正向遗传学克隆基因的方法范文

导语：如何才能写好一篇正向遗传学克隆基因的方法，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

1.巴氏小体案例在遗传学教学中的应用

2.下一代测序技术在表观遗传学研究中的重要应用及进展

3.遗传学教学中在细胞与分子水平上理解等位基因的显性与隐性

4.果蝇唾腺多线染色体研究进展及其在遗传学教学中的应用

5.以人类血型为遗传学案例教学的思考与实践

6.表观遗传学药物的研究进展

7.表遗传学几个重要问题的述评

8.构建优质教学体系,促进《遗传学》精品教育

9.小鼠毛色遗传的控制机制及其在遗传学教学中的应用

10.肝癌发生的分子遗传学和表遗传学研究

11.景观遗传学原理及其在生境片断化遗传效应研究中的应用

12.以遗传信息为主线的遗传学教学架构及与其他课程的衔接

13.认知过程中的表观遗传学机制

14.我国高校遗传学教材的出版与使用现状的调查

15.表观遗传学:生物细胞非编码RNA调控的研究进展

16.表观遗传学视角下运动干预阿尔茨海默病的机制分析

17.遗传学与基因组学整合课程探讨

18.表观遗传学研究进展

19.癫痫表观遗传学研究进展

20.不仅仅是遗传多样性:植物保护遗传学进展

21.利用文献精读教学新模式优化遗传学教学

22.2015年中国医学遗传学研究领域若干重要进展

23.发展行为遗传学简介

24.光遗传学技术应用于动物行为学在神经回路中的研究进展

25.表遗传学推动新一轮遗传学的发展

26.生物教育专业《遗传学》教学改革的探索

27.糖尿病肾病遗传学研究进展

28.肿瘤表观遗传学研究热点的聚类分析

29.浅谈高校《遗传学》课程教学改革与实践

30.2015年中国微生物遗传学研究领域若干重要进展

31.利用经典文献优化《遗传学》双语教学

32.孟德尔豌豆基因克隆的研究进展及其在遗传学教学中的应用

33.表观遗传学在肺癌诊治中的研究进展

34.人格行为遗传学研究的两类取向

35.害虫遗传学控制策略与进展

36.表观遗传学及其应用研究进展

37.阿尔兹海默病的表观遗传学机制及相关药物研究

38.胃癌遗传学及表遗传学研究进展

39.遗传学在胆管细胞癌发展中的重要性

40.子痫前期表观遗传学研究进展

41.行为遗传学:从宏观到微观的生命研究

42.遗传学史在遗传学教学中的作用

43.男性不育的遗传学评估

44.表观遗传学与肿瘤干细胞

45.开放式教学在遗传学实验教学中的探索与实践

46.表观遗传学调控与妇科肿瘤发生、演进及治疗的研究进展

47.规律运动干预人类衰老过程的表观遗传学机制研究进展

48.表观遗传学及其在同卵双生子研究中的新进展

49.分子群体遗传学方法处理鲤形态学数据的适用性

50.番茄果重数量性状基因的研究进展及在遗传学教学中的应用 

51.遗传学教学中遗传学史及科学方法论的教育

52.景观遗传学:概念与方法

53.孤独症的遗传学和神经生物学研究进展

54.肺癌表观遗传学的研究进展

55.肿瘤的表观遗传学研究

56.遗传学课程群的设置和思考

57.《遗传学》课程的建设与优化

58.表观遗传学在中枢神经系统退行性疾病中的研究进展

59.遗传学实验教学体系的改进

60.肝癌表观遗传学研究进展

61.保护生物学一新分支学科——保护遗传学

62.表观遗传学在淋巴系统肿瘤研究中的新进展

63.大肠癌的表观遗传学研究进展

64.重视经典遗传学知识体系构建和学生自学能力的培养

65.植物化学遗传学:一种崭新的植物遗传学研究方法

66.关联分析及其在植物遗传学研究中的应用

67.表观遗传学及现代表观遗传生物医药技术的发展

68.三阴性乳腺癌与表观遗传学研究现状

69.构建培养新型医学人才的医学遗传学课程体系改革

70.骨髓增生异常综合征的遗传学检测研究进展

71.钉螺遗传学及其生物学特性的研究进展

72.羞怯:来自行为遗传学的观点

73.遗传学探究性实验教学的思考及实践

74.“教学、实践、科研、临床”四位一体的医学遗传学教学体系建设探索与实践

75.国内高校遗传学教材发展研究

76.男性生殖遗传学检查专家共识

77.肿瘤表遗传学研究的进展

78.创新性遗传学大实验对提高大学生综合能力的研究

79.白内障表观遗传学研究的现状及进展

80.遗传学研究性实验教学模式探索与创新人才培养

81.表观遗传学在木本植物中的研究策略及应用

82.高通量测序技术结合正向遗传学手段在基因定位研究中的应用

83.激发与培养学生学习遗传学兴趣的教学途径

84.从表观遗传学开展复杂性疾病证候本质的研究

85.蓝藻分子遗传学十年研究进展

86.建设遗传学课件体系 提高多媒体教学质量

87.表观遗传学与肿瘤

88.原发性肝癌的表观遗传学及其治疗

89.青少年焦虑、抑郁与偏差行为的行为遗传学研究

90.儿童孤独症的遗传学研究进展

91.本科生遗传学实验教学的改革探讨

92.与闭经有关的遗传学问题

93.多媒体教学在遗传学“三点测验”教学中的实践

94.一个实用的群体遗传学分析软件包——GENEPOP3.1版

95.论从“肾为先天之本”到“中医遗传学”

96.《遗传学》多媒体教材的编写与实践

97.肺癌的表观遗传学研究进展

98.无创性产前遗传学检测研究进展

篇2

【关键词】X-连锁无丙种球蛋白血症（XLA）；Burton酪氨酸激酶（BTK）；诊断；治疗

【Abstract】X-linkedagammaglobulinemia（XLA）belongstotheprimaryimmunodeficiencydisease（PID），whichcallsBrutondisease.Recently，itcannotgenerateimmuneglobulin，becauseofthemutationoftheBruton’sagammaglobulinemiatyrosinekinase（BTK）gene，whichleadstodevelopmentaldisorderoftheBcell.Thisarticlereviewsthegeneticcharacters，mutationanalysis，molecularpathogenicmechanismandtherapyoftheBKTgene.

