反向遗传学研究方法范文

导语：如何才能写好一篇反向遗传学研究方法，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

曹树青，2001年7月获南京农业大学博士学位。2001年8月至2003年7月在复旦大学生命科学学院从事博士后研究。2011年9月至12月在美国普渡大学从事访学研究。现任合肥工业大学生物与食品工程学院生物科学系主任、教授、博士生导师。先后主持包括国家自然科学基金面上项目、国家重大科技专项子课题等在内的国家级和省部级以及企业委托等课题20余项，指导国家大学生创新性实验计划项目2项和校级大学生创新项目7项，主持校级精品课程及研究生教改项目各1项，参与省部级教改项目3项。

作为课题组的负责人，曹树青在本领域研究较深。他先后在国内外权威和核心刊物上发表学术论文80余篇，其中在国际知名学术期刊New Phytologist、 Nature Communications、Planta、PLOS ONE、Molecular Genetics and Genomics、Pant and Soil、Plant Physiology and Biochemistry、Physiologia Plantarum等上发表SCI收录的论文30余篇。除了这些重要论文，曹树青还获授权或申请国家发明专利14项，参与撰写“973”专著1部。

土壤重金属污染是全球面临的重要环境问题之一，因为土壤污染的重金属可通过农作物而进入食物，严重影响食品安全和人类健康。为解决这一问题，科学家采取了很多措施，植物修复基因工程便是解决土壤重金属污染的重要途径之一。

其原理是利用绿色植物来转移、容纳或转化污染物使其对环境无害。研究表明，通过植物的吸收、挥发、根滤、降解、稳定等作用，可以净化土壤或水体中的污染物，达到净化环境的目的。而在其中，植物修复的对象是重金属、有机物或放射性元素污染的土壤及水体。因而，植物修复基因工程是一种很有潜力、正在发展的清除环境污染的绿色技术。

经过长年不懈的努力，合肥工业大学生物与食品工程学院生物科学系主任、曹树青教授，带领科研团队首次揭示了植物响应重金属镉胁迫信号转导的分子调控机制，为土壤重金属污染植物修复基因工程提供了新的技术途径和基因资源。2014年10月20日，这一成果在线发表在国际植物学知名学术期刊《新植物学家》上，并获得第十三届全国农业生物化学与分子生物学学术研讨会优秀论文奖。

从源头保障农产品安全

寻找和发掘耐受重金属毒害且调控重金属超量积累的关键基因并阐明其作用机理却不容易，但这却是植物修复基因工程获得成功并从源头上控制农产品食品安全的关键所在。

我国有近20%的耕地存在镉、砷、汞、铅、镍、铜等重金属超标，而土壤中重金属可通过农作物吸收进入食物链，严重影响食品安全并危及人类健康。曹树青介绍说，通过物理和化学手段治理土壤重金属污染非常困难，也容易造成二次污染。

曹树青课题组的此次研究正是瞄准于此，主要通过正向和反向遗传学途径，筛选和克隆涉及植物重金属超量积累（或降低重金属吸收）的关键基因，并阐明其作用机理。该研究不仅有助于揭示植物耐受重金属毒害的分子机理，而且可以为从源头上控制农产品安全提供新的技术途径。

在得到了转基因重大专项以及国家自然科学基金等项目资助下，曹树青课题组利用正向遗传学途径筛选和鉴定了一个拟南芥耐镉突变体xcd1-D，并克隆了其相应的基因MAN3，该基因编码一个1，4-糖苷水解酶。过量表达MAN3基因导致镉的耐受和积累，而MAN3基因功能缺失则该突变体表现出对镉敏感。镉胁迫诱导MAN3基因表达、增加甘露聚糖水解酶活性及甘露糖水平，从而激活谷胱甘肽依赖的植物螯合素合成途径上的相关基因协调表达，进而增加植物对镉积累和耐受。大量实验表明，过量表达MAN3基因的拟南芥植株，在重金属镉污染的土壤中仍然保持正常生长状态。

随着研究的不断深入，他们发现了MAN3及其介导的甘露糖的新功能，首次揭示了其在植物响应重金属镉胁迫过程中新的信号转导通路，这为土壤重金属污染植物修复基因工程提供了新的技术途径和基因资源。成果自从在线发表在国际植物学知名学术期刊《新植物学家》后，获得了业界广泛瞩目。

科研活动是一个连贯的对自然、社会规律的探索过程，因而一项科研需要坚持以保证其延续性。曹树青表示，下一步，他打算深入挖掘植物响应重金属镉信号转导的分子调控机制，对植物响应其他重金属包括砷及铅等的分子调控机制进一步研究，争取将已获得的研究成果产业化。

拓展科研的广度

创新路上，中国科技正不断向各种高度、深度和广度延伸。“精度”既是科技创新的目标，也是丈量科技创新质量的标尺，“广度”则涵盖了科学研究领域的方方面面。严格意义上，曹树青的视野在生物科学，除了从事植物修复基因工程、植物抗逆分子生物学及食品生物技术等方面研究，他的科研视野也落在利用正向和反向遗传学途径上，他筛选鉴定多个与非生物胁迫相关的功能基因，初步阐明这些基因参与非生物胁迫响应调节的可能机理。

为什么会选择这方面的研究？缘于他对粮食安全的担忧。粮食安全是国家安全的物资基础，始终是关系到国计民生和国家安危的重要问题。在他看来，如何增强作物品种的抗逆性，还依然是目前我国农业生产上亟待解决的关键问题之一。在解决这个问题方面，利用转基因育种提高作物的耐寒和抗旱能力无疑具有重要的理论与经济意义。这项工作的关键在于对植物抗逆分子机理的认识及关键基因的发掘。

