转座子的遗传学效应范文

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篇1

[关键词]RNAi；dsRNA；siRNA

[中图分类号]R394[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2007）10（b）-007-03

RNAi（RNA interfering，也称RNA干扰）是利用小双链RNA特异阻断特定基因的表达，并促使靶mRNA降解，从而使细胞表现出某种特定基因缺失表型的现象。由于RNAi对基因表达的阻断具有高效、特异性，已迅速发展成为代替基因敲除的遗传工具。

1 RNAi的分子作用机制

经过众多学者的研究，现已基本阐明了RNAi的作用机制。在不同生物中RNAi的作用机制各有不同,主要分为两种：大于30 nt（核苷酸，nucleotide,nt）的长双链RNA的非特异效应和21～23 nt的短双链RNA的特异效应[1]。RNAi的特异效应作用机制是在转录水平、转录后水平、翻译水平等多个不同的水平上实现的。其中以siRNA转录后水平的RNAi研究最为深入，应用最为广泛，下文将做主要介绍(图1)。

1.1 转录后水平的RNAi机制

转录后水平的RNAi机制是在对线虫、果蝇等生物体进行研究而进一步推导得出来的。不同研究领域的学者相继提出了多种RNAi机制的模型，这些模型大致都将RNAi分为两个阶段：起始阶段和效应阶段。

起始阶段包括：①dsRNA的导入：包括由外源导入或由转基因、转座子、病毒感染等各种方式引入的dsRNA;②dsRNA在细胞内被一种命名为Dicer的酶切割成21~23 nt长的小分子干扰RN断（short interfering RNA, siRNA）。

效应阶段包括：①在siRNA反义链指导下，双链siRNA与一个不同于DICER的RNA酶结合形成沉默复合物RISC。②siRNA双链解旋，正义链被释放出来，RISC被激活。③活化的RISC通过碱基配对识别互补的靶mRNA，siRNA反义链与mRNA复合体中换位，并在距siRNA的3'末端12 nt处切割靶mRNA，从而实现了对mRNA的降解。降解位点多为尿嘧啶。

某些学者认为RNAi过程中还具有自身循环放大机制，并将其归为模型的第三阶段――循环放大阶段，其机制大致如下：

在效应阶段，活化的RISC结合mRNA后，内切核酸酶将mRNA切割成12~23 nt的片段，特异性地抑制了靶基因的表达。同时，释放出来的siRNA可以作为一种特殊引导物，在RNA依赖的RNA聚合物（RdRP）作用下，以靶mRNA为模板合成新的dsRNA，后者又被降解为新的siRNA，进入上述循环，呈放大效应。此过程又称为随机降解性多聚酶链式反应（PCR）[2]。

1.2翻译水平的RNAi机制[1]

翻译水平上的RNAi是抑制相应mRNA的翻译，使相应的蛋白质表达受阻，其中起重要作用的是stRNA (small temporal RNA)，它是由长度约70 nt的RNA形成的茎环样前体，经Dicer酶作用后形成长约21～23 nt的dsRNA， 通过RISC结合在相应mRNA的3'末端非翻译区上,进而阻断mRNA的翻译。

1.3转录水平上的RNAi机制[1]

该机制是通过siRNA与互补的DNA直接发生作用，激发同源DNA甲基化的加强，使目的基因转录受限，表达关闭，进而加强了基因沉默。有报道dsRNA可诱导组蛋白H3及相应DNA区域甲基化。如果甲基化出现在启动子区域,则转录就不能进行,如甲基化出现在编码区,则转录进行,但在转录后水平上沉默。

1.4 非特异效应

许多研究表明，当向哺乳动物转染大于30 nt的长双链RNA（dsRNA）时，由于dsRNA激活双链RNA依赖的蛋白激酶（dsRNA dependent protein kinase, PKR）途径[3]，使EIF-2α因子磷酸化，进而非特异性地抑制翻译，从而使细胞内发生全面的细胞沉默。

1.5 RNAi过程所涉及的主要因子

siRNA：是RNAi作用赖以发生的重要中间效应分子。它是长约21~23 nt的双链RNA小分子，与靶mRNA序列具有同源性。此外，siRNA每条单链 的3'末端均有2~3个非配对的碱基[4]。

