免疫组织化学技术范文
时间：2023-11-16 17:51:31
导语：如何才能写好一篇免疫组织化学技术，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
[关键词]免疫组织化学染色； 质量管理； 标准化； 文献综述
[中图分类号]R818.023[文献标识码]A [文章编号] 1005-0515（2010）-12-030-01
免疫组织化学染色技术的出现和发展给传统病理学带来了一场革命，使纯形态学观察的病理学发展成为形态与免疫信号相结合的现代病理学，免疫组织化学染色在病理诊断中的作用已得到广泛的认同，具有特异性高、敏感性高、程序相对一致等特点，已成为病理诊断中不可缺少的重要辅助技术。免疫组织化学染色的方法与步骤复杂繁琐，在应用中还存在不少问题，直接或间接地影响了最终的病理诊断，而且目前还没有很好的标准化方案。纵观免疫组织化学染色的全过程，重视染色应用中的环节问题，充分发挥病理诊断医生和技术人员不同的质量保障作用，才能有效地利用好免疫组织化学染色这一有力工具。
1 诊断医生涉及的环节问题
1.1 抗体配备的选择：用于病理诊断的抗体种类很多，拥有抗体种类的多少与实验辅助诊断水平有一定相关性。诊断医生在决定科室内实验抗体的选择配备时，要不断学习相关知识并根据科室实际情况选择确定适用的有效抗体种类和数量。
1.2 抗体应用的选择：每一种抗体的特性、适用范围、可能产生的交叉反应等都不相同。决定抗体的实验应用，是诊断医生在形态学诊断的基础上，根据鉴别诊断的需要选择提出的，诊断医生应不断学习掌握相关知识，达到正确选择适用的实验抗体，而且应选择联合抗体配套使用，避免得到片面的结果，造成错误的解释和诊断。
1.3 检测片的选择：很多病例的组织切片不止一张，不同切片中的组织成分常常不完全一样。正确选择检测片是获得正确每一组织化学染色结果的前提，应由诊断医生正确选择用于免疫组织化学染色的检测片，避免由技术人员选择可能出现的差错。
1.4 阳性对照的选择：每一组织化学染色过程比较复杂、影响因素也多，只有把握住阳性对照和阴性对照，所有的染色结果才容易判断。阳性对照是由诊断医生根据组织的不同情况设定的，诊断医生应不断加强相关知识的学习，正确运用阳性对照的表达。
2 技术人员涉及的环节问题
2.1 检测片质量：因机械性损伤、电烙性损伤、固定工作人为差错等原因导致的组织细胞外部或内部结构损伤及组织块处理不良等都会引起组织化学染色效果不好。尤其组织固定，其目的在于良好地保持组织和细胞的生前结构及位置，以保证化学成分和各种酶类（抗原）在组织中的定位研究，但当前组织固定不良仍是技术中的主要问题，有关免疫组织化学技术、免疫组织化学质量控制、免疫组织化学标准化的文章和书籍，都对其有所阐述。诸如组织固定不及时、组织人为的变干导致的抗原损失，固定液种类和浓度不恰当使用造成的组织固定不良，固定时间、处理工艺掌握的差异影响的组织固定效果，等等，都会造成免疫组织化学染色效果不好。
2.2 抗原修复质量：抗原修复技术的应用提供了免疫组织化学标准化的基础，但目前国内技术的最突出和最顽固的问题还是抗原修复质量问题，主要有修复温度、时间掌握不利，修复液质量存在问题等。专业内普遍认为，甲醛等固定液造成组织抗原失活是影响免疫组织化学染色应用的重要原因，挽救因甲醛固定而失活的抗原是克服途径之一，抗原修复是解决问题的焦点，目前最需要改进的方面就是要进行充分的抗原修复。
3 总结
纵观免疫组织化学染色应用的全过程，为使免疫组织化学染色能真正地有效地为病理诊断服务，诊断医生和技术人员应建立互相尊重、团结互助、共同提高、密切配合的和谐关系，共同努力争取获得合格的准确的免疫组织化学染色结果。病理诊断在临床治疗工作和医院质量中举足轻重，加强病理诊断工作的质量管理相当重要，科学的管理和规范化操作，是解决质量问题的关键。
为了促进免疫组织化学实验的标准化，检测免疫组织化学染色结果的可靠性，每次染色都应该进行有效的质量控制，保证室内质控、保证免疫组织化学染色的质量是全科室人员的责任。病理科主任应基于相当过硬的免疫组织化学诊断知识和丰富的免疫组织化学技术经验，有责任指导监督科室内免疫组织化学质控工作，加强人员继续教育工作，开展免疫组织化学相关知识的培训提高工作。
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篇2
[关键词] 胃原发性肿瘤；神经内分泌肿瘤；临床病理分析
[中图分类号] R36 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）07（c）-0106-02
神经内分泌肿瘤（neuroendocrine tumor，NET）是一组起源于肽能神经元和神经内分泌细胞的异质性肿瘤，可发生于全身许多器官和组织，其中以胃肠胰NET最常见，Yao等[1]研究发现NET的发病率近年来有上升的趋势。本研究对发生于胃的18例NET患者进行分析，探讨胃神经内分泌肿瘤（gastric neuroendocrine tumor，GNET）的病理特征及鉴别诊断方法，旨在提高对该病的认识。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集云浮市新兴县人民医院病理科2005年7月～2012年12月18例胃原发性NET病例资料，包括原始取材记录、HE切片、免疫组织化学技术染色切片和原病理诊断资料，其中，后期肿块切除手术病理资料6例。所有病例资料中，男8例，女10例，中位年龄55岁，随访时间6个月～6年。
1.2 方法
所有标本经4%的甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋切片，HE染色和免疫组织化学技术染色，免疫组织化学技术采用PV-7000二步法，DAB显色，突触素（synaptophysin，Syn）、嗜铬粒素A（chromaffin granule A，CgA）和Ki-67等试剂均购自北京中杉金桥生物技术公司。Syn、CgA阳性细胞胞质呈黄色颗粒状，Ki-67为细胞核阳性表达，设阳性和阴性对照，光学显微镜下观察组织学和免疫组织化学染色结果。通过门诊复诊、电话及邮件等方式随访。
1.3 分类标准
根据2010年WHO新的分类方法将胃肠NET分为3类：①NET，根据核分裂象与Ki-67指数分为NET 1级和NET 2级；②神经内分泌癌（neuroendocrine carcinoma，NEC），根据细胞形态大小分为大细胞NEC和小细胞NEC；③混合性腺神经内分泌癌（mixed adenoneuroendocrine carcinoma，MANEC），要求每种肿瘤成分不少于30%[2]。
2 结果
2.1 临床特点
患者临床症状相似，主要为上腹部不适、隐痛，部分伴有黑便。发生部位：贲门1例，胃底6例、胃体6例，胃窦幽门部5例。肿瘤大小：手术切除病理资料6例中，肿瘤直径为1.0～11.0 cm。肿瘤巨检：隆起型11例、局限溃疡型3例、浸润型4例。
2.2 光学显微镜观察结果
本研究中NET 14例，其中，男性5例，女性9例；镜下肿瘤细胞较小，呈多边形、卵圆形，胞质中等量，核圆较深染，染色质分面均匀，无明显核仁，细胞排列可呈实心巢状、结节状、菊形团状等，核分裂象少见，无坏死。NEC 3例，其中，男性2例，女性1例；小细胞NEC 2例，镜下肿瘤细胞小或中等大，像淋巴细胞，大小约为成熟淋巴细胞的2倍，胞质少，弥漫性或成巢状生长，核染色质均质细腻，核分裂象常见，灶状坏死，胃镜钳取检标本常被挤压变形；大细胞NEC 1例，肿瘤由大细胞组成，胞质丰富，核空泡明显，核仁突出，可见局部坏死。MANEC 1例，男性，镜下见神经内分泌成分为小细胞NEC，腺癌成分为管状腺癌，每种成分超过30%。
2.3 免疫组织化学技术染色结果
18例胃原发性NET中Syn和CgA均呈阳性表达，低级别NET呈弥漫性阳性表达，高级别NET阳性表达相对较弱，Ki-67在小细胞NEC中高表达（>60%+）。
3 讨论