通过长期的钻研，曹树青探索出了一条比较有效的科研方法。他以模式植物拟南芥为材料，通过正向和反向遗传学途径，利用现代分子生物学技术和基因工程手段，筛选和克隆抗逆关键基因，阐明其功能，并用于作物抗逆分子遗传改良。这一研究可获得具有自主知识产权的新基因，不仅可以为作物抗逆遗传改良提供新的基因资源，而且对于揭示植物抗逆分子机理具有重要的理论意义。

科研育人，并行不悖

曹树青是一个忙碌的人，平时除了做科研，还在合肥工业大学作为教授、博士生导师带学生。在他的指导下，先后培养硕士和博士生30余人，一些学生已先后在国内外知名大学从事博士后研究和攻读博士学位。他指导过的优秀学生和研究团队更是不计其数。

篇2

关键词：RNA干扰;长牡蛎（Crassostrea gigas）;TLR2-2基因;MyD88-2基因

中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：0349-8114（2014）12-2860-04

Effects of Inhibition of TLR2-2 Gene by RNA Interference on MyD88-2 Gene in Crassostrea gigas

LI Ying-xiang1，2，DU Yi-shuai1，ZHANG Lin-lin1，LI Li1，ZHANG Guo-fan1

（1.Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences， Qingdao 266071，Shandong，China;

2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100039，China）

Abstract：Double strands RNA synthesized in vitro transcription was injected toPacific oysters（Crassostrea gigas）， to study the interaction between TLR2-2 and its potential downstream MyD88 gene. The expression of TLR2-2 and MyD88-2 analyzed by qPCR reduced 72 h after injection. Moreover， in oysters where expression of TLR2-2 was inhibited by dsRNA， MyD88-2 was also found down-regulated， while the expression level of TLR2-2 in oysters where MyD88-2 was suppressed was not significant different compared with that of control group.

Key words： RNA interference; Crassostrea gigas; TLR2-2 gene; MyD88-2 gene

由于技术手段的限制，经典的基因功能研究方法（如诱变）在软体动物中暂时无法得到应用，而RNA干扰技术则成为了软体动物基因沉默的反向遗传学研究工具[1]。利用双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱导转录后的基因沉默也是一种应用非常普遍的技术手段。在细胞中，dsRNA可以被Dicer酶切割成约21～23 bp的双链RN段，即siRNA（small interference RNA），siRNA整合到沉默复合体（RNA-induced silencing complex， RISC），引导复合体中的酶切割目标基因的mRNA，从而达到使目标基因沉默[2-5];在脊椎动物中，dsRNA已经被证明可以特异性地抑制目标基因的表达;而在软体动物中，尤其是双壳贝类，虽然已经有研究在日本珍珠贝、栉孔扇贝等物种中利用dsRNA成功实现目标基因沉默[6-8]，但整体上，在双壳贝类中RNA干扰技术的应用还远远滞后于脊椎动物。

Toll-like receptor（TLR）家族参与的信号通路是天然免疫系统中非常重要的通路，其中TLR家族能够作为模式识别受体（Pattern recognition receptor，PRRs）参与入侵微生物或病原体的识别并激活免疫反应。研究表明，MyD88（Myeloid differentiation factor 88）可以通过其TIR结构域参与到该信号通路来阐明TLR信号通路。本研究通过在长牡蛎中对TLR2-2基因和MyD88-2基因进行dsRNA干扰，研究了长牡蛎天然免疫中TLR2-2基因与MyD88-2基因的上下游调控关系，为长牡蛎天然免疫的深入研究提供了参考，也为RNA干扰技术在双壳贝类的应用提供了借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 长牡蛎取自山东省青岛市胶南海域，选择大小一致、健康的个体，试验前于海水培养箱中暂养1周，每天换水。

1.1.2 主要试剂 Trizol购自Invitrogen公司;PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser和SYBR Premix Ex Taq酶购自宝生物工程（大连）有限公司;氨苄青霉素、卡那霉素、LB培养基、胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司;Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit购自Fermentas公司，其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器 7500 Fast型荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司），高速冷冻离心机、Nanodrop 2000超微量分光光度计（ThermoFisher公司），普通PCR仪（BIOER公司），冰箱、超低温冰箱、微量可调移液器、恒温摇床、高压锅、制冰机、水浴锅和超净工作台等。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计 PCR所用的引物根据GenBank中长牡蛎TLR2-2基因（OYG_10012212）和MyD88-2基因（Accession No. KC155822.1）序列设计，EF-1α（Elongation Factor-1α）基因为内参基因，具体序列见表1。

1.2.2 dsRNA的制备 剖取大小一致、健康的长牡蛎鳃组织，以Trizol法提取总RNA，反转录后得到cDNA。以cDNA为模版，用5′端带T7启动子的引物进行扩增，PCR扩增片段连接pMD 19-T载体并转化大肠杆菌DH5α。挑取菌落进行PCR，选取阳性克隆对应的剩余菌液扩大培养并测序。根据测序结果，提取的质粒即为双链RNA体外转录的模版。体外转录模版，利用T7体外转录试剂盒，按照试剂盒提供步骤进行操作，即可获取dsRNA。

将获得的dsRNA以琼脂糖凝胶电泳检测其纯度;用Nanodrop 2 000超微量分光光度计测量浓度和RNA纯度;同时用RNase A和DNase I两种酶检测产物的质量。用RNase A和DNase I进行检测时，按照试剂说明书，将转录产物分别与RNase A以1∶1的比例，与DNase I以1∶4的比例一起在37 ℃孵育30 min，孵育后电泳检测。

1.2.3 dsRNA的注射及取样 将体外转录合成的dsRNA溶解于灭菌的PBS缓冲液中，使其终浓度为1 μg/μL。从暂养1周后的长牡蛎中选取健康个体48只，随机分为4组，分别标记为空白对照组、PBS对照组、TLR干扰组和MyD88干扰组，每组单独置于一个养殖桶中。TLR干扰组和MyD88干扰组每只分别注射100 μL其对应的dsRNA，PBS对照组每只注射100 μL的PBS缓冲液，空白对照组不做处理。注射后72 h进行血细胞样品的取样，提取总RNA，用于检测目的基因表达量。