Dicer酶：Dicer酶（在果蝇中发现）是一种RNaseⅢ家族中的一种识别dsRNA的酶，据报道其结构含有1个PAZ结构域，1个氨基螺旋酶结构域，2个RNaseⅢ模体及2个dsRNA结构域。在dsRNA导入后，Dicer酶以ATP依赖的、持续方式连续切割dsRNA。在对dsRNA进行切割时，Dicer以二聚体形式参与，每个二聚体包括4个活性中心，在降解RNA时其中的2个要失活,从而使降解过程每隔一定间隔进行,这个间隔正好为22个核苷酸,即每隔22个核苷酸Dicer酶将dsRNA降解一次。而Dicer酶结构上的微小改变将会引起间隔的改变,所以不同的物种产生的siRNA长度也略有不同[1]。

RdRP：许多实验证明，RdRP是RNAi所必需的。RdRP目前仅知其主要是在单链siRNA指导下扩增RNA而加速RNA的过程。由于RdRP的存在，使RNAi能在低浓度下高效快速地进行。

ATP[5]：ATP在siRNA介导中起重要作用，dsRNA被降解为siRNA的过程需要ATP；siRNA解旋，反义链与RISC前体结合形成RISC的过程也依赖ATP。研究还发现，RNAi过程中外源性ATP不能起促进作用。

2 RNAi的特征

高稳定性：以3'末端突出的TT碱基的dsRNA尤为稳定，无需象反义核酸那样进行进行广泛的化学修饰以提高半衰期[6]。

高效率：在低于反义核酸几个数量级的浓度下，就能使目标基因的表达降到极低水平甚至完全抑制，从而产生缺失突变体表型[7]。

高特异性：siRNA除正义链3'末端突出的2个碱基在序列识别中不起主要作用外，其他单个碱基的改变均可能使RNAi效应大大减弱。而针对同源基因共有序列的RNAi则导致同源基因共同失活[5]。

高传递性：RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持，在某些生物中RNAi还可以传递到后代中去。

3 RNAi应用过程需要解决的几个问题

避免非特异性效应：前述已阐明，在哺乳动物中，当大于30 nt的dsRNA被导入时，可激活PKR途径而导致非特异性抑制。这就要求在设计dsRNA时必须考虑该dsRNA导入时能否避免非特异性效应的出现。多数实验表明，以21~23 nt为最佳选择。

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干涉dsRN段的获取和导入：在实际应用中，siRNA的长度、结构、组成及其触发的效果基因、种属、序列、细胞类型、甚至实验体系的不同而有变异。目前，siRNA的获取大多数仍旧是生化合成，其设计仍处于试验阶段，能否成功地设计出合理实用的siRNA对其能否广泛应用起决定性作用。对RNAi效应的调控：目前对RNAi的研究还限于以双链干涉片段抑制特定基因的表达，对其调控的干涉较少。但大量的研究表明，dsRN段的大小、潜在靶位、活性片段浓度等都是RNAi有效性发挥的影响因素。Yang等还证实RNAi现象可被过剩的不相关的dsRNA竞争性抑制，深入的研究表明，甚至过剩的正义链与反义链也可竞争性抑制RNAi效应。

4 RNAi的应用及前景

4.1遗传学研究的应用

4.1.1 稳定转座子RNAi缺陷可引起内源性转座子的移动。转座子的重要特征之一是具有反向重复序列，生物体通过此序列可以产生dsRNA发夹，启动PTGS效应，所以抑制转座子的移动有利于遗传稳定，防止遗传损害。因此人们认为RNAi的一个自然功能就是转座子沉默[8]。

4.1.2 基因功能分析人类基因组计划中的基因测序已经完成，人类将进入后基因组时代。其主要任务是确定基因的功能，因此迫切需要建立有效、经济的分析基因的技术。

尽管目前对RNAi机制并未完全弄清，但其高效、特异阻断基因的表达已在某些研究中开展。RNAi克服了传统基因功能分析技术要求高，过程繁等缺点，已吸引了越来越多学者的重视。可以预见，RNAi将成为新一代基因组功能研究的有力工具。

4.2 临床应用

4.2.1 抗病毒David等认为在动物中RNAi代表一种古老的抗病毒反应，与植物的PTGS（转录后的基因沉默）一样可抵抗病毒的感染，目前这一观点已被普遍认可。

目前，利用体外培养人类细胞研究抗病毒感染，主要限于单链 RNA病毒，包括人类免疫缺陷病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒和脊髓灰质炎病毒等。Novina[9]等用针对CD4的siRNA转染Magi-CCR5细胞，产生了对CD4受体表达特异性抑制达75%，Northern杂交发现CD4分子的mRNA明显降低了8倍，从而阻断了HIV-1病毒细胞。Kapadie等[10]用针对HCV的siRNA与表达HCV的质粒共转染人的肝癌细胞株Huh-7细胞，2 d后，Northern杂交检测显示：HCV的RNA含量下降，证明了HCV特异的siRNA抑制了病毒的复制[9]。

