生物质谱技术与方法范文

导语：如何才能写好一篇生物质谱技术与方法，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

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1质谱分析的特点

质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。

2质谱分析的方法

近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：

①电喷雾电离质谱；

②基质辅助激光解吸电离质谱；

③快原子轰击质谱；

④离子喷雾电离质谱；

⑤大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛。

3蛋白质的质谱分析

蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。

3.1蛋白质的质谱分析原理以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。

3.2蛋白质和肽的序列分析现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrosprayionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrixassistedlaserdesorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDITOFMS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一。目前在欧洲分子生物实验室(EMBL)及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDITOFMS蛋白质一级结构(序列)谱库，能为解析FAST谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据。

3.3蛋白质的质谱分析方式质谱用于肽和蛋白质的序列测定主要可以分为三种方法：一种方法叫蛋白图谱(proteinmapping)，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获取待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂.第三种方法与Edman法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序(laddersequencing)，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。

3.3.1蛋白消化蛋白的基团越大，质谱检测的准确率越低。因此，在质谱检测之前，须将蛋白消化成小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6-20个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的赖氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)处将其切断。因此，同一蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。

3.3.2基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法(MALDI-TOFMS)简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/电荷之比(mass/charge，m/z)来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。

3.3.3电子喷雾电离质谱测量法(electrosprayion-izationmassspectrometry，ESI-MS)。

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1.离子化接口

液质联用经历了约30年的发展，直至采用了大气压电离（（API）技术之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。液质中最常用有大气压电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源（APCI），两者同属于大气压电离（API）技术，其离子化过程发生在大气压下，这与气质中采用在真空下电离的技术有本质不同。其中ESI技术应用更为广泛。

2.质量分析器

用于液质联用仪中最常用的有四极杆质谱仪，离子阱质谱仪、飞行时间质谱仪、四极离子阱质谱仪和四极飞行时间质谱仪等等。迄今为止，四极质谱仪与其它质谱仪相比，仍然是应用最为广泛的。其包括单四极质谱仪和三重四极质谱仪。

单四极质谱仪的主要优点是相对可靠、优良的性价比，适合于定性定量分析。其缺点是质谱谱图分辨率较低。只有在测定成分是纯物质且没有化学背景杂质与之重叠时，才可能测定准确质量。用单四极质谱仪作定量分析采用选择离子监测（SIM），检测限取决于能否将目标化合物与样品中的其它成分（包括背景干扰）加以区别。

单四极质谱仪无法实现MS/MS功能，若需要该功能，以进行化合物结构分析或者选择反应检测（SRM）以提高选择性及定量分析检测限，则要采用三重四极质谱仪（QQQMS或TQMS）。目前，用液质联用仪进行复杂成分的定量分析时，三重四极质谱仍是首选仪器，它具有多种MS/MS功能，除产物离子扫描外，还有前体离子扫描和恒定中性丢失扫描。

二、液质联用仪的应用概况

1.药学领域

将液质联用技术应用于药物及其代谢产物研究是该技术在医药领域中应用最广泛、研究论文报道最多的领域。液相质谱与串联质谱联用显示了独特的优势，代表了药物代谢研究的发展趋势。

从质量分析器的角度看，尽管QQQMS在药物生物转化与代谢产物鉴定上取得显著的贡献，但他的局限性在于四极杆质量分析器没有足够的质量准确度，不能给出母离子和子离子的元素组成，因此，用于结构鉴定有时不够明确。与QQQ相比，离子阱（TRAP）在MS和MS/MS的全扫描功能上更强，而且它的多级质谱测定（MSn）灵敏度较好，并能解释分子裂解过程。现在常常应用此功能进行代谢物鉴定。但是TRAP具有低质量截止点（1/3效应）、碰撞效率低和定量分析性能较差等缺憾，而Q-TRAP不但可以克服这些缺点，而且可以选择母离子扫描和中性丢失扫描等。Q-TRAP用于代谢产物是相对较新的方法，其组成相当于QQQ中的第3个Q用线性离子阱代替，可以得到更丰富的数据。Q-TOF可以精确测定母体药物或代谢产物分子以及由CID产生的碎片离子的准确质量，从而获得其元素的组成，但只有当母离子不受元素组成相同的离子的干扰时，才可能用子离子的准确质量测定去做结构解析。QQQ以及Q-TOF还有一个局限性是产生的CID图谱不能将一级子离子与二级或三级分解子离子区分开来，使图谱解析变得困难。而Q-TRAP可以在质谱分析的每一阶段将母离子隔离并捕获，从而可以确定离子的亲缘关系，使代谢物的CID图谱的解释变得较为容易。

2.食品领域

食品中的化学污染物包括：农药残留、兽药残留、添加剂、加工过程中的污染物、有毒或不洁的包装材料、环境污染物、生物毒素、真菌毒素以及重金属等。对这些污染物的监测能力则是控制食品安全的关键所在。此类分析对样品的制备方法要求较高，并对分析仪器的检测能力要求更为苛刻。

目前，国外LC/MS在农残上的应用以分析苯脲、三嗪、氨基甲酸酯、氯苯氧酸及硝基酚为主。分析仪器主要使用QQQ和Q-IT。定量分析使用SIM。不同的农药分析需要选取不同的检测模式。一般说来，中性及碱性农药，如三嗪、氨基甲酸酯、有机磷、季胺盐农药、苯脲使用正离子（PI）检测，而酸性农药，如苯氧酸、磺酰脲使用负离子（NI）检测。有时两种模式同时使用。

3.代谢组学

代谢组学以生物体液为研究对象，包括尿液、胆汁、血浆、组织提取液、脑脊液、、唾液、膀胱液等，力求分析生物体系中的所有代谢产物，整个分析过程应能尽可能地保留和反映总体代谢产物的信息。

代谢组学要求分析生物体系中所有的代谢产物，单一的分析技术难以满足这一要求。气质联用技术（GC/MS）具有高灵敏度、高重复性、可检库鉴定已知物等特点，其局限性是样品必须气化，且不能分析大分子、难挥发性物质和热不稳定性物质；核磁共振（NMR）对样品无损伤且重复性好，广泛应用于药物工业和病人的尿、血样分析，但其灵敏度不高，不能鉴定混合物；而液质联用技术（LC/MS）是具有高效、快速分离效能的LC与灵敏、准确的MS或MSn的结合，被广泛应用于难挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子化合物（包括蛋白质、多肽、多糖、多聚物等）的分析，既可定性，也可定量，是最具前途的代谢组学的研究技术之一。

4.蛋白质组学

80年代后期在有机质谱的发展中出现了历史性的巧合，同期出现了基体辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI/TOF/MS）和电喷雾电离质谱 （ESI/MS），打开了有机质谱分析研究生物大分子的新领域，并很快发展成为能在所有层次上分析研究蛋白质和其它生物分子的生物质谱学。MALDI/TOF/MS 的肽质量指纹谱方法（PMF）具有高通量高灵敏度和操作简便等优点，已得到了广泛的应用，但它不适合分析蛋白质的混合物。与之相比HPLC/ESI/MS/ MS虽然只有较低的高通量分析，但能取得更好的分析结果，而且适合分析蛋白质混合物和蛋白质复合物。

5.同时液质联用技术还广泛应用于兴奋剂检测、物证鉴定、印染行业有害物质检测、环境污染物分析、临床诊断研究等领域。

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EDC和POPs对生态环境和人体健康造成的不良影响，危害人类的生殖能力，诱发肿瘤、影响人类神经系统，成为继温室效应、臭氧层破坏之后的第三大环境问题，引起全球广泛关注，其分析检测技术和方法的相关研究也得到广泛关注。

EDC和POPs多有交叉，多数环境激素属于持久性有机污染物，而持久性有机物几乎都直接或间接地具有环境激素作用。我国从2004年开始开展水环境中持久性有机物和环境激素的检测，目前已有多个研究机构发展了EDC和Pops的分析能力，并应用于水环境污染与评价研究；国外对该类有机污染物的检测更是超过30年，如对水环境中多氯联苯（PCBs），多氯代烷烃（PCAS），多溴联苯醚（PBDEs）等的转化和迁徙均进行了大量的研究工作[3]。

当前水环境中持久性有机物和环境激素的检测技术仍随着检测新技术的发展而不断改进与提高。本文一方面介绍水环境中环境激素和持久性有机物的检测技术发展现状，另一方面对检测技术中运用的重要技术特点，包括高分辩气相色谱/质谱联用或多重质谱（HSGC/MS/MS）、柱后衍生、大体积富集浓缩等技术的要点进行分析，以利广大环境研究工作者参考和借鉴。