NET是一类起源于神经内分泌细胞的肿瘤，包含了由高分化到低分化的肿瘤谱系[3]。近年来，GNET的发病率逐年升高，占整个消化道NET的11%～41%。冯强等[4]报道，NET患者在女性中居多，而男性NEC发病率更高，本组NET和NEC患者中男、女比例分别为1∶1.8和2∶1，与报道相似。
GNET作为一个谱系，其发生发展是一个复杂的过程，组织学上由高到低，生物学行为上由倾向于良性到恶性，在同一肿瘤中其内分泌细胞会出现不同分化。多数低级别NET生长非常缓慢，如果发生转移，通常局限于局部淋巴结和肝脏中，出现转移并不影响长期生存。NET 2级肿瘤可能是一组多相性的肿瘤，这样可以解释其在不同的研究中具有不同的预后[5]。而高级别NET（包括NEC和MANEC）预后普遍较差，淋巴结转移率高，脉管内癌栓发生率高，即便进行规范的根治及淋巴结清扫，术后总体生存期仍然较短。GNET的预后与诸多因素有关，因此，2010年WHO分类中，病理专家推荐病理报告中必须包括标本类型、肿瘤部位、大小和数目、浸润深度和范围、脉管和神经受累及情况、核分裂象数和（或）Ki-67阳性指数、神经内分泌标志物（Syn与CgA）、切缘情况、淋巴结转移情况等，以供肿瘤分期与预后参考。本组14例低级别NET患者随访6个月～6年均存活，而4例高级别NET患者中，3例术后2年内死亡，1例术后5个月见肺转移灶。以往的病理报告中，未要求对核分裂象数和Ki-67阳性指数作评估，本组实验证实，两者评估值越高，预后越差。
胃镜检查是发现GNET的重要手段，足够量的活检取材有助于提高确诊率[6]。部分大细胞NEC镜下特点与低分化腺癌难以区分，易被误诊为分化差的胃腺癌；胃镜钳取样标本容易挤压变形，导致部分小细胞ENC易与淋巴瘤相混淆。本组有1例大细胞NEC，最初诊断为低分化腺癌，1例小细胞ENC最初诊断为非霍奇金淋巴瘤，经免疫组织化学技术Syn和CgA染色阳性后确诊为NEC。因此，免疫组织化学技术在具有腺样结构的大细胞NEC和小细胞为NEC的鉴别诊断中作用巨大，对指导治疗与预后判断有重要意义，是目前明确诊断不可缺少的辅助检查方法。
综上所述，胃原发型NET在临床表现方面较其他常见胃肿瘤无特异性，诊断与鉴别诊断主要依靠病理形态和免疫组织化学技术，正确的病理分型对治疗和预后评估均有指导意义。
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篇3
【关键词】胃癌 DEK蛋白：免疫组织化学：组织芯片
1材料与方法
1.1实验材料 胃癌组织芯片
人胃癌组织芯片购置于上海芯超生物科技有限公司，组织芯片编号为200点的0D-CT-Dgstm01-002（90例胃癌，8例正常组织，12例其他器官对照组织，共110例）和62点的OD-CT-Dgsm03-003（31例胃癌和31例癌旁组织）。
1.2主要试剂
1.2.1 PBS缓冲液（PH：7.2-7.4）：购于美国CAMBREX公司；
1.2.2 枸橼酸缓冲液（PH：6.0）：购于北京中山生物技术有限公司；
12.3 单克隆抗体：DEK抗体为美国US bio生物公司产品；
1.2.4 ABC免疫组织化验试剂盒：购于北京华美生物工程公司。
1.3 实验方法：
1.3.1免疫组织化学染色方法检测DEK蛋白在胃癌中的表达
免疫组织化学染色方法根据ABC试剂盒说明书步骤进行。
1.3.2免疫组织化学染色结果判定
DEK蛋白以细胞核呈棕黄色颗粒为阳性。蛋白表达采用双评分半定量法进行评分。
1.4 统计学处理
应用SPSS13.0统计软件处理分析，免疫组织化学染色结果分析采用卡方检验，P
2结果
2.1 DEK蛋白在胃癌中的表达见表1
2.2 DEK蛋白在胃癌不同组织学类型中的表达见表2
2.3 DEK蛋白的过表达与胃癌病理学行为的相关性见表3
3 讨论
胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率局世界癌症的第二位，在我国胃癌的死亡率局各种恶性肿瘤的首位。目前发现参与胃癌的发生发展过程的癌基因有C-met、ras、bcl-2、c-myc、survivin、Ki-67、CDK4和MMPs基因等。淋巴结转移是胃癌侵袭转移的重要方式，在胃癌的早期即可出现。有无淋巴结转移对胃癌的治疗方案产生重要影响。因此，早期发现淋巴结转移并及时进行治疗是改善胃癌预后、提高生存率的关键。
DEK蛋白广泛存在于有机体的大多数细胞中，是一种丰富的细胞白，存在于大多数生物体中和一些单核细胞有集体中（小木军除外）。研究发现DEK蛋白与自身免疫疾病的发生有密切相关，同时在许多恶性肿瘤比如膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、小细胞肺癌和肝癌中，DEK蛋白均有过表达。人类DEK蛋白是在急性粒细胞白血病（AML）亚型中作为一种融合蛋白，这种AML亚型的特征是有特殊的染色体异位（6；9）（p23；q34）。它广泛存在于有机体的大多数细胞中（酵母菌除外）。人类的DEK蛋白由375个氨基酸组成。DEK蛋白定位于细胞核，主要分布与细胞核的常染色质，DEK的表达水平与细胞的生理状态有密切相关，细胞增殖状态时DEK表达水平升高。而静止或终末分化状态时细胞内的DEK表达水平降低。
我们利用胃癌组织芯片，通过免疫组化方法研究DEK蛋白在胃癌中的表达及病理学行为相关性。结果表明，DEK蛋白在胃癌中的阳性表达率明显高于正常胃黏膜组织，两组间有非常显著的统计学差异 （p
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篇4
【关键词】cd44v5 胃癌 免疫组织化学 淋巴结转移
在我国，胃癌(gastric carcinoma, gc)死亡率居消化系统各类癌症死亡的首位，严重危害人类健康。胃癌浸润和转移是影响患者预后的主要因素，临床和病理资料显示，有60%以上的患者在确诊时已发生肿瘤细胞的扩散和转移[1]。淋巴结转移是胃癌转移的主要方式，是影响胃癌预后的独立因素，评估淋巴结的转移情况对决定术式、判断预后具有重要意义[2]。目前发现肿瘤细胞表达多种 cd44的剪接变异体(cd44v)，其表达与肿瘤细胞的侵袭性、转移性有关。在本研究采用免疫组织化学法对胃癌患者cd44v5表达进行研究，探讨cd44v5表达与胃癌淋巴结转移的关系。
1 材料和方法
1.1材料 潍坊医学院附属医院2006年8月-2008年7月期间，经手术病理证实的48例胃癌患者的临床资料、病理结果及标本蜡块。其中男性30例，女性18例，年龄≥60岁38例，<60岁10例，有淋巴结转移39例，无淋巴结转移9例。分化好(包括高、中分化腺癌)16例，分化差(包括低分化腺癌、印戒细胞癌、粘液腺癌、类癌)32例。cd44v5单克隆抗体(兔抗人)、即用型sabc免疫组化检测试剂盒、dab显色试剂盒均购于美国mscn life生物技术有限公司。
1.2方法 采用免疫组织化学技术sabc法（抗体浓度1:80）对48例胃癌标本cd44v5的表达进行检测。cd44v5免疫组化结果的判定，根据文献报道，cd44v5在胞浆和胞膜都有表达，以膜上有cd44v5线样表达作为阳性表达，连续计数10个高倍视野，根据有阳性表达的细胞数占细胞总数的百分比将cd44v5的表达分为以下四组：(1)阴性组：阳性细胞数百分比<5%；(2)弱阳性组：阳性细胞数百分比在6-35%之间； (3)阳性组：阳性细胞数百分比在36-70%之间；(4)强阳性组：阳性细胞数百分比>70%[3]。数据统计时将阴性和弱阳性组之和作为阴性组，阳性和强阳性组之和作为阳性组。将检测结果与临床资料对照分析，采用spss统计软件处理，以α=0.05(双侧)作为显著性检验水准。
2 结果
48例病例中cd44v5表达阳性28例(58.3%) (图1，2)，表达阴性20例(41.7%) (见图3)。cd44v5蛋白的表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤大小及发生部位均无显著关系(p>0.05)，与有无淋巴结转移有关(p<0.05)，即发生淋巴结转移的胃癌组织中，癌细胞中的cd44v5阳性表达率(24/39, 61.5%)明显高于未发生淋巴结转移的胃癌组织(4/9, 44.4%)。
3 讨论