1.2.4 目的基因表达量的检测 基因表达量的检测通过实时荧光定量PCR进行。以Trizol法提取总RNA，以Nanodrop 2000超微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度和纯度。反转录合成cDNA，以cDNA为模版，进行实时荧光定量PCR反应。反应体系为20 μL，PCR扩增程序为95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。以Elongation Factor-1α（EF-1α）基因为内参基因，数据分析采用2-ΔΔCt法。

2 结果与分析

2.1 dsRNA的制备与检测

以Nanodrop 2000超微量分光光度计检测合成的dsRNA的纯度，发现A260 nm/280 nm为1.9，产量为120 μg/个转录反应（20 μL）。同时琼脂糖凝胶进行电泳检测发现dsRNA的条带单一，且片段大小与模版cDNA大小相符（图1、图2）。对于合成的dsRNA的检测，主要采用了RNase A和DNase I两种酶进行。将转录产物与RNase A以1∶1的比例在37 ℃孵育30 min，电泳检测发现产物完全降解，而将转录产物与DNase I以1∶4的比例在37 ℃孵育30 min，则发现产物未被降解（图3）。检测结果说明转录产物是RNA，而不是DNA。

2.2 dsRNA干扰的效果检测

dsRNA注射72 h后，提取血细胞检测目的基因相对表达量（相对内参基因EF-1α的表达量）。与空白对照组、PBS对照组相比，TLR组（图4A）和MyD88 组（图4B）注射的dsRNA均有效地降低了目的基因的相对表达量，其中TLR组TLR2-2基因表达量较PBS组下降了76.7%，而MyD88组MyD88-2基因相对表达量也是较PBS组下降了74.3%，而PBS组与空白对照组中，两个目的基因的相对表达量没有统计学差异。

2.3 TLR2-2基因干扰后对下游MyD88-2基因影响的检测

由图5可以看出，与PBS对照组相比，TLR干扰组中MyD88-2基因的相对表达量大幅下降;与PBS对照组相比，MyD88干扰组中TLR2-2基因的相对表达量差异不大。

3 小结与讨论

RNAi作为反向遗传学的工具已经成为研究基因功能的有效手段。近年来，这项技术在无脊椎动物的研究中也开始得到了越来越广泛的应用。但在长牡蛎等双壳贝类中相关的技术较脊椎动物还是非常不成熟的。研究认为，dsRNA处理后靶标mRNA水平下降70%以上，才可以认为干扰有效[15]。虽然也有其他研究质疑这一标准过于苛刻，认为mRNA表达量不必下降到这个水平才可引起足够的蛋白表达量变化和表型差异[16]，但即使按照70%的严格标准，本研究干扰效果也可以被认为是有效的。

目前，对长牡蛎中天然免疫系统的研究还是非常少，贝类和无脊椎动物缺少特异性的免疫反应和免疫记忆，所以完全依赖细胞和体液介导的天然免疫来进行病原防御。本研究初步探究了长牡蛎中TLR2-2基因沉默后对MyD88-2基因的影响，为其调控关系的确定提供了研究支持，对于明确TLR和MyD88在天然免疫系统中的作用提供了帮助。

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篇3

摘要:

种质资源又称遗传资源，其不仅是进行农业科技原始创新以及现代种业发展的物质基础，更是保障粮食安全、建设生态文明并实现农业可持续发展的战略性资源。本文从种质资源的收集、鉴定和评价、创制及利用等方面进行了综述，以期为分子育种时代的种质资源创新和利用工作提供可利用的信息。

关键词:

分子育种;种质资源;创新;利用

种质资源又称遗传资源，是进行新品种选育的基础材料。古老的地方品种、重要的遗传材料、野生近缘植物以及利用上述繁殖材料人工创造的各种植物的遗传材料，都属于种质资源的范畴。就作物而言，种质资源不仅是进行农业科技原始创新以及现代种业发展的物质基础，更是保障粮食安全、建设生态文明、实现农业可持续发展的战略性资源。种质资源的核心是其所携带的基因，对优异基因进行挖掘和充分利用可使农业生产取得突破性进展，举世闻名的第一次“绿色革命”就源于小麦和水稻中矮秆基因的发现和应用［1］。长期以来，我国作物种质资源工作的重点一直停留在收集、保存与鉴定等方面，导致具有广泛应用前景的高产、优质、多抗、高效等关键功能基因的发掘与利用滞后，突破性新种质匮乏以及特有基因资源流失严重等问题。根据《国家中长期科学和技术发展规划纲要》精神，从国家科技发展总体布局出发，结合经济发展和国家安全需求，在现代生物技术高速发展的时代背景下，作物种质资源的工作重心将转向其优异基因资源发掘与种质创新，包括高产、优质、抗生物及非生物逆境、水肥高效利用等基因资源，在明确其功能和应用价值的基础上，创造一批可直接用于育种的中间材料。最新公布的七大作物育种专项也将优异种质资源鉴定与利用作为各项工作的重中之重。本文对我国种质资源的收集、鉴定和评价、创制及利用现状等方面进行了综述，以期为作物种质资源的创新和利用工作提供可利用的信息。

1种质资源的收集

种质资源的收集是一个很古老的话题。作为作物种质资源大国，长期以来，我国政府和科学家也一直非常重视作物种质资源的收集工作。自20世纪50年代以来，不仅先后组织了多次农作物种质资源征集和考察工作，而且在保存设施建设方面也加大了投入，挽救了一大批濒临灭绝的地方品种和野生近缘种及其特色资源，建立了完善的种质资源保护体系［2］。2015年，农业部、发展改革委和科技部联合印发了关于《全国农作物种质资源保护与利用中长期发展规划(2015—2030年)》的通知，深入分析了在现代农作物种业发展过程中我国目前农作物种质资源保护与利用工作存在的问题，严密部署了第3次全国农作物种质资源普查与收集行动，并就实施过程提出了详细的技术规范。