1仪器分析技术

1.1色谱与质谱分析

在水环境中，EDC和POPs具有分布广泛、残留浓度低的特点，因此，对水环境中的POPs进行分析时，要求分析手段必须具有灵敏、准确、快速和自动化程度高等特点。气相色谱法（GC）、气相色谱/质谱法（GC/MS）等是常用的分析方法。

采用气相色谱进行分离分析时，配合电子捕获检测器（ECD）可以提高灵敏度。采用大容量注射（如编程的温度汽化器，或柱上进样）注入几十微升的样本提取，可以提高检测限[4]。采用GC/MS，须针对环境激素的质谱裂解特征，确定各个化合物的灵敏度高、抗干扰能力强的准分子离子和子离子，优化质谱检测模式，各个化合物的检测条件，使每个组分均可获得高的专一性和高灵敏度，使同时快速检测痕量多组分成为可能。同时，用程序升温方法，优化气相色谱方法，尽可能的提高分离度，为质谱分析提供基础。薛南东等采用GC-ECD检测、GC-MSD定性证实的农药类内分泌干扰物检测方法,实现31种目标物同时检测[5]。常爱敏等采用GC-ECD定量检测,GC-MS定性验证,建立了同时分析水中31种农药类环境激素的检测方法[6]。

采用GC/MS进行EDC的检测，对样品进行衍生化处理，可提高质谱检测灵敏度。普遍采用的方法为三甲基硅烷（TMS）衍生化，如加入100μL吡啶，200μL含有1%三甲基氯硅烷（TMCS）的双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA），混匀，密封，在70℃下水浴1h。

1.2GC或LC与串联质谱联用

POPs干扰物质多、组成复杂，且毒杀芬、多氯联苯、二恶英等包含多种同系物或异构体，普通的低分辨质谱难于达到上述要求。高分辨质谱或多级质谱，借助其高灵敏度和高选择性、高特异性，能达到对POPs定性和定量的要求，因此，成为目前的发展趋势[7]。

采用气相色谱/质谱/质谱(GC/MS/MS)法测定多氯联苯(PCB),具有良好的灵敏度和选择性,在地表水样品检测时,样品只需进行简单的液液萃取一浓缩,无须任何净化过程即可上机分析,方法检出限低于ng/L级[8]。

液相色谱—串联质谱技术(LC-MS/MS),颜流水等建立了基于时间分段技术的高效液相色谱—串联质谱技术测定饮用水中9种环境激素残留的方法，利用多反应监测(MRM)和扫描时间分段检测技术实现正、负离子不同扫描模式一次完成双酚A和邻苯二甲酸二丁酯的检测，研究并建立了饮用水中环境激素的多组分快速检测方法[9]。

2预处理技术

在应用气相色谱法(简称GC)或高效液相色谱法(简称HPLC)进行有机物分析，尤其是环境中EDC、POPs、PCB、Dionex等超痕量、多组分物质的分析时，由于特异性、选择性和灵敏度的要求极高，各种样品的预处理技术被予以重视并得到充分应用[10]。

2.1大体积富集浓缩技术

无论是EDCs还是POPs的水环境样品检测，都需要对大体积样品进行富集、提取、浓缩，降低被测定物质的检测限，提高检测灵敏度，实现痕量检测。在EDC和POPs的检测中，一般情况下，每个样品都采集10L至20L水样，经过萃取浓缩，最后达到1mL甚至0.1mL的进样体积，以满足超痕量分析的需要。

在POPs水样预处理中，采用丙酮和正己烷等有机溶剂，对12L水样进行液-液萃取分离。对这样大容量样品进行萃取，可以巧妙地利用磁力搅拌，充分混合水相和有机相，使水相中POPs最大限度地转移至有机相中。

2.2固相萃取技术

固相萃取技术(SolidPhaseExtraction，SPE)是一种吸附剂萃取技术，样品通过填充吸附剂萃取柱，分析物和部分杂质被保留在柱上，然后用选择性溶剂除去杂质，洗脱出分析物，从而达到分离和富集目的。EDCs分析中，普遍采用SPE技术进行EDC样品的前处理。比如处理水样体积为10L水样。采用oasisHLB5cc萃取柱（玻璃壁）进行固相萃取，采用二氯甲烷和丙酮混合溶剂（70％二氯甲烷/30％丙酮）进行洗脱。

不同固相萃取吸附剂适用于不同环境激素的富集、净化，这方面的优化研究对象包括硅藻土吸附剂、氧化铝吸附剂、活性炭吸附剂、键合硅胶基吸附剂、有机聚合物吸附剂。经过优化筛选出回收率高，净化能力强的高效固相萃取剂，为痕量多组分同时检测提供样品处理方法。

2.3滤膜技术的广泛应用

滤膜技术广泛应用于EDCs分析中，对大体积样品进行SPE之前，往往采用Millipore玻璃纤维滤膜（孔径1μm）对水样进行初步过滤，以去除杂质、固液分离、膜萃取有机物。在EDCs和POPs的分析技术，广泛应用各种滤膜。在POPs分析中，采用高通量滤膜将水样中的固体和液体部分过滤分离，分别处理后进行检测分析。

2.4微波萃取技术

在利用液-液萃取分离富集固形物质中的POPs时，滤膜中固体物质可采用微波萃取进行分离。微波萃取时，为提高萃取效率，可将每张滤膜撕成条状，放入50mL具有螺旋盖的圆底离心管，每瓶加入溶剂，采用微波进行多次提取，保证了提取效率。最后一次离心后挤压滤纸，收集残留的萃取液，保证提取完全。

2.5大容量和分步浓缩技术

无论是EDC检测中SPE处理后的洗脱液，还是POPs检测中反复液-液萃取处理之后的丙酮层，均可使用浓缩仪进行浓缩。POPs分析中还采用了分步浓缩技术，先将萃取液浓缩至5mL，进行净化处理，之后再浓缩至0.1mL进行GC/MS分析。高效浓缩技术能保证富集效率，满足GC/MS的检测要求，有效降低方法的检测限。

2.6净化柱技术

在EDC分析中，采用硅净化柱（5％aqueousSilicagelcolumn）过滤，或者在固相萃取小柱之后连接净化柱，在SPE的洗脱步骤之后，连续实现样品的脱水和净化。对POPs分析中浓缩至5mL的初步浓缩液，也同样使用净化柱，实现样品的脱水和净化。与采用无机物净化相比，净化柱能大大提高样品的净化程度，减少进入GC/MS的样品中的杂质，有利于后续GC/MS的高效分析工作。

3快速检测方法的应用

EDC分析中，除了使用高分辨分析仪器，还可利用生物对POPs的某些特征反应进行检测，以实现对环境中POPs的检测，主要包括:生物传感器检测法、表面胞质团共振(SPR)检测法和以Ah受体为基础的生物测试方法等。

例如采用特异性核受体检测技术——NuclearLigandAssay的CoA-BaP系统（共激活剂－细菌碱性磷酸酶）进行EDC的生物分析。这是一种快速的生物配体筛选方法，易于使用，敏感度高，适用于大多数核受体。特异性核受体检测技术使用器材为ERα雌激素试剂盒（MicrosystemCompany），应用96孔板，具有高效、高通量筛选的特征[11]。

4结束语

在EDC和POPs检测中，严密的工作方案是十分重要的，比如，对一个样品进行反复萃取，能提高POPs和其他目标物质的萃取效率。

实验过程中必须严格避免交叉污染，避免有毒物质对实验室环境的沾污。实验室操作中，非常注意器具和材料不能直接接触桌面。分离的滤膜如果不能立即分析，用无尘纸包覆，并置于锡箔内，严格避光保存于4℃以下。

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关键词：肽类毒素　脂多糖内毒素　霉菌毒素　检测方法

项目类别：农业科技 项目编号：XF11C004 项目名称：徐州市乳品质量安全检测技术

生物毒素主要指微生物在生长代谢过程中产生的有毒化学物质，微量毒素侵入机体后即可引起生物机能破坏，使人畜中毒。包括肽类毒素、脂多糖内毒素、霉菌毒素等。

肽类毒素主要有溶血素、肠毒素等，其中产生溶血素的细菌主要有单核细胞增生李斯特菌、霍乱弧菌等。溶血素的致病机理是作用于细胞膜，造成其结构和功能的紊乱，使大量细胞内的成分泄漏，导致细胞死亡。产生肠毒素的细菌主要有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌等。肠毒素是细菌外毒素，通过吸收或在肠内产生，作用于肠黏膜，通常引起腹泻等不适症状。