侵袭和转移是恶性肿瘤标志性生物学行为。肿瘤浸润转移是肿瘤细胞与宿主间复杂、多步骤相互作用的结果，也是胃癌治疗失败和死亡的主要原因。liotta[4]首先提出浸润转移的三步学说：即粘附、降解和转移。其中粘附是指肿瘤细胞通过自身细胞膜表面的粘附受体与细胞外基质成分间的相互作用。近年来研究发现,肿瘤细胞都是首先破坏细胞上的粘附分子而发生转移的。
cd44v5是cd44的一个变异体，属细胞表面黏附分子家族。cd44是一种在淋巴细胞和上皮细胞表面上发现的、高度糖基化的跨膜糖蛋白[5]。是一类多结构、多功能的细胞表面黏附分子，广泛存在于细胞与细胞间和细胞与细胞外基质间。其基因组结构包括20个外显子。前面5个和最后5个外显子是恒定的，中间的10个外显子是可变的，形成可变区。它可以通过 10个可变外显子的选择性剪接及糖基化产生多种变异体。目前发现肿瘤细胞表达多种cd44的剪接变异体，其表达与肿瘤细胞的侵袭性、转移性有关。cd44是多功能的受体，介导细胞与细胞间、细胞与基质间的交互作用、细胞移动、淋巴结归巢、迁移细胞的生长因子的表达、传递生长信号等。cd44还参与降解ha，传递信号调节造血和凋亡。许多癌细胞及其转移灶都有高水平表达。cd44特别是它的变异体常用来诊断或作为判断人类恶性疾病的指标[6]。cd44v表达与恶性肿瘤的浸润转移有关的机理可能是：cd44分子的氨基酸末端细胞外区域能与细胞外间质及基底膜的透明质酸结合，从而调节细胞运动及形态，cd44v与透明质酸结合而“锚”定在宿主细胞外间质及基底膜上，同时cd44v阳性细胞更易与后小静脉中的高柱状内皮细胞结合，使肿瘤细胞更易进入淋巴系统和循环系统。
cd44不同变异型在不同的组织中的表达的报道各不相同。有学者报道cd44可以存在于正常组织中[7]，另一些人则认为cd44只在恶性组织中表达[8]。普遍认为，cd44与胃癌的转移、进展、预后有关。王书奎[9]等采用流式细胞术对39例胃癌患者的癌灶、癌旁组织、淋巴结转移灶和外周血的cd44v5表达率进行检测和对比，结果胃癌患者不同组织的cd44v5阳性细胞检出率显著高于对照组，胃癌患者的各种组织中，伴肿瘤转移患者的cd44v5细胞检出率均显著高于未转移者。muller[10]用免疫组化方法检测胃癌中的cd44v5，cd44v5的表达与胃癌病理分级、淋巴结累及、血液和淋巴浸润有关。cd44v5阳性病人的总体生存率明显低于阴性病人。
目前研究表明cd44v5与胃癌的一些生物学行为，尤其是侵袭和转移有一定的关系，但是关于其在胃癌中的作用尚有不少分歧。ham等认为cd44v5的表达与胃癌的淋巴结转移有关。muller等研究结果提示cd44v5在有淋巴结转移的胃癌中的表达率与无淋巴结转移的胃癌患者的差别无统计学意义。本研究中，淋巴结转移组阳性率61.5%(24/39)高于无淋巴结转移组44.4% (4/9)，与ham等认为cd44v5的表达与胃癌的淋巴结转移有关的论点一致。在胃癌组织中，cd44v5表达与胃癌淋巴结转移有关，因此我们认为cd44v5可以作为判断胃癌恶性程度和预后的参考指标。
图1 病理证实为透明细胞癌，cd44v5免疫组织化学染色（×400）示成片的瘤细胞胞浆、胞膜被染成棕黄色。按shimizu方法，阳性细胞数百分比>70%，划为强阳性组。
图1
图2 病理证实为腺癌，cd44v5免疫组织化学染色（×400）示大部分瘤细胞胞浆、胞膜被染成棕黄色。按shimizu方法，阳性细胞数百分比在36-70%之间，划为阳性组。
图2
图3 病理证实为腺癌，cd44v5免疫组织化学染色（×400）未见阳性细胞，划为阴性组。
图3
参 考 文 献
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篇5
关键词： 输尿管梗阻； 纤维化； 姜黄素； 免疫组织化学； 大鼠，Spragua-Dawley； 肾间质
肾间质纤维化几乎是所有慢性肾脏疾病进行性发展的共同最终通路，延缓肾间质纤维化的发展，可降低终末期肾病(ESRD)的发生率［1］。姜黄素是姜黄中提取的一种植物多酚，也是姜黄发挥药理作用最重要的活性成分。近年来的研究不仅证明了姜黄的传统作用，而且还揭示出一些新的药理作用，如抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗人类免疫缺陷病毒、保护肝脏和肾脏、抗纤维化以及防癌抗癌等作用，而且无明显的毒副作用［2］。2007年5~8月研究了姜黄素抑制肾间质纤维化的作用机制，其中重在研究姜黄素对在单侧输尿管梗阻（UUO）模型大鼠中肾间质中转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）的影响，希望在临床上研制出有效药物。
1 材料与方法
1.1 材料
雄性、无特定病原体动物级（specific pathogen free, SPF）、Sprague-Dawley大鼠[同济医学院动物中心提供，生产许可证：SCXK（鄂）2004-0028]30只，7 w龄，体重(180.2±8.35)g。动物房饲养环境为每笼6只，每24 h换1次垫料，喂以正常饮食，自由进水，温度为（24±2）℃，相对湿度为（45±3）%。姜黄素纯度为＞95%（美国Sigma公司）；兔抗大鼠TGF-β1、CTGF 多克隆抗体及SP免疫试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 造模 适应性饲养1周后，按照完全随机设计方法，以体重由轻到重的顺序编号用随机排列表法分为假手术组、模型组、姜黄素组各10只。假手术组和模型组每天给予蒸馏水2 ml灌胃，姜黄素组将姜黄素粉末（200 mg·kg-1·d-1）混悬于2 ml蒸馏水中灌胃，术前1 d开始给药。造模方法：模型组和姜黄素组行右侧输尿管结扎术，质量浓度为20 g/L戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，行正中竖切口打开腹腔，分离右侧输尿管并行双结扎，假手术组只分离但不结扎。于术后第14天处死所有大鼠，处死前下腔静脉取血3 ml做血生物化学检验并行肾原位灌流去除血细胞。取右侧肾脏，纵切为两部分，一部分用体积分数为4%的多聚甲醛溶液浸泡24 h做病理及免疫组织化学检测，另一部分速冻于-70 ℃冰箱。
1.2.2 BUN、Scr检测 采用自动生化分析仪(Beckman CX3 Delta)进行BUN、Scr的检测。
1.2.3 免疫组织化学检查 SP法检测肾组织中的TGF-β1、CTGF表达，按SP试剂盒说明书进行。每张切片不含肾小球的肾小管间质区域，随机选取8个高倍镜视野（400倍），用免疫组织化学分析软件系统HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统（同济医学院清屏影像公司）对所选视野内的棕黄色阳性信号进行图像分析，计算各组大鼠肾组织TGF-β1、CTGF的平均阳性表达率，即棕黄色阳性信号占整个视野的百分比。
1.2.4 肾组织病理检查 右侧肾组织行Masson染色，光镜观察肾间质纤维化情况。间质纤维化定量分析也借助HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统，取Masson染色切片，每张切片观察8个不含肾小球，互不重叠的间质高倍镜视野（400倍），计算每张切片肾间质绿染面积占整个视野的百分比。
1.3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件处理数据，计量数据采用(x±s)表示，组间比较用单因素方差分析和两两比较用q检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 血生化检查
模型组和假手术组比较BUN、Scr都显著升高（P＜0.01），姜黄素组和模型组比较，BUN、Scr都显著降低（P＜0.01）。见表1。
2. 2 免疫组化TGFβ1、CTGF的表达
模型组与假手术组比较，TGFβ1、CTGF的表达都显著上调（P＜0.01），而姜黄素组与模型组比较都显著抑制了其表达（P＜0.01）。见表1、图1和图2。
