsin u=0.40，约0.2 μm）时，测量误差小于0.2（当λ=0.550 μm，nsin u=0.40，约4.4 nm）。常用图像传感器的像元尺寸和物镜参数能够满足归一化图像采样间隔要求。

4 核孔膜核孔测量实验

核孔膜是具有理想圆孔形状、尺寸均一的过滤薄膜，广泛用于膜分离（即过滤）、安全识别、防伪等领域[10]。核孔孔径是决定核孔膜过滤性能的核心参数，在化学腐蚀工序中亟需在线快速测量手段以精确控制圆孔孔径[11]。核孔孔径范围为零点几微米到十几微米。常规光学显微测量方法不能准确测量其孔径。以参数为λ=0.550 μm、nsin u=0.40、M=10×，图像传感器像元尺寸10 μm（对应归一化图像像素尺寸vΔ=0.457 0，约vAiry/8） 的光学显微镜作为测量设备，利用超分辨复原方法实现了对图 6所示名义值为6 μm（vd≈27.4）直径核孔的测量。核孔膜准确孔径由扫描电子显微镜得到，为6.268 μm，测量不确定度为0.083 μm（3σ）。核孔膜光学显微图像如图 7所示。

图7中超分辨复原图像比原始图像更为清晰，便于观察；二值化图像便于对核孔膜进行分析、测量和计数。由二值化图像得到孔径测量结果为6.35 μm，测量不确定度为0.08 μm，与扫描电镜测量结果相符，误差为0.08 μm。实验中图像处理和孔径测量时间小于30 s，较为准确地测量了核孔直径，适用于较大孔径核孔化学腐蚀过程中在线测量以及核孔膜产品质量快速检查。

5 结 论

通过对圆孔显微图像的超分辨复原，本文建立了圆孔复原图像的边缘判据IE=0.399，实现了对核孔膜核孔的精确探测和准确孔径测量，为核孔膜产品的生产过程检测和产品质量分析提供了低成本、精度满足需要、快捷易用的新方法。本方法也可以用于针孔等样品的直径测量。

参考文献：

[1] 杨国光.近代光学测试技术[M].杭州：浙江大学出版社，2001.

[2] 赵维谦，陈珊珊，冯政德.图像复原式整形环形光横向超分辨共焦显微测量新方法[J].物理学报，2006，55（7）：3363-3367.

[3] GOODMAN J W.Introduction to Fourier optics[M].3rd ed.Englewood：Roberts and Company，2004.

[4] 苏秉华，金伟其.基于Poisson-Markov场的超分辨力图像复原算法[J].电子学报，2003，31（1）：1-4.

[5] 王植，贺赛先，毛庆洲，等.数字图像处理技术在钢坯在线检测系统中的应用[J].武汉大学学报（信息科学版），2005，30（3）：269-273.

[6] 杜华月，顾济华，杨勇，等.数字图像消卷积在显微测量中的应用[J].光学技术，2007，33（4）：576-579.

[7] 顾 M.共焦显微术的三维成像原理[M].王桂英，译.北京：新时代出版社，2000.

[8] CONCHELLO J A.Superresolution and convergence properties of the expectation-maximization algorithm for maximum-likelihood deconvolution of incoherent images[J].Journal of the Optical Society of America A，1998，15（10）：2609-2619.

[9] MARKHAM J，CONCHELLO J A.Fast maximum-likelihood image-restoration algorithms for three-dimensional fluorescence microscopy[J].Journal of the Optical Society of America A，2001，18（5）：1062-1071.

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爱护眼睛，青少年朋友首先要做到，在看书学习的时候，要把书本、纸张放在距离眼睛25厘米的地方。这个距离称为“明视距离”。老师、家长要求的“25厘米距离”是怎么来的?原来，我们的眼睛，能分辨离眼睛25厘米处相距0.1毫米(100000纳米)的两个点。在这种情况下，对眼睛来说，它们所成的视角大约是1’，所成的像恰好能落在视网膜的两个感光细胞上。两个点的距离如果小于0.1毫米，它们在视网膜上的像，就都落到一个感光细胞上，我们的视觉感受到的就只是一个点。显然，设法把这个视角放大，我们就可以看到更小的东西。

光学显微镜的诞生

显微镜的问世，要从400年前说起。1590年前后，眼镜工匠詹森把两个凸透镜前后放置，发现物体的细节变得十分清楚。光学显微镜就是这样偶然发明的。但是，谈到显微镜，荷兰人列文虎克的名气比詹森大得多。列文虎克的贡献，不仅是自制出放大倍数达到300的显微镜，而且致力于显微镜的实际应用。这使他成为显微镜发展史上的杰出人物。

阅读关于列文虎克的记载文字，给我们留下最难忘印象的，就是他那不可遏止的强烈的好奇心。他本是个卖亚麻制品的商人，却以制作玻璃与金属制品为乐事。他把磨制镜片、组装显微镜作为业余的消遣。做商人，那是为了生计；做实验，那是他的游戏。列文虎克用自制的显微镜发现了一个微观的世界，一个人们从未见过的世界。这使他异常兴奋。我们见惯了大自然的美，有了显微镜才发现，那个微观的自然世界也很动人、也很美!列文虎克怀着极大的兴趣观察了许许多多东西的“细节”。唾液、、尿液、叶片、牛粪等，都成了他的观察对象。他破天荒第一次利用显微镜观察到细菌，打破了数百年来人们的迷信猜测，开辟了征服传染病的新纪元。

显微镜的历史，就是不断提高分辨率的历史：使越来越小的样本细节，能够在眼睛上形成1’以上的视角。科学家渐渐认识到，光学显微镜的分辨率与照明辐射的波长成正比。照明辐射的波长越短，显微镜的分辨率越高。可见光的波长为400纳米～760纳米。现代光学显微镜的最大有效放大倍数可以达到2000，能够分辨200纳米的物体，可以看到最小的细菌。多数病毒比细菌小得多，使用光学显微镜就无法观察了。