脂多糖内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的主要组成成分。研究表明，过量的脂多糖内毒素可引起机体严重的病理生理反应，表现为发热、低血压、休克、器官功能衰竭甚至死亡等。

霉菌毒素是霉菌产生的一种有毒的次级代谢产物，它是主要的真菌毒素，多数具有致癌作用。霉菌毒素主要有：黄曲霉素、赭曲霉素、单端孢霉烯族毒素等。目前为止，黄曲霉毒素有　B　1、B　2、M　1、M　2、G　1、G2　等几种，其中黄曲霉素B1的毒性和致癌性最强，被称为第一大类致癌物。赭曲霉素有　A、B、C、D　共4　种，其中毒性最大的是赭曲霉素A。单端孢霉烯族毒素中比较常见的是A　类单端孢霉烯族毒素，它主要包括T-2　毒素和HT-2　毒素。

目前，生物毒素的检测技术已得到越来越多的重视，国内外学者对这些毒素也研究颇多。传统的检测技术以检测致病菌为主，需要培养，检测时间长。现代检测技术简便、快速、灵敏度高，且能达到微量检测的目的。本文对这些生物毒素的检测技术进行较为详细的阐述并对这些方法的特点进行总结。

1、肽类毒素的检测

肽类毒素传统的检测方法主要有：酶联免疫检测技术、聚合酶链反应技术和生物传感技术等。近年来产生了一些新兴检测技术，如：悬浮芯片技术等。

1.1　酶联免疫检测技术

酶联免疫检测技术是利用酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，当偶联物与固相载体上的抗原或抗体反应和酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。所生成的颜色深浅与待测标本含量成比例，由此进行定性或定量分析。酶联免疫检测技术是一种敏感、快速、简单的方法，应用较广，但是利用酶联免疫检测技术检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素时，会因为假阳性或假阴性影响检测结果。

1.2　聚合酶链反应技术

聚合酶链反应技术是一种在体外模拟DNA　复制过程，对特定的DNA或DN段进行快速扩增的方法。聚合酶链反应技术具有灵敏度高、检测时间短等优点。目前常用的聚合酶链反应种类有定性聚合酶链反应和荧光定量聚合酶链反应。荧光定量聚合酶链反应是把荧光基团加入普通聚合酶链反应技术反应体系中，利用荧光信号积累检测整个聚合酶链反应反应的进程，通过标准曲线对未知物进行定量。荧光定量聚合酶链反应比常规聚合酶链反应技术自动化程度更高、特异性更强，其应用也更广泛。根据报道已有包括葡萄球菌各型肠毒素，大肠杆菌毒素等30多种毒素可以应用聚合酶链反应来检验。

1.3　生物传感技术

生物传感技术是以酶的催化或者抗原抗体结合等特异反应，通过换能器将反应结果输出为可检测的信号通过信号分析定性或定量待测物质。生物传感器检测法具有分析速度快、检样微量、生物功能膜可反复多次使用等特点，可用于许多物质的检测。

1.4　悬浮芯片技术

悬浮芯片技术具有操作简便、重复性好、灵敏度高以及线性范围宽等优点。国外已经有利用悬浮芯片技术检测的报道。国内孙肖红等利用悬浮芯片系统建立检测模型，检测不同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素B，其线性范围为0.2～1653.4ng/mL，最低检测值为203pg/mL均优于酶联免疫检测技术（最低检测质量浓度为60ng/mL），除与2.μg/mL金黄色葡萄球菌热休克毒素有交叉反应外，和其他几种细菌、毒素、蛋白均无交叉反应。实验证明悬浮芯片定量检测方法对于模拟添加的金黄色葡萄球菌肠毒素B　具有良好的检测效果。这比国外报道的荧光免疫层析法、磁免疫层析法、芯片传感器等方法的灵敏度都要高，与生物传感器-　质谱联用技术、毛细管芯片技术等在同一数量级。综合国内外对悬浮芯片的研究来看，该技术应用前景十分广阔，但是悬浮芯片能否从粉末样品中直接检测毒素和病原，尚缺乏模型和评价。

2、脂多糖内毒素的检测

1968年，国外研究人员Levin等建立了利用鲎实验检测脂多糖内毒素的方法。近几十年来，脂多糖内毒素的检测方法已有很大进展，实验简便、经济、准确性高，但是由于费时、响应慢、自动化程度低等原因已限制了其应用。近十年来出现了利用生物传感技术和气相色谱-质谱联用仪检测细菌内毒素的报道。国外研究人员Goh等用增强型绿色荧光蛋白固定在传感器上制成了荧光内毒素生物传感器，根据脂多糖内毒素与之结合时荧光强度的衰减检测细菌内毒素的含量。此荧光生物传感器存在非分析物产生的荧光干扰问题，是近年来发展较快的一类光学生物传感器。国内岳丽娜等利用气相色谱-质谱联用仪联用技术，对脂多糖内毒素标准品所含的3-羟基脂肪酸种类进行检测，用于分析脂多糖内毒素标准品菌种来源的纯度。结果表明脂多糖内毒素工作标准品中含有非肠道细菌，因此会出现误差，对检测结果产生影响。气相色谱-质谱联用仪联用法检测脂多糖内毒素，不受其标准品及细菌的生物活性的限制，可用于细菌内毒素标准品菌株来源的辅助监控及应用中的异常情况的研究分析。

此外，检测脂多糖内毒素也有酶联免疫检测技术、流式细胞术、化学发光测定法等方法，这些方法特异性、准确性高，但需要专业人员操作，步骤多，必须在实验室完成，其应用需要大量实际操作验证。

3、霉菌毒素的检测

检测霉菌霉素的常规方法由经典的薄层色谱法发展到高效液相色谱法、酶联免疫检测技术、免疫亲和层析法等。现在，质谱分析已被引入毒素分析中并衍生出各种质谱方法，如高效液相色谱法-常压化学电离质谱测定法、液质连用法、电喷雾-质谱法、液相串联质谱法、超高压液相联合三重四极杆质谱仪法，及同时测定上百种样品的高效液相色谱法-串联质谱-电喷雾阳离子等技术。随着这些新方法、新手段的发展，为霉菌毒素的检测提供了比较广的选择，适应了不同的检测目的和要求。

3.1　薄层色谱法

薄层色谱法是测定食品中霉菌毒素的经典方法，该方法操作简便、费用低、能同时定性定量霉菌毒素。其检测过程是：提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层分离。由于此方法操作繁琐、灵敏度低，现在的研究重点是改进样品的提取和净化方法，因此建立了薄层扫描法来测定霉菌毒素，进而提高薄层色谱法的精度。国内张寰等报道了利用薄层扫描法，在扫描仪上绘制黄曲霉毒素扫描图谱，并由此分辨出黄曲霉素种类，然后定量分析，从而得到样品的黄曲霉毒素含量。鉴于此方法的灵敏度低、安全性差等缺点，已越来越不适用现代分析的要求。

3.2　高效液相色谱法

高效液相色谱法具有高效、快速、灵敏度高、重现性好、检测限低、定量准确的特点，是定性定量霉菌毒素的常用方法，其中应用最广的是反相高效液相色谱法。国外研究人员Sobolev等利用高效液相色谱法，以新研发的氧化物质Al2O3作为流动相，对农产品的甲醇　―　水提取液进行净化处理，样品中加标品2.5～7.5ng/g，结果表明：AFBl、AFB2、AFGl、AFG2　的回收率为　80%～87%，最低检测限为1.0ng/g，此方法与商业检测黄曲霉素方法相比，净化设备费用更低。国外研究人员Razzazi-Fazeli等利用高效液相色谱法-质谱联用仪检测单端孢霉烯族毒素，检测限为　5　0～8　5　n　g　/　g，回收率为77%～101%。鉴于高效液相色谱法的这些优点，其在霉菌毒素检测中的应用越来越多，但是由于样品前处理较复杂，设备昂贵，操作时需专门人员等问题，难以满足快速检测的目的，限制了其应用。

3.3　酶联免疫检测技术

酶联免疫检测技术法灵敏度高、特异性强、操作简便，适宜大量样品的快速筛选，且设备费用比高效液相色谱法低，因此广泛用于霉菌毒素的检测。利用此方法检测霉菌毒素可以达到定性定量的目的。此外，根据酶联免疫检测技术开发的毒素试剂盒实现了快速检测霉菌毒素的目的。国外Saha等利用基于酶联免疫检测的流动装置检测红辣椒中黄曲霉素B1与赭曲霉毒素A，检测限分别为2ng/g　和10ng/g，结果证明此方法准确性高，与单独酶联免疫检测相关性良好，并且为欧盟的法定标准提供了简单、快速、有效的检测方法。酶联免疫检测测定结果易出现假阳性问题，且只能测定单一毒素。目前的一项研究是将酶联免疫检测技术和胶体金技术与噬菌体展示技术相结合，此方法可以显著提高检测限，缩短检测时间，同时可以减少毒素测定中所使用的毒素标准品对实验人员及环境的危害，这种结合技术应用前景广阔[　31]。