2.3 肾组织病理改变
模型组中肾间质增宽，可见间质细胞增多，胶原成分增加，出现明显的纤维化。模型组与假手术组比较，P＜0.01；姜黄素组与模型组比较，肾间质的胶原成分显著减少（P＜0.05）。见表1和图3。表1 各组BUN、Scr、TGF-β1、CTGF及Masson染色面积比的改变情况(1)与假手术组比较P＜0.01；(2)与模型组比较P＜0.01，(3)P＜0.05
篇6
【关键词】 喉鳞癌;claudin3;ecadherin;免疫组织化学
【摘要】 目的 检测claudin3及上皮型黏附素(ecad)在喉鳞癌中的表达，探讨二者在喉鳞癌发生发展及转移中的作用。方法 应用免疫组织化学法检测98例喉鳞癌组织及30例正常喉黏膜组织中claudin3、ecad蛋白的表达情况，并将检测结果与临床病理特征进行综合分析。结果 claudin3蛋白阳性表达主要定位于喉鳞癌癌旁正常黏膜细胞质和细胞膜，ecad蛋白阳性表达主要定位于喉鳞癌癌旁正常黏膜细胞膜，claudin3、ecad蛋白在喉鳞癌中表达的阳性率明显低于正常黏膜。喉鳞癌中claudin3和ecad蛋白的表达与肿物大小、分化程度、有无甲状软骨累及和淋巴结转移密切相关。结论 claudin3和ecad在喉鳞癌组织中表达下调，二者可能与喉鳞癌的发生发展有关，联合检测claudin3和ecad可能与喉鳞癌的预后密切相关。
【关键词】 喉鳞癌;claudin3;ecadherin;免疫组织化学
喉鳞癌的发生发展是涉及多个蛋白水平的变化，而细胞间的黏附力丢失常导致细胞连接的破坏〔1〕。claudin3是紧密连接的主要跨膜蛋白，此蛋白在细胞间传输转运中起重要接头作用，是细胞黏附功能的基础，研究表明claudin3在众多肿瘤组织中异常表达〔2〕。ecad是钙依赖的黏附素家族的一个经典成员。本文应用免疫组织化学方法检测喉鳞癌组织中claudin3和ecad蛋白的表达情况，并分析其与临床病理特征的相互关系，以深入探讨二者在喉鳞癌发生发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
收集2005年8月至2008年8月本院病理科喉鳞癌切除标本作为实验组，共98例，年龄为31～79(平均51.3)岁。其中男76例，女22例，有淋巴结转移的35例，无淋巴结转移的63例，术前均未进行放化疗，同时选取30例癌旁正常黏膜组织为对照组。
1.2 试剂
实验用的兔抗人claudin3多克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供，鼠抗人ecad单克隆抗体，sp和dab显色试剂盒均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。
1.3 免疫组织化学方法检测二种蛋白的表达
claudin3和ecad蛋白的表达应用免疫组织化学sp法进行。主要步骤：①将5 μm切片脱蜡水化后，用pbs冲洗3次，每次3 min。②用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复。③每张切片加1滴过氧化物阻断溶液(试剂a)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10 min。④pbs冲洗3次，每次3 min。⑤甩去pbs液，每张切片加1滴非免疫性动物血清(试剂b)，室温下孵育10 min。⑥甩去血清，每张切片加1滴第一抗体，室温下孵育60 min或4℃过夜。⑦pbs冲洗3次，每次3 min。⑧甩去pbs液，每张切片加1滴生物素标记的第二抗体(试剂c)，室温下孵育10 min。⑨pbs冲洗3次，每次3 min。⑩甩去pbs液，每张切片加1滴链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液(试剂d)，室温下孵育10 min。pbs冲洗3次，每次3 min。甩去pbs液，每张切片加2滴新鲜配制的dab溶液，显微镜下观察3～10 min，阳性显色为棕色。自来水冲洗，苏木素复染，0.1%盐酸分化，pbs冲洗返蓝。切片经梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。
1.4 结果判定标准
claudin3蛋白阳性染色位于细胞膜和细胞质，光镜下以细胞膜与细胞质同时出现棕黄色着色为阳性细胞，细胞无着色或者单纯细胞质着色、细胞膜着色为阴性细胞。ecad蛋白阳性染色位于细胞膜，呈棕黄色为阳性细胞，细胞无着色或者淡黄色为阴性细胞。合并计算高倍镜下(×400)随机选择的5个视野中阳性细胞占全部计数肿瘤细胞的百分率，平均每个视野细胞质(膜)呈阳性反应的细胞数≥10%为阳性，无明显阳性反应或阳性反应的细胞数<10%为阴性。
1.5 统计学分析
采用sas6.12软件进行χ2检验。
2 结 果
2.1 claudin3和ecad在喉癌与正常黏膜中的表达
claudin3和ecad在喉鳞癌中表达的阳性率明显低于正常黏膜(p<0.000 1)。见表1，图1。表1 claudin3和ecad在喉癌与正常黏膜中的阳性表达
2.2 claudin3和ecad的表达与喉鳞癌临床病理特征的关系
喉鳞癌claudin3和ecad蛋白的表达与肿物大小、分化程度、有无甲状软骨累及和淋巴结转移情况密切相关，而与患者的年龄及性别无明显相关。见表2。图1 ecad和claudin3在喉癌组织和正常黏膜组织中的表达(×400)表2 claudin3和ecad的阳性表达与喉鳞癌临床病理特征的关系
3 讨 论
claudins是一类跨膜蛋白，是从鸡肝中得到的一种紧密连接的片段，迄今在人体内发现至少有24种不同蛋白，分子量大约为20～27 kd之间。近年有研究显示，多种上皮性恶性肿瘤claudins有异常表达，并且与这些肿瘤发生和发展有密切关系〔1〕。claudin3是其家族的重要成员，不仅具有调节细胞间物质流动和维持上皮细胞极性的功能，而且还参与细胞增殖分化、基因转录、肿瘤抑制等过程。但我们发现claudin3在不同肿瘤中的表达并不完全相同。soini等〔3〕通过免疫组化研究表明claudin3在肾癌、膀胱癌中的表达下调。long等〔4〕利用northen印迹发现在人类前列腺上皮中，claudin3基因转录的mrna量较周围正常组织明显增高，同时用免疫组化发现claudin3蛋白在骨转移灶中的表达也是增高的。resnick〔5〕等发现claudin3在肠型胃癌中是高表达的。但是claudin3在喉鳞癌中的表达未见报道。黏附素是一组ca2+依赖跨膜蛋白，包括至少9个基因家族，其中以ecad最为重要，是钙依赖的黏附素家族的一个经典成员。近年来，有关紧密连接蛋白及黏附分子功能的研究日趋增多，并证实了其在肿瘤发生发展中的重要作用〔6〕。当肿瘤组织中ecad发生结构功能异常，如转录受抑、基因突变、启动子区域甲基化、β连接蛋白磷酸化时，其细胞黏附功能发生障碍，不仅可使细胞分化降低，而且可致肿瘤细胞侵袭性生长，并易脱离原发部位，向深部浸润而发生局部或远处转移。本实验通过免疫组织化学方法检测claudin3和ecad在喉鳞癌中的表达，发现claudin3、ecad的阳性表达率比对照组明显降低，且都与喉癌的分化程度、肿物大小、是否累及甲状软骨及有无淋巴结转移密切相关。这些结果既提示claudin3和ecad在喉癌发生发展中可能起相当重要的作用，又由于分化程度、肿物大小、是否累及甲状软骨及有无淋巴结转移是与喉鳞癌患者预后密切相关的因素，因此提示二者低表达可能与患者的预后不良密切相关。claudin3促进肿瘤生长可能有：①引起紧密连接屏障的破坏，导致营养素、生长因子和其他活性分子向肿瘤内部转运，促使肿瘤处于生长状态。②claudin3下调的肿瘤细胞不能进入细胞程度性死亡过程，促进肿瘤的发生和发展〔7〕。而claudin3与ecad可能共同参与特定细胞连接与黏附信号的传递，影响细胞迁移，进而促进肿瘤的发生发展。
【参考文献】
1 王翠芝，周小鸽，黄受方，等.claudin1在宫颈病变中的表达及其诊断价值〔j〕.诊断病理学杂志，2006;13(5)：3624.