电子显微镜的诞生

人们对光的认识也在不断深化。1864年，麦克斯韦把全部电磁现象归结为一组数学方程，推论出自然界存在电磁波，指出光只是波长在一个很小范围内的特殊的电磁波。1878年人们认识到，光学显微镜的分辨率在理论上是有限度的。科学家知道，为了提高分辨率，必须采用波长更短的“辐射”来照射样品。1905年，26岁的爱因斯坦发表了题为《关于光的产生和转化的一个启发性观点》的论文，首次揭示了光子的波粒二象性。1921年，爱因斯坦获得诺贝尔物理学奖，就是因为这篇论文的成就。1923年夏天，32岁的德布罗意提出，一切实物粒子都具有波动性；1924年，他给出物质波波长的计算公式，实物粒子动量越大，它的波长就越短。德布罗意获得1929年诺贝尔物理学奖。

物理学的这些革命性事件，引起了显微镜科学技术的革命。德国科学家鲁斯卡和克诺尔想到，既然“一切实物粒子都具有波动性”，那可以用电子束代替光作为显微镜的“光源”。电子与光子一样，也具有波粒二象性，而电子的波长比光的波长短得多，利用电子束照射样品，就能分辨样品更微小的细节。1932年，他们研制出第一台电子显微镜，放大倍数达到12000，超过了光学显微镜。这一年鲁斯卡年仅26岁。1939年，在鲁斯卡主持下，西门子公司制造出世界上第一台实用的电子显微镜。如今，电子显微镜的工作电压高达100万伏，有效放大倍数高达100万倍。电子显微镜完成了显微技术的一次革命，因此鲁斯卡获得1986年诺贝尔物理学奖金的一半，另一半由研制出扫描隧道显微镜的宾尼希和罗雷尔分享。获诺贝尔物理学奖时，鲁斯卡已经是80岁的耄耋老人了，离他去世仅仅两年。

电子显微镜的革命性在于，它用电子束代替了光学照明。在受到50～100千伏电压的加速后，电子的波长为0.53～0.37纳米，大致等于光波长的l／1000。根据两者波长的关系，大家可以推测，电子显微镜的分辨率会比光学显微镜高得多。现代电子显微镜可以分辨物体上距离0.2纳米的两个点，是光学显微镜的1／1000。借助电子显微镜，人们能够观察金属的晶体结构、蛋白质分子、细胞和病毒的结构。电子显微镜的发明，推动了生物学的研究。

扫描隧道显微镜的诞生

电子显微镜观察的物体要放在真空中，要接受脱水处理，而且要接受高速电子的打击。因此，能放进电子显微镜观察的试样受到限制，观察结果也受到影响。科学技术的发展，需要基于新原理的显微镜；而显微镜要在理论上有所突破，必须依赖基础科学的革命性的进展。1958年，日本科学家江崎玲於奈在研究重搀杂PN结时发现了隧道效应，揭示了固体中电子隧道效应的物理原理。江崎玲於奈与贾埃弗、约瑟夫森分享1973年诺贝尔物理学奖。

1978年，一种新型显微镜的灵感，在一次谈话中产生了。一天，IBM公司苏黎世实验室的科学家罗雷尔向德国研究生宾尼希介绍他们实验室的表面物理研究计划。31岁的宾尼希提出，可以用隧道效应来研究表面现象啊!罗雷尔对他的想法很有兴趣。于是，1978年底，罗雷尔就邀请宾尼希来到苏黎世，一起研制利用隧道效应的显微镜。宾尼希和罗雷尔克服了重重困难，终于在1981年研制出扫描隧道显微镜。它是显微技术的又一个革命性的进展，放大倍数达到数千万倍。这种新型显微镜的革命性表现在，它是借助隧道效应研究材料表面。因此，它不使用透镜，对样品无破坏性，而且可以获得三维图像。

扫描隧道显微镜的研制成功，展示的是综合性成果之和谐美。最早利用隧道效应来研究表面现象的不是宾尼希和罗雷尔，而是美国物理学家贾埃弗。我们可以想见，观察样品表面原子尺度，必定要求仪器具有极高的稳定性。贾埃弗未能克服这个巨大的障碍。宾尼希和罗雷尔却在3年时间里，实现了理论上、实验技术上和机械工艺上三大方面的突破，解决了仪器的稳定性难题，取得了最后的成功。没有机械工艺上的突破，扫描隧道显微镜是无法成功的。

扫描隧道显微镜分辨率极高，水平方向达到0.2纳米，垂直方向更达到0.001纳米，可以给出样品表面原子尺度的信息。我们知道，一个原子的典型线度是0.3纳米。对于单个原子成像来说，这样的分辨率已经是足够了。扫描隧道显微镜的发明，促进了生物科学、表面物理、半导体材料和工艺、化学作用的研究。扫描隧道显微镜技术还在继续发展。例如，为了弥补扫描隧道显微镜只能对导体和半导体进行成像和加工这个缺陷，研制出能在纳米尺度对绝缘体进行成像和加工的原子力显微镜。

在上世纪30年代，还出现了一种借助电子来显示物体表面结构的显微镜，那就是场一发射显微镜。1937年，缪勒发明了场一发射显微镜，直接把发射体表面的图像投射到荧光屏上。因为是“直接投射”，这种显微镜的放大倍数，大约等于荧光屏半径除以发射体半径，可以达到100万。场一发射显微镜和场一离子显微镜，是迄今最得力的显微镜之一。场一发射显微镜的分辨率可以达到2纳米。场一离子显微镜的分辨率更高，可以达到0.2纳米。0.2纳米的分辨率是什么意思呢?就是说，荧光屏上能够显示出样品(针尖)表面上的单个原子。在场一离子显微镜中，样品尖端要承受强大的电场力作用。因此，场一离子显微镜仅用于研究金属材料，无法进行生物分子的研究。

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关键词 倒置显微镜；应用领域；发展趋势

中图分类号 TH7 文献标识码 A 文章编号 1674-6708（2016）166-0148-02

20世纪80年代以来，我国光学显微镜的设计发生了很大的进展，在其制作上，越来越注重实用性。为了改进光学显微镜的多功能方面，采用组合方式的装配设计集普通光镜加相差、暗视野、荧光、DIC、摄影装置于一体，使光学显微镜在使用中操作方便且灵活[1]。倒置显微镜与此原理相同，也是结合其他技术达到使用功能的目的，根据倒置显微镜的用途可以分为生物倒置显微镜、偏光倒置显微镜、金相倒置显微镜、荧光倒置显微镜等种类，从而在诸多领域被广泛使用。根据其使用功能特点，我们可以看出倒置显微镜技术具有极其宽阔的发展前景。