3.4　免疫亲和柱法

免疫亲和柱是以单克隆免疫亲和柱为分离手段，根据单克隆抗体与载体蛋白偶联后将其填柱形成免疫亲和柱，并与霉菌毒素抗原产生一一对应的特异性吸附关系。免疫亲和柱法包括免疫亲和柱-荧光光度法和免疫亲和柱-高效液相色谱法。裴道国等采用改良型免疫亲和柱净化-　荧光光度检测技术检测花生及花生制品中的黄曲霉毒素。结果表明：改良后的方法具有更好的准确性和精密度，检测技术操作更简便，检测时间由传统的25min缩短至10min，大大提高了检测效率。免疫亲和柱-高效液相色谱法用于检测霉菌毒素在国内外的报道中也比较多。陈新等利用免疫亲和柱-高效液相色谱法分别定量地检测饲料中的黄曲霉毒素B1、B2、G1　和G2，在黄曲霉毒素B1为0～50μg/kg　测定范围内其线性相关系数为0.91，检测灵敏度为1μg/kg，可以作为测定饲料及饲料原料中的黄曲霉毒素B1的定量确认法。国外研究人员Aksenov等利用免疫亲和柱-荧光-高效液相色谱法检测了赭曲霉素，将检测限提高至0.5mg/kg，优化了其检测方法。免疫亲和柱法简便快速、灵敏度极高，一个样品只需10～15min，比传统方法快。特别是免疫亲和柱-高效液相色谱法可以特效性地将霉菌毒素或其他真菌毒素分离出来，分离效率和回收率高，比高效液相色谱法更有优势和应用前景。

4、结论

生物毒素的检测方法多种多样，但其灵敏度、精度、适用条件各不相同。近几年来，检测肽类毒素切实可用的检测方法主要是荧光定量聚合酶链反应技术和酶联免疫检测技术，生物传感器技术因其分析速度快、检样微量等特点，可用于许多物质的检测，但在国内的使用情况来看，由于成本高而不能被广泛采用。悬浮芯片技术由于操作简便、灵敏度高以及线性范围宽等优点，未来的应用前景将十分广阔。利用气色谱法-质谱联用仪检测脂多糖内毒素的技术相对比较成熟，而免疫学方法在我国还处于理论阶段，未来还需要大量的实践验证及优化。检测霉菌毒素较常用的检测方法是酶联免疫检测技术法和免疫亲和柱法。酶联免疫检测技术法法操作简便，成本比较低，适合大量样品的快速筛选，且设备费用较低，因此在我国已广泛应用。免疫亲和柱法快速简便、灵敏度极高，分离效率和回收率高。另外，国外一些新技术的发现和使用，在我国是值得引进且具有推广价值的。

参考文献

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关键词：食品安全；现代检测技术；食品检测

1引言

近年来，食品安全问题逐渐成为全球关注的焦点之一。危及人类健康和生命安全的重大食品安全事件屡屡发生，从欧州的疯牛病、二恶英到我国的苏丹红、瘦肉精和三聚氰胺等令人防不胜防。新技术的发展、农用化学品的滥用，养殖业的不规范用药以及环境的污染等都是造成食品安全问题的原因，因此加强食品安全检测是解决食品安全的重要措施。传统的食品检测方法已不能满足人们对食品安全的需求，因此，新的检测技术应运而生。现代食品检测技术主要通过仪器分析、分子生物学等方式对食品进行科学检测，能够对食品中含有的有害物质、微生物及食品转基因等问题进行检测，从而及时采取合理措施对问题食品进行处理，保障社会中食品使用的安全。

2现代检测技术

2.1荧光定量PCR检测技术

荧光定量PCR检测技术是在常规PCR的基础上运用荧光共振能量转移技术，把核酸扩增、杂交、检测等技术结合在一起，在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量，据此计算待检样品中目的基因的拷贝数。荧光定量PCR标记的方法由最初单一的染料法，发展到特异性更高的探针法。

荧光定量PCR技术自产生以来，经过不断的发展完善，已广泛应用于食品中致病微生物的检测。李光伟等[1]采用沙门氏菌fimY基因序列，设计特异引物和探针，建立了检测食品中沙门氏菌的荧光定量PCR检测方法。胡建华等[2]根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物，筛选合适的DNA 模板制备方法，以荧光定量PCR检测方法与常规PCR检测方法结合，检测培养液和牛奶阳性样品中的志贺菌目。

同时，荧光定量PCR技术是检测转基因食品最可靠、最快捷的方法，基于转基因特异DN段的荧光定量PCR筛选方法已被一些国家作为相关食品法规的标准检测方法。吴志毅等[3]采用普通PCR法和荧光定量PCR法对Bt63转基因大米的检测灵敏度进行对比研究。根据大米内源蔗糖磷酸合成酶基因SPS和结构特异性基因Btc的基因序列，选用特异性的引物和探针进行研究，经验证试验表明具有专一性，能用于品系鉴定。在灵敏度试验中，阳性转基因大米按照不同质量百分比进行梯度稀释，提取DNA进行PCR扩增。结果表明：普通PCR检测的灵敏度在0.1%左右，而荧光定量PCR检测的灵敏度为0.01%，是普通PCR检测的10倍以上。

2.2核酸探针检测技术

核酸探针检测技术的原理是碱基配对、互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品定基因序列的检测。每一种病原体都有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断及食品安全等研究，该技术具有特异性好、灵敏度高的优点。

在食品检测中，核酸探针检测技术主要用于致病性病原菌的检测。核酸探针可用于检测任何特定的病原微生物，并能鉴别密切相关的毒株，因此可广泛应用于进出口动物性食品的检验，包括沙门氏菌、弯杆菌、轮状病毒、狂犬病毒等多种病原体[4]。但核酸探针技术在实际应用中仍存在一些问题，如放射性同位素标记的核酸探针半衰期短，对人体有危害，操作技术复杂，使用费高等缺点，所以多作为实验室诊断手段。

2.3酶联免疫吸附技术

ELISA是一种把抗原和抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的检测技术。基本原理是，使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。

ELISA已广泛应用于食品安全检测的各个领域。在致病微生物检测方面姚斐等[5]用间接ELISA可快速有效检测出活的非可培养状态的大肠杆菌O157：H7。此外，采用Dot-ELISA检测沙门氏菌，耗时短，比传统方法快4～6d，这都表明了ELISA可以快速的检测出食品中的致病微生物。

在农药残留检测方面，余向阳等[6]以辣根过氧化物酶对兔抗拟除虫菊酯类农药抗体进行标记，建立了检测蔬菜中多种拟除虫菊酯类农药的直接竞争抑制ELISA方法，用该方法对南京市场107个样品检测的阳性检出率明显高于气相色谱法。贺亮[6]建立了直接竞争ELISA检测磺胺二甲嘧啶残留方法，该方法最小检出量为1.97ng/mL，检测范围5～200ng/mL。现已开发的商业化酶联免疫ELISA检测试剂盒，可快速定性、定量检测动物组织、鸡蛋、蜂蜜、牛奶、血清等样品中磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺嘧啶（SD或SDZ）、磺胺甲恶唑（SMZ）、磺胺噻唑（ST）药物的残留量。

ELISA已用于检测食品中毒素。黄曲霉毒素是一种致癌性很强的真菌毒素，各国都严格限制其在食品中的含量，其中B1的毒性最强。蒋建云等[7]利用ELISA法的AFB1试剂盒，通过抗黄曲霉毒素B1抗体与酶标抗原、待测抗原的竞争免疫反应以及酶的催化显色反应相结合来检测黄曲霉毒素B1的含量。该方法具有分析速度快，提取和纯化步骤简便，准确度高、成本低、污染少，一次可测定大批量标本等优点。

2.4高效液相色谱～质谱连用技术

HPLC-MS技术是将液相色谱与质谱串联成为一个整机使用的检测技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在食品安全检测领域得到了广泛的应用。