2 van itallie cm,colegio or,anderson jm,et al.the cytoplasmic tails of claudins can influence tight junction barrier properties through effects on protein stability〔j〕.j membr boil，2004;199(1)：29.
3 soini y.expression of claudins 1,2,3,4,5 and 7 in various types of tumours〔j〕.histopathology，2005;46：55160.
4 long h，crena cd，lee wh,et al.expression of clostridium perfringens enterotoxin receptors claudin3 and claudin4 in prostate cancer epithelium〔j〕.cancer res，2001;61：787881.
5 resnick mb，cavilanez m，newton e,et al.claudin expression in gastric adenocarcinomas：a tissue microarray study with prognostic correlation〔j〕. hum pathol，2005;36：88692.
篇7
【关键词】 眼睑; 基底细胞癌; Survivin; 统计分析
眼睑基底细胞癌(basalcell carcinoma，BCC)是最常见的眼睑恶性肿瘤，约占眼睑恶性上皮性肿瘤的85%～95%[1]。研究显示多种癌基因的异常表达在眼睑BCC的发生发展过程中有重要作用，研究癌相关基因抗原在BCC发生、发展及转移机制中的作用，对于揭示BCC的生物学行为及探索有效的防治方法有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源 收集武汉市中心医院和武汉大学中南医院病理科 2002 ～ 2009 年手术切除及活检的眼睑基底细胞癌( basalcell carcinoma，BCC)标本共20例，另取癌周围正常组织5例作对照。所有标本均经10%甲醛固定， 常规HE染色，光镜观察，病理检查确诊。
1.1.2 主要试剂 即用型鼠抗人Survivin单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司);超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新生物有限公司);DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。
1.1.3 主要仪器 YWY781型医用微波仪，250W，50Hz，浙江临安电子器材厂生产;家用高压锅。
1.2 方法
1.2.1 常规HE染色 取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。
1.2.2 免疫组织化学SP法检测Survivin抗原 主要步骤： ① 4μm组织切片常规脱蜡至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;② 抗原修复(柠檬酸缓冲液微波抗原修复法)，室温自然冷却后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min;③ 滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;④正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景;⑤ 甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min;⑥ 滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(Pp 7.4)漂洗3×3 min;⑦ 滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑧ 滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间(约3～5 min)，自来水冲洗终止反应; ⑨ 苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝;⑩ 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检;用PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 免疫组织化学结果判断
Survivin抗原以细胞浆或胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，细胞浆或胞核内无棕黄色反应物。
采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对细胞浆或胞核的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。
1.4 统计学处理
数据以均数±标准差表示，用SPSS11. 5 软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q) 检验，检验水准α为0.05。
2 结果
2.1 HE染色
瘤体由基底样细胞组成，细胞核大，呈圆形或椭圆形，胞浆为嗜碱性，可见少量核分裂相。瘤体周边细胞呈栅栏状排列。肿瘤周围结缔组织增生，有较多纤维母细胞，产生胶原纤维包绕在瘤体周围。
2.2 Survivin的表达
基底细胞癌组织中可见癌细胞胞浆内棕黄色颗粒较多，Survivin表达呈阳性;癌旁组织的细胞胞浆内可见极少量的棕黄色颗粒，Survivin表达呈阴性。图像分析结果显示：眼睑基底细胞癌Survivin表达的平均光密度为0.3853±0.0254，癌旁组织Survivin表达的平均光密度为0.0246± 0.0029; 眼睑基底细胞癌Survivin表达的阳性面积率为0.3520±0.0263;癌旁组织中Survivin表达的阳性面积率为0.0305±0.0021。经单因素方差分析，组间有显著性差异(P
3 讨论
基底细胞癌是眼睑最常见恶性肿瘤，常发生于长期暴露于阳光下的中年以上的人群，男性略多，好发于下睑及内眦，病变位置表浅， BCC 是生长缓慢的肿瘤，病程一般较长， 最长可达20年。BCC一般只局部侵袭， 很少转移， 但若不及时治疗， 肿瘤可侵及眼轮匝肌、睑板和眶骨， 并可经眼眶向颅内侵犯。近年来随着人口的高龄化， BCC有逐渐增多的趋势[2，3]。
人Survivin基因位于17号染色体端粒部位，基因总长度14. 7KB，包含4个外显子和3个内含子。Survivin作为IAP家族中最小的1个新成员，结构独特。它只含有1个B IR结构，该结构被认为是Survivin发挥抗凋亡作用的部位[5～7]。目前普遍接受的观点是， Survivin作用于各个凋亡途径的汇集点: 直接抑制终末效应蛋白caspase9、caspase3和caspase7。最新发现Smac分子是与细胞色素C同时从线粒体释放出来的具有拮抗IAP 作用的蛋白小分子， 它是通过其NH2 末端与IAP分子结合而抑制后者的功能。受Smac分子作用的启发，大量的工作致力于发现能与IAP结合的非肽类小分子化学物质，这些小分子能够通过模拟Smac分子的作用而诱导肿瘤细胞凋亡[8～10]。
Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，Survivin具有肿瘤特异性，只表达于肿瘤和胚胎组织，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关[11]。现已发现，Survivin在所有常见恶性肿瘤中表达，如乳腺癌、胃癌、肾癌、黑色素癌、肠癌、神经母细胞癌和卵巢癌等，而在正常组中无表达。它的这一特性，使得靶向Survivin的免疫治疗和基因治疗能够促进肿瘤细胞的凋亡，抑制其增殖，正常组织却能不受损伤和影响。Survivin可以作为抗肿瘤免疫治疗的一个广泛适用的靶基因[12～15]。
实验采用免疫组织化学方法观察了Survivin在眼睑基底细胞癌组织和癌旁组织中的表达，实验表明眼睑基底细胞癌与癌旁组织之间，Survivin的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P
目前，关于Survivin在肿瘤中的研究已经取得了一定的进展，但是还有不少方面需要更深入地进一步研究。如Survivin与肿瘤发生发展及其临床预后的相关性，Survivin在细胞浆和细胞核中的表达受到何种调节，Survivin的各种异构体之间的关系及作用，以及Survivin在肿瘤靶向治疗中的作用等都需要我们去探究。
参考文献
1 李凤鸣.中华眼科学上册.人民卫生出版社 ，2005，880～881.