1 倒置显微镜技术的原理和具体操作

1.1 倒置显微镜技术的结构原理

倒置显微镜的结构主要由机械、光学和照明3个部分组成，每部分的功能组成都不相同，接下来我们将对其进行详细介绍。

首先，在机械部分，与普通光学显微镜相似，主要有镜座、镜臂、观察镜筒、物镜转换器、载物台以及调节器（包括粗螺旋和细螺旋）组成，在倒置显微镜中有着不用的功能作用，例如，镜座是用以支持整个镜体的一个底座；镜臂是在取放显微镜的时候用来手握的部位；物镜转换器是可以调换不同倍数物镜的结构；载物台用以放置玻片标本；调节器是调节标本与物镜相对位置的装置。

然后，光学部分主要包括目镜和物镜。区别于正置显微镜的是，倒置显微镜的物镜在观察用品的下方，有4～6个，其中，刻有“10×”符号的物镜较短，为低倍镜，刻有“40×”符号的较长，为高倍镜，最长的是刻有“100×”符号的油镜[2]。而且，在油镜和高倍镜上经常会有一圈颜色不同的线，以示区别。目镜装在镜筒的上端，目镜上面分别刻有5×、10×、15×，表示其放大倍数，10×的目镜较为常用。另外，显微镜的放大倍数是目镜放大倍数和物镜放大倍数的乘积，如物镜为10×，目镜为15×，其放大倍数就为10×15=150。

最后，照明部分分为透反射2种，透射式照明在载物台的上方，提供明场、相衬、诺马斯基干涉相衬等显微术的照明；反射式照明安装在物镜的下方，提供荧光观察、金相的明暗场观察、偏振光观察等；随着高分辨成像技术的发展，研究级的倒置显微镜还配置了3～4个的外接照明端口，用于激光共聚焦、荧光漂白后恢复等模块照明；通常倒置显微镜的照明系统均采用科勒照明，使均匀度达到80%以上。聚光器（集光器）的主要作用则是光线集中于所要观察的标本上，其由聚光镜和光圈2部分组成，位于镜台下方的集光器架上[3]。

1.2 倒置显微镜技术的具体操作

在倒置显微镜操作中，最常用的观察方法是相差。这种方法在观察活细胞和微生物的时候不需要染色，是一种比较理想的观察方法。在此基础上，提供各种聚光器来满足需要，可以观察到具有高对比度和对比度的自然背景颜色图像。以下我们叙述一下倒置显微镜的具体操作流程。首先接连电源开机，打开镜体下方的电控开关。在使用的之前，先把要观察的对象放在载物台上，转动转换器，选择物镜，然后进行观察，调节铰链式双目目镜到舒适的状态为止，接下来开始推拉调节镜下的亮度调节器至适宜光源状态，再调节聚光镜下面的光阑，调节光源大小。下一步是调节像距，即转动物镜转换器选择合适倍数的物镜和目镜的同时，调节升降来减小或消除图像周围的光晕，从而提高图像的衬度。下一步就可以直接通过目镜进行观察了，在观察过程中可以调整载物台，选择想要观察视野。最后一步是关机：取下观察对象，使用光源亮度调节器把光线调至最暗；然后关闭镜体下方开关，断开电源，转动物镜转换器，把物镜镜片置于载物台下侧。

2 倒置显微镜技术的主要特点和应用

2.1 倒置显微镜技术的主要特点

根据倒置显微镜的结构分析和具体操作，我们可以发现倒置显微镜组成与普通显微镜相似，但其物镜与照明系统颠倒，倒置显微镜在观察培养的活细胞的时候，具有相差物镜。倒置显微镜和放大镜起的作用是相同的，就是把近处的一个微小物体放大成一个在人眼视力中清晰的图像，但是，倒置显微镜比放大镜的放大率更高。除了此特点，倒置显微镜的发展趋势逐渐与光电转换技术、计算机成像技术等技术结合，在使用中越来越方便灵活。根据其用途可以分为生物倒置显微镜、偏光倒置显微镜、金相倒置显微镜、荧光倒置显微镜等种类，在生物学、医疗科研等领域具有广泛的应用价值。

2.2 倒置显微镜技术的主要应用

倒置显微镜种类较多，根据目镜类别可分为单目倒置显微镜、双目倒置显微镜和三目倒置显微镜，其中三目倒置显微镜的构造中，除了用于双眼观察的两目，还有一目可以用来外接数码相机或计算机，从而组成数码相型倒置显微镜、电脑型倒置显微镜，而电脑型倒置显微镜可以分为生物倒置显微镜和金相倒置显微镜，根据其不同构造发挥的功能，不同的倒置显微镜应用的领域也有所不同。以倒置生物显微镜和金相倒置显微镜为例，倒置生物显微镜适用于生物领域，可以用来观察细菌以及活体组织培养、生物切片、流质沉淀以及其他透明或者半透明物体、粉末、细小颗粒等物体，与普通生物显微镜相比较，倒置生物显微镜对附着培养皿底部和悬浮培养基中的活体物质具有高效的观察功能，另外，倒置生物显微镜在食品检验、水质鉴定、晶体结构分析及化学反应沉淀物分析等领域也能发挥巨大作用。金相倒置显微镜的物镜在工作台下方，在使用金相倒置显微镜的时候不需要考虑所观察物体非观察面的平整情况，并且由于倒置的结构，工作台面的上方比较空旷，也不用考虑所观察物体的高低大小[4]。因此，金相倒置显微镜在金属材料以及其它固体块状物体的工业企业研究中应用广泛。不过，在工作台下方的镜头十分容易沉积灰尘，因此金相倒置显微镜使用者需要勤加保养，以免由于镜头的污渍影响观察效果。