HPLC-MS技术在食品安全方面的应用主要集中在食品中农药、兽药残留和非法添加物的检测。王凤池[8]建立了通过固相萃取（SPE）-HPLC-MS/MS技术同时测定肠衣品中8种硝基咪哇类药物残留量的方法。样品经乙酸乙醋提取，经SCX固相萃取柱净化后，通过HPLC-MS/MS测定，8种分析物在0.1、0.5和1μg/kg 3个水平的回收率在87.3%～117%之间，重复性在3.35%～10.1%，8种分析物的检出限为0.049～0.083μg/kg。黄芳等[9]建立了食品中三聚氰胺的高效液相色谱-质谱测定方法，用Kromasil C18 柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为5%乙腈：95%水（含0.1%甲酸），采用正离子模式的电喷雾质谱检测，线性范围为0.01～0.5mg/L，检出限0.01mg/L，回收率为80%～99%。

2.5近红外光谱技术

现代近红外光谱技术是将光谱测量技术、计算机技术、化学计量学技术与基础测试技术有机结合，以无损检测为优势的分析技术。近红外光是介于可见光和中红外光之间的电磁波，近红外光谱区与被测物质中O-H、N-H、C-H 及S-H 等含氢基团的分子内部原子间振动的倍频和合频的吸收区一致，通过扫描样品的近红外光谱，能得到其中有机分子含氢基团的特征信息[10]。不同物质在近红外光谱区因成分不同而存在特定的吸收特征，这为近红外光谱定量或定性分析物质提供了理论依据。

近红外光谱技术具有无损性、前处理操作简便、检测成本低、反应迅速等特点使其在食品安全检测中的应用日益广泛。Kawasaki等[11]构建了基于近红外光谱技术的牛奶品质检测模型，该模型可较好地检测牛奶的各项理化指标，评价牛奶的品质。屠振华等[12]运用近红外光谱技术，结合模式识别法对蜂蜜掺假进行了识别分析，分别采用偏最小二乘判别分析、独立软模式法等方法进行蜂蜜掺假识别模型的建立和样品检测，结果表明该方法的正确判别率达100%。Liu等[13]采用表面增强拉曼光谱建立了苹果和番茄表面西维因、亚胺硫磷、谷硫磷残留的检测方法，采用偏最小二乘法和主成分分析法建立这3种农药的定性和定量模型对光谱数据进行校正处理，处理后西维因、亚胺硫磷和谷硫磷这3种农药在苹果上的检出限分别为4.51、6.51、6.66mg/mL，在番茄上的检测限分别可达5.35、2.91、2.94mg/mL，方法回收率可达78%～124%，所建立的方法可以有效检测水果和蔬菜中的农药残留。

3结语

随着经济的发展，人们生活水平的提高，食品安全越来越受到大家的关注。食品安全关乎国计民生，政府机构应制定切实可行的食品安全政策法规，建立健全市场监管机制，加强消费者的食品安全意识。同时，必须大力发展食品安全检测技术，完善检测体系，为食品的安全和品质监管作出更大的贡献。

参考文献：

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[5] 姚斐，沙莎.间接酶联免疫吸附技术检测活的的非可培养状态的大肠杆菌O157：H7[J].青岛海洋大学学报，2001，31（2）：211～214.

[6] 余向阳，骆爱兰.拟除虫菊酯类农药多残留直接竞争ELISA建立及初步应用[J].分析测试学报，2008，27（3）：249～252.

[7] 蒋建云，杨学文.酶联免疫法检测饲料中黄曲霉毒素B1[J].江西饲料，2006（6）：18～19.

[8] 王凤池.液质联用技术在食品安全检测中的应用研究[D].保定：河北大学，2008.

[9] 黄芳，黄晓兰，等.高效液相色谱-质谱法对饲料及食品添加剂中三聚氰胺的测定[J].分析测试学报，2008，27（3）：313～315.

[10] 徐广通，袁洪福，陆婉珍.现代近红外光谱技术及应用进展[J].光谱学与光谱分析，2000，20（2）：1l34～142.

[11] Kawasaki M，Kawamura S，Tsukahara M，et a1.Near-infrared spectroscopic sensing system for on-line milk quality assessment in a milking robot [J].Computers and Electronics in Agriculture，2008，63（1）：22～27

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关键词：气相色谱法 气相色谱质谱联用 定性 物质成分 添加剂

中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）02-0031-01

随着现代科学技术的迅速发展，人们为了增强分析的灵敏性，把气相色谱法和高灵敏选择性检测器结合了起来。气相色谱法刚开始应用是在20世纪五、六十年代，并且迅速在工农业等行业里变得流行，它是一种把气体当作流动相的色谱法。气相色谱法的原理是如果把样品置于固定相和流动相中间，由于气体扩散速度比较快，便能够快速到达平衡状态，所以在当时可以算作是一种高新的分离分析技术。而后来出现的气相色谱质谱联用技术则是为了弥补气相色谱法定性能力不强的缺陷，既囊括了它的优势，又很好地解决了它仅能依靠组分的保留特性来对样品进行定性的不方便问题，现在气相色谱质谱联用技术正以其快分析速度、高灵敏度和高分离效率的良好特点被广泛应用在食品和药品等领域中。

1 气相色谱质谱联用技术的分析特点

气相色谱质谱联用技术同时具有气相色谱法的高效率和质谱法的极强定性能力的优点，克服了单一的气相色谱和质谱的缺陷，主要优势为：第一，既避免了样品制备和样品转移等繁琐过程，又满足了质谱分析的单一性样品要求；第二，能够兼具质量、强度三维、保留时间等信息；第三，借助计算机，可以使操作更加简单方便，实现高效的分析自动化。

2 气相色谱质谱联用在食品检验中的应用

2.1 对物质成分进行准确分析

近几年来，食品安全问题一直备受关注，而利用气相色谱质谱联用可以准确分析物质成分，比如说，使用固相微萃取技术和气相色谱质谱联用技术分析啤酒的成分，可以分析出的主要化合物有四十二种，用这种方法来检测淡水鱼肉气味，醇类和羟基化合物等主要成分能够被分析检测出来，分析出的挥发性成分分别在鲫鱼肉中有四十二种，草鱼肉中有三十种，鲢鱼肉中有四十种。由此可见，气相色谱质谱联用在食品检验中的成分分析方面可以有很广泛的应用。

2.2 在食品农药残留检验中有着重要作用

近年来，菜农都加大了对蔬菜喷施的农药剂量和次数，导致蔬菜中残留的农药成分相当复杂，由于现在农药残留而导致的中毒事件频发，食品安全的问题更加得到了人们的关注。传统上是用气相色谱的检测器对农药残留进行检测，但是农药极性差别很大，不能利用单一色谱进行检测，所以这种传统的方法并不能全面地对所有品种的残留农药进行检测。利用气相色谱质谱联用技术的离子检测方式回收率在百分之八十到一百二十之间，能够定性、定量地对农产品中的除虫菊酯、氨基甲酸酯等残留农药进行检测，例如许国旺结合时间编程选择离子检验模式，借助气相色谱质谱联用方法，有效地检测出了果蔬中的多种除虫菊酯，这种技术操作简单、实用性强、检出限低、回收率高，由于不需要对提取液进行严格净化，可以进行定性和定量分析，所以能使检测速度大幅度提升。

气相色谱质谱联用技术在果蔬农药残留检测中应用十分广泛，通过气相色谱质谱联用方法能够定量、定性地分析苹果中的农药残留，可以分析检测出苹果中的氨基甲酸酯、有机氯、有机磷等五十多种农药成分，结果准确可靠。此外，啤酒的有机磷农药检测利用了固相萃取技术可以使回收率高达百分之八十以上，测量结果和标准值偏差小于百分之八。

2.3 在兽药残留中的应用

养殖户在养殖牲畜的时候通常要给动物喂养一些药物，这些药物可以帮助控制畜禽的疾病或者对某种疾病起到预防作用，另外还可以促进动物成长，而这些药物在肉食产品中难免会有少量的残留，这时对肉、禽、蛋、奶的药物残留检测就可以用到气相色谱质谱联用技术。

2.4 在食品添加剂中的应用

为了使食品色、香、味等品质得到改善，常常在食品加工过程中加入一些天然的或经化学合成的添加剂，这些食品添加剂不仅可以增加食物的营养成分，还能够使视频的保质期尽量延长，我国的食品添加剂种类众多，像香料、着色剂、抗氧化剂、营养强化剂、防腐剂等加起来一共有两千个的品种。