RNAi在针对其他病毒，如呼吸道合胞病毒、SARS病毒、脊髓灰质炎病毒，猪瘟病毒等均显示出抑制病毒复制的作用。最近有文献报道RNAi在研制抗SARS药物中显示出特殊的作用。

从当前的这些研究结果可以看出，siRNA通过序列特异性干扰作用，能封闭病毒基因在体内的复制，RNAi成为控制病毒在细胞内复制的重要工具，为病毒治疗提供了新的思路。

4.2.2 抗肿瘤利用RNAi的高效率和高度特异性，我们可以设计特异siRNA分子，沉默目标基因，而正常基因不受影响。这是用RNAi抗肿瘤的基本思路。从现阶段研究的进展看来，RNAi有望成为新一代研究抗肿瘤的重要工具，发挥重要作用。

肿瘤是多因素、多基因的疾病，单个癌基因的抑制难以达到治疗效果，用基因敲除等方法进行治疗研究就造成了时间和经费的浪费。RNAi技术可同时抑制多个基因，且抑制效果互不干扰，并且RNAi识别可以精确到单个核苷酸，对由野生型突变形成的癌基因，如ras、p53等，能产生准确有效的封闭效果，而野生型不受影响[11]。Wilda等针对bcr/abl基因融合位点设计了一段21 nt长的dsRNA分子，特异性沉默了该融合基因，并使表达该融合基因的细胞凋亡，而对不表达该基因的肿瘤无任何作用。最近，Linsl等把针对bcl2基因的mRNA-cDNA杂交体转染到人前列腺癌lncap细胞中，产生了长时期的阻抑bcl2表达效应，这一效应与体外培养的前列腺癌细胞中的RNAi非常相似。

5 结语

RNAi的发现改变了人们对细胞基因调控的传统思路，提供了特异性阻断基因表达的新工具和评价基因功能的新策略，为人类基因功能研究和疾病基因治疗开辟了一条革命性的新领域。尽管其机制仍未完全弄清，但RNAi技术在病毒、肿瘤等尚未根治的疾病提供了新的治疗方案，并带来根治的希望。目前RNAi在各方面的研究已经日新月异，可以相信，不久的将来，将会出现基于RNAi的基因治疗药物，RNAi技术也将成为未来生命研究的重要工具。

[参考文献]

[1]康洁，刘福林．RNAi的抗病毒作用及其机制[J]．现代免疫学，2004，24（5）：439-441.

[2]Lipardi C，Wei Q，Paterson BM.RNAi as random degradative PCR： siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generate new siRNAs[J]． Cell， 2001，107（3）：297-307.

[3]朱汝森，刘新光，梁念慈． RNAi实现策略的进展[J]． 国外医学临床生物化学与检验学分册，2005，25（3）：214-215.

[4]Nykanen A，Haley B，Zamore PD．ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway[J]．Cell，2001，107（3）：309-321.

[5]Harborth J，Elbashir SM，Becheft K，et al．Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs[J]．Cell Science，2001，114（24）：4557.

[6]Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al． Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J]． Nature，2001，411（6836）：494-498.

[7]Bass BL．RNA interference．The short answer[J]．Nature，2001，411（6836）：428-429.

[8]Vastenhouw NL，Fischer SE，Robert VJ，et al． A genome-Wide Screen identefies 27 genes involved in transposon silencing in C.elegans[J]． Curr Biol，2003，13（15）：1311-1316.

[9]Peng HJ， Tsai LC， Su SN， et al． Comparison of different adjuvants of protein and DNA vaccination for the prophylaxis of IgE antibody formation[J]． Vaccine， 2004，22：:756.

[10]Kumar M，Behera AK， Hu J，et al． IFN-grmma and IL-12 plasmid DNA as vaccine adjuvant in a murine model of grass allergy[J]． Allergy Clin Immunol，2001，108：402.

[11]陈竞． RNAi的研究进展[J]．川北医学院学报，2004，19（3）:198.