【Keywords】XLA；BTK；diagnosis；therapy

X连锁无丙种球蛋白血症（X-linkedagammaglobulinemia，XLA），又称Bruton无丙种球蛋白血症，是最早发现的人类原发性免疫缺陷病（primaryimmunodeficiencydisease，PID）之一，Bruton（1952年）首次报道。患者临床上以反复细菌感染为特征，血清中各类免疫球蛋白明显降低或缺乏，对抗原刺激不能产生抗体应答，血循环中B淋巴细胞减少，淋巴结及淋巴组织缺乏生发中心和淋巴滤泡，骨髓中无浆细胞，但前B淋巴细胞数量正常，T淋巴细胞数量及功能正常。典型病例为出生后半年左右开始反复化脓感染（如肺炎链球菌或嗜血流感杆菌）或迟至幼年发病，患者体内缺少成熟B细胞，基本上不能自主产生免疫球蛋白，必须依靠免疫替代疗法维持体液免疫水平。该病严重危害患者健康，危及患者生命。80%～90%［1］临床诊断病例可检出相关致病基因BTK发生突变，而其他10%～20%［1］的病人存在其他问题，有研究显示常染色体编码Igφ［2，3］、μHC［4］和LC的基因存在突变。

1BTK的遗传学特性大多数PID的遗传形式已经明确，几乎均为单基因遗传，多数为常染色体隐性遗传，其次为X连锁隐性和常染色体显性遗传。大多数情况男性发病，女性携带，但也有男性携带者不发病的报道。60%的PID突变基因的DNA序列已被克隆，突变位点（包括突变基因定位的染色体节段和基因位点）和突变形式（单个核苷酸缺失、替代、插入、移码突变、无义或错义突变等）也已确定［5］。在WHOPID专家委员会的指导下，成立了有关疾病基因库，记录登记全球范围的PID基因突变及其类型。多基因遗传性PID的确定较困难，至今尚无确切的报道。

1.1BTK的蛋白结构BTK蛋白为B细胞信号传递系统中的重要蛋白，属于非受体型蛋白酪氨酸激酶Tec家族的一员，该家族的成员还包括TEC、ITK/TSK/EMT和BMX。Tec家族蛋白酪氨酸激酶包括5个不同的结构区段（见图1），从N末端起为PH（pleckstrinhomology；PH）段，约有120个氨基酸，TH（Techomology；TH）段约有60～80个氨基酸SH3（Srchomology3;SH3）段约有60个氨基酸，SH2段约100个氨基酸，激酶催化段约280个氨基酸［6］。

图1BTK蛋白的组成（从N端开始）包括5个区域：PH、TH、SH3、SH2和激酶区。

注：图上边的数字代表各段的氨基酸长度，图下边的数字代表不同的外显子及其相应的位置。

BTK蛋白的空间结构多数已测明，包括PH区、TH区的前半部、SH3区和激酶催化区［7］，SH2区的结构可借用其他蛋白激酶的类似结构进行研究。这些三维空间结构可用于分析突变造成的蛋白空间结构的改变。

1.2BTK基因的分子结构及其突变分析在20世纪80年代，多位学者应用DNA多态性标志分析的方法，成功地将XLA的缺陷基因定位于X染色体中部（Xq21.3-22）的2cm区域内［8］。Vetrie等用定位克隆方法在XLA病变基因区内分离鉴定了一个新的基因，该基因表达于正常人各期B淋巴细胞，在XLA患者中发生突变，故认为是XLA的致病基因。Tsukada等也找到XLA的KD致病基因。BTK基因全长37.5kb，含有19个外显子，除第一外显子外，其余18个编码BTK蛋白的659个氨基酸，分子量为76KD［9］。cDNA含有2560个核苷酸，有一个编码659个氨基酸多肽的开放阅读框架，起始密码子在核苷酸第133位置上，在起始位置上游的15个密码子处阅读框架闭合。根据国际研究小组BTK突变分析，迄今已经在471个家族544个XLA病人中发现了BTK基因341个独立存在的碱基置换、插入或缺失，其中有13个大段缺失和2个大段插入。突变不仅存在于19个外显子，还涉及内含子和启动区域。其中，发生频率最高的是错义突变，其次是无义突变和拼接位点突变。错义突变主要发生在三联体密码子的前两位。外显子8和9的185~287位没有错义突变，这些位点可能不易突变或是功能上不重要。33%的替代累及CPG双核苷酸，这是目前认为的最常见的突变热点［10］，而突变高频位点R520也属于CPG突变［6］。编码外显子蛋白突变的区域［11］（见表1）。表1编码外显子蛋白突变的区域

2BTK的分子致病机制BTK属于非受体酪氨酸蛋白激酶，该类激酶广泛参与细胞信号传导，影响细胞的存活、增殖和分化，BTK是B细胞发育成熟的关键因素。正常人除T细胞和浆细胞外均有BTK表达，而BTK基因突变只影响B细胞的数量，这说明BTK在B细胞的生长发育过程中起着至关重要的作用。目前对BTK参与细胞信号传导研究比较清楚的是BCR交联介导的信号传导途径。其过程简述如下：BCR交联激活Pl-3激酶并产生一定数量的Pl-3，4，5-risphosphate与膜结合，Pl-3，4，5-risphosphate与BTK的SH3段作用使其定位于细胞膜。然后，BTK经过两步活化：首先BTK激酶段Y551位磷酸化（很可能是与Lyn作用），接着是SH3段Y223位的自身磷酸化。活化后的BTK与B细胞衔接蛋白（BLNK）结合并激活phospholipaseC-γy（PLC-γ），导致钙离子通道打开，胞外钙离子内流。该信号传导途径最终导致细胞增生加强和转录的变化。此模式仅限于以B细胞受体交联作为刺激信号，至于前B细胞受体交联是否也引起相同的信号传导目前还缺乏证据［1，12］。该信号传导途径受FcRⅡB和SHIP（SH2-containinginositol-5-phosphatase）磷酸酶介导的另一途径制约，通过水解Pl-3，4，5-risphosphate和Ins（1，3，4，5）-etraphosphate关闭钙离子内流通道［13］。BTK不仅可以由BCR和FCR介导激活，也可以通过其他很多受体激活，包括G-protein-coupledreceptors（GPCR）、IL-3、IL-5和IL-6，另外，CD19和单克隆抗体的交联也可激活BTK［13］，近年来研究表明，CD40也是B细胞发育过程中的重要受体，传递刺激信号影响细胞存活、生长和分化。与BCR介导的BTK活化途径相似，CD40的交联也可激活BTK。CD40和BCR可能是B细胞发育过程中不同阶段激活BTK的信号传递通路。但也有研究提示CD40不通过BTK也可提高NFKB和JNK的水平，是独立于BTK的信号传导通路［14～16］。BTK在细胞内与很多分子相互作用，共同构成了一种微环境，在信号传导的过程中起着重要的作用。这些分子分别与BTK的不同区段相互作用，其中与PH段作用的分子研究得很多，R28附近区域与PIP3、IP4、PKCβⅠ、BP-135、F-ac-tin、STAT3和Fas作用。PH-TH区域与Gαq和Gβ双体作用;SH3与c-Cb1、WASp、Vav和sab作用;SH2与磷酸化的BLNK作用。另外，SH3与TH在BTK分子内作用，抑制BTK的活性。在BCR交联介导的信号传导途径中，Syk和BLNK对BTK的活化起正向调节作用，磷酸化的PKCs、sab和IBTK对BTK的活化有抑制作用。尽管与BTK作用的分子很多，但是它们如何协调地与BTK作用，完成BTK参与的信号传导，机制目前尚不清楚［17，18］。