2种质资源的鉴定与评价

目前我国编入全国作物种质资源目录的材料约48万余份，跃居世界第2位［3］。如何对数以万计的种质资源进行精准评价，从中发掘出优异基因并将其应用于现代化育种工作，是现阶段我国进行种质资源收集的最主要的目标之一，也是亟待解决的科学问题之一。在对种质资源进行广泛收集和考察的基础上，我国相关研究人员也对所保存的资源进行了基本农艺性状的鉴定，并进行了综合评价。而这些基于不同年份、不同地点的调查所进行的评价，由于以易受环境影响的表型特征为依据，同时受研究条件和研究方法的制约，不能全方位、多层次地展开，因此精度有限。与表型鉴定相比，基于DNA序列多态性的分子标记则能在DNA水平上揭示种质间的不同，不受环境及发育时期等因素影响，而且具有较高的稳定性和可重复性，从而成为进行种质资源的鉴定和评价的一个更直接、高效且可信的工具。现阶段，我们应重点基于分子标记进行种质资源的DNA指纹分析、遗传多样性分析、核心种质构建以及功能基因的鉴定和评价等。

2.1DNA指纹分析

DNA指纹分析是分析并比较任何生物体之间DNA序列的非常快速的方法，该方法已被广泛且有效地用于种质资源的管理。目前，用于指纹识别的分子标记有简单重复序列或微卫星、SCoT、抗性基因同源序列、SNP等多种类型。这些分子标记大多为单位点，符合孟德尔遗传规律，而且多态性高、信息量丰富。随着测序技术的不断发展，基于高通量测序的基因型检测方法也逐渐成为研究热点之一。

2.2遗传多样性分析

遗传多样性是生物多样性的核心问题，是种质资源研究的重要方向。物种内或物种间的遗传多样性可以表现在多个层次上，如分子、细胞和个体等，遗传多样性是物种保持进化潜能的基本条件。近年来，遗传多样性的研究发展迅速，新的理论和方法不断产生、发展和完善。基于分子标记的遗传多样性分析可直接用于指导育种实践，例如利用分子标记技术对作物种质资源的群体结构与遗传多样性进行分析，可以帮助育种家更有目的地选择杂组亲本，提高育种效率。

2.3核心种质构建

对资源的广泛征集和不断累积交换使得种质资源越来越多，但数量的增加并不意味着遗传变异也得到相应增加，因为资源库中可能含有较大比例的遗传冗余甚至重复的材料。这就为我们种质资源工作了提出一个新的问题，就是如何对数目庞大的种质资源进行评价和有效利用，“核心种质”这一概念的提出为这一问题提供了解决办法。构建核心种质是提高种质资源利用效率、提升种质创新能力的基础。另外，核心种质本质就是一个基因库，在作物优质单元型区段(或基因)的发掘过程中也具有广泛的应用价值。近年来，作物遗传资源核心种质的构建越来越受到学者的关注。目前，我国已构建了水稻、小麦、玉米、大豆等几大作物的核心种质库。在国家973项目的资助下，我国科学家还开展了水稻、小麦和大豆核心种质重要农艺性状单元型区段及互作研究，该项工作也将为以上作物的分子设计育种和遗传转化育种提供基因资源，为未来重要基因的合理布局提供科学依据。

3种质资源的创新

种质资源创新的过程，就是对现有种质资源中所包含的遗传信息采取某种手段或方法进行改变的过程，传统意义上的杂交育种就是种质创新的一种最基本和常用的途径。随着人们对生物体认识的不断深入以及生物技术的不断发展，种质资源创新的方法也不仅仅停留和局限于通过杂交来进行，还在组织、细胞乃至分子水平上进行。创新途径主要包括诱变、染色体工程技术、小孢子培养、原生质体融合基因工程等。近化手段、生物技术的兴起也极大地提高了人们创造和利用变异的能力，为种质创新提供了多种可利用的手段。突变体库的建立和筛选也是基因挖掘的重要基础。国际上已构建了4个大规模水稻插入突变体库。通过60Co－γ射线照射、甲基磺酸乙酯(EMS)诱变等技术，各国科学家也创制了多个水稻、玉米、小麦、大豆等主要作物的突变体库［4］。单倍体育种技术是近来发展成熟的、基于小孢子培养、花药培养等组织培养技术的育种方法，它是对植物单核晚期的花粉进行培养，诱导其形成胚状体，并通过染色体人工或自然加倍产生纯合的二倍体或多倍体植株的过程。该方法可快速获得大量纯合、稳定的双、单倍体再生植株，为保存和创造作物种质资源提供了一条有效途径。转基因技术的发展则实现了不同物种间基因的交流。转基因育种就是根据育种目标，利用现代生物技术从供体生物中分离目的基因，经DNA重组和遗传转化将其导入受体作物，经过筛选获得稳定表达的重组单株，最终结合大田选择和田间试验培育新品种或新种质的过程。该技术可以突破物种间的遗传障碍，大跨度地超越物种间的不亲和性，从而打破了遗传物质分类上的界限，实现了基因在不同物种间的转移，大大拓宽了作物遗传改良可供利用的基因来源［5］。目前，转基因育种在大豆、玉米、棉花和油菜等作物中都已取得成功［6］。多项研究表明，基因序列的微小变化可以对植物基因型产生显著影响，从而影响植物的表型。新近发展起来的基因组编辑技术有望成为继突变和转基因技术之后的育种技术发展的又一个里程碑，主要包括寡核苷酸介导的定点突变、转录激活类似效应因子核酸酶技术、锌指核酸酶、成簇的规律间隔的短回文重复序列系统。以上技术不仅可以特异地修饰某个靶向序列，从而创造新的等位基因，而且与传统的点突变相比，效率更高、速度更快、无多余的随机突变。目前，基因组编辑技术在植物的抗病性、除草剂抗性以及营养代谢等相关领域得到成功应用［7］。我们相信在不久的将来，这些基因也将对作物育种产生深远影响。