(收稿日期:2007-08-23)

篇2

[关键词]桔梗；同源四倍体；DNA甲基化；MSAP

[Abstract]In order to investigate the epigenetic variations between diploid and autotetraploid of Platycodon grandiflorus.the diploid buds of P. grandiflorus were soaked in the mixture of different concentration colchicines and 0.002 g・mL-1 dimethyl sulphoxide （DMSO）.The identification of autotetraploid plants were based on morphological characteristics，chromosome number and flow cytometry. And then the level and pattern of DNA methylation explored by using the technology of methylation sensitive amplified polymorphism （MSAP）.The result demonstrated that the buds soaked in 0.2% colchicines and 0.002 g・mL-1 DMSO solution for 12 h was ideal conditions to induce autotetraploid of P. grandiflorus，with induction rate of 32.0%.The diploid and tetraploid plants existed distinctly differences in morphological indexes.Totally，1 586 bands were amplified by 20 pairs of selective primers，of which 764 and 822 bands were detected in diploid and autotetraploid respectively.The total methylation ratio，full methylation ratio and hemimethylated ratio were 91.25%，61.25% and 30.65% in diploid of P. grandiflorus，respectively.However，the total methylation ratio，full methylation ratio and hemimethylated ratio of autotetraploid of P. grandiflorus were 86.13%，54.38% and 31.75%， respectively. Compared with diploid，the genomic DNA total methylate ratio and full methylation ratio of autotetration plants decreased by 6.02% and 7.14%.But the hemimethylated ratio of autotetraploid was higher than that of diploid，which more than 1.6%.All this results indicated that DNA methylation patterns have adjusted during the polyploidy process.

[Key words]Platycodon grandiflorus； autotetraploid； DNA methylation； MSAP

多倍体是指含有3套或3套以上完整染色体组的生物体[1]。由于多倍体将1个或多个整套染色体累加到基因组上，对生物体的基因组产生了一定冲击，这种“基因组冲击”使生物体的新陈代谢和基因调控等发生改变，从而使植株的形态器官、生理指标、遗传特性等产生变异[2-5]，这些变异会增强植株的生态适应性和环境的抗逆性，降低蒸腾作用，提高光合效率等，对植株的生物量和某些次生代谢产物含量及品质有促进作用[6]。因此多倍体植物具有更大的生存潜能和更强的选择优势。研究表明，多倍化不仅能导致植物的基因组结构改变、碱基序列消除、转座子激活等，还能影响表观遗传调控模式[7-8]。表观遗传变异是指不改变DNA碱基序的一种可遗传的基因表达变化，包括DNA甲基化修饰、组蛋白的各种修饰等[9]，其中DNA甲基化修饰是研究多倍体表观遗传变异的最佳途径之一[10]。DNA甲基化能在分子水平上对基因的表达进行调控，保护基因组结构的完整性，并控制冗余基因的表达，保持多倍体植物基因组的稳定性 [11-12]。多倍化能够诱导DNA甲基化的改变，而DNA甲基化又在基因组调控和基因表达上起到一个枢纽的作用，因而用甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）研究不同倍性植株基因组DNA甲基化的表达水平及模式变化，在一定程度上对解释多倍体植株出现的新的表型具有重要的意义。

目前多倍体方面的研究主要集中于异源多倍体的物种[13-16]，而对同源多倍体化后所产生的一系列变化方面的相关文章较少，这是因为异源多倍体化后较同源多倍体化后引起的变化更为明显[17-18]。但是，异源多倍体带来的杂交效应将混淆于倍性引起的后果[19]，因此，仅依赖于倍性调控变化方面的研究应通过同源多倍体来体现，揭示仅由基因组加倍而不涉及杂交等其他因素所造成的基因组冲击以及随后多个基因组趋于稳定的内在机制也需通过同源多倍体的研究来阐明。

桔梗为常用大宗药材，具有开宣肺气，祛痰排脓的功效[20]，在我国南北各地大面积栽培。但长期以来只种不选，导致品种退化，药材产量和品质下降[21]。本研究在采用生物技术离体诱导并鉴定获得桔梗同源四倍体的基础上，采用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术对二倍体和四倍体基因组DNA的甲基化变化情况进行分析，一方面为桔梗的品种选育提供材料，另一方面从表观遗传学的角度探讨桔梗四倍体表型变化的分子机制，为多倍体育种提供一定的理论依据。