3 倒置显微镜技术的发展趋势

综合以上对倒置显微镜的结构特点和主要应用来分析，我们可以看出倒置显微镜能够供高校科研实验、医疗卫生单位等部门使用，可以用于细胞、微生物、细菌、组织培养、沉淀物、悬浮体等的观察，能够连续观察并拍摄记录细菌等生物在培养液中繁殖分裂的过程，在免疫学、细胞学、遗传工程学、肿瘤学、寄生虫学、工业微生物学、植物学等各个领域发挥十分重要的作用。接下来我们将根据倒置显微镜技术的具体应用情况，可以看出倒置显微镜技术的发展趋势主要体现在倒置显微镜本身仪器精化、计算机系统应用于倒置显微镜技术和样品制作方法3个方向，接下来我们将分析倒置显微镜技术在这3个方向的具体进程。

首先，在倒置显微镜仪器本身方面，可以将单一功能的仪器逐渐发展为多功能组合的大型仪器，提高仪器的使用效率，并且不断精化各个部件仪器，有效提高其分辨率，能够使倒置显微镜技术在实际应用中能够观察到更加精细的结构，推进微观生物学的发展。其次，关于计算机技术与倒置显微镜技术相结合的方向，可以使科研能够和信息时代的发展接轨，将计算机技术与倒置显微镜技术有效结合，促进仪器的操作技术准确化和科学化，促进图像分析技术高度自动化，在方便倒置显微镜技术操作的同时，使倒置显微镜技术能够更具有实用性和灵活性。最后，在样品制作方面，要严格规范样品制作的过程和环境，研制出特殊环境的样品室和超高压倒置显微镜，使用科学有效的方法，使研究的生物能够在自然环境下完成动态过程，并观察到自然状态下的生物形貌，提高观察研究成果的质量和效率。除此之外，在对倒置显微镜的保养方面，一定要注重各个零件构造的清洁和养护，以保证仪器的使用性能，从而延长显微镜的使用寿命。

1674年，列文？虎克研制发明出来了第一台光学显微镜，从此以后，显微镜成为了人们观测微观世界的必不可少的工具，在各个学科领域中得到广泛的应用并发挥了巨大的作用。随着科技的发展和社会的进步，为了满足各个领域科研对显微镜的需求，倒置显微镜技术作为一种新型的显微镜操作技术在各个科学领域应用后受到了极大的推崇。科学是没有止境的，伴随着倒置显微镜技术在生命科学教学、科研、医疗研究等方面的推广，倒置显微镜技术会逐渐趋向成熟，使其在实际使用中更加方便灵活，具有更大的实用性和使用价值。

参考文献

[1]沈思嗣，杨怡姝，王小利，李泽琳，曾毅. 配有电动载物台倒置显微镜的操作[J].实验室研究与探索，2010，29（12）：4-8.

[2]窦文斌，王建国，孙忠良.倒置显微镜成像系统焦区衍射场分析[J].东南大学学报：自然科学版，2002（3）：340-345.

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关键词：光学薄膜 薄膜应用 薄膜制备

中图分类号：G633.91 文献标识码： C 文章编号：1672-1578（2013）04-0178-01

光学薄膜的应用始于20世纪30年代。现代，光学薄膜已广泛用于光学和光电子技术领域，制造各种光学仪器。光学薄膜的特点是：表面光滑，膜层之间的界面呈几何分割；膜层的折射率在界面上可以发生跃变，但在膜层内是连续的；可以是透明介质，也可以是吸收介质；可以是法向均匀的，也可以是法向不均匀的。本文依据光学薄膜的性质特点，介绍了不同作用的光学薄膜在以下几个仪器设备中的的应用。

1 望远镜上的光学薄膜

常见的望远镜镜头上呈蓝色或红黄色。当膜是蓝色的它属于单层氟化镁，它的折射率N=1.38，相对于基质玻璃的折射率N=1.5较小（目前还找不到射率N=1.22的材料） ，膜层材料折射率小于基质折射率，膜就会产生增透的效果。而当膜层材料折射率大于基质折射率时，膜就会产生增反的效果。由于它是针对人眼敏感的黄绿光（λ=550nm）设计的λ/4光学厚膜，对在离开550nm波长稍远的光波，此膜所产生的反射率增大，因此我们看到这种膜为蓝色（λ=400nm）或紫红色（λ=380nm及780nm）。同样道理，如果把允许通过的光波范围设计在偏离红黄的区域，这种增透膜会对红黄色光谱的增透作用将略为降低，而对非红黄的蓝光真正增透，我们就会看到一种反射为红黄色的膜，即此膜对红黄色的光反射略为强。

在实际中，分别采用蓝膜和红膜的两架望远镜进行观察比较，就会发现：蓝膜镜观察到的景物略呈红黄色，红膜望远镜镜观察到的景物呈淡蓝色，就是上述这个道理。

2 光学薄膜在摄像机、照相机上的应用

摄像机镜头，是让可见光范围内全部光谱最大限度透过，即透过波带要尽量的宽，从而获得真实地反映自然界色彩的效果，采用了三层膜系结构。

当基质玻璃折射率Ng1.65时，用λ/4-λ/4-λ/4形式。这种分层膜系，由于在更多的波谱处追求反射率为零，增透波带变宽，某些反射率不为零的色光被反射的情况相对突出起来，所以这种膜系更是五彩纷呈（如有绿红带黄的，以及其它一些色彩）。再者，由于薄膜对于入射白光的选择性反射，也因入射光的角度变化而发生相应变化，所以我们从不同的角度观察这些光学表面时，将会看到不同的色彩反光。通常，入射角度越大，红光的反射越大，所以侧面看镜头时多呈红黄色。

为了与彩色显示设备中的三原色还原系统标准相一致，光电式彩色摄像机中所用的彩色分光系统，也是利用薄膜对光波的选择性透反作用，将白色光分离成三束原色光进入信号记录仪，以备在相应制式的放映系统中播放使用。

3 光学薄膜在显微上的应用

显微镜是用来观察极细微物质的光学系统，除了要对极其细微的物质充分照亮外，它的成像光学系统其必须尽可能地提高光通量，以减少光能反射损失，由于显微镜的光学系统较为复杂，光学表面多达20个左右，如不采取增透措施，其光通量可能降到30%，同时较强的反射光还会使杂散光增加，从而影响像的衬度、损害像的质量，所以它的镜片表面所镀的起增透作用的膜是必要的。