4种质资源的利用

4.1作物种质资源利用的传统途径

我国对种质资源的传统利用大致经历了直接利用、杂交育种和杂种优势利用3个阶段。20世纪50年代初期到60年代中期，我国生产上以直接利用种质资源中的优异地方品种进行就地繁殖和推广为主。在此基础上，各地不但相互交换优良品种，而且还从许多其他国家引进了多种农作物优良品种，并通过系统选择和杂交改良等途径，实现了两次品种更新换代，使优良品种得到迅速普及［3］。尽管当时这些改良品种对产量的贡献率比较低，但是，通过对全国种质资源的筛选，明确了这些作物种质资源所具有的不同特性，为后来作物新品种选育奠定了良好基础。20世纪50年代后期，杂交育种技术初露端倪，我国就迅速推广普及杂交育种技术，大规模独立自主地培育主要农作物新品种。60年代以后，我国自育优良品种已经覆盖大部分生产面积。这期间，在第一次“绿色革命”浪潮的影响下，我国科学家利用水稻地方品种“矮子占”和小麦创新种质“矮孟牛”以及从国外引进的矮秆种质资源育成了大量的水稻和小麦矮秆新品种，进一步提高了水稻和小麦的产量水平。杂种优势是在杂交育种过程中，后代所表现出的超亲现象。早在20世纪60年代以前，一些国家就开始在玉米和高粱育种中利用杂种优势，并使得产量大幅提高。我国的杂种优势利用工作起步相对较晚，前期工作主要是从国外引进了玉米自交系和高粱雄性不育系，并加以利用，该项工作为我国两系杂交技术的迅速发展奠定了基础。20世纪70年代以来，我国“杂交水稻之父”袁隆平院士利用“野败”不育株，实现了水稻的“三系”配套，成功育成了杂交稻，水稻产量得到大幅提高，并使得我国迅速摆脱了粮食紧缺的困扰，有效提高了我国生产技术水平和粮食自给能力。此后，我国杂种优势利用技术得到进一步发展，目前，在水稻、玉米、高梁、谷子、小麦、蔬菜、大豆、棉花、油菜等主要农作物新品种培育过程中都不同程度地利用了杂种优势，不仅使得新品种的产量和品质得到大幅提高和改善，同时为提升我国粮食综合生产能力和国际农产品市场竞争力提供了坚实的支撑［3］。

4.2与生物技术相结合的种质资源利用途径

种质资源利用的最终目的是培育出新品种。目前，世界范围内的育种研究已从传统的常规育种进入依靠生物技术育种的时代，从单个基因的测序转为有计划、大规模地检测水稻等重要生物体的基因图谱。目前，全世界已有6000多项农作物方面的生物技术研究成果进入田间试验，这些也表明，生物技术在作物育种中具有巨大的应用潜力。

4.2.1优异基因挖掘。要实现生物技术在作物育种中的重要作用，首要任务是确定植物群体内基因或基因片段的表达及与表型现象的内在关联。在这一过程中，目前常用的方法就是基于双亲分离群体(F2、RIL、CSSL、NIL等)的数量性状位点定位和基于连锁不平衡的将标记或候选基因的等位变异与目标性状联系起来的关联分析，这2者都属于正向遗传学的研究范畴。随着测序技术的飞速发展，基于高通量测序的QTL定位和关联分析相关研究也取得了较大进展，并显示了广阔的应用前景。而在反向遗传学中，基因所影响的表型并不清楚，但可通过基于遗传转化所进行的基因功能获得或缺失技术研究基因所引起的表型变异及其功能，并对其加以利用。随着水稻、玉米等基因组测序的完成，以及结构和功能基因组学的飞速发展，越来越多的作物中的重要性状相关基因被克隆，如水稻中已克隆的产量与品质相关基因GS3、GS5、GW2、Ghd7，抗病相关基因xa13，抗褐飞虱基因Bph14等［8］。根据已克隆的基因信息，在种质资源中进行目的基因的等位变异分析，找到优异的等位基因，这样不仅能完成对现有种质资源的精确鉴定，还能对鉴定的含有优异等位基因的材料通过分子标记辅助选择应用到育种中，从而培育出优良的品种。而对于大麦、小麦等基因组庞大的作物来说，也可以参考水稻等模式植物的研究结果，通过同源克隆、关联分析等策略对一些重要性状产生的分子机理进行解析，并对相关基因进行功能鉴定和利用。随着现代生物技术的高速发展，作物基因发掘出现了一些新的发展趋势，例如基因组测序技术的更新换代、高通量基因型和表型分析平台的建立，都将促进基因发掘的规模化和高效化。

4.2.2分子标记辅助选择。20世纪80年代后期，我国开始利用分子标记辅助选择进行新品种的培育。分子标记辅助选择的核心是借助与目标基因紧密连锁的分子标记，直接选择目标基因型个体。分子标记辅助选择不受环境影响，可在早代进行准确、稳定的选择，而且可以克服再度利用隐性基因时识别难的问题，并能同时聚合多个目标基因，因此，可大大提高育种效率和水平。随着现代生物技术的高速发展，各主要作物越来越多的重要性状相关基因被定位或克隆，这将极大地促进作物分子标记辅助选择育种技术的应用。在种质资源的应用工作中，我们应以种质资源的鉴定评价、种质创新和优异基因挖掘等工作为基础，通过分子标记辅助选择，有目的的将野生近缘种属、地方农家品种和国外引进优异种质中的有益基因导入栽培种中，从而对栽培种进行性状改良，创造出一批更适合育种需要的中间材料。