郭岚等曾经用酒精来提取食用油中的丁基羟基茴香醚（即BHA）和叔丁基对苯二酚（即TBHQ） 等，并且运用气相色谱质谱联用技术分离测定这几种抗氧化剂，结果令人满意。这种方法的平均回收率高达百分之八十以上，以其无毒、准确、简捷的优势广泛应用在调和油、花生油和大豆油等食用油的抗氧化剂测定中。郭新东等人对测定辣椒油中苏丹红1和苏丹红2的分析方法进行了研究，采用了固相萃取-气质联用，周敏等也采用改进的前处理方法，用气相色谱一气质联用仪快速对面粉中过氧化苯甲酞进行定性定量分析，此种方法操作很简单，灵敏度高，稳定性也很好。后来，胡强等人又建立了一种对不同食品中低含量甜蜜素的快速气相色谱质谱联用的检测方法，成功地对含脂肪等液、固体试样、含蛋白等不同样品除去杂质，用超声波提取、衍生，最后利用气相色谱质谱联用技术进行定量、定性测试。

3 结语

随着科学技术的发展和食品检测的高准确性和迅速性的需求，气相色谱质谱联用也借着计算机技术的进步而达到了十分广泛的应用，且应用范围越来越宽，比如酒香气成分检测、品质检测等都可以用到这种方法。综上所述，气相色谱质谱联用在食品检验中的应用则主要表现在对物质成分、对农药残留、对兽药残留和食品添加剂的精准的定性和定量检测中，以后气相色谱质谱联用技术必将在食品检验中发挥更重要的作用。

参考文献

[1]刘艳霞，骆传环.色谱-质谱联用法在新药研究中的应用[J].生命科学仪器，2014（5）：6-8.

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关键词 微型辉光放电等离子体； 质谱； 扫描； 成像

1 引 言

质谱成像是一种分子成像技术，但是它不同于需要荧光标记的激光共振聚焦、放射自显影、免疫沉淀等方法，这种方法无需额外标记或分子印染过程就能获得独特、精确的图像，它使成像不局限于某些特异分子，而是面向大多数分子。经过几十年的发展，质谱成像已成为法医、食品分析、地质检测[1～4]等相关领域的重要分析手段，近年来，该技术广泛应用于生物组织及临床研究[5～7]，并取得了较好的成果。质谱成像是将样品的空间信息与其化学信息一一对应，可以对样品x，y二维或x，y，z三维方向顺次扫描，由此获得对应的质谱数据，然后用不同的颜色代表不同组分的空间分布，并通过相关的软件按其空间位置做出质谱影像图。

目前，用于质谱成像的技术根据其工作条件和解吸机制的不同，主要分为以下几类：（1）在真空条件下的基质辅助激光解吸电离（Matrix assisted laser desorption ionization， MALDI）质谱成像技术[8]、二次离子质谱（Secondary ion mass spectrometry， SIMS）[9]等技术；（2）常压下基于喷雾的电离技术， 如解吸电喷雾电离（Desorption electrospray ionization， DESI）[10]、探针电喷雾电离（Probe electrospray ionization， PESI） ＼[11] 等技术；（3）基于激光电离技术，如激光烧蚀电喷雾离子化（Laser ablation electrospray ionization， LAESI）[12]、红外激光消融亚稳诱导化学离子化 （Infrared laser ablation metastable-induced chemical ionization，IR-LAMICI） ＼[13]等技术；（4）基于等离子体的电离技术，如低温等离子体探针（Low temperature probe， LTP）技术[14]、解吸大气压化学电离（Desorption atmospheric pressure chemical ionization， DAPCI）[15]等。近年来，随着医学诊断、地质检测等相关领域的需要，质谱成像技术越来越受到人们的关注，尤其是常压开源质谱成像，该技术主要用于分析分子量低于2000 Da的分子，空间分辨率通常为几十到几百微米[16～18]。基于等离子体的离子化技术由于其本身的限制，用于质谱成像的还较少。由于本实验室研发的微型辉光放电等离子体离子源（MFGDP）[19]具有无污染、高灵敏度、特异性强、高通量等优点，同时又是尺寸小、低温的等离子体，因而在质谱成像方面具有巨大的潜能，基于此，本实验对MFGDP作为离子源用于成像分析作了初步的探索研究，通过对加有尿素的钢笔墨迹以及冬枣切片的扫描，得到了字迹的具体轮廓和切片中不同营养物质硬脂酸和槲皮素衍生物的质谱影像图，并取得了较好的结果，因而为字画研究、艺术品鉴定、营养物质分布图的获取提供了一种新方法。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

LCQ-Fleet型离子阱质谱仪（Thermo Fisher， San Jose， CA），配置Xcalibur （Version 1.4RS1）工作站；载物台、2维电控位移台及步进电机控制器（北京卓立汉光仪器有限公司）；直流稳压电源（扬州双鸿电子有限公司）；质量流量控制器（北京七星电子有限公司）；MFGDP离子源（实验室自主研发）。

碳素钢笔墨水与冬枣均从当地商店购得；分析纯的尿素购自于上海生工公司；普通氩气（99.9%）由侨源气体公司提供。

2.2 实验方法

2.2.1 样品制备 配含有70 μg/mL尿素的碳素钢笔墨水溶液，将钢笔字迹“3”写于陶瓷片，字迹的扫描面积为14 mm×12 mm；用刀片切下约0.5 mm厚的带果皮的冬枣切片，并将切片置于干净的载玻片上直接进行成像分析。

2.2.2 MFGDP的参数及工作条件 MFGDP离子源本体结构参数见原报道[19，20]。工作条件：维持MFGDP离子源的稳定放电电压为1520 V，电流11 mA，氩气流速0.8 L/min；等离子气出口端距电动平移台上的样品约6 mm；离子源与质谱仪进样口距离为约1 cm；样品与质谱仪进样口平齐；MFGDP-MSI的实际工作情况如图1所示；电动位移台的移动速度、移动顺序均由步进电机控制。

2.2.3 质谱条件 MFGDP直接与一台去掉厂方配置离子源的LCQ-Fleet型离子阱质谱仪联用，进行质谱分析检测。 在正、负离子模式下均关闭质谱仪的自动增益（ACG）。 质谱仪参数如下：毛细管温度200℃； 毛细管电压9.5 V； Tube lens 29 V； Multipole RF DAC 320 V； 最大离子注射时间50 ms； 微扫描次数（Microscan）3； 其余参数均为质谱仪的自动调谐值。

2.2.4 数据处理 数据分析时将质谱仪得到的原始raw文件先用imzML Converter软件转化为imzML文件，再通过Datacube Explorer获得最终的质谱影像图。

3 结果与讨论

3.1 质谱成像的可行性评估

为了验证MFGDP离子源用于质谱成像的实用性，本实验对含有70 μg/mL尿素的钢笔墨迹进行了一系列对比分析。对钢笔写下的“3”字进行质谱成像分析，图像的扫描面积为14 mm×12 mm，单个像素点的尺寸为144 μm×150 μm，以尿素的质子化分子离子峰m/z 61作为检测对象，对应的质谱图、质谱成像图和实际样品图如图2所示。

结果表明，质谱成像图中尿素的二维离子分布轮廓图与实际图中分布基本一致，但在质谱图能观察到较为明显的明暗条纹，这可能是由于采用较小的行距引起，其影响因素还需进一步考察并验证。实验可以表明MFGDP离子源用于质谱成像具有实用性，能够提供目标分子在样品中的分布信息及其相对丰度。

3.2 MFGDP-MSI的条件优化

与其它的等离子体常压解吸源测试样品一样，用MFGDP离子源直接扫描样品时仪器工作参数的设定会直接影响质谱信号的强弱，进而影响成像的质量。为了优化实验参数，继续对含有70 μg/mL尿素的钢笔字迹进行对比分析，在MFGDP离子源本身结构参数确定的条件下，MFGDP离子源工作电流、工作气的流速、样品与等离子体羽尾端之间的距离、样品与质谱仪入口之间的距离、等离子体羽的长短、电动位移台的移动速率、纵向间隔都会影响MFGDP-MSI的分辨率。本实验中MFGDP离子源工作电流、工作气的流速、样品与等离子体羽之间的距离、样品与质谱仪入口之间的距离、等离子体羽的长短都采用了MFGDP离子源做质谱分析时的最优条件[19]，通过对影响质谱信号的其它参数的优化，选择了最优体系，结果表明，电动位移台的移动速率、纵向间隔对图案的轮廓清晰度以及纵向分辨率的影响最大。通过初步研究探索，确定电动位移台的最佳水平移动速率为0.3 mm/s，纵向间隔dy为0.4 mm。由最佳条件下钢笔墨迹“A”的影像图（图3）可见，影像图与实际图的轮廓一致，且清晰度较高。