我们常见的显微镜物镜和目镜光学表面呈蓝色或紫红色，这是为了让波长为λ=550 nm的黄绿光有利通过，而在镜片上镀上氟化镁的效果，其光学厚度为λ/4根据透射对光谱的选择性曲线，在红光区及紫光区反射相对增加，因此所见的薄膜成紫红色或蓝色。

4 光学薄膜在眼镜镜片上的应用

如果镜片表面没有镀膜，会使观察者看戴镜者眼睛时，看到的却是镜片表面的一片白光或者是观察者的像。拍照时，这种反光还会严重影响戴镜者的美观。再者，由于屈光镜片的前后表面的曲率不同，它们之间会产生内反射光，内反射光会在远点球面附近产生虚像，也就是在视网膜的像点附近产生虚像点既“鬼影”。所以高折射率的镜片如果没有减反射膜，反射光会对戴镜者带来的不适感比较强烈。增透膜就利用了这个原理，在镜片的表面镀上增透膜，使得膜层前后表面产生的反射光相消干涉，达到增透的效果。

利用人眼敏感度较高的波长为555nm光波。膜层厚度应为基准光的1/4波长，当时，对于增透膜层，当镀膜的厚度过薄，反射光会显出浅棕黄色，如果呈蓝色则表示镀膜的厚度过厚。镀减反射膜层的目的是为了减少光线的反射，并不可能完全做到没有反射光线。镜片的表面也总会有残留的颜色，残留颜色哪种是最好的，其实并没有标准，目前主要是以个人对颜色的喜好为主，较多的绿系。

同样，染色镜片或变色镜片的透光量会降低，但镜片表面的反射光依然存在，产生的鬼影和眩光依然会干扰视觉，影响戴镜者视物的清晰度和舒适性。所以染色镜片和变色镜片也是需要镀增透膜的。

5 光学薄膜在照明设备上的应用

利用光学薄膜的干涉特性，选择性地吸收，反射或透射照明光源中的红外辐射能量，已成为近年热性能光学控制薄膜的一个重要应用领域。其中对可见光具有很高透过率的红外高反射薄膜，用于白炽灯、卤素灯、低压钠灯等照明光源上，即可提高能量利用率，又能改变光源光谱的能量分布，满足特定照明的需求。红外高反射薄膜中用途较广的是金属――介质复合膜和全介质多层干涉膜。

金属――介质复合膜最典型的薄膜，以较简单的结构实现了可见光透过红外高反射的目的，该薄膜的光学特性曲线。

采用膜系结构的金属――介质复合膜，用热蒸发方法镀制于白炽灯玻壳内表面，可使白炽灯的相对光谱能量分布中红外辐射能量几近为零，而可见光的光谱能量却较未镀膜时有所增加，使相同功率的镀膜白炽灯输出光通量较普通灯泡为大，起到了一定的节能作用。

参考文献：

[1]王文梁等.光学薄膜消偏振技术及进展[J].光学仪器.2007，9.

[2]显微技术与光学薄膜[J].现代显示.2007.3，10-16.

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十大望远镜品牌 1.ZEISS蔡司 蔡司是一家成立于1846 年德国，于1957年进入中国市场的全球知名光学和光电行业品牌，这家在光学和光电行业中占据举足轻重地位的科技企业，旗下产品覆盖了医疗技术、视力保健、显微镜、半导体制造、工业质量等多个领域。

2.Nikon尼康 尼康这家成立于1917年日本，专注于开发和销售各类光学产品的光学产品设计制造商，虽然在国内以照相机、数码相机、镜头享誉业内，但因双筒望远镜中所含的较高光学技术也享誉业界。

3.Leica徕卡 徕卡这家成立于1907年德国的企业，除了享誉国际的相机和运动光学产品，还先后推出了显微镜、图像采集产品、图像分析软件、激光测距望远镜、测距仪、步枪瞄准镜等多个系列产品。

4.Bushnell倍视能 倍视能这家成立于1947年美国的高性能运动光学产品生产商，经过70多年的发展，这家先后推出了雷尔相机、全球定位系统、瞄准镜、望远镜、测距仪等产品的企业，产品兼顾了从入门到专业性的各类用户。

5.Canon佳能 说起佳能大家最先想到的可能是它家的相机和镜头产品，而除了这些以外这家成立于1937年以光学技术为核心的企业，旗下产品覆盖了影像系统、个人消费、办公和产业设备等多个领域。除了数码相机、镜头、照相机外，还涉及到打印机、望远镜等产品。

6.博冠BOSMA 博冠是一家成立于2000年，集运动光电、智能家居和智能交互三大领域于一体的高新技术企业，经过二十多年的发展，旗下推出的枪瞄镜、望远镜、激光测距仪等上百种产品已经被广泛应用于医疗健康、战术、工业检测和个人消费等多个领域。

7.STEINER视得乐 视得乐是一家专注于研发创新双筒望远镜，成立于1947年德国的全球军用望远镜制造提供商，旗下推出的各类望远镜产品凭借着高清晰、坚固耐用的特点，使得普通消费者可以用于目标跟踪、高速塞车、狩猎等多个户外活动场景中。

8.熊猫牌PANDA BRAND 熊猫牌这家成立于1936年的企业，集研发生产、销售服务望远镜系列产品于一体，是先后推出望远镜、夜视仪器、眼镜等光学产品，并拥有国防级别工业也是产品科研和生产基地的望远镜知名品牌。

9.PENTAX宾得 宾得这家由理光公司于1919年推出的世界著名光学品牌，经过上百年的发展，旗下产品覆盖了数码相机、光学仪器、望远镜和各类镜头等多个领域，并因过硬的制镜技术使得品牌的运动光学双筒望远镜在业界内享有较高的声誉。

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[关键词]单分子检测；全内反射荧光显微术；绿色荧光蛋白；实时观测

[中图分类号]R 782[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.04.026

Single-molecule detection technology and its application of experimental metastasis of human salivary tu－morTian Tian, Li Shu.（Dept. of Periodontics, Stomatological Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China; Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Biomedicine, Jinan 250012, China）

[Abstract]Single-molecule detection（SMD）directly explores the essence of macro presentation by detect scale of nanometer scalar which can review every unit of the heterogeneous group and identify, classify, measurable compare its subgroups. SMD can sensitively detect small probability event or minority aim molecules of the biology system. This paper reviews total internal reflection fluorescence and applications in the life sciences.