4.2.3分子设计育种。种质创新和基因挖掘是对种质资源研究工作的提升，对种质资源进行充分利用则是作物种质资源研究工作的最终目的。科学技术的不断发展将使得作物基因发掘的速度和数量大幅提高，这也将促进后基因组时代的到来，加深我们对基因互作的了解，从而揭开作物重要性状的基因网络调控途径。因此，在创制一批满足育种需要的中间材料的同时，还应着眼于未来，结合分子标记辅助选择，将挖掘到的优异基因导入到该作物的当前应用广泛、综合性状优良的某一品种中，构建包括高产、优质和高抗等基因的一系列的近等基因系;以上述近等基因系为材料，通过基因的定向组装达到性状的协调改良，突破传统育种的瓶颈，实现作物品种的精准分子设计育种。同时，我们也应该把握机遇，充分利用植物基因组学和生物信息学等前沿学科的重大成就，及时开展分子设计育种的基础理论研究，建立具有自主知识产权的分子设计育种技术体系和技术平台［9］。

5展望

当代生物技术的高速发展，如高通量表型和基因型鉴定技术，使得种质资源创新和利用的各个环节都融入了现代高新科技的元素。有理由相信，这些工作的顺利完成将为选育突破性农作物新品种、发展现代种业、保障粮食安全提供物质和技术支撑。

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篇4

关键词：热激反应；耐热机制；转录因子；遗传规律分析

植物在生长发育过程中会受到各种非生物因子的胁迫，其中温度对植物生长发育的影响尤其严重。近年来，随着全球“温室效应”的加剧，气温上升，植物面临着高温的胁迫。一般认为，当温度高于环境温度10～15℃时，植物就会产生热激反应（heat shock response），在数小时内迅速获得耐热性，以抵御致死高温[1]。但是高温会影响植物的各种生理生化过程，如抑制光合作用、改变细胞膜稳定性、改变激素和次级代谢物的合成，甚至导致植物死亡[1]，因此，探究植物耐热性机理和分子机制对于提高植物耐热性及植物的引种选育都具有指导意义。

1 植物耐热性的分子机理

植物在长期的进化过程中形成了各种机制使其在温度升高的情况下得以生存，包括遗传机制、形态适应、短期的逃避机制（改变叶片方向和蒸腾作用等）、细胞生理反应等。

1.1 热激蛋白（Heat shock proteins，Hsps）

陆地上的植物通常一年四季都暴露在外界大范围的温度波动当中，和许多动物不同的是，植物固定在一个地方生长，且不能逃脱它所不适宜的温度环境。为了生存，植物必须能够预期到即将面临的为害，然后在细胞中表达和积累所谓的热休克蛋白（Hsps）基因，从而来对抗热损伤。

植物在热胁迫下会瞬时合成新的或功能增强的Hsps，Hsps的积累可以增强植物的耐热性[2]，从而维持细胞正常的生理行为。在真核细胞中由热激基因所编码的热激蛋白在结构上可分为6个家族：Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60 （Chaperonins）、小分子量热激蛋白（small Hsps， sHsps）以及泛素蛋白（8.5 kDa）[3]，其中发挥最主要作用的就是sHsps[4]。

①sHsps 存在于高级植物的叶肉组织中，sHsps是最丰富的一个组分，为17～30 kDa。sHsps含量的丰富和它的遗传特性说明其可能具有独特的生理功能[5]。植物中一般会产生20种以上的sHsp，它们含量丰富并呈不均匀分布，是植物体中最主要的压力应激Hsp。植物sHsp都是由细胞核编码的，分为6个级别：CⅠ、CⅡ、CⅢ位于细胞质和细胞核中，其他3个组分CⅣ、CⅤ、CⅥ位于原质体、内质网和线粒体中。所有的sHsps都有90个保守氨基酸碳端区域，就是所谓的热休克区域。这个区域使得sHsps能够被热诱导而且可能在伴侣活性方面有很重要的作用。在植物中，sHsps的积累量和耐热性呈正相关。Korotaeva等[6]研究发现，当玉米、小麦和黑麦在42℃的环境中时，玉米中有5种线粒体sHsps（28，23，22，20，19 kDa）表达，而在小麦和黑麦中只有一种sHsp （20 kDa）表达，这说明玉米相对小麦和黑麦具有更强的耐热性。

②Hsp70 Hsp70家族成员具有很大的保守性，在氨基酸序列上至少50%是相同的。Hsp70家族蛋白包括：大肠杆菌dnaK蛋白，酵母细胞质基质蛋白Ssalp和Ssa2p。它们存在于真核细胞的线粒体、细胞质、细胞核、内质网和叶绿体中。Hsp70家族蛋白在高温、寒冷和化学品刺激等环境压力下都会表达，同样，过表达Hsp70会诱导植物的耐热性和对环境压力的抵抗性[7]。

③Hsp100和Hsp90 组成型表达的Hsp100家族蛋白，在环境压力下可以上调，它们的主要功能是保护蛋白质，防止其变性和聚集。研究表明，Hsp101对于拟南芥和酵母的耐热性都是必需的，同时对于其他植物的耐热性也是非常关键的[8]。在拟南芥中过表达Hsp101对于其生长过程中的恢复期有积极影响[9]。最近也发现，Hsp101同源蛋白在拟南芥中也涉及细胞质体分化过程中调节内部类囊体膜的形成和在热激压力下赋予叶绿体耐热性的作用[10，11]。

Hsp90家族蛋白的大小在80～94 kDa，是一种ATP依赖的分子伴侣，主要功能是协助蛋白折叠，并在各种胁迫反应中表达量增加[2]。Hsp90也是高度保守，通过全基因组测序鉴定到葡萄中的7个Hsp90基因和拟南芥的相应基因具有高度相似性，而且在提高温度时，Hsp90表达量会增加，这也说明Hsp90在热激反应时起保护作用[12，13]。

④Hsp60和泛素蛋白 Hsp60家族是一类高度保守的大小约为60 kDa的分子伴侣，它们在原核和真核中的成员是二聚体而且是被磷酸化的亚型。这个家族的成员通常是具有14个亚基的低聚物，位于细菌的细胞质当中，主要在胞液、线粒体与叶绿体的内部，不存在于内质网和细胞质中。主要帮助蛋白的折叠和其亚基的装配， 并且需要一个更小的大约10 kDa的伴侣蛋白与之一起作用[14]。