3XLA的诊断XLA是一种原发性体液免疫缺陷症，危害着人们的健康。因而，对该症进行产前诊断和女性携带者的鉴定就显得十分重要［19］。为了研究XLA家系女性成员的情况，Fearon等采用了X染色体失活的方法去发现携带状况以及验证B淋巴细胞发育的内在缺陷。根据这一方法用重组DNA探针同时发现RFLP和X染色体基因甲基化。在无携带状态的女性的外周血粒细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞中发现X染色体的随机失活。相反，该症的三个携带者在外周B淋巴细胞两个X染色体中的一个优先失活，但不是T细胞或粒细胞。这一发现强烈地支持XLA是由B淋巴细胞发育的内在缺陷所致的假设。Lovering（1994）等［20］对BTK基因缺失患者DNA分子斑点杂交分析见到了已改变的DNA限制性片段，并对7个患者家庭用已经改变的限制性片段方法对与患者有关的女性携带状况作出诊断。随后，Schuster等［21］报道了对所有19个外显子。包括侧翼内含子边界采用PCR-SSCP方法成功地检测到两例男性患儿BTK的SH2功能区的新突变，并用一个已改变过的第一个引物做PCR扩增突变发生，作出三代中健康女性携带者的鉴定。接着，Hagemann等［22］对一个散发的XLA患儿及家庭的三代成员应用PCR扩增基因组DNA，采用序列分析的方法直接鉴定XLA的基因突变，结果诊断出患儿及其免疫学表现正常的女性携带者。以上这些方法均可应用于产前诊断。这无疑对优生优育是很有意义的。

4XLA的治疗研究免疫重建是采用正常细胞或基因片段植入患儿体内，使之发挥功能，以持久地纠正缺陷的基因及其表达产物。1968年使用HLA配型同种异体骨髓移植治疗2例致死性免疫缺陷病获得成功。至今已有近2000例PID患儿接受骨髓移植，总存活率为62%，其中同型合子骨髓移植达79%。无关供体配型骨髓（matchedunrelatedmarrowdonor，MUD）移植在近年已很盛行，成功率约为50%，5岁以内接受移植者可达85%［23］。近年开展脐血干细胞移植，存活率为75%。用母体骨髓CD34+干细胞宫内移植（腹腔注射）已有成功的报道［5］。将正常目的基因片段整合到患儿干细胞基因组内（基因转化），随细胞有丝分裂，转化的基因片段能在患儿体内复制而持续存在。理论上讲，凡能通过骨髓移植治愈的疾病均是基因治疗的指针［24］。基因治疗PID的尝试已经历多年，取得一定成效，但尚处于探索和临床验证阶段［25］。Faust等［26］的动物实验是通过免疫球蛋白的增强子和驱动子介导的小鼠BTKcDNA转录至两组免疫缺陷鼠（XLD或BTK-/-鼠）。转入1个拷贝的XLD或BTK-/-鼠经蛋白印迹法检测其BTK达到正常量的25%；而转录2个拷贝者其BTK达到正常量的50%。两组小鼠经检测均有正常数量的脾B细胞，两组小鼠对TNP一蔗聚糖刺激所产生抗体的反应和血清IgM、lgG3水平较正常野生鼠明显减低，但较XID小鼠有所提高。Drabek等［27］通过人类BTKcDNA与鼠主要组织相容性复合体Ⅱ区调节因子的转基因治疗，纠正了BTK缺陷鼠的B细胞功能，并发现转入的基因并不表达于前B细胞以前的分化阶段，此外它在胸腺上皮细胞、活化T细胞、单核细胞上表达，并在其他组织均有低水平表达。经蛋白印迹法检测转基因鼠的脾细胞产物发现，BTK蛋白总含量可达到与野生型鼠相同。这些研究均向我们提供了基因治疗XLA的可能性。此外，Rohrer等［28］通过动物实验证实，应用极少量正常骨髓细胞输注即可通过竞争使XID小鼠获得B系统免疫重建。这项研究推测，即使不成功的基因治疗也可对XLA患者有益，为今后开展人类XLA的基因、细胞治疗提供有利的基础和广阔的前景。总体上说，尽管目前基因治疗离成熟的临床治疗技术还有相当的距离，但经过近10年的临床试验，人们已获得了大量宝贵的临床资料。我们有理由相信，XLA的基因治疗将在不久的将来获得突破性进展。

5展望尽管80%～90%临床诊断为XLA的病人依靠BTK突变检测确诊为XLA，但是XLA的基因突变位点很多，与临床症状的相关性不强，同一家系中的XLA病人临床表现程度很可能各不相同。即：基因型和临床表型的关系是目前需要研究的课题之一［29］。这涉及到突变基因产物蛋白质的功能、结构稳定性和二维构像［30，31］。这样，通过基因突变及其对蛋白的影响无法预知XLA的病程、复杂程度、B细胞数量和免疫球蛋白的水平。只有彻底明确BTK在B细胞信号传导中的作用机制，才能找到基因突变和临床症状的相关性，完善XLA的基因诊断，并为治疗奠定理论基础［32］。1994年，国际上成立了BTK基因突变分析小组并建立了BTK基因突变数据库（http：//uta.fi/imt/bioinfo/btkbase/），为XLA的基因诊断提供了便利的条件。但是数据库中的病源主要来自西方国家、日本和俄罗斯，而国内的BTK基因研究相对处于空白阶段。因此，目前开展BTK基因突变的检测工作应成为国内同类研究的重点，通过建立有效可靠的BTK基因突变筛查方法，研究中国人BTK基因突变的规律。因此，随着对PID认识的深入和检测方法的简化，将会有更多的病例被确诊，不仅可以用常规方法治疗，而且可以做基因分析，同时，建立PID登记网络［33］，也将有助于了解确切的发病率和需要治疗的患者。总之，来自突变基因的BTK蛋白还没有被完全认识，在蛋白质水平这些突变的结果还不清楚。BTK基因突变在XLA发病机制中更详细作用还不清楚，但作为疾病基因，对其基因组结构的研究，将为未来的体细胞基因治疗创造条件。当然，体细胞治疗存在着一定的问题，目前还不能达到此目的，但这是今后研究的一个重要方向，基因治疗无疑是近20年来分子生物学和重组DNA技术迅速发展的一种结果。由于体内大剂量静脉丙种球蛋白的长期替代疗法有不少的副作用，且价格昂贵，不能根本解决问题。若能将缺陷的基因进行原位的修补，基因治疗将是最理想的根治方法。

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篇3

关键词：白菜型油菜；BraSDG2；RNA干扰；拟南芥；遗传转化

中图分类号：S634.301文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）10-0007-05

据估计，50%～70%的被子植物在其进化过程中至少经历过1次多倍化过程[1]，基因表达的变化在多倍体化过程中起着重要作用[2]。组蛋白甲基化修饰作为一种重要的表观遗传修饰，在参与重塑染色质结构与基因表达方面起到重要作用，其主要包括赖氨酸和精氨酸的甲基化[3]。组蛋白赖氨酸（K）甲基化修饰包括组蛋白H3的K4、K9、K27、K36和组蛋白H4的K20的单、双和三甲基化的修饰状态。组蛋白H3K4及H3K36的甲基化修饰被认为参与基因表达的激活，而H3K9、H3K27和H4K20的甲基化修饰则被认为与基因沉默及异染色质结构的维持相关[4]。