1材料

挑选籽粒饱满的桔梗种子，经流水冲洗40 min后置于超净工作台，用75%乙醇消毒30 s后转入0.1%升汞（HgCl2）中灭菌6 min，无菌水清洗3～5次，接入MS培养基，25～30 d后获得桔梗无菌系。

2方法

2.1桔梗无菌快繁体系的建立和优化

以桔梗幼芽为材料，接种到增殖和生根培养基上，增殖培养基以MS为基本培养基，分别添加不同浓度6-BA（6-苄氨基嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）和2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）；生根培养基以1/2MS为基本培养基，并添加不同浓度NAA（α-萘乙酸）和IBA（吲哚丁酸）进行生根培养，试验设计见表1，2。每个处理15个幼芽，5瓶重复，培养30 d后分别统计增殖系数和生根率。

2.2桔梗同源四倍体的离体诱导及鉴定

2.2.1桔梗同源四倍体的离体诱导具体方法参照王红娟等[22]，并作适当调整。质量分数为0.05%，0.1%，0.2%的秋水仙素（加0.02 g・mL-1二甲亚砜）混合液经20 mL的注射器和0.22 μm的水系滤头抽滤灭菌后将桔梗不定芽浸泡在其中，置于震动摇床内处理12，24，36，48，60 h，然后用无菌水冲洗3次后接种到MS培养基中进行培养。以清水浸泡作为对照，共15个处理，每个处理15个幼芽，做5次重复。

2.2.2桔梗同源四倍体的鉴定采用形态鉴别、流式细胞仪分析和根尖染色体鉴定相结合的方法来确定倍性株系。先将形态变异明显的植株进行流式细胞仪分析，具体方法参照张俊娥等[23]，称取0.5 g组培苗叶片，用滤纸吸干水分后置于干净培养皿中，加入2 mL预冷的组织解离液（80 mmol・L-1KCl，20 mmol・L-1NaCl，15 mmol・L-1Tris-HCl，20 mmol・L-1Na2EDTA，0.1% TritonX-100，2.0% PVP-K30，pH 7.5），用刀片一次性快速切碎叶片，过滤后于4 ℃环境下2 000 r・min-1离心5 min，漂洗2～3次，加入2 mL DAPI染液室温下反应1 h后即可上样测定。流式细胞仪鉴定的株系进一步采用根尖压片法确定植株染色体数目。具体方法参照张振超等[24]，早上9：00～11：00点取幼苗根尖（0.5～1 cm），在0.002 mol・L-1的八羟基喹啉预处理2～3 h，于4 ℃冰箱中卡诺固定液（乙醇-冰醋酸 3∶1）处理24 h，在60 ℃的1 mol・L-1 HCL中解离8 min，卡宝品红染色10 min，然后制片、镜检。

2.3总DNA提取

称取0.5 g二倍体和四倍体桔梗试管苗幼叶，采用改良的CTAB法进行DNA提取，具体方法参照陈昆松等[25]，提取的DNA经紫外-可见分光光度计测定浓度和纯度后用并1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，总DNA 置于-20 ℃冰箱待用。

2.4MSAP分析及聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.4.1酶切、链接反应MSAP试验步骤参照Portis等[26]方法，用双切酶组合EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoR Ⅰ/ MspⅠ对基因组DNA进行酶切，在酶切片段的两端加上人工设计的与EcoRⅠ和Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ酶切位点互补的人工接头，然后用AFLP扩增体系进行扩增，接头和引物序列见表3。引物由北京博友顺生物科技有限公司合成。

2.4.2预扩增、选择性扩增和电脉预扩增反应体系为20 μL，其中含有10 mmol・L-1 dNTPs 0.4 μL，10×Buffer 2 μL，5 U・μL-1Taq酶0.2 μL，10 μmol・L-1 E00-primer 0.5 μL，10 μmol・L-1 M00-primer 0.5 μL，其余用水补齐。反应条件为：94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，26个循环，72 ℃延伸10 min。预扩增产物稀释20倍，供选择扩增用。

选择扩增体系同预扩增体系，条件为：94 ℃ 30 s，65 ℃至56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，13个循环，每个循环降0.7 ℃进行降式PCR 扩增；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，23个循环，72 ℃延伸10 min。

选择性扩增完成后在扩增PCR产物中加入上样缓冲液，94 ℃变性10 min 后然后立即转移到冰上冷却防止复性，取5 μL变性产物于6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，银染后观察。