泛素蛋白是一类广泛存在于真核细胞中的高度保守的蛋白，是由75～76个氨基酸残基组成的低分子量蛋白，存在于每一个真核细胞中。泛素蛋白对于热激诱导合成中的耐热性和恢复性有着至关重要的作用，主要介导蛋白的降解。在牧豆树和大豆遭受热胁迫时，作为一种重要的耐热机制，泛素蛋白在热胁迫开始的30 min内会大量合成[15]。

1.2 抗氧化系统

高温胁迫会使植物发生氧化应激反应，产生一系列活性氧中间体（reactive oxygen species，ROS），如O2-・、H2O2、・OH及丙二醛（MDA）等，它们会催化细胞膜脂质和色素类的过氧化反应，从而导致细胞膜渗透性增加，破坏其功能。这时，植物便会产生一些酶和抗氧化剂，如超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、抗坏血酸（AsA）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR），h型硫氧还蛋白（Trxh）、谷胱甘肽还原酶（GR）及谷胱甘肽（GSH）等，来清除ROS对细胞膜的伤害，提高植物的耐热性[16，17]。Khanna等[18]研究发现，在藜（Chenopodium album）的叶片和花序的叶绿体和线粒体中含有多种耐热性的SOD和APX，而且SOD的热稳定性优于APX。

1.3 植物激素

在植物的耐热等环境应激反应中，包括脱落酸（ABA）和水杨酸（SA）等多种植物激素也都参与其中。比如，有研究证实ABA在翦股颖（Agrostispalustris）遭受热胁迫后的植株恢复期中有所积累并发挥作用[19]，ABA转录因子ABF3的过表达可以使植物获得对高温、冷冻等胁迫的抗性[20]。SA是植物系统获得耐热性（SAR）和过敏反应（HR）信号通路中的重要组分，SA通过稳定热休克转录因子促使Hsps产生[21]。此外，SA的衍生物磺基水杨酸（SSA）能够有效地清除黄瓜在热胁迫时产生的H2O2[22]。

1.4 渗透调节物质

在压力环境下，植物会积累很多渗透调节物质如糖类、糖醇、脯氨酸、叔铵和季铵化合物及叔硫化合物等来增强植物的抗逆性。Amooaghaie等[23]研究发现，多胺类可以使热处理后的大豆幼苗恢复生长，而用多胺类的抑制剂CHA和DMFO处理会导致幼苗的热敏性增强。甜菜碱（GB，一种两性的季铵化合物）在植物遭受高盐或高温胁迫时会作为主要的渗透调节物质发挥作用，如玉米和甘蔗在遭受干旱或高温时就会大量积累GB来保持水分[24]。同样，脯氨酸和可溶性糖类在植物遭受高温胁迫时也会大量积累来提高耐热性，它们也是植物抵御高温胁迫的最受关注的渗透类物质[25]。但是最近也有研究指出，高温下拟南芥幼苗中脯氨酸的积累可能会诱导ROS的产生从而降低其耐热性，而ABA和乙烯会抑制这一过程[26]。

1.5 光合作用与蒸腾作用

光合作用是植物最重要的生理过程之一，对高温胁迫也最为敏感。高温可以破坏光系统Ⅱ、阻止CO2的扩散、降低Rubisco（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶）对CO2的亲和力及使PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）羧化酶和丙酮酸羧激酶活性下降等，从而导致光合速率降低[27]。与不耐热品种相比，耐热品种在高温解除后净光合速率回升较快，能维持较高的同化速率[28]。此外，叶绿素的含量也是判断耐热性的一个标准，被作为覆盆子耐热性指标[29]。有研究指出，通过喷洒外源Ca2+可以有效地提高应激反应中烟草的光合作用，从而增强其耐热性[30]。

水分对植物耐热性的影响主要与蒸腾作用的强度有关，在一定的温度范围内，随着温度的升高，植物的叶导度增加，蒸腾作用增强，可以起到降温作用，但随着蒸腾作用的加强，植物会因为缺水而枯萎，这时要降低蒸腾速率来维持体内的水分，而耐热品种的这种保护能力更强[31]。

1.6 细胞膜热稳定性（cell membrane thermostability，CMT）

高温会破坏细胞膜的脂质双分子层，使质膜的电解质通透性增加，降低细胞膜的稳定性，因此，CMT也成为众多植物品种中衡量其耐热性的主要指标之一，如小麦、棉花、高粱和大麦等。陈希勇等[32]测定了春小麦多种基因型幼苗的CMT，结果发现CMT与产量性状表现出较高的正相关。

1.7 其他耐热机制

植物叶片会向大气层中不断挥发大量的挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs），其中异戊二烯和单萜占了80%以上，最近众多研究表明VOCs的挥发是植物耐热性的一项重要机制[33]。Kadman等[34]分别将过表达异戊二烯和野生型的拟南芥品种在60℃下处理2.5 h，结果发现前者明显具有更好的耐热性。

自然生态系统中的所有植物都是与真菌共生的，这些真菌在获取营养时会不同程度地影响宿主的适应性。Regina等[35]通过研究指出，这种植物和真菌的共生系统会使植物获得耐热性，他们从美国两个火山地收集了200种植物，研究表明，这些植物不论在试验条件下还是田间种植条件下，与真菌Curvularia sp.（弯孢霉属）共生的植物都具有更好的耐热性。Baynes等[36]指出，广泛生长在亚欧大陆和北美的旱雀草（Bromustectorum）的耐热性也与其共生的羊肚菌（Morchella）有关。