3.3 实际样品分析

以冬枣切片为分析对象，研究不同营养物质硬脂酸和槲皮素在枣内的分布情况。用刀片切下厚约0.5 mm的带果皮的冬枣切片，并置于干净的载玻片上直接扫描，扫描面积12 mm×11.2 mm，在最佳条件下，扫描总时间不超过20 min。图4为冬枣切片的实际样品图、以硬脂酸和槲皮素为目标离子的质谱成像图。从图4可见，整个冬枣切片中都含有硬脂酸，但主要分布于果肉中，而槲皮素主要以其衍生物的形式多存在于果皮中。

3.4 实验结果讨论

从“A”字的成像图中可以看出，成像图虽与实际图较符合，但还是存在明显的拖尾现象，其主要是受等离子体羽本身的形状、尺寸大小的限制，也可能与质谱仪的记忆效应有关。在冬枣的成像图中，观察到有明显黑白相间的宽条纹，主要因为MFGDP产生的等离子羽在x轴方向为薄片而在y轴方向相对较厚。初步实验证明，MFGDP质谱成像在不需要对分析物标记，也不需要对分析样品复杂预处理的前提下，不仅能提供样品中目标物质的空间分布，还能提供其分子的结构信息；更重要的是，因其整个扫描过程具有耗时短、操作简易、等离子体羽低温等特点，使其有望成为生物化学、药物定位、刑侦鉴定等领域的有力工具。目前其空间分辨率还不是很理想，本实验中分辨率大约为300 μm，主要受到了MFGDP离子源本身的制约，还需进一步调整MFGDP离子源的结构，现阶段我们正在改进放电通道的结构， 以得到尺寸更小的等离子体羽。

4 结 论

利用新型MFGDP离子源与常规离子阱质谱仪联用实现了对不同样品的成像分析， 此方法无需复杂的预处理，具有无污染、耗时短、特异性强等优点，比较适合定位小分子物质在组织样品中的分布。经初步探索研究，虽取得较好的结果，但目前其空间分辨率、灵敏度还有待进一步提高，还需进一步调整MFGDP离子源本身的参数，通过改进MFGDP的结构和设计可以获得更微型化的等离子羽，从而进一步提高成像的分辨率。

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篇8

关键词电感耦合等离子体质谱；激光剥蚀；元素成像；单细胞分析；鼠脑切片；金纳米颗粒

1引言

生物体内的微量元素具有十分重要的生物功能，参与多种生物化学过程[1＼]，如金属离子常作为蛋白质的活性中心，催化和调节生物体内的化学反应[2＼]。微量元素还与一些疾病的发生发展密切相关[3＼]。研究发现，阿尔茨海默病（Alzheimer′sdisease，AD）患者大脑的沉积斑中有高浓度的铜、锌、铁离子[4＼]；金属离子在脑组织微区内的代谢紊乱、氧化应激与AD的形成和损伤关系密切[5＼]。因此，生物样品中微量元素的分析和检测，特别是元素的原位微区分析，无论对于研究微量元素在生物体内的结构、功能和生物效应，还是对于阐明与微量元素相关疾病的发病机理，寻找这些疾病的预防和治疗策略，都具有重要的意义。

生物体内微量元素的分析主要使用原子吸收、原子发射、原子荧光、无机质谱等原子光谱/质谱仪器完成。常规方法大都需要使用强酸消化样品，前处理过程冗长而繁琐，一般只能得到元素总量的信息，而无法得到元素在生物样品中的分布信息。如果采用具有空间分辨能力的原位分析方法，如二次离子质谱[6＼]、激光电离飞行时间质谱[7＼]、同步辐射X射线荧光[8＼]、激光烧蚀电感耦合等离子体质谱（Laserablationinductivelycoupledplasmamassspectrometry，LAICPMS）[9＼]等方法，可以实现生物样品中元素的原位、微区分析，得到元素成像图。

在上述原位元素分析方法中，LAICPMS由于具有空间分辨率好（约5μm）、分析检出限低（10

4g/L级）、仪器商品化程度高、运行成本较低等优点，逐渐成为应用最广泛的元素成像方法[10，11＼]。杨红霞等[12＼]利用LAICPMS原位分析了印度芥菜中的7种元素，得到了植物茎中的元素分布图；冯流星等[13＼]将同位素稀释法应用于LAICPMS的定量分析，建立了生物切片中Fe元素的原位定量分析方法。本实验详细描述LAICPMS元素成像的步骤和方法，并将建立的方法应用于鼠脑切片和单个细胞的元素成像分析。

2实验部分

2.1仪器与试剂

NWR213Nd：YAG激光剥蚀系统（美国NewWave公司）；四极杆电感耦合等离子体质谱仪（NexION300DICPMS，美国PerkinElmer公司）；冷冻切片机（德国LEICA1900）；NuncLabTekII腔室载玻片（美国赛默飞世尔科技有限公司）

本实验所用小鼠（C57BL/6J）购自中国医学科学院实验动物研究所；高纯Ar气和He气购自北京普莱克斯公司；LAICPMS调谐用标准物质（SRM612），30nm金纳米颗粒（RM8012）购自美国国家标准与技术研究院（NIST）；细胞培养基、小牛血清、PBS、胰酶、青霉素、链霉素均购自美国赛默飞世尔科技有限公司。

2.2样品前处理

3月龄正常小鼠麻醉后，用生理盐水快速灌注15min，再断头取脑组织。将脑组织快速冷冻，制成30μm厚的冠状切片，置于干燥器中备用。

小鼠巨噬胞（RAW264.7）用含有10%小牛血清（FBS）、100μg/mL链霉素、100units/mL青霉素的DMEM/F12培养基在培养箱中（37℃，5%CO2）培养。NIST金纳米颗粒超声处理后，用纯水稀释至合适的浓度，加入细胞培养液。细胞暴露于0.1mmol/L金纳米颗粒4h后，JP吸出细胞培养液，用PBS反复清洗后，将细胞转移至腔室载玻片，待细胞贴壁后，除去腔室间的隔断，将载玻片置于干燥器中备用。

2.3LAICPMS实验

激光剥蚀产生的气溶胶由He气载带出样品ZH（池，通过三通与Ar气混合后进入ICPMS分析。ICPMS用NIST612调谐，使U、Th信号最强且得到较低的氧化物产率（UO+/U+）。LAICPMS所用的仪器参数见表1。

LA采用线剥蚀模式，激光剥蚀时自动触发ICPMS以时间分辨模式采集质谱数据。所得数据用MicrosoftExcel处理，用IgorPro.（美国WaveMetrics公司）软件画出元素成像图。

3结果与讨论

激光烧蚀系统可以作为ICPMS的固体进样装置，工作时激光束先剥蚀样品表面，产生的固体气溶胶被载气运送至等离子体而完成电离，然后在质谱中得到检测。LAICPMS的准确分析需要尽可能地满足下面3个条件：（1）激光剥蚀产生的气溶胶与固体样品的组成相同；（2）气溶胶可以高效率地传输至质谱；（3）进入质谱的气溶胶可以完全电离[14＼]。在实际分析过程中，上CM（203/5述条件常常很难完全满足，这样会导致“元素分CM）ZH）馏”（不同元素在LAICPMS分析过程中的行为差异）的产生。为了校正激光能量、样品厚度、漂移对质谱响应的影响，LAICPMS元素成像分析时，需要选用适合内标元素。还要使用基体匹配的标准，以获取准确的定量分析结果。研究表明，相比过去常用波长的激光器（如266nm），使用213nm波长的NdKG-3∶KG-5YAG激光剥蚀得到的样品更为均匀，元素分馏效应更小[15＼]。使用氦气作为载气，可以有效地提高气溶胶的传输效率，从而提高分析的灵敏度[16＼]。因此，在本实验中，使用波长为213nm的激光，采用He气作为载气，并采用13C的信号作为内标校正元素。

3.1剥蚀模式的选择

元素成像可采用点剥蚀模式（Spotablation）或线剥蚀模式（Lineablation）完成（图1）。在点剥蚀模式中，激光在样品表面每隔一定距离取一点剥蚀样品，重复操作直到激光采样的点阵覆盖整个样品。在此模式下，采集的数据真实反映每个采样点上的元素信息，激光光斑越小，采样点越多，得到的元素成像图的分辨率越高。而在线剥蚀模式中，在样品表面每隔一定距离设置一条剥蚀线段，重复设置剥蚀线段，直到激光采样的线段覆盖整个样品。工作时激光沿直线连续剥蚀样品，此时，元素成像图的分辨率取决于激光光斑、剥蚀频率、线扫描速率，以及剥蚀线间的距离等条件。