[Key words]single-molecule detection；total internal reflection fluorescence；green fluorescent protein；realtime observation

全内反射荧光显微术（total internal reflection fluorescence，TIRFM）是近年来新兴的一种光学成像技术，可用来实现对单个荧光分子的直接检测。

本文以TIRFM为例，对单分子检测（singlemolecule detection，SMD）技术和光学分子成像技术在人涎腺肿瘤实验性转移中的应用作一综述。

1全内反射荧光显微术

TIRFM[1]利用了全内反射产生的隐失波照明样品，使照明区域限定在样品表面百纳米级厚的薄层范围内，有效控制激发体积，因此具有其他光学成像技术无法比拟的高信噪比和对比度。

至今，TIRFM已广泛用于生命科学研究，特别在SMD中，已成为当今最具前途的生物光学显微技术之一。

1.1全内反射的基本理论

全内反射是一种普遍存在的光学现象，一束平面光波从玻璃表面进入到溶液中，界面上会同时发生反射和折射，并且存在一个临界角。当入射角继续增大到大于临界角时，光不再透射进溶液，即发生了全反射。从几何光学的角度来看，当光发生全反射时，光会在玻璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。实际上，由于波动效应，有一部分光线会穿过界面渗透到溶液中，平行于界面传播，这部分光场就是所谓的隐失波。隐失波的频率与入射光线的频率相同，其强度随临界面的垂直距离呈指数衰减。由于隐失波仅沿着临界面极薄的一层范围内传播，所以利用隐失波照明样本，可以仅激发紧贴近盖玻片的一薄层范围（100～300 nm）内的荧光基团，不激发更深层溶液中的荧光基团，因此极大地提高了显微成像的信噪比和对比度，使得所呈图像的分辨率得到了显著改善。

1.2全内反射中的荧光探测

在单分子的荧光探测中，最关键的问题是如何减少背景光的干扰，使单分子的光信号超过背景光信号而被探测到。近年来，探测设备的超灵敏化使得在生理状况下荧光探测生物单分子成为现实。全内反射显微成像是采用隐失波照明的，隐失波的特点是在平行界面方向以行波场方式传播，在垂直界面方向则是一个指数衰减场。所以这种显微成像技术成像的视野开阔，同时探测样品的厚度却很薄，约为百纳米量级，可以将背景光减小到极低的水平。对于生物大分子而言，如蛋白质和核酸，为了加强信号的强度，每一个分子要用很多个相同的荧光团来标记。

1.3TIRFM的应用

1.3.1活细胞中的单分子成像单分子成像技术能够定量检测活细胞内单个信号发放分子的定位、运动、翻转以及复合物的形成等，可作为阐述细胞中信号发放机制的有效方法。TIRFM因其独特的照明方式，背景荧光极低，较之其他生物成像技术而言，在活细胞中的单分子成像中更显优越性。TIRFM单分子成像技术也可用来检测活细胞中绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白标记的蛋白质分子[2]。

1.3.2生物大分子的相互作用TIRFM单分子成像技术可用于监测RNA聚合酶与DNA、葡聚糖与葡糖基转移酶以及其他蛋白质的相互作用[3-4]。此外，Yao等[5]使用TIRFM单分子成像技术，实时监测了在液/固界面上发夹型分子信标DNA探针杂交反应的动力学过程。

1.3.3酶反应3, 4亚甲基二氧基甲基苯丙胺可导致人或动物模型中血清素的长期消耗，降低血清素载体的功能。Kivell等[6]利用TIRFM和活细胞共聚焦显微镜观察到了3, 4亚甲基二氧基甲基苯丙胺作用下，色氨酸转运体从细胞表面到细胞内的再分配过程。

1.3.4离子通道离子通道是一种位于细胞膜上由蛋白质单个分子或分子复合体构成的充满水的微小孔道，它的开放与关闭控制着细胞内外的离子交换。目前，离子通道构象与功能的相互关系的详细机制还不清楚。Ide等[7]将荧光标记的离子通道掺入琼脂包被玻璃上的平板脂质双层中，并用物镜型TIRFM进行观察。该技术与荧光共振能量转移或双屏光学系统结合，能够进一步观察离子通道与其配体的相互作用，也可在体外同时跟踪离子通道的构象变化和离子电流。

1.3.5DNA转录近年来，TIRFM被用于直接观察基因的表达过程[8-9]。研究人员将单RNA聚合酶分子进行荧光标记，观察到了其在DNA表面的滑动运动，这为寻找启动基因的滑动机制提供了直接证据。当RNA聚合酶与DNA的启动基因结合时，转录过程就开始了。

2分子光学成像在人涎腺肿瘤实验性转移中的应用

肿瘤本身具有病因多样复杂、病程长短不一、症状表现各异、易于扩散转移以及死亡率高等特点，因此，对实验动物肿瘤模型的应用和需求比一般疾病更多、更全面。利用免疫缺陷动物建立人体肿瘤的高转移模型，是研究肿瘤转移机制和抗转移治疗的重要实验工具，国内外学者在这方做了大量研究和探索，但理想的转移模型并不多。

转移是恶性肿瘤的生物学特性之一，是绝大多数肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因之一。通过复制人类肿瘤动物模型，可研究肿瘤的发生发展过程并阐明肿瘤的转移机制。目前肿瘤转移模型主要有两种[10]：自发转移模型和实验转移模型。近年来，分子成像技术的发展使得对小动物肿瘤模型实时非侵入活体成像已成为可能[11]。其中光学成像具有许多优点：非电离低能量照射、高灵敏度、无放射试剂、成像系统费用低[12]，这些都适用于小动物肿瘤研究。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）作为新一代报告基因，已经广泛应用于生物医学的各个领域。基于GFP的活体荧光成像可用于发现肿瘤发生发展的细胞和分子机制，并进行非侵入性活体评价抗肿瘤药物的疗效[13]。Yang等[14]利用整体光学成像系统对表达GFP的肿瘤进行了荧光成像，记录了肿瘤转移过程，分辨率可达到单个荧光细胞。他们同时建立了多种荧光蛋白标记的肿瘤模型，通过监测荧光强度反映了肿瘤的大小和位置，并对肿瘤的生长、转移和消退等特性进行了活体研究。这在一定程度上实现了对肿瘤治疗效应的活体监测和评价。整体光学成像是一种非侵入的外部成像技术，对软组织器官和骨转移癌的检测非常灵敏和快速。目前，已建立了肺癌、黑色素瘤、结肠癌等多个原位GFP肿瘤的整体荧光成像的动物模型，并利用其进行抗肿瘤生长、转移和血管生成的活体药物的筛选和评价[15]。