拟南芥SDG2编码一个包含2 335个氨基酸的蛋白质，其含有SET、Post-SET、GYF保守结构域，具有特异的H3K4me3甲基转移酶活性。SDG2突变后，拟南芥的育性完全丧失，50%的四分体包含小孢子的数量少于四个，且BT3、SPL、MS1、EDA31、MEE65等11个与雄配子发育相关基因的表达发生明显下调[5]。因此，SDG2介导的H3K4me3甲基转移酶活性影响着雄配子体的发育及植物育性。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）所介导的基因沉默现象，它在转录、转录后以及翻译水平上干扰基因的表达。RNAi技术是一种研究功能未知基因的有效方法。我们前期的研究表明，在二倍体的白菜型油菜中，BraSDG2具有2个拷贝，并具有不同的组织表达模式，这些结果暗示在基因多倍体化过程中组蛋白甲基转移酶基因的命运可能发生了明显分化[6]。本研究拟通过构建BraSDG2的RNA干扰载体，经浸花法转化哥伦比亚野生型拟南芥（Col-0），筛选BraSDG2基因沉默的稳定遗传的转基因拟南芥植株并观察其表型特征，为进一步研究白菜型油菜BraSDG2的生物学功能奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

白菜型油菜（Brassica rapa）B2；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α；根癌农杆菌GV3101；载体pMD19-T vector和pFGC5941（含PPT抗性）。以上试验材料均来自湖南农业大学植物发育与表观遗传调控实验室。

1.2试验方法

1.2.1白菜型油菜BraSDG2-RNAi片段的克隆从Tair与白菜基因组数据库BRAD收集拟南芥SDG2、白菜BraSDG2a和BraSDG2b CDS序列，经比对分析后选取一段258 bp的保守序列，命名为BraSDG2-RNAi。设计引物序列BraSDG2-RNAi F：5′-CCATGGTCTAGATTGGTGGGCTGCCAGATTG-3′（下划线分别表示NcoⅠ、XbaⅠ酶切位点）；BraSDG2-RNAi R：5′ -GGCGCGCCGGATCCGATCCCCAAACACACGTCTCATAAC-3′（下划线分别表示Asc Ⅰ、BamHⅠ酶切位点）。

高保真酶PCR扩增后获得RNA干扰目的片段，切胶回收后连接到pMD19-T载体上，命名为pMD19-T-BraSDG2-RNAi，将连接好的载体通过热激法转化至感受态大肠杆菌DH5α，挑选PCR检测为阳性的单菌落提取质粒测序。

1.2.2RNAi载体的构建使用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切载体pMD19-T-BraSDG2-RNAi和pFGC5941。将反向BraSDG2-RNAi片段导入终止子与CHSA intron之间，获得中间载体p-BraSDG2-RNAi；再通过AscⅠ和NcoⅠ对载体pMD19-T-BraSDG2-RNAi和p-BraSDG2-RNAi进行双酶切，将正向BraSDG2-RNAi片段导入35S启动子与CHSA intron之间，最终获得RNA干扰载体pFGC5941-BraSDG2-RNAi。对获得的RNA干扰载体进行酶切验证。

1.2.3拟南芥的遗传转化及筛选将pFGC5941-BraSDG2-RNAi导入到工程菌GV3101后，挑选阳性菌落用于拟南芥转化。通过浸花法将该重组质粒转化至野生型拟南芥（Col-0）中，采用浓度为100 mg/mL的PPT筛选T0代拟南芥转化子。设计检测引物35S825 F：5′-ATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTT-3′，Intron825 R：5′-TGAC-TCCATCTTATTCCCTCCGTTTC-3′，对获得的抗性苗进行PCR检测筛选转基因植株。

1.2.4转化子的表型观察将野生型、T3代和T4代（纯合体）转基因拟南芥种子经4℃春化2～3 d后，置于22℃长日照（16 h/8 h）条件下培养37 d，对其进行表型观察。

2结果与分析

2.1BraSDG2-RNAi片段的克隆

经序列比对，选取一段长度为258 bp的保守序列作为RNAi片段，命名为BraSDG2-RNAi，并成功克隆到该基因片段，见图1。将克隆的目的片段与pMD19-T载体连接并导入感受态工程菌DH5α中，选取编号为13和16的两个阳性单菌落（图2）送至公司测序。结果如图3所示，目的

片段与预期片段比对，序列基本一致（5个位点的差异是由于本实验室所提供的白菜型油菜品种与白菜基因组数据库品种有所差异导致）。

2.2BraSDG2干扰载体的构建

将BraSDG2-RNAi片段正反向插至目的载体pFGC5941上，结构如图4所示。通过酶切验证，确认BraSDG2 RNA干扰载体pFGC5941-BraSDG2-RNAi构建成功，酶切后的片段大小与预期一致，如图5所示。

2.3拟南芥的遗传转化

经浸花法将构建的重组质粒转化野生型拟南芥（Col-0），通过100 mg/mL PPT筛选得到抗性苗并进行PCR检测，扩增结果如图6所示。结果显示，获得了1株转基因植株。

2.4BraSDG2 RNAi转基因植株表型观察

在相同长日照条件下（16 h/8 h），对生长37 d的T3、T4代 BraSDG2 RNAi转基因拟南芥植株与Col-0进行观察。相比Col-0，T4代BraSDG2 RNAi转基因植株（纯合体）形态特征表现为植株矮小且出现败育现象（图7），其表型与拟南芥sdg2缺失突变体相近。

3讨论与结论

组蛋白赖氨酸甲基化修饰是一种重要的表观遗传学标记，其作用机理是通过特异的组蛋白赖氨酸甲基转移酶催化改变染色质结构，间接影响基因表达，在植物生长发育中起到重要的生物学作用。拟南芥核组蛋白的赖氨酸残基被甲基化常见的有4类， histoneH3lysine4（H3K4）、H3K9、H3K27、H3K36。现有研究的基因组规模分析的结果显示不同位点不同程度的甲基化会导致转录异常，从而影响基因的表达[7-15]。

研究表明，拟南芥的大多数基因都存在组蛋白甲基化现象，其中发挥重要作用的就是组蛋白赖氨酸甲基转移酶（histone lysine methyltransferase，HLMT），这是一类包含130～150个氨基酸保守 SET结构域的蛋白[16]，该保守结构域也是其发挥催化作用的活动中心。SDG蛋白家族都含有SET结构域，拟南芥SDG2功能表现为特异性地催化组蛋白，对H3K4位点造成双甲基化与三甲基化，从而调控相关基因表达[17]。