2.5条带统计与数据处理

由于甲基敏感扩增多态性技术中分别用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ双切酶对基因组DNA进行酶切。因此每个样品同时拥有2条泳道：第1条泳带采用EcoRⅠ/HpaⅡ进行酶切，记为H，第2条泳带采用EcoRⅠ/ MspⅠ进行酶切，记为M。同一位点有条带的记为“1”，无带的记为“0”。

3结果与分析

3.1增殖及生根培养基优化

将长1.5～2 cm的桔梗不定芽接到7种增殖培养基中，经30 d培养后均出现不定芽增殖的现象，具体结果见表4，在4号培养基中，分化的芽数最多，增殖系数平均达9.3±0.24，且出芽整齐，生长健壮，叶色浓绿。因此，桔梗无菌苗增殖的最适培养基为MS+6-BA 1.5 mg・L-1+ NAA 0.3 mg・L-1。

生根培养基优化结果见表5，不同浓度的NAA和IBA对桔梗试管苗生根率、根生长状况均有影响，随着NAA和IBA浓度的增大，生根率逐渐降低，且出根不整齐，根细短。当培养基蔗糖含量为28 g・L-1，NAA质量浓度为0.6 mg・L-1时，平均生根率高达82.6±3.8，且根粗壮，整齐。由此可见，桔梗的最佳生根培养基为1/2MS+NAA 0.6 mg・L-1。

3.2桔梗同源四倍体的诱导结果

将桔梗不定芽用抽滤灭菌的秋水仙素（加0.02 g・mL-1二甲亚砜）混合液浸泡处理后，成功得到了桔梗同源四倍体植株。诱导结果见表6，不同的质量浓度和处理时间对不定芽的诱导效果不同，低浓度和短时间处理下诱导率低，但成活率高，随着质量浓度和处理时间的增加，诱导率逐渐提高，但不定芽成活率降低。根据四倍体植株的诱导率和成活率，筛选出最佳处理浓度和时间，即用0.1%的秋水仙素溶液处理48 h或0.2%的秋水仙素溶液处理12 h为桔梗同源四倍体诱导的最佳条件。

3.3桔梗同源四倍体的鉴定

一般而言，四倍体植株具有巨型化特征，将形态变异明显的植株先经流式细胞仪分析后，再用根尖压片法鉴定，见图1。结果表明，桔梗二倍体植株根尖染色体数为2n=2x=18，DNA相对含量在100处有1个单峰；同源四倍体植株染色体数为2n=4x=36，DNA相对含量在200处有1个单峰，见图2。

3.4桔梗二倍体和同源四倍体基因组DNA甲基化水平差异

MSAP技术中同裂酶HpaⅡ和MspⅠ都能识别并切割CCGG序列，但二者识别甲基化的位点不同，HpaⅡ能切割无甲基化和单链甲基化位点而不能切割双链甲基化位点；MspⅠ能切割无甲基化和内甲基化位点而不能切割外甲基化位点，因此经HpaⅡ和MspⅠ切割后在聚丙烯酰胺凝胶电泳分析胶上能检测出4种条带类型，即：Ⅰ型，H，M都有带，说明CCGG位点无甲基化；Ⅱ型，H有带，M无带，说明CCGG位点发生单链外甲基化，即半甲基化；Ⅲ，H无带，M有带，说明CCGG位点发生双链内甲基化，即全甲基化；Ⅳ，H，M都无带，说明CCGG位点有双链内外侧甲基化、双链外甲基化或无CCGG序列[16]。桔梗二倍体和同源四倍体DNA经MSAP扩增的条带数及甲基化水平见表7，用20对引物组合共扩增后共有1 586条条带，其中二倍体764条，四倍体822条。二倍体总甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分别为92.15%，61.52%，30.65%，而四倍体的为86.13%，54.38%，31.75%，与桔梗二倍体相比，其同源四倍体总甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，而半甲基化率升高1.6%，这说明染色体加倍后其DNA甲基化水平发生了变化。

3.5桔梗二倍体和同源四倍体基因组DNA甲基化类型

二倍体和同源四倍体桔梗基因组DNA甲基化类型见表8，二倍体和四倍体共有15种条带，见图3。其中A型为单态性位点，包括3个亚类，表示二倍体与四倍体甲基化状态相同；B型为去甲基化位点，包括5个亚类，说明在该位点二倍体存在甲基化，而四倍体发生了去甲基化；C型为过或超甲基化类型，也有5个亚类，即与二倍体相比，四倍体甲基化升高；D型为次甲基类型，有2个亚类，表示相比于二倍体来说，四倍体甲基化降低，但仍有甲基化现象[17]。与二倍体相比，桔梗试管苗染色体加倍后，其基因组DNA有23.54%发生了去甲基化现象，29.07%发生了过或超甲基化现象，2.97%发生了次甲基化现象，只有44.42%的基因组DNA未发生任何改变。