国内在此方面的研究内容集中于肿瘤生长，少见相关转移的报道。金鹰等[16]利用整体光学成像系统对GFP标记的皮下肿瘤进行了简单观察，但其并没报道皮下肿瘤连续生长过程中的荧光图像。熊涛[17]通过脂质体转染和细胞筛选，成功建立了表达增强型GFP的人涎腺癌细胞株，为研究肿瘤光学成像提供了内源性的光学信号。建立了GFP标记肿瘤的尾静脉注射实验转移模型以及原位种植转移模型，并对模型动物进行了整体荧光成像研究。整体荧光成像系统对裸鼠直接行荧光成像，并且实时非侵入地记录了涎腺肿瘤生长和转移的过程。实验中对5只原位注射了人涎腺癌细胞的裸鼠进行胸腔解剖观察发现，其中4只的肺部可获得清晰的GFP荧光图像，同时还观察到原位肿瘤转移至骨骼和膀胱处。

3展望

随着SMD研究的飞速发展，人们已将研究方法从宏观的统计分析扩展到对微观个体的离散研究，将研究对象从简单体系推广到复杂生物体系，力图在分子水平上阐述蛋白质、DNA等生物分子的结构与功能的关系等问题。如何实现对活细胞或体内环境的实时观测，是单分子成像研究的热点。

4参考文献

[1]Sasuga Y, Tani T, Hayashi M, et al. Development of a microscopic platform for real-time monitoring of biomolecular interactions[J]. Genome Res, 2006, 16（1）：132-139.

[2]Smyth JT, Lemonnier L, Vazquez G, et al. Dissociation of regulated trafficking of TRPC3 channels to the plasma membrane from their activation by phospholipase C[J]. J Biol Chem, 2006, 281（17）：11712-11720.

[3]Hibino K, Watanabe TM, Kozuka J, et al. Single- and multiple-molecule dynamics of the signaling from H-Ras to cRaf-1 visualized on the plasma membrane of living cells[J]. Chemphyschem, 2003, 4（7）：748-753.

[4]Yokota H, Kaseda K, Matsuura H, et al. Single-molecule imaging of the dynamic interactions between macromolecules[J]. J Nanosci Nanotechnol, 2004, 4（6）：616-621.

[5]Yao G, Fang X, Yokota H, et al. Monitoring molecular beacon DNA probe hybridization at the single-molecule level[J]. Chemistry, 2003, 9（22）：5686-5692.

[6]Kivell B, Day D, Bosch P, et al. MDMA causes a redistribution of serotonin transporter from the cell surface to the intracellular compartment by a mechanism independent of phospho-p38-mitogen activated protein kinase activation[J]. Neuroscience, 2010, 168（1）：82-95.

[7]Ide T, Takeuchi Y, Aoki T, et al. Simultaneous optical and electrical recording of a single ion-channel[J]. Jpn J Physiol, 2002, 52（5）：429-434.

[8]Wang Y, Zhang J, Chen Y, et al. Characterization of GLUT4-containing vesicles in 3T3-L1 adipocytes by total internal reflection fluorescence microscopy [J]. Sci China C Life Sci, 2009, 52（7）：665-671.

[9]Prasad TK, Robertson RB, Visnapuu ML, et al. A DNAtranslocating Snf2 molecular motor：Saccharomyces cerevisiae Rdh54 displays processive translocation and extrudes DNA loops[J]. J Mol Biol, 2007, 369（4）：940-953.

[10]Ji H, Chang EY, Lin KY, et al. Antigen-specific immunotherapy for murine lung metastatic tumors expressing human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein[J]. Int J Cancer, 1998, 78（1）：41-45.

[11]Weissleder R. Scaling down imaging：Molecular mapping of cancer in mice[J]. Nat Rev Cancer, 2002, 2（1）：11-18.

[12]Lewis JS, Achilefu S, Garbow JR, et al. Small animal imaging：Current technology and perspectives for oncological imaging[J]. Eur J Cancer, 2002, 38（16）：2173 -2188.

[13]March JC, Rao G, Bentley WE. Biotechnological applications of green fluorescent protein [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 62（4）：303-315.

[14]Yang M, Baranov E, Wang JW, et al. Direct external imaging of nascent cancer, tumor progression, angiogenesis, and metastasis on internal organs in the fluorescent orthotopic model[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99（6）：3824-3829.

[15]Steffens S, Frank S, Fischer U, et al. Enhanced green fluorescent protein fusion proteins of herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and cytochrome P450 4B1：Applications for prodrug-activating gene therapy[J]. Cancer Gene Ther, 2000, 7（5）：806-812.