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7 Ryan B ，Konecny G，Kahlert S ， et al. Survivin protein expression predicts poor outcome in patients with primary breast cancer ，2005 ASCO Annual Meeting Proceedings. J Clin Oncol ，2005 ，23 (16S) :547.
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9 Hoffman WH ，Biade S ，Zilfou JT ， et al. Transcriptional repression of the antiapoptotic survivin gene by wild type p53. J Bio Chem， 2002 ， 277(5):3247～3257.
篇8
【关键词】 IgA肾病；肾组织；抗原
IgA肾病也称为Berger病， 是指患者肾小球系膜区域内有IgA或IgA沉积， 可伴随肾小球系膜区域有其他免疫球蛋白沉积的原发性肾小球病变。该病是终末期肾病的重要诱导因素[1]， 其发病机制尚不明确， 目前认为由免疫、遗传和环境因素共同引发IgA肾病[2]。已有调查表明， IgA肾病患者35%～40%伴随有上呼吸道感染症状， 而人巨细胞病毒（HCMV）和腺病毒（ADV）等和上呼吸道感染之间有密切关联。同时， IgA肾病患者乙型肝炎病毒（HBV）感染率明显比健康人群高。为对HCMV、AdV、HBV抗原在IgA肾病患者肾组织中的表达和其意义进行探讨， 作者选取34例IgA肾病患者， 利用免疫组织化学技术对肾组织中HCMV、AdV、HBV抗原进行检测， 现将相关情况报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 选取本院于2011年7月～2013年8月诊治IgA肾病患者34例， 所有患者均临床症状、辅助检查结果均与WHO 1999年制定的IgA肾病诊断标准相符， 其中男20例， 女14例， 患者年龄为31～58岁， 平均为（42.3±2.5）岁；病程为1～5周， 平均（2.6±1.1）周；所有患者均有不同程度水肿、高血压， 24 h尿蛋白定量1～3 g， Lee氏分级为Ⅰ～Ⅳ级。
1. 2 方法 取IgA肾病患者肾活检组织， 利用免疫组织化学技术检测肾组织中HCMV、AdV、HBV抗原表达情况。在检测中所用链霉亲和素-生物素复合物（sABC）试剂盒、DAB显色试剂盒、鼠抗人HBsAb多克隆抗体与鼠抗人HCMV抗原单克隆抗体均由北京中杉金桥生物技术公司提供。鼠抗人AdV抗原单克隆抗体均由Neomarkers公司提供。利用sABC法进行检测， 操作步骤为：载玻片彻底清洗组织包埋切片捞取组织脱蜡抗原修复封闭血清一抗二抗将sABC加入加入显色剂复染脱水封片。
2 结果
2. 1 IgA肾病患者肾组织中HCMV与AdV的表达 肾组织中HCMV主要表达部位是肾小管与肾小球， 且随着肾小球与肾小管间质破坏程度越严重， HCMV表达越高；AdV主要表达部位是肾小管上皮细胞， 部分在肾小球中表达， 少部分在肾间质中表达。
2. 2 IgA肾病患者肾组织中HBsAg的表达 在IgA肾病患者肾组织中， HBsAg主要表达部位为肾小管上皮细胞， 部分可在肾小球与肾间质中表达。HBsAg表达和肾小球与肾小管间质破坏程度间无相关性。
3 讨论
IgA肾病是临床常见肾小球病变， 在普通人群中发病率高于1%， 预后较差， 每10年内约有20%患者进至终末期肾病阶段。IgA肾病发病隐匿， 病程较长， 主要有反复发作的镜下血尿或肉眼血尿， 可伴随不同蛋白尿、高血压或肾功能不全症状。患者通常是在行常规尿检时才发现， 其诊断、观察病理损伤情况、评估病情进展等均需利用肾组织活检实现[3]。
IgA肾病患者通常会伴随上呼吸道感染症状， 其中最常见的为扁桃体炎， 而在 IgA肾病患者中可发现扁桃体免疫学异常。当通过手术将扁桃体切除后， IgA肾病临床症状可得到明显缓解， 部分患者IgA肾病主要症状甚至会完全消失， IgA肾病得到有效抑制， 转变成肾功能不全， 由此可见IgA肾病起病、发展均和扁桃体免疫异常有重要关联。而HCMV与ADV是上呼吸道感染常见病因， 特别是和扁桃体发炎之间有密切联系， 由此可推断， HCMV与ADV和IgA肾病起病有一定关系。国内外多数专家认为， HBV感染和和IgA肾病发病与进展有密切联系， HBV抗原引发IgA肾病的机制为：当患者感染HBV抗原后， 血液循环与体内血清中的抗体会构成免疫复合体， 在病程迁延下， HBsAg复合体数量会明显增加。同时， 血液中持续存在HBV会对肝细胞造成损伤， 导致肝细胞对免疫复合体清除的能力减弱， 致使肾脏中有大量免疫复合体沉积， 最终引发IgA肾病。本次研究通过免疫组织化学技术对HCMV、AdV、HBV抗原和IgA肾病间的关系进行探讨， 结果表明， 在IgA肾病肾组织中， HCMV主要在肾小管、肾小球中表达， 且表达阳性率可达90%甚至更高， 同时， 在肾间质中存在大量炎细胞浸润细胞；随着患者肾小球与肾小管间质破坏程度越严重， 其HCMV表达程度越高。AdV主要表达部位是肾小管上皮细胞内， 部分在肾小球中表达， 少部分在肾间质中表达；在肾远曲小管内， AdV表达率可达95%， 同时在肾间质中有炎细胞浸润现象。HBsAg主要在肾小管上皮细胞， 部分可在肾小球与肾间质中表达。
综上所述， 肾组织中HCMV、AdV、HBV抗原的表达和IgA肾病的发病及发展相关， 可作为IgA肾病诊断与观察病情进展的重要指标。同时， 在日常生活中加强HCMV、AdV、HBV感染的预防， 以促使IgA肾病发生率大幅降低；在IgA肾病治疗中， 应将抗HCMV、抗AdV与抗HBV和IgA肾病治疗有机结合起来， 对这一疾病发展予以有效控制。
参考文献
[1] 张建周. IgA肾病采用糖皮质激素治疗临床效果观察.中国现代药物应用， 2013， 7（8）：78-79.