4讨论与结论

4.1桔梗同源四倍体的离体诱导及鉴定

本研究中采0.2%抽滤灭菌的秋水仙素溶液浸P11～P20.其中的10对引物，每对引物下有4条泳道，从左往右依次为2H，2M，4H，4M；2H和4H分别表示二倍体和四倍体桔梗EcoR Ⅰ/Hpa Ⅱ酶切的扩增结果；2M和4M表示二倍体和四倍体桔梗EcoR Ⅰ/Msp Ⅱ酶切的扩增结果。

泡桔梗顶芽12 h，获得了诱导率为32.0%的四倍体植株。高山林等[27]采用培养基中添加40 mg・L-1秋水仙素的方法诱导桔梗四倍体，诱导率达到37.5%；王小华等[28]采用0.1%秋水仙素处理桔梗嫩茎40 h，诱导率达到50%。前人诱导率较高的原因可能是在鉴定过程中仅用形态学和细胞学的方法鉴定倍性，并没有排除嵌合体的干扰，从而将嵌合率也计算到诱导率中，出现诱导率较高的现象，本研究采用了形态鉴别、流式细胞仪分析和根尖染色体鉴定相结合的方法进行倍性鉴定，排除了嵌合体的干扰，提高了结果的可靠性，为进一步研究桔梗同源四倍体的遗传稳定性和农艺性状评价提供可靠的材料。

4.2桔梗二倍体与四倍体基因组DNA甲基化水平差异及模式变化

多倍体植物具有器官巨大、活性成分含量高、抗逆性强等优点，这可能是多倍化后植物体内基因组结构和表观遗传修饰发生了广泛变化[3]，进而导致植物出现新的性状。但在对拟南芥[5]、水稻[29]、白菜[18]的同源多倍体及二倍体的比较研究中发现这些植物同源多倍化后基因组结构并没有发生明显改变，且多倍化后多倍体的基因表达谱也与二倍体十分相似。表明同源多倍化后基因组并没有同异源多倍化一样发生大规模的基因组结构调整事件。本研究中，从图1可以明显看出桔梗同源四倍体比二倍体植株粗大，叶片增厚增大，叶柄叶脉粗大等现象，同源多倍体桔梗新出现的区别于亲本的性状则可能与表观遗传调控密切相关。

甲基化是一种常见的表观遗传修饰形式，在基因表达中起着重要的调节作用，同源多倍化过程中，DNA甲基化会参与多倍体的适应性调整，并发生特异性的变化以调控基因表达和转座子的活性等，所以不同倍性材料中DNA甲基化水平会发生一定程度的改变[29]。杨岚等[30]采用MSAP技术对甜叶菊同源四倍体与二倍体的表观遗传进行研究后发现四倍体基因组DNA的总甲基化率和全甲基化率略有所降低，甲基化模式主要以过和超甲基化为主；长春花[31]多倍化后基因组CCGG位点的 DNA的总甲基化率、全甲基化率和半甲基化率较二倍体植株均有所提高，甲基化类型以C型即过或超甲基化类型最多。本研究中，桔梗同源四倍化后基因组DNA的总甲基化率和全甲基化率有所降低，其中总甲基化率降低6.02%，全甲基化率降低7.14%，且甲基化模式主要以过或超甲基化类型（C型）为主，占29.07%，其次是去甲基化（B型），占23.54%，最少的是次甲基化（D型），占2.97%。由此可推测同源四倍体出现新的表型与DNA甲基化模式的重新调整尤其是大量过或超甲基化变异有关，过或超甲基化就可能导致相应位点所在基因表达的关闭或抑制，进而维持四倍体植株这自身基因组的稳定性。有关染色体加倍后DNA甲基化模式调整的程度对多倍体性状和表型改变的机制还有待进一步的研究。

[参考文献]

[1]宋灿，刘少军，肖军，等.多倍体生物研究进展[J].中国科学：生命科学，2012，42（3）：173.

[2]Soltis D E，Soltis P S，Tate J A.Advances in the study of polyploidy since plant speciation[J].New Phytologist，2004，161（1）：173.