已有试验表明，对拟南芥SDG2进行RNAi，会导致植株弱小、叶片变小、根长变短、莲座叶数目变少。本研究通过序列比对获得白菜型油菜中与拟南芥SDG2同源的基因片段BraSDG2-RNAi，并构建BraSDG2 RNA干扰载体转化拟南芥，结果表明构建的载体可以有效干扰拟南芥SDG2基因的表达，BraSDG2 RNAi拟南芥转基因纯合植株表型与sdg2拟南芥突变体相似，都表现为植株矮小且育性极低，从而佐证了组蛋白甲基化转移酶SDG2同系物在植物中是高度保守的。有研究显示，拟南芥SDG2的缺失导致H3K4me3甲基转移酶在体内剧烈下降，突变体具有强烈的多向性的表型以及许多基因的错误调控，植株矮小和败育就是其中重要的表型[18]。本试验证明了白菜型油菜中SDG2的同系物BraSDG2可能对H3K4me3甲基转移酶具有相似的功能，该结果为进一步研究组蛋白甲基转移酶SDG家族的作用机制与白菜中BraSDG2的生物学功能奠定基础。

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篇4

［关键词］ 乳腺癌；甲基化;NDRG-1基因

［中图分类号］ R735 [文献标识码] A [文章编号] 1671-7562（2008）02-0079-05

The methylation status of CpG island in the promoter

region of NDRG-1 gene in breast cancer

WANG Li-wei1，ZHOU Dong-rui2，FANG Ru-jing2，ZAHNG Ren-min2，LU Zu-hong2，HE Jie1

（1.Department of Pathology,Zhongda Hospital,School of Clinical Medicine,Southeast University,Nanjing 210009,China;2.State Key Laboratory of Bioelectronics,Southeast University,Nanjing 210096,China)

Abstract:Objective To explore the correlations of methylation status in the promoter region of NDRG1 geneto carcinogenesis of breast cancer.Methods Microarray-based methylation analysis was used to detect the methylation status in the promoter region of NDRG1 gene in 33 pairs of breast cancer and corresponding normal tissues.Results The methylation level of CpG island in the promoter region of NDRG1 gene in breast cancer was higher than that in tissues adjacent（t=14.12，P

Key words:breast cancer;methylation;NDRG-1 gene

（Modern Medical Journal,2008,36:79-83）

NDRG-1基因（N-myc downstream regulated gene 1）又称Drg-1[1](differentiation related gene 1，分化相关基因)、RTP[2]（reducing agents and tunicamycin responsive protein，还原剂和衣霉素敏感蛋白）、Cap43[3](calcium activated protein 43，钙激活蛋白43)、Rit42[2]（reduced in tumor 42）和PROXY-1[4](protein regulated by OXYen-1，氧调节蛋白)。NDRG-1基因是近年来发现的与细胞分化相关的新基因，作为候选的抑癌基因，具有调控肿瘤细胞分化、抑制肿瘤细胞转移和生长的功能，并且能够在诱导分化剂作用下表达增加，NDRG-1基因与多种肿瘤的发生发展相关，如直结肠癌、乳腺癌、肝细胞癌等[5]。有研究表明，NDRG-1基因的表达与乳腺癌的转移呈负相关，它能抑制肿瘤细胞增殖、降低其侵袭能力，可作为一个候选的肿瘤抑制基因，并有望成为乳腺癌基因治疗新的候选基因[6]。目前更倾向于NDRG-1基因在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中表达下调，但仍需进一步研究得以证明。对于NDRG-1基因的可能调控机制主要有：DNA甲基化,PPARγ/ RXR 转录因子途径,Ca离子通道途径等。本实验采用双色荧光杂交微阵列基因芯片技术[7]对NDRG-1基因启动子区甲基化状态进行研究，探讨NDRG-1基因在乳腺癌和癌旁组织中甲基化程度是否存在差异，并进行定量检测，对NDRG-1基因的甲基化模式和程度进行研究。

1 材料与方法

1.1样本来源

收集东南大学附属中大医院2004年1月―2007年12月外科手术切除的乳腺癌标本33例，其中乳腺浸润性导管癌29例，乳腺导管内癌1例，乳腺导管原位癌1例，乳腺导管状癌合并黏液癌1例，乳腺黏液癌1例。组织学分级Ⅰ级14例，Ⅱ～Ⅲ级19例。33例乳腺癌患者均为女性，平均年龄52.3岁（39~81岁），采集肿瘤组织及其相应的肿瘤旁正常乳腺组织，-80℃保存。患者术前均未行化疗和放疗，所有标本均经病理学检查确诊。

1.2DNA提取

采用蛋白酶K及酚氯仿法抽提组织基因组DNA，正常对照标本取自健康正常人外周血作为未甲基化基因对照（阴性对照），正常健康人血细胞经过甲基转移酶M.SssI（New England Biolabs）作用，作为甲基化基因对照（阳性对照）,-20℃保存。

1.3亚硫酸氢盐处理

参照文献[7-9]，取1~2μg基因组DNA，加入5.5μl3mol•L-1NaOH，加水至55μl，42℃水浴变性30min，再加入520μl 新鲜配制的40.5%亚硫酸氢钠sodium bisulfite（pH=5）和30μl 0.5mmol•L-1的对苯二酚，混合充分后离心，再加入200μl石蜡油封层，50℃水浴16~18h。移去石蜡油，用Wizard DNA Clean-Up System（Promega Corporation）纯化DNA。纯化的DNA加入NaOH，使终浓度为0.3mol•L-1，室温放置5~10min。加入1/10体积的3mol•L-1乙酸钠和2.5体积的乙醇，-20℃沉淀5h，然后4℃下12000r•min-1离心30min。室温干燥后50μl灭菌双蒸水重新溶解DNA，-20℃保存。

1.4PCR扩增

为了能同时扩增甲基化和非甲基化DNA，设计的引物中不含有CpG位点。前引物PF-5′-GGTTTA GGGTGTGTTATAGTGTAATA-3′,后引物PR-5′-CCTA ACTCCAACCAACTCAAAAA-3′（扩增基因序列Genebank no：NC_000008.9，前引物位置为781-806，后引物位置为933-957）。PCR反应体系50μl，其中含10×buffer3μl，Mg2+1.8mmol•L-1，dNTPs200μmol•L-1，每条引物各1μl，模板DNA2μl，Taq DNA聚合酶2U。PTC-225 热循环仪（MJ Research）上进行PCR扩增：95℃预变性5min，然后95℃变性50s，59℃复性45s，72℃延伸45s，共35个循环，最后72℃再延伸5min。取 5μlPCR反应产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，Syngene公司凝胶成像系统下观察并记录图像。采用DNA纯化试剂盒（TAKARA）对PCR产物进行纯化，纯化后的DNA进行芯片点样。

1.5阴性阳性样本克隆与测序

正常人血液DNA扩增的阴性PCR产物和经过M.SssI处理DNA扩增阳性PCR产物割胶纯化（TAKARA），克隆到pMD18-T载体（TAKARA）中（根据pMD18-T载体说明书操作），分别挑取2个阴性和阳性克隆并测序（由上海英骏生物技术有限公司完成），测序正确的克隆提取质粒并保存于-20℃待用。