篇9
【关键词】 骨肉瘤; Fascin基因; 免疫组织化学; 图像分析; 统计分析
骨肉瘤是青春期正常骨骼快速生长相应发病高峰期最常见的原发性恶性肿瘤。其发生率约为0.1/10万， 其恶性度高，进展快，预后差，且以青少年好发。多发于10～20岁的青少年的长骨， 尤以股骨下段和胫骨上段多见[1]。占骨恶性肿瘤的20%左右，肺转移是其主要死亡原因，80%的病例在确诊时已有肺部微小转移灶。骨肉瘤早期临床症状无特异性，且病情进展较快，大多数病例就诊时已经进入临床ⅡB期[2～4]。Fascin基因属于fascins家族，其蛋白质编码产物是一种结构独特、进化保守的肌动蛋白( actin)交联蛋白，位于细胞膜皱褶、微棘及应力纤维，在各种转化细胞中促使细胞膜突起并增加细胞运动性。近年来的研究发现， fascin在许多恶性肿瘤组织细胞中表达上调，在恶性肿瘤的进展中起重要作用[5～7]。研究通过应用免疫组织化学方法和图像分析技术检测骨肉瘤及良性骨软骨瘤组织中fascin基因的表达水平，并进行了统计学分析，探讨Fascin基因在骨肉瘤发生、发展过程中的作用机制，为临床上防治骨肉瘤提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 材料来源及分组 收集武汉市四大三级甲医院病理科2000～2008年骨肉瘤存档蜡块20例及良性骨软骨瘤存档蜡块5例。所有切片经病理学专家诊断为骨肉瘤及良性骨软骨瘤。
1.1.2 材料 采用免疫组织化学SP法检测Fascin基因在骨肉瘤与良性骨软骨瘤组织中的表达。
1.2 主要试剂和仪器
1.2.1 主要试剂
①Fascin兔抗人多克隆抗体(北京中山生物技术有限公司);②超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司);③DAB显色试盒及多聚赖氨酸(北京中山生物技术有限公司)。
1.2.2 主要仪器 ① YWY781型医用微波仪，250 W，50 Hz (浙江临安电子器材厂生产);② 家用高压锅;③ 电热恒温干燥箱 (湖北黄石医疗器械厂生产);④ 显微镜成像系统 (Olympus公司)。
1.3 方法
蜡块切片厚5μm，贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。免疫组织化学SP法检测Fascin基因相关抗原 具体步骤：① 4μm组织切片常规脱蜡至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;② 抗原修复(柠檬酸缓冲液微波抗原修复法)，室温自然冷却后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗5×3 min;③ 滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;
④ 正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景;⑤ 甩去多余血清，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×5 min;
⑥ 滴加生物素标记的二抗37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑦ 滴加链霉素抗生物素蛋白过氧化物复合物37℃湿盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑧ 滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间(约3～5 min)，自来水冲洗终止反应;
⑨ 苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返蓝;⑩ 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检;用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为阳性对照组。
1.4 免疫组织化学结果判断
Fascin阳性染色为棕黄色颗粒，定位于细胞核和胞质内。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对Fascin基因的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400) ，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。
1.5 统计学处理
数据以均数±标准差表示，用SPSS11. 5 软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q) 检验，检验水准α为0.05。
2 结果
Fascin基因的表达：在骨肉瘤组中可见密集分布的棕黄色颗粒，Fascin基因表达呈阳性;在良性骨软骨瘤组中可见少量的棕黄色颗粒，Fascin基因表达弱阳性或阴性。图像分析结果显示: 骨肉瘤组Fascin基因表达的平均光密度为0.2659±0.009， 良性骨软骨瘤组Fascin基因表达的平均光密度为0.0886±0.0043; 骨肉瘤组Fascin基因表达的阳性面积率为0.2994±0.0080， 良性骨软骨瘤组Fascin基因表达的阳性面积率为0.0987±0.0056，经单因素分析骨肉瘤组与良性骨软骨瘤组比较，差异有显著性(P
3 讨论
原发性恶性骨肿瘤是罕见的，只占所有新癌症病例的0.2%。这些罕见肿瘤的治疗是复杂的，对骨外科来说是一项重大的挑战。骨肉瘤是青春期正常骨骼快速生长相应发病高峰期最常见的原发性骨肿瘤。近年来强度新佐剂和佐剂化疗的使用使得这种疾病患者得以存活。无复发存活率已经从没有进行化疗的不足20%提高到了使用手术和多化疗相结合治疗的55%～70%[8～10]。完全手术切除和术前化疗良好的组织学反应是患者疾病定位最重要的预后指标。患者术前化疗反应良好(>90%坏死)5年存活率为75%～80%，与此相比那些化疗反应差的(
人类Fascin基因是由Bryan等[13]20 世70 年代从海胆母细胞中发现的，其蛋白质编码产物是一种分子量为55 kDa 的细胞骨架蛋白[14～15]，Fascin蛋白N端11～50之间的氨基酸残基高度保守，其中第39位的丝氨酸为蛋白激酶C的磷酸化位点，该位点的磷酸化可调节Fascin蛋白与F肌动蛋白的结合活性以及细胞膜表面丝状伪足和微棘的形成，提示Fascin蛋白可能在细胞迁移、细胞黏附以及细胞间信息交流等过程中发挥作用[16，17]。研究发现， 在正常上皮细胞中Fascin表达较低或缺失， 然而在胃癌、肺癌、食管癌等恶性肿瘤中Fascin1 表达上调[18～20]。
本实验结果显示，Fascin基因在骨肉瘤的表达明显高于对照组(P
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篇10
【关键词】 子宫颈腺癌 子宫内膜腺癌 p16 鉴别诊断
【Abstract】 Objective:TObjectives Observation of p16 protein in cervical adenocarcinoma and endometrial cancer in the differential diagnosis of significance. Also part of the guideline on early cases whether the fertility preservation. Methods SP with Immunohistochemistry assay for the detection of cervical adenocarcinoma and 40 examples of 73 cases of endometrial carcinoma p16， p53， ER and PR of the expression. Results (1) the p16 in 40 examples of cervical adenocarcinoma in 37 cases (92.5%) is diffuse and positive， in 73 cases of endometrial carcinoma in 28 patients (38.4%) is of positive. (2) in cervical adenocarcinoma in p53， ER， PR positive expression of various 20.0% and 5.0% and 7.5%， while in endometrial cancer in p53 38.4% overexpression， Hormone receptor ER， PR in endometrial cancer respectively 78.1% and 71.2% expression. In cervical adenocarcinoma p16 protein in the diffuse nuclear and cytoplasmic-positive， and histological forms resemble endometrial carcinoma irregular of positive， and the overall strength is low . In cervical adenocarcinoma p16 protein displayed prevalent， the strength of expression in to， and histological forms resemble endometrial carcinoma is the weaker of positive. P16 protein p53 protein detection at the joint， hormone receptor ER， PR will not only identify cervical adenocarcinoma and endometrial cancer， can also be used for uterine serous carcinoma and endometrial cancer diagnosis. Conlusions Consultation on biopsy or scraping of uterine cancer samples， selection of p16 protein detection can be used as an auxiliary immunocytochemistry to identification of cervical adenocarcinoma and endometrial cancer.