篇9

美国贝克曼研究所高级科学和技术博士后研究员史蒂芬说：“该技术能够超越现在的光学系统，最终获得最佳品质的图像和三维数据。这将是非常有用的实时成像技术。”

畸变如散光或扭曲困扰着高分辨力成像。其会使对象细点的地方看上去如斑点或条纹。分辨力越高，问题会变得更糟糕。这是在组织成像别棘手的问题，而精度对于正确诊断至关重要。

自适应光学可以校正成像的畸变，被广泛应用于天文学来校正当星光过滤器通过大气层的变形。医学科学家已经开始将这种自适应光学系统的硬件应用于显微镜，希望能改善细胞和组织成像。

但伊利诺伊大学生物工程内科医学的电子和计算机工程教授斯蒂芬指出，这同样富有挑战，将其应用于组织、细胞成像，而不是通过大气对星星成像，存在很多光学上的问题。基于硬件的自适应光学系统复杂而昂贵，调整繁琐，故不太适用于医疗扫描。

篇10

关键词：胸腹水；有核细胞指数；检验方法

现阶段大部分医院在对胸腹水中的细胞含量检测仍然使用较为传统的普通光学显微镜测定法。随着检验技术的不断完善，检验仪器的不断发展，部分医院已经尝试使用分析仪器对胸腹水中的细胞含量进行检测。有研究指出[1]，在一定范围内，使用分析仪器与传统光学显微镜检测的细胞计数结果差异并不显著。但临床上采用单一的分析仪对不同浓度的体液细胞检测具有一定的限制性，无法满足部分常规细胞计数检测的测定。本次研究对400例患者使用了不同的检测方法进行细胞计数测定，同时与传统方法进行了比较分析，现将结果整理如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2012年4月-2013年4月期间我院收治的400例行胸腹水检测患者为研究对象，所有患者均在无菌操作下进行胸腹水穿刺操作，标本抽取结束后立即送检，并在40-60min内完成检测。

1.2检测仪器

本次检测仪器由杭州市隆鑫科技有限公司提供的LX-7860型尿沉渣检验分析仪，深圳市迈瑞科技有限公司提供的BC-3200全自动血液细胞分析仪，绍兴市精源仪化贸易中心提供的细胞计数板，桂林华通科技有限公司提供的奥林巴斯光学显微镜（CX21）。

1.3检测方法

1.3.1有核细胞线性测定和精密度试验

将患者抽取的胸腹水进行自然沉淀，同时在高浓度EDTA抗凝血中取富细胞血浆，并将校准后的BC-3200对富细胞血浆进行有核细胞的重复检测。选取足量的3份胸水标本进行LX-7860型尿沉渣检验分析仪检测与BC-3200全自动血液细胞分析仪检测，重复测定20次后计算有核细胞的CV值（标准差与均值的比率=σ/μ）[2]。

1.3.2尿分析仪法和血细胞分析仪法

将采集的标本使用配套质控产品进行检测，随后手动模式进行计数，操作2次后取结果的平均值。

1.3.3手工测定法

严格遵照《全国临床检验操作规程》[3]进行操作，并按照光学显微镜对胸腹水有核细胞的计数进行分组，其中有核细胞计数

1.4统计学处理

数据处理采用SPSS14.0软件包进行数据处理，计数资料采用n（%）表示，使用χ2检验，计量资料采用（χ±s）表示，使用t检验，检验结果以P

2结果

2.1三种不同方法检测出的有核细胞计数比较

第1、2组检测结果中，三种方式间存在组内差异，其中LX-7860与显微镜检测结果无显著差异（P>0.05），而BC-3200对有核细胞的检出明显高于其他两种方式；第3组组检测结果中，三种方式间两两比较均无显著差异（P>0.05）；第4组检测结果中，三种方式间存在组内差异，其中BC-3200与显微镜检测结果无显著差异（P>0.05），而BC-3200与显微镜检出方式对有核细胞的检出明显高于LX-7860（P

3结论

胸腔水是指在正常情况下的两层胸膜间存在的起到作用的液体，其含量大概在1-30ml [4]，能有效降低呼吸活动中胸膜间存在的摩擦，让肺部在胸腔内的舒展更为舒适。临床中对胸腔水中有核细胞的检测具有重要的意义，然而大多数医院现阶段采用的有核细胞计量测定仍然是产统方法，采用仪器测定在一定程度上存在局限性。尽管在一定浓度范围内对胸腹水的测定与手工测定结果无显著差异，但部分分析仪相比传统普通光学显微镜的检测精准度更高，例如细胞流式分析仪，但该仪器对于送检标本的要求也更高，一旦样品中含有不透明的杂质均会对检测结果造成影响。

随着自动化检验在临床中的普及，自动化仪器用于常规细胞计数的测定也越来越广泛，大部分学者认为在一定的浓度范围内，采用仪器检测可取代传统的普通光学显微镜检测。王刚，张延京[5]采用XE-5000全自动血液分析仪与手工法检测对胸腹水中的有核细胞进行进行检测时，将线性范围规定在800×106/L以内，而采用BC-5500对胸腹水中的有核细胞进行检测时，将线性范围规定在800×106/L以上。另外还有研究指出[6]，采用血球分析仪对有核细胞进行测定时发现，只有在标本浓度足够高的情况下其线性才足够良好，而低浓度会导致巨大的差异。所以可看出单一的仪器对线性的测定范围相对较窄，无法对临床标本中的所有浓度进行覆盖。故使用联合仪器检测能有效的拓宽检测的线性范围。本次研究发现，浓度在500×10^6/ L以内时，采用三种方式对有核细胞进行检测存在组内差异，其中LX-7860与显微镜检测结果无显著差异（P>0.05），而BC-3200对有核细胞的检出明显高于其他两种方式。当浓度在500×10^6/L-1000×10^6/L时，三种方式间两两比较均无显著差异（P>0.05）。当浓度超过1000×10^6/L，三种方式间存在组内差异，其中BC-3200与显微镜检测结果无显著差异（P>0.05），而BC-3200与显微镜检出方式对有核细胞的检出明显高于LX-7860（P

综上所述，在对患者进行胸腹水有核细胞检测时，应当选择适宜的检测仪器与方法，可提高有核细胞的检测的精准度，两种方法均可在临床中参考借鉴。

参考文献：

[1]何银华，颜宇飞，蔡峥等.Sysmex XE-2100全自动血液分析仪计数胸腹水有核细胞的评价[J].检验医学，2011，26（4）：228-230.

[2]马兴璇，龙康，唐健等.Sysmex XT-1800I全自动血液分析仪检测胸腹水有核细胞的评价[J].海南医学，2013，24（5）：735-736.

[3]胡颖.SYSMEX XT -4000i检测胸腹水有核细胞结果分析[J].中国保健营养（下旬刊），2012，22（6）：1689-1690.

[4]徐淑贞，陈明涛.UF-1000i尿沉渣分析仪在胸腹水有核细胞计数中的应用[J].浙江实用医学，2011，16（4）：302-303.