1.6 探针及丙烯酰胺标记引物合成

寡核苷酸探针由上海英骏生物技术有限公司合成并标记，PM1-3#是与甲基化的位点完全匹配的探针，标记为cy5；PU1-3#是与未甲基化的位点完全匹配的探针，标记为cy3。NDRG-1-P-L#是丙烯酰胺标记引物，由上海超世生物公司合成并标记，标记为Acrydite。见表1。

表1 探针与PCR扩增未经亚硫酸氢钠处理的原序列

1.7 芯片制备

将纯化后的PCR产物与丙烯酰胺、10％过硫酸胺和甘油等按照比例混合后，吸取20μl样本点至一块384孔板（AxyGen），准备机点或者手点。机点采用点样仪（CapitalBio SmartArrayerTM-48）将准备好的PCR产物点于处理好的玻片上，两个点圆心之间的距离为300~500μm。

1.8 杂交

取等量PM1-3#和PU1-3#混合，使得每种探针浓度为1pmol•L-1，再与杂交液（Telechem）1∶3混合。取25μl探针溶液均匀覆盖于玻片上面，加盖经离水处理的盖玻片，放入湿润密闭的杂交盒中，45℃、37℃各杂交1h。取出玻片，用70%甲酰胺70℃变性15min，变性电泳1h，在室温下用灭菌双蒸水反复清洗后氮气吹干玻片。

1.9 图像扫描与数据处理

杂交清洗后的玻片采用双色共聚焦扫描仪[CapitalBio LuxScanTM-10K（A），中国博奥]扫描，分别记录cy3和cy5滤片扫描的图像，采用Genepix Pro 3.0分析结果，记录每个点的荧光强度，最后将记录下来的数据用Microsoft Office Excel 2003统计并制表。统计分析用SPSS13.0软件，采用t检验，P

2 结 果

2.1 阳性克隆与阴性克隆测序结果

经过亚硫酸氢钠处理及PCR扩增序列中所有非CpG位点的胞嘧啶C均转变为胸腺嘧啶T，而引物区及非引物区的CpG位点均呈甲基化状态，胞嘧啶C保持不变。见图1。

A 纯阴性克隆模板反向测序结果

B 纯阳性克隆模板正向测序结果

图1 阳性与阴性样本克隆后测序结果

2.2 定量分析

阳性PCR产物和阴性PCR产物分别以阳性克隆和阴性克隆为模板进行PCR扩增，扩增出来的PCR产物经过样纯化后参比使用，每个混合物样本的DNA总浓度是一致的，而阳性PCR产物分别占0%，33.3%，50%，66.6%，100%，而阴性PCR产物分别占100%，66.6%，50%，33.3%，0%,扫描结果见图2。每样重复5次，杂交反应后分别用cy5标记和cy3标记扫描头扫描，计算双色荧光强度定量平均值，并以荧光强度为纵坐标，以混合物中阳性产物百分率为横坐标作图，可见cy5随着阳性片断浓度的增大而信号增强，cy3则随着阴性片断浓度的增大而信号增强（图3）。以cy5/（cy5+cy3）比值为纵坐标，混合物阳性产物百分率为横坐标作图，可得检测DNA甲基化水平的剂量反应曲线，可根据该曲线计算样本的甲基化水平，见图4。

从左至右阳性PCR产物分别为0%、33.3%、50%、66.6%、100%图2 阳性和阴性PCR产物参比后微阵列芯片扫描结果

图3 阳性和阴性PCR产物参比后微阵列芯片扫描荧光强度值对比图

图4 阳性和阴性PCR产物参比后微阵列芯片扫描cy5/（cy5+cy3）对比图

2.3 甲基化水平测定标准曲线建立

将上述数据做一定量曲线，定量曲线的横坐标为甲基化水平，纵坐标为cy5/（cy5+cy3）的比值，通过回归分析发现数据呈现较好的线性关系，决定系数为0.9485。见图5。

图5 甲基化水平定量分析标准曲线

2.4 样本甲基化水平测定

用双色荧光杂交基因芯片检测33对乳腺癌及癌旁组织样本，在一张芯片上点上一个阳性样本和一个阴性样本作为对照，每个样本重复5~8次。样本杂交结果见图6。肿瘤样本的荧光呈偏黄色，而对应的癌旁组织样本则呈绿色，表明癌旁的cy3的荧光强度更大，肿瘤样本的cy5荧光强度更大。根据样本芯片杂交荧光结果，计算cy5/(cy3+cy5)的比值，肿瘤样本cy5/(cy3+cy5)的比值均值为0.3041，而对应的癌旁组织样本的cy5/(cy3+cy5)的比值均值为0.1261。由甲基化水平定量分析标准曲线可得到相应的甲基化率，肿瘤样本组织中该检测CpG位点甲基化率为40.76%，而对应的癌旁样本组织中该检测CpG位点甲基化率为22.41%，差异有统计学意义（t=14.12，P

图6 乳腺癌标本和癌旁组织标本PCR产物微阵列芯片荧光结果图

3 讨 论

DNA甲基化与肿瘤的发生有着密切关系，它作为表观遗传学的一种调控机制是最早被人们发现的。肿瘤可发生许多种基因的异常甲基化，包括抑癌基因、DNA损伤修复基因及与肿瘤代谢和浸润相关的基因。DNA高甲基化，不仅可以直接或间接影响基因转录，也可导致CT突变；引起基因表达异常，导致细胞恶变，最终形成肿瘤[10-12]。

甲基化状态的改变可以导致基因结构和功能的异常，进而导致细胞发生癌变，最重要的甲基化碱基是胞嘧啶，通常发生在启动子区CpG岛区域。CpG岛甲基化可以抑制启动子序列的基因表达，DNA甲基化水平与肿瘤的生物学特性密切相关[13]。

Bandyopadhyay等[14]研究发现,在乳腺癌细胞中NDRG-1基因蛋白表达显著降低，特别是在存在淋巴结转移或者骨转移患者的乳腺癌细胞中，该基因蛋白表达明显比非转移乳腺癌细胞低。Wang等[6]的研究结果提示,NDRG-1基因的表达与乳腺癌的转移呈负相关，该基因可能成为早期预测乳腺癌转移的分子生物学标记物之一，可作为一个候选的肿瘤抑制基因，有望成为乳腺癌基因治疗新的候选基因。Kalaydjieva等[8]发现NDRG-1基因 5′端含有一个CpG岛，说明该基因的表达调控可能与DNA甲基化有关；Guan等[15]也发现DNA甲基化可能是该基因的调控途径之一；Bandyopadhyay等[14]用DNA甲基化抑制剂5′-氮杂2′-脱氧胞核苷（5-Azacytidine)作用于多种乳腺癌细胞株，发现可以明显增加该基因的表达，进一步说明该基因的低表达可能受DNA甲基化调控。

对于NDRG-1基因的启动子区甲基化状态研究，国内外尚无研究报道。本实验利用双色荧光杂交微阵列基因芯片技术对NDRG-1基因启动子区甲基化水平进行定量检测，发现CpG位点肿瘤组织和对应癌旁组织的甲基化率分别为40.76%和22.41%，差异有统计学意义。因此可以推测甲基化调控机制可能是NDRG-1基因的重要调控途径之一，从而与乳腺癌的发生相关。