【Key words】Carcinoma of cervix uterus Endometvial cancer P16 Protein Distinguishing
前言:子宫癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，由于许多子宫颈腺癌可以表现为宫内膜样分化，子宫内
膜腺癌也可以呈现浆液性、粘液性、腺鳞癌样改变，两者有时在组织形态上具有相似之处，在活检和诊刮标本中来决定子宫腺癌组织来源是比较困难的。尤其肿瘤原发灶在子宫下段和宫颈时，在缺乏明显的癌前期病变的情况下，即使子宫全切除术后标本，仅靠组织学将二者区别开来是比较困难的。由于两者临床手术方式不同，尤其对于需要保留生育功能的早期病例，鉴别诊断尤为重要。早期国内外文献报道免疫组织化学雌激素受体（ER），孕激素受体（PR）在宫内膜腺癌中表达，而在宫颈内膜腺癌中不表达，可据此来鉴别子宫内膜腺癌和宫颈内膜腺癌。近期研究表明根据表达模式不同，p16可以作为一个辅免疫组织化学标记来鉴别子宫颈腺癌和子宫内膜腺癌。本文通过对40例子宫颈内膜腺癌及73例子宫内膜腺癌中p16、p53、ER、PR表达的检测，也证实p16是鉴别二者有效的方法。
1.材料和方法
1.1材料：收集2000年1月-2010年1月中南大学湘雅二医院病理科和张家界市人民医院病理科已确诊子宫颈腺癌40例标本，其中年龄最大者为54岁，最小者为35岁，平均年龄42岁。1例为子宫颈内膜活检标本，4例为子宫颈LEEP术，3例为锥切标本，其余均为子宫全切标本。并取相同年月子宫内膜腺癌73例，其中年龄最大者为78岁，最小者为43岁，平均年龄55.7岁。8例为宫内膜活检标本，其余均为子宫广泛及次广泛切除标本。
1.2方法：全部标本经10%甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，5um切片，HE染色和免疫组织化学法SP法染色。检测p16蛋白、p53蛋白、ER、PR的表达。试剂均购自福州迈新生物技术
有限公司。染色步骤参照试剂说明书进行。AEC-H2O2显色，苏木精对比染色。
1.3结果判断标准： p16蛋白阳性定位于胞核或胞质，p53蛋白、ER、PR阳性定位于胞核。阳性着色呈棕红色颗粒。根据阳性细胞在组织中所占面积分为4个等级：≤5%为（-）、5-10%为弱（+）或可疑（+）、10-30%为阳性，≥30%为强阳性。统计学处理时将阴性组、弱阳性组及可疑阳性组合并为阴性病例组，阳性及强阳性合并为阳性病例组。
1.4统计学处理：采用X2检验方法和相关分析，以P
2 结果
2.1免疫组织化学：（1）p16蛋白表达：在40例子宫颈腺癌中37例表达弥漫、中到强度阳性（见图一），其中微偏性腺癌均表达阴性；73例子宫内膜癌中35例呈阳性，其中28例灶性阳性且总体强度较弱（见图二），2例弱阳性， 5例可疑阳性。（2）p53蛋白表达：在40例子宫颈腺癌8例阳性。73例子宫内膜腺癌中28例阳性，其中19例灶性呈阳性，3例弱阳性，6例可疑阳性。（3）PR表达：在40例子宫颈腺癌中3例阳性。73例子宫内膜腺癌中52例呈阳性。（4）ER表达：在40例子宫颈腺癌中2例阳性。73例子宫内膜腺癌中57例呈阳性。
表1 p16、p53、ER、PR在宫颈不同类型腺癌中表达：
类别
n p16 n(%)
p53 n(%)
PR n(%) ER n(%)
子宫内膜样腺癌 6 6（100.0） 0（0.0） 2（33.3） 2(33.3）
腺鳞癌
4 4（100.0） 0（0.0） 0（0.0）
0（0.0）
浆液性腺癌 6 6（100.0） 5（83.3） 0（0.0）
0（0.0）
粘液性腺癌 21 21（100.0） 1（0.0） 0（0.0）
0（0.0）
p53、ER、PR在不同子宫内膜腺癌中表达：
类别
n p16 n（%） p53 n（%） PR n（%） ERn（%）
子宫内膜样腺癌 47 23（48.9）
15(31.9) 38(80.9) 42(89.4)
腺鳞癌
14
7(50.0)
8(57.1) 10(71.4) 11(78.6)
浆液性腺癌 7
4(57.1)
5(71.4)
2(28.6)
2(28.6)
透明细胞癌 2
0(0.0)
0(0.0)
1(50.0)
0(0.0)
微偏性腺癌 1
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
1(100.0)
非典型增生癌变 2
1(100.0)
0(0.0) 1(100.0) 1(100.0)
2.2 统计学处理 经统计学分析，p16蛋白在子宫颈腺癌阳性率明显高于子宫内膜腺癌，差异有极显著性（X2=30.17，P
2.3 结论 在子宫颈腺癌中p16蛋白呈弥漫性细胞核和细胞质阳性，而组织学形态与其相似的宫内膜腺癌中呈不规则灶性阳性，而且总体强度较弱。根据上述p16蛋白表达结果显示， p16可用于子宫颈腺癌和子宫内膜腺癌的鉴别诊断。当子宫颈腺癌和内膜的浆液性腺癌均表达p16阳性且激素受体阴性表达，此时浆液性腺癌与子宫颈腺癌鉴别要借助p53的表达。
3 讨论
子宫内膜腺癌和宫颈腺癌是妇科最常见的恶性肿瘤，发病率高。近年来，宫颈腺癌有逐渐增加趋势，且趋于年轻化。原发于子宫颈具有子宫内膜样分化的腺癌和子宫内膜的子宫内膜样腺癌，还有子宫颈和子宫内膜的粘液腺癌，在形态上有很大的重叠，然而在临床病理诊断工作中，我们常常不易区分子宫体下段腺癌和宫颈腺癌，特别是宫颈的子宫内膜样腺癌，其组织学形态和一般概念上的子宫内膜腺癌相同，尤其在诊刮诊断时，虽然内膜样分化或粘液分化等形态特征可能有所提示，宫颈的肿瘤易于向宫旁及阴道上段浸润，这种典型的浸润方式也有利于确认腺癌原发于宫颈，但是如果宫体（特别是子宫下段）和宫颈同时被累及，没有明显的癌前病变，子宫腺癌的原发部位就很难确定。宫颈腺癌无明显的宫颈间质浸润，却直接累及子宫内膜，甚至侵入宫体肌层，这种宫颈腺癌的浸润方式在以前的研究中很少报道过，所以当宫颈的腺癌主要累及内膜和宫体肌层时，常常被认为是原发于内膜的腺癌累及宫颈，尤其当宫颈腺癌累及内膜无法与不典型复杂性增生过长的内膜区分时，这种错误更易发生。对于活检和诊刮标本，在手术前确定其原发部位是非常必要的，因二者手术方式不同，尤其对于尚未生育的妇女是否保留子宫，尤为重要。以前实验证明激素受体ER、PR在大多数宫内膜腺癌中的表达，在大多数宫颈腺癌中为阴性。虽然单独使用激素受体可以区别一些腺癌，但少数情况下HPV阳性的宫颈腺癌激素受体也阳性（一般ER强于PR），而子宫内膜样内膜腺癌也可不表达激素受体[1]。在近期较多研究表明[2-4]鉴别二者时，人类状瘤病毒（HPV）DNA的检测较ER、PR有更高的敏感性和特异性，因为高危型HPV对宫颈癌的发病起作用，对内膜癌的发病不起作用。由于原位杂交不能在各个病理科实验室普及，所以需要一个和HPV密切相关的免疫组织化学标记来代替，在一系列的研究中显示出p16不仅比激素受体的表达更为稳定，而且可以作为检测高危型HPV相关性腺癌的方法。这是由于基因p16作为一种肿瘤抑制基因，定位于人类染色体9p21[5，6]，p16蛋白是细胞周期调节蛋白之一，其作用是竞争抑制细胞素D1与CDK4结合，并特异性地抑制CDK4的活性，使抑癌基因PRb的蛋白处于非磷酸化的活性状态，从而阻止细胞由G1期进入S 期，抑制细胞繁殖，而高危型HPV病毒蛋白可与PRb结合并使其失活，导致p16蛋白的过度表达[4，7]。所以当激素受体的表达不典型时（宫颈癌ER PR，内膜癌ER+PR+），组合中加入p16就显示出重要的意义。p16蛋白在宫颈腺癌中表达的情况各个学者研究结果不尽相同。一些研究表明，在几乎所有的原位和浸润性宫颈腺癌中p16蛋白都有弥漫强阳性表达，而其他研究则显示较低的阳性率[8]。还有学者报道p16蛋白表达于73%~86%的子宫内膜腺癌[9，10]。在本组研究结果中显示出40例子宫颈腺癌除3例微偏性腺癌外，其余均表达弥漫中度至强度阳性，癌细胞阳性率达90%以上。微偏性腺癌不表达，这可能与其形态学及组织结构酷似正常宫颈内膜腺体有关。据李胜水等[11]用免疫组织化学p16、p53、HPV16/18检测10例子宫颈微偏性腺癌，证实了p16、HPV16/18均无表达，而P53则有85%表达。本组研究结果同时也显示了73例子宫内膜腺癌中28例p16呈灶性阳性且阳性程度普遍较弱。
总之，许多研究发现在HPV相关性的宫颈腺癌中，p16显示弥漫的、中到强度的表达，而组织学形态与其相似的宫内膜腺癌则显示弱的灶性阳性， p16蛋白表达较原位杂交更敏感快捷，因为所有宫颈腺癌都确切弥漫表达p16，而有些原位杂交却无法检测到宫颈腺癌的HPV的DNA，因此p16可以作为一个辅的免疫组织化学标记来鉴别子宫颈腺癌和子宫内膜腺癌。
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