[3]Otto S P.The evolutionary consequences of polyploidy[J].Cell，2007，131（3）：452.

[4]Chen Z J，Ni Z.Mechanisms of genomic rearrangements and gene expression changes in plant polyploids[J].Bioessays，2006，28（3）：240.

[5]Wang J，Tian L，Lee H S，et al.Genomewide nonadditive gene regulation in Arabidopsis allotetraploids[J].Genetics，2006，172（1）：507.

[6]韦荣昌，吴庆华，马小军，等.植物多倍体的研究进展[J].种子，2013（32）：50.

[7]Lim K Y，Kovarik A，Matyasek R，et al.Sequence of events leading to near-complete genome turnover in allopolyploid nicotiana within five million years[J].New Phytologist，2007，175（4）：756.

[8]Wendel J F.Genome evolution in polyploids[J].Plant Mol Biol，2000，42（1）：225.

[9]何灵江，邵伟.表观遗传学研究进展[J].生物学教学，2008（33）：5.

[10]Lee H S，Chen Z J.Protein-coding genes are epigenetically regulated in Arabidopsis polyploids[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（12）：6753.

[11]Salmon A，Ainouche M L，Wendel J F.Genetic and epigenetic consequences of recent hybridization and polyploidy in Spartina （Poaceae）[J].Mol Ecol，2005，14（4）：1163.

[12]Ortrun M S，Karin A，Jerzy P.Formation of stable epialleles and their paramutation-like interaction in tetraploid Arabidopsis thaliana[J].Nat Genet，2003，35（4）：450.

[13]王家利，王芳，郭小丽，等.同源多倍体化效应研究进展[J].中国农学通报，2013，29（12）：22.

[14]Gaeta R，Pires J，Iniguez-Luy F E，et al.Genomic changes in resynthesized Brassica napus and their effect on gene expression and phenotype[J].Plant Cell，2007，19（11）：3403.

[15]Lukens L N，Pires J C，Leon E，et al.Patterns of sequence loss and cytosine methylation within a population of newly resynthesized Brassica napus allopolyploids [J].Plant Physiol，2006，140（1）：336.

[16]Pires J C，Zhao J，Schranz M E，et al.Flowering time divergence and genomic rearrangements in resynthesized Brassica polyploids （Brassicaceae）[J].Biol J Linn Soc，2004，82（4）：675.

[17]Pignatta D，Dilkes B P，Yoo S，et al.Differential sensitivity of the Arabidopsis thaliana transcriptome and enhancers to the effects of genome doubling[J].New Phytol，2010，186（1）：194.

[18]Albertin W，Brabant P，Catrice O，et al.Autopolyploidy in cabbage （Brassica oleracea L.） does not alter significantly the proteomes of green tissues[J].Proteomics，2005，5（8）：2131.

[19]Comai L.The advantages and disadvantages of being polyploid[J].Nat Rev Genet，2005，6（11）：836.

[20]中国药典.一部[S].2010：95.

[21]魏尚洲.桔梗资源的综合开发利用[J].陕西科技大学学报：自然科学版，2005，23（5）：141.

[22]王红娟，杨岚，李雅婷，等.茅苍术同源四倍体离体诱导与鉴定[J].核农学报，2015，29（6）：1030.

[23]张俊娥，邓秀新.采用流式细胞仪分析柑橘愈伤组织的细胞周期[J].果树学报，2006，22（6）：741.

[24]张振超，张蜀宁，张伟，等.四倍体不结球白菜的诱导及染色体倍性鉴定[J].西北植物学报，2007，27（1）：28.

[25]陈昆松，李方，徐昌杰，等.改良CTAB法用于多年生植物组织基因组DNA的大量提取[J].遗传，2004，26（4）：529.

[26]Portis E，Acquadro A，Comino C，et al.Analysis of DNA methylation during germination of pepper （Capsicum annuum L.） seeds using methylation-sensitive amplification polymorphism （MSAP） [J].Plant Sci，2004，166（1）：169.

[27]高山林，舒娈.桔梗同源四倍体的诱导与鉴定[J].中药材，2002（25）：461.

[28]王小华，熊丽，屈云慧，等.中国桔梗多倍体诱导与鉴定[J].植物分类与资源学报，2006，28（6）：593.

[29]曾秀凤.双胚苗水稻同源多倍体基因表达和DNA甲基化的研究[D].雅安：四川农业大学，2012.