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篇5

【关键词】 鼻咽癌;放射治疗;肿瘤干细胞

鼻咽癌是我国南方地区常见恶性肿瘤之一，以放射治疗为主，但疗效尚不理想，约55%的NPC在放疗后5年出现复发转移。其原因主要与NPC发病部位隐蔽、鼻咽部组织构成复杂，治疗方式较单一，且不同的NPC患者在病理类型、肿瘤分化程度、就诊时病变严重程度、临床表现、体质状况、对放化疗敏感性方面都存在着不同程度的差异有关。本文对影响NPC放疗敏感性的机制综述如下。

1 DNA损伤修复与NPC放疗后复发

1.1 DNA修复基因 放射可引起DNA链断裂和DNA-蛋白交联，最终导致细胞死亡。DNA的修复能力是影响细胞存活和死亡的原因之一。

hMSH2是被研究最多的错配修复系统基因之一。hMSH2蛋白参与组成hMutSα和hMutSβ二聚体，识别DNA复制中的错配碱基及插入缺失环，并与之结合，是完成DNA修复必需的组件之一[1，2]。范凯[3]等报道放射可以诱导鼻咽癌细胞hMSH2表达;hMSH2对放射造成的DNA损伤可能有修复作用。

MGMT基因主要修复由烷化剂等诱变剂造成的DNA损伤。DNA链的断裂是诱导MGMT表达的最终信号，电离和紫外线辐射可以诱导MGMT的表达。人类和鼠肝细胞以及肺、肾等组织在接受电离辐射后MGMT表达及酶活性增强，MGMT的这种改变发生在基因转录水平，并且与其启动子的激活有关。刘敏等[4]认为X射线照射可能诱导CNE细胞株MGMT基因的表达，参与细胞照射后DNA损伤修复过程。

DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)是哺乳动物细胞经照射后，参与DNA双链断裂(DSB)损伤修复主要的分子途径之一，是由Ku70、Ku80以及DNA-PKcs(DNA-PK的催化亚基)三亚基组成，其中Ku70、Ku80组成Ku蛋白调节亚基，在DSB修复中起着辨认、结合和排列DNA末端并招募催化亚基DNA-PKcs的作用。曲颂等[5]认为DNA-PKcs是决定鼻咽癌DNA-PK功能比较重要的亚基，其催化功能在射线照射后引起的DSB修复中发挥着较为重要的作用，调控着DNA-PK的活性，DNA-PKcs基因的表达与鼻咽癌细胞的放射敏感性有关。另有研究表明[6，7]，不同放射敏感性的细胞株CNE1(敏感性低)、CNE2(敏感性高)中Ku70、Ku80、DNA-PKcs的表达水平无明显差异，而在射线照射后三者的表达水平却明显升高，这表明Ku70、Ku80、DNA-PKcs在鼻咽癌的放射敏感性中起着重要的作用。

1.2 热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs) HSPs是一组具有重要生理功能的糖蛋白质，在体内可与多种蛋白形成复合体，参与蛋白质的折叠与伸展、多聚复合体的组装，发挥调节靶蛋白的作用，但又不改变靶蛋白的结构，又称为“分子伴侣”。根据其同源程度及分子量大小分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP等几个家族。HSP90、1HSP70在许多肿瘤中有表达。在放射适应性反应中，由蛋白质组成的DNA修复系统起着主要作用。近年研究发现HSPA8 heat shock 70kDa protein 8)与放射适应性反应关系密切。冯雪萍等[8]报道HSP90β和HSPA8 参与了细胞照射后DNA修复系统的构建，与放射耐受有一定的相关性，并推测HSPs可能与CNE1细胞株放射相对耐受有关。

gp96是存在于真核生物细胞内质网中的分子量约为96kD的热休克蛋白，属于HSP90家族。有研究表明[9]，基于gp96的免疫治疗可以提高放射治疗的功效。Chang等[10]实验发现用RNA干扰鼻咽癌放射抵抗细胞gp96基因的表达，能够使瘤细胞克隆形成能力减弱。据报道[11，12]，HSP90调节Akt激酶活性并且参与放射后DNA损伤修复。gp96作为HSP90家族成员之一，是否也通过影响Akt来发挥细胞保护作用和增强细胞生存能力，其机制还有待于进一步研究。

2 瘤细胞凋亡调节与NPC放疗后复发

2.1 p53基因 p53是一种凋亡抑制基因，在细胞周期的调控和诱导细胞凋亡中起重要作用。其编码蛋白可分为野生型蛋白(wtp53)和突变型蛋白(mtp53)。wtp53是体内重要的抑癌基因，它通过调节细胞周期和诱导细胞凋亡而发挥其抑癌的功能。当细胞发生DNA损伤时，wtp53蛋白的表达会急剧升高，导致细胞周期停滞在G1期来进行修复，使细胞恢复正常状态，重新进入细胞周期。若损伤无法修复，它可激活与DNA凋亡相关基因如bcl-1/bax、TNF-α、Fas等，启动细胞凋亡机制，使有癌变倾向的细胞失去活性从而起到抑癌的作用。多数学者认为由于mtp53干扰DNA受损细胞的G1期抑制，使其很快进入S期，另外增加了DNA修复酶的活性、提高DNA修复能力，因而抗拒放射线。

在NPC中，60%以上的NPC组织和几乎100%的NPC细胞株有p53蛋白过表达。p53蛋白过表达及其功能失活可能与一些EB病毒基因产物与wtp53蛋白稳定结合，使p53蛋白半衰期延长有关。叶伟军等[13]研究发现NPC中p53表达高者放射敏感性差。而石慧英等[14]研究结果表明NPC细胞中过表达的p53蛋白具有生物学功能，在放射诱导的NPC细胞损伤和凋亡中发挥重要作用，临床NPC病人对放疗抗拒可能与p53蛋白过表达无关。Agaoglu等[15]对97例NPC患者行免疫组织化学p53检测，发现p53表达与分期、总生存率、无病生存率无关。

2.2 bcl2基因 bcl2基因是目前发现的抗凋亡作用最强的基因之一，它通过抑制细胞凋亡而延长细胞存活。一般认为bcl2蛋白可能是作为抗氧化剂起作用，通过调整Ca2+转运而调节凋亡。大量研究表明，bcl-2蛋白的高表达会抑制放疗诱导的肿瘤细胞凋亡，而抑制bcl-2基因的表达可能会增加放射敏感性。Jayasurya[16]等认为bcl-2高表达与NPC放疗后局部复发存在相关性。Yu等[17]研究表明Bcl-2蛋白的高表达可以阻止放疗引起的细胞凋亡，降低鼻咽癌细胞对放疗的敏感性。张文玲等[18]利用免疫组化、原位杂交检测发现，Bcl-2在NPC放疗敏感组和放疗不敏感组比较有统计学差异，提示bcl-2参与了NPC的放疗耐受。而苏珊[19]等认为bcl-2可能未参与放射引起的NPC细胞株CNE-1及CNE-2的凋亡过程。