1.8 植物耐热机制的信号途径

植物在高温胁迫下的耐热性反应由一系列的信号途径参加完成，复杂而有序，这些信号机制中包括离子运输者、渗透保护剂、自由基清除剂、信号级联反应和转录控制中的一系列蛋白和元素，这些物质的协同运作对抵制压力效应都是必需的。其中，有些组分是此信号通路中的关键因素，如细胞膜和第二信使（Ca2+、NO、H2O2等）及各种下游调节组分（钙调蛋白、MAPK、Hsp90、Hsfs、ATP、PLC9等）[37～40]。植物耐热性的一系列改变和机制，从感知高温到信号传导，再到产生一系列相关代谢物来应付各种热激胁迫，其基本原理和过程都已被提出[1]（图1）。

2 植物耐热性的分子生物学研究

2.1 植物耐热性相关转录因子的研究

在植物耐热的信号传导过程中，转录因子是一个关键因素，在胁迫反应中它们不断合成并将信号传递和放大，调控下游基因的表达，从而引起植物的一系列抗逆反应。目前在植物的耐热机制中，已发现了多种转录因子。Hsfs （heat shock transcription factors）是植物耐热机制中最重要的一类转录因子，它诱导Hsps的产生[41]。在植物中有20多种Hsfs，番茄HsfA1a和拟南芥HsfA2是诱导产生耐热性的主要转录因子[42]，而且通过对眼子菜属不同种耐热性的对比研究发现，由HsfA2诱导获得的耐热性具有种的特异性[43]。Suzuki等[44，45]发现，转录因子MBF1c （multiprotein bridging factor 1c）是拟南芥耐热过程中必需的，它可以在热激反应中控制36种不同转录本的表达来介导植物对高温的耐性。APX1 （cytosolic ascorbateperoxidase1）和Zats （zincfinger proteins）在植物耐热反应ROS信号传导中发挥着必不可少的作用[46，47]。DREB2A/DREB2C （dehydration-responsive element-binding proteins）通过激活HsfA3来正调控植物的耐热性[48，49]。Li等[50]利用WRKY家族中的WRKY25/26/33的拟南芥缺失突变体作为研究材料，通过试验发现它们与野生型相比热敏感度增加，发芽率和成熟率明显下降，可见WRKY也是植物耐热反应中必不可少的转录因子。此外，MYB类、bZIP类、NAC类和AP2/EREBP类转录因子在植物防卫反应和逆境胁迫应答过程中具有重要功能[51]。

2.2 植物耐热性的遗传规律研究

植物的耐热性并不是由某一种耐热基因所决定，而是在不同生命周期和不同部位由不同基因控制。下面介绍几种常用的分析方法及研究结果。

①数量性状位点（QTL，Quantitative trait loci）分析 开始运用QTL的方法来分析植物的耐热性是在1991年，Ottaviano等[52]发现在玉米的44个重组自交系（RILs，recombinant inbred line）的遗传性CMT中，有6个QTLs占了全部遗传变异的53%。盘毅等[53]以耐热水稻品系996和热敏感品系4628为亲本构建的RILs为材料，采用复合区间作图法检测到2个花粉育性耐热性QTL，命名为qPF4和qPF6，对高温胁迫下花粉育性的表型解释率分别为15.1%和7.15%。

②共分离（Co-segregation）分析 在春小麦的RIL群体里，小麦幼苗耐热性的获得是依据CMT与以色列炎夏中小麦产量的RILs的对应关系而确定的[54]，此外，关于Hsps参与耐热性的遗传效应也是通过对冬小麦RILs的共分离分析揭示的[55]。陈飞雪等[56]利用耐高温和不耐高温黄瓜品系为材料，利用SSR（Simple Sequence Repeats）和SRAP（Sequence-related amplified polymorphism）引物进行多态性和选择基因型分析，发现了1个SSR和9个SRAP标记与黄瓜耐高温QTL连锁，对表型贡献率为6%～17%。

③遗传繁殖群（Genetic stock）分析 通过分析小麦、大麦、燕麦或其他谷类的遗传繁殖系，包括末端缺失、重组和移位品系以及杂交系，可以说明这些谷类耐热性的遗传基础。例如，缺失染色体1B长臂的小麦品种可以在更低的温度下获得耐热性，而缺失7D长臂的小麦品种变为热敏性并且Hsp的表达合成下降，可见，染色体1B长臂携带有在低温和耐热反应中抑制热激反应的基因，而7D长臂携带有诱导Hsps合成和获得耐热性的必需基因[57]。

最近利用转基因、反向遗传学和突变的方法分析一些非谷类植物品种所获得的实验数据有力地证明了Hsp在植物耐热性中的作用。利用热敏感突变体证实了4个基因位点在拟南芥中决定了获得耐热性的能力，其中包括编码Hsp101的基因[58]。

3 展望

详细介绍了目前在植物耐热性分子机理和遗传规律等方面获得的研究成果，为耐热性品种的培育提供了理论基础。在众多参与植物热激反应的成分中，Hsps是最为重要的一类物质，利用转基因技术获得Hsps高表达的品种不失为一种有效的培育方法。此外，选育耐热品种，进行热锻炼及在幼苗上喷洒ABA、SA、Ca2+等植物生长调节剂也是提高耐热性的有效方法[23]。

尽管前人对植物的耐热性进行了较多的研究，但目前植物对抗热胁迫方面还存在一些问题：①对耐热性的遗传机理研究不够深入，多集中于对植物耐热性相关的农艺性状和生理特性的分析；②很多研究仅仅停留在实验中，许多实验结果并未能真正用到生产实践中；③对于植物的耐热性研究现阶段主要集中在农作物上等，对木本植物的耐热性研究比较少，而且对于木本植物的抗热性的研究还没有形成一个完整的系统。

高温胁迫是影响植物生长、降低农作物产量的主要非生物胁迫之一，因此，获得耐热性在内的各种抗逆性是人们最为希望得到的作物品质。我们只有通过在热胁迫环境下，对植物体内的一系列参数变化进行进一步的探究，才可以从变化中找到与抗热性密切相关的各种因素，为今后植物抗热性研究奠定重要的基础。

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