LAICPMS分析时，如果采用点剥蚀模式，在两个剥蚀点之间需要耗费较多的时间等待质谱信号回到本底水平，才能进行下一点的分析。这样减少了有效质谱分析时间的比例，增加了元素成像分析所需要的时间。所以在本实验中，采用线剥蚀模式，并使用两种剥蚀参数分别应用于鼠脑切片和细胞样品（见表1）。需要注意的是，由于剥蚀参数的选择，最终得到的元素成像图在激光扫描的方向常会拉长变形，一般需要在最后处理过程中恢复原始比例。

3.2激光能量的选择

与地质样品不同，生物样品的含水量较高，因此在剥蚀时，必须有效地控制剥蚀条件，既要实现完全剥蚀样品，又要避免用过高的能量剥蚀而使样品中的水大量汽化，造成样品不规则撕裂和严重的元素分馏。此外，在分析生物样品时，选择较低能量密度（

3.3鼠脑和细胞的元素成像图

元素C作为生物样品的内标校正元素，Fe，Cu，Zn是生物体中重要的必需微量元素，具有多种生物功能。所以，本研究选择分析以上元素。LAICPMS分析得到的鼠脑元素成像见图3。从图3可以清楚地分辨小鼠脑的不同区域，并可以看出Fe，Cu，Zn等重要微量元素在各个脑区中的分布情况。由于Fe元素在ICPMS中受到ArO+等多原子离子的严重干扰，所以得到的Fe元素成像图不如其它元素成像图清晰。JP文献＼[18＼]报道，采用碰撞反应池技术可以消除测量时的质谱干扰，得到更加清晰的Fe元素成像图。由于缺乏可用于LAICPMS定量分析的生物标准参考物，定量元素成像分析相对困难。国外实验室常自制基体匹配的生物切片标准物质，采用外标校正的办法，实现生物样品的定量元素成像[10＼]。

如果LAICPMS技术与免疫组织化学方法相结合，使用元素标记的抗体与切片上的待测抗原反应，通过分析标记的元素，可以得到切片上蛋白质（抗原）的分布信息，进一步拓展LAICPMS在生物成像分析的应用范围。Seuma等[19＼]成功得到了两种癌症生物标志物在组织上的成像。利用类似的方法，Wang等[20＼]同时得到了Fe，Cu，Zn等金属元素和β淀粉样蛋白在老年痴呆模型鼠脑切片中的元素和分子成像图。

图4是暴露金纳米颗粒后的单细胞光学成像和元素成像图。在本实验条件下，除了Mg元素外，不能得到其它天然微量元素的清晰成像。@主要是由于细胞中的这些元素含量较低，或者是由于分析这些元素时存在较为严重干扰。从图4可见，Mg和Au元素浓度较高的位置与光学显微镜中细胞所在位置重合，而在没有细胞的位置，Mg和Au元素浓度很低。因此可以确定，Mg和Au的元素信号分别来自于细胞本身和进入细胞的金纳米颗粒。

为了准确得到单个细胞中的元素含量，需要发展合适的定量标准和校正方法。Wang等使用微喷系统制备了与细胞大小和含碳量相似的标准液滴，作为基体匹配的单细胞定量标准，成功实现LAICPMS定量分析单细胞中的金属纳米颗粒[21＼]。此外，现有的激光器最小光斑约为5μm，如果希望用LAICPMS技术得到单个细胞中的元素成像图，则需要进一步提高空间分辨率。Becker等提出的近场剥蚀技术，将LAICPMS空间分辨率提高到亚微米级，有望真正实现单个细胞成像分析[22＼]。

4结论

本研究建立了LAICPMS元素成像方法，得到了鼠脑切片、单细胞等不同水平生物样品的元素成像图。LAICPMS由于具有空间分辨率高、检出限低、运行成本较低等优势，有望作为其它生物成像技术的有力补充，在生物医学研究中得到更广泛的应用，发挥更重要的作用。

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AbstractTraceelementsplayaveryimportantroleinbiologicalorganismandcloselyrelatedtomanydiseases.Thenewanalyticalmethodsareurgentlyneededforinsitudeterminationoftraceelementsinbiologicaltissuesorsinglecells.Amethodbasedonlaserablationinductivelycoupledplasmamassspectrometry（LAICPMS）wasdevelopedforsuchinsituanalysis.Lineablationmodewaschosenandtheoutputenergyofthelaserwasalsooptimizedatalowfluenceoflessthan1J/cm2.Thetwokindsofelementalbioimagingofbothacoronalsectionfrommousebrainandsinglecellsexposedtogoldnanoparticleswereobtainedbythedevelopedmethod.Becauseoftheuniquecharacteristics，suchasgoodspatialresolution，excellentdetectionlimit，andreasonablerunningcost，LAICPMSwillbeappliedwidelyandbecomeausefultoolinbiomedicalresearchinthefuture.

KeywordsInductivelycoupledplasmamassspectrometry；Laserablation；Elementalbioimaging；Singlecellanalysis；Mousebrainsections；Goldnanoparticles

篇9

关键词：代谢组学；血清前处理方法；气相色谱质谱联用

1引言

代谢组学是对生物系统的细胞在给定时间和条件下所有小分子代谢物质进行定性定量分析，从而定量描述生物内源性代谢物质的整体对内因和外因变化应答规律的科学。大鼠血清作为代谢组学研究中的重要体液样本，在采用常用的气相色谱质谱联用（GM）对其进行分析之前，需要进行除蛋白质和衍生化等前处理步骤。除蛋白质是希望通过有机溶剂沉淀去除血清中所含的大量蛋白质成分；衍生化是将血清中极性较强、挥发性较低的物质转化为稳定性和挥发性较高的物质。目前常用的除蛋白试剂有甲醇、甲醇乙醇等。衍生化通用的是两步法（肟化和硅烷化），而两步法中最常用的衍生化试剂有A（NOistrimethylsilyltrifluoroacetamide）、MA（NmethylNtrimethylsilyltrifluoroacetamide）。这些方法、试剂在血清代谢组GM分析中得以广泛应用，但目前还没有文献对它们给血清代谢物产生的影响进行过比较分析，本研究采用GM技术，对比分析了血清样品前处理中常用的有机溶剂沉淀蛋白、两步衍生化步骤中不同试剂对最终所能测到代谢组的影响，结果可望为血清代谢组学GM分析前处理方法的选择提供依据。

2实验部分

篇10

关键词 粉葛； 高效液相色谱电喷雾质谱； 同分异构体； 源内碰撞诱导解离

1 引 言

粉葛（Radix puerariae thomsonii）为豆科植物甘葛藤（ Pueraria thomsonii Benth）的干燥根, 味甘, 辛、凉,有解肌退热、透疹、生津止渴、通经活络之功效 \。粉葛自古与野葛同作葛根用。研究发现, 粉葛与葛根（野葛）HPLC指纹图谱\及临床应用\存在较大差别, 2005版中国药典首次将粉葛与葛根（野葛）分列作为中药材记载。粉葛中主要成分为异黄酮类化合物, 大部分以苷的形式存在, 主要包括：葛根素、3′羟基葛根素、大豆苷等\, 其主要结构见表1。该类化合物中存在多对同分异构体, 主要分为碳苷和氧苷两类化合物。同分异构体结构相似, 极性相近, 分离难度大。分离和鉴别中药中同分异构体化合物, 一直是药物分析的难题。

高效液相色谱质谱联用（HPLCESIMS）技术结合了色谱与质谱的优点, 可有效分析复杂混合物中的单个和多个组分\。文献\采用高效液相色谱（二极管阵列）/电喷雾质谱联用系统（HPLCESIMS）方法分析葛根中异黄酮类化合物。但对粉葛中化合物质谱分析尚未见报道。本研究采用HPLCPDAESIMSn技术鉴别分析了粉葛中C苷和O苷两类化合物, 建立区分粉葛中异黄酮类化合物同分异构体的电喷雾质谱方法。表1 粉葛中主要异黄酮类化合物

谱配有电喷雾离子源（ESI）；高效液相色谱仪系统（Surveyor HPLC）包括 Surveyor PDA Plus检测器、Surveyor AutoSample Plus自动进样器、Surveyor MS Pump四元泵； Xcalibur 2.0化学工作站软件； Mass Frontier 6.0软件。

粉葛药材购于合肥市当地药店, 经安徽中医学院药学院中药教研室王德群教授鉴定为豆科植物甘葛藤（ Pueraria thomsonii Benth）的干燥根；葛根素对照品（中国药品生物制品检定所, 批号 0752200509）; 乙腈、甲酸（色谱纯, 美国Merck公司）, 实验用水为亚沸蒸馏水。

2.2 样品处理