2.3 MDR1基因多态性，STR基因多态性 P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是由多药耐药基因(MDR1)编码的一种转运蛋白。P-gp可以稳定肿瘤细胞线粒体膜电位和线粒体膜通透性，抑制X射线的凋亡效应，从而递呈放射抵抗表型。迄今已发现MDR1基因有多个单核苷酸多态性，其中有21外显子G2677T(Ala893Ser)和26外显子C3435T(Ile1145Ile)及其单体型，可能与MDR1和P-gp的功能和表达密切相关。王等[20]发现MDR1G2677T和C3435T多态性可能是NPC放疗疗效的影响因素之一。

STR基因座由长度为1～6个碱基对的短串联重复序列组成[21]。这些重复序列广泛分布于人类基因组中并呈现高度多态性。串联重复序列可能影响染色质结构、基因活性的调控、DNA复制重组、细胞分裂周期及错配修复系统等。王旭丹等[22]研究表明，不同辐射抗拒鼻咽癌细胞株CNE-2和CNE-2R细胞的STR基因座表达存在量和质的差异，变异的STR基因座可能参与鼻咽癌细胞CNE-2辐射抗拒的诱导。至于这些串联重复序列如何影响NPC细胞辐射抗拒的确切机制有待进一步探讨。

2.4 放疗群集耐受性(multicellular resistance) 研究表明，实体瘤的放疗敏感性与单层培养的肿瘤细胞显著不同;在三维培养时，肿瘤细胞对细胞毒药物和放射线等治疗的耐受性比单层细胞明显增强，而与在体肿瘤相近，即群集耐受性。

整合素是重要的细胞黏附分子，介导细胞与细胞以及细胞与细胞外基质的黏附作用。αV整合素是肿瘤细胞形成三维结构的重要分子，抑制αV整合素的作用影响多细胞球(MCSs)的形成过程。栾巍等[23]研究表明，NPC中，较之单层细胞，MCSs的放射敏感性显著下降;2Gy的X射线照射后MCSs凋亡率上调亦不明显，体现了MCSs的群集耐受性。肿瘤多细胞球广泛而紧密的黏附是群集耐受的基础。实验中用单克隆抗体预先阻断αV整合素的作用后再照射，则MCSs的细胞存活率下降，放射敏感性提高，凋亡率也明显上调。栾巍等[24]用CNE-2Z多细胞球模拟实体瘤实验表明，SAPK/JNK信号通路短暂激活可能传递生存信号而在鼻咽癌放疗群集耐受中发挥作用，特异性阻断其信号传递上调MCSs凋亡率，这可能与促进caspase3蛋白表达有关。

3 肿瘤干细胞与NPC放疗后复发

TSC是一类具有永生或无限自我更新能力的细胞，它们的数目相对恒定，有强的迁徙、浸润和转移能力;具有多分化潜能，能分化为不同表型的肿瘤细胞;在发育期间能够通过对称性分裂以扩增数量，或者通过非对称性分裂进行自我更新和产生更多不同分化类型的祖细胞;这些细胞具有治疗抵抗特性，能够耐受传统的细胞毒化疗和放射治疗。许多学者认为，肿瘤复发、转移以及对治疗的耐受等均与TSC相关。

2007年，Wang等[25]从5个鼻咽癌细胞系CNE-1，CNE-2，SUNE-1，HONE-1，和C-666-1中分离出了具有干细胞表型特征的肿瘤细胞(SP细胞)，并且检测了从CNE-2细胞系中分离出的SP细胞的干细胞特性，结果表明SP细胞具有强的分裂增值能力、自我更新能力及分化潜能，并且具有对放疗和化疗的抵抗性。通过将SP细胞植入非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)体内，他们观察到SP细胞具有很强的成瘤能力。Wang等还发现SP细胞高表达角蛋白19，这很可能成为进一步研究鼻咽癌肿瘤干细胞的有用的分子标志。

肿瘤干细胞放射抗拒的机制可能与损伤DNA的修复，影响细胞周期调控、细胞凋亡、增殖等信号转导通路改变有关。Bao等[26]通过多种放射损伤标记例如DNA损伤修复、肿瘤细胞凋亡、γH2AX焦点形成等检测放射线处理后的变化，从而验证CD133+肿瘤干细胞表现出显著的放射抗拒。并且他们还发现胶质瘤干细胞在接受放射线处理后，有效激活了放射引起的DNA损伤信号通路，使得相关通路蛋白—ATM，Rad17，Chk1和Chk2磷酸化，通过给予检查点(Chk1和Chk2)激酶的特异性抑制剂能够逆转肿瘤干细胞放射抗拒。他们推断胶质瘤干细胞能够通过优先激活DNA损伤的应答，诱导细胞循环阻滞进而修复损伤的DNA，从而提高放射抗拒。神经肿瘤干细胞与正常神经干细胞有相类似的信号转导途径，如Wnt途径、Notch途径、Shh途径等[27]。这些信号转导途径在一些其他肿瘤干细胞中可以调节其放射敏感性。Chen等[28]在乳腺癌细胞中验证Wnt/β-catenin信号转导通路能够调节乳腺癌干细胞放射敏感性。Phillips等[29]研究了电离辐射是否直接干扰Notch-1信号通路，发现分次放射线处理激活Notch-1信号通路，将会引起乳腺癌干细胞的增加，引起放疗抗拒。Wang等[25]发现Shh信号转导通路能够调节鼻咽癌干细胞样细胞放射敏感性，经环王巴明(Cyclopamien)处理封闭该信号转导通路能够提高鼻咽癌干细胞样细胞放射敏感性。此外，肿瘤干细胞的放射敏感性除与其内在敏感性密切相关以外，其活体微环境也很可能正向或者负向调节其特性。

4 结 语

NPC放疗后复发涉及了多个基因的共同参与，它们之间的相互作用是NPC放疗后复发的基础。NPC放疗后复发的机制仍不清楚。随着基因组学和蛋白质组学方法的不断完善，建立恶性肿瘤发生和发展过程中基因表达谱和蛋白质表达谱，将使筛选出NPC放疗后复的相关分子成为可能。

NPC肿瘤干细胞研究对于探索NPC的发病机制、复发转移机制、判断预后以及探索新的治疗方法具有重要意义。针对肿瘤干细胞的治疗有望从根本上治疗肿瘤。通过调控肿瘤干细胞内重要基因表达而使其失去干细胞特性，研究肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞蛋白或基因表达的差异、信号转导通路的差异、表面标志的差异，选择性地对这些细胞进行干预，可为NPC的治疗开辟新的途径。NPC肿瘤干细胞研究还处于起步阶段，这些细胞数量少，且其信号转导通路及表面标志与正常成体干细胞有较多的共性，缺乏特异标志进行区分。这些都为选择性杀灭肿瘤干细胞提出难题。这些细胞保持长期自我更新的机制、对称分裂及非对称分裂方式的调控机制均有待进一步研究。

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