缺失的遗传学效应范文

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缺失的遗传学效应

篇1

关键词：异常孕产史染色体核型分析

中图分类号：R596 文献标识码：B 文章编号：1004-7484（2011）06-0040-02

异常孕产史包括自然流产、死胎、死产、曾育畸形儿等，随着细胞遗传学研究的深入发展，发现染色体异常是重要原因之一。为探讨染色体异常与异常孕产史的关系，本文对723对具有上述病史的夫妇进行了细胞遗传学检查，现将结果报告如下：

1 资料方法

1.1病例资料

从2005年4月~2011年1月，因有自然流产、死胎、畸胎和新生儿死亡等异常孕产史在我院就诊的723对夫妇，其表型、智力均正常，行外周血染色体核型分析。女性年龄21~39岁，男性年龄23~42岁。

1.2染色体检查方法

采用常规外周血染色体检查方法，镜下每例计数30个分裂相，应用染色体自动分析仪（CIARS1.0）分析染色体G显带核型5个，有异常则增加计数和分析数量，必要时加C带处理分析。

2 结果

723对夫妇中，检出染色体异常核型28例，异常检出率1.94%，其中男性10例，女性18例。常染色体结构异常28例，其中相互易位23例，罗伯逊易位5例，倒位1例，无常染色数目异常，异常染色体核型与不良孕产史情况见表1。常染色体异染色质多态性变异136例，性染色体异染色质多态性变异27例。异染色质多态性变异情况见表2。

表1 28例染色体异常核型及主要临床表现

类别异常核型例数主要表现

相互

易位 46,XY,t(4;7)(q33;q22) 1 配偶流产2次

46,XY,t(1;7)(q32;q32) 1 配偶流产4次

46,XX,t(3;16)(q21;q22) 1 流产3次

46,XX,t(2;21)(q31;q22) 1 流产1次

46,XX,t(5;6)(q11;q23) 1 胎儿脊椎裂1次，死胎1次

46,XY,t(11;20)(q23;q13) 1 配偶流产3次

46,XX,t(2;11)(q14;q23) 1 流产4次，母亲流产10次

46,XX,t(7;13)(q22;q21) 1 流产3次

46,XX,t(3;5)(q13;q15) 1 流产2次

46,XX,t(5;6)(q12;q26) 1 流产2次

46,XY,t(10;22)(q11;q11) 1 配偶流产2次

46,XY,t(10;18)(p11;p11) 1 配偶流产4次

46,XX,t(13;20)(q21;q12) 1 流产3次

46,XY,t(8;16)(q24;p13) 1 配偶流产2次

46,XY,t(1;3)(q22;q22) 1 配偶流产3次

46,XX,t(3;8) 1 流产5次

46,XX,t(10;13) 1 流产2次

46,XX,t(3;11) 1 配偶流产2次

46,XY,t(1;14) 1 配偶流产3次

46,XY,t(1;18) 1 胎儿脑积水1次，死胎1次

46,XY,t(5;6) 1 配偶流产2次

46,XX,t(4;15) 1 流产4次

罗伯逊易位 45,XX,rob(13;14) 3 各流产2次

45,XX,rob(14;21) 1 流产1次

45,XX,rob(14;22) 3 流产3次

倒位 46,XX,inv(10) 1 流产3次

表2 163例异染色质多态性变异情况

核型例数

常染色体多态 46,XX/46,XY,1qh+ 50

46,XX/46,XY,15p+ 13

46,XX/46,XY,inv(9) 13

46,XX/46,XY,22S+ 11

46,XX/46,XY,16qh+ 9

46,XX/46,XY,14s+ 7

46,XX/46,XY,21s+ 7

46,XX/46,XY,9qh+ 6

46,XX/46,XY,15s+ 6

46,XX/46,XY,13s+ 6

46,XX,14p+ 2

46,XX/46,XY,21p+ 2

46,XY,13p+ 1

性染色体多态 46,XY,Yq+ 23

46,XY,Yq- 4

3 讨论

本文对723对异常孕产史夫妇的外周血染色体检查中检出染色体异常核型28例，染色体多态163例，总检出率13.3%，略高于文献报道的55%―6%的发生率，结果表明，染色体异常是异常孕产史的重要细胞遗传学因素。染色体结构异常中平衡易位是不良孕产史夫妇中最常见的染色体异常，是两条染色体同时断裂后，两个断片相互交换位置后重接，而形成两条衍生染色体。染色体平衡易位携带者的异常核型可以由父母遗传而来，也可以在配子形成过程中或胚胎早期卵裂时，发生新的突变。染色体发生易位后，一般没有遗传物质的丢失，所以平衡易位携带者表型大多正常，但会影响生育。相互易位携带者生殖细胞形成正常配子仅占有1/18，与亲代一样带有相互易位染色体的配子占1/18，而16/18的配子有染色体部分重复或缺失，即遗传物质不平衡。与正常人婚配，16/18几率的胚胎在临床上表现为早期流产、胎死宫内或生育染色体异常后代。罗伯逊易位的平衡易位携带者，其胎儿只有1/6的可能为正常儿，1/6的可能为平衡易位携带者，其余的为胎儿死亡或先天畸形儿[1]。

倒位是一条染色体发生2次断裂，其中间片段倒转1800后又重新接上。这种倒位携带者无遗传物质的丢失，故表型正常，但在生育下一代时理论上可形成4种结果：一种正常，一种倒位携带者，另两种因染色体片段部分重复和缺失最终导致流产、死胎、畸形。倒位片段占所在染色体的比例不同，其遗传效应不同，而遗传效应主要决定于重复和缺失片段的长短。一般来说，倒位片段越短，其重复和缺失的部分越长，形成配子和合子正常发育的可能性越小，临床表现为婚后不育、早期流产和死产的比例越高，娩出子女的可能性相对低；而倒位片段越长，则其重复和缺失部分越短，其配子和合子正常发育的可能性越大，娩出畸形胎儿的危险性相对较高[2]。

染色体多态性在人群中普遍存在，是指表型正常个体的染色体上的微小变异[3] ，表现为Y染色体长臂变异，D/G组染色体短臂变异，1，9，16号染色体的次缢痕的变异以及9号染色体臂间倒位等变异现象。以往多认为无临床效应，现今对其研究较多。大Y染色体与胎儿发育异常、流产之间有着某种联系，可能是Y染色体异染色质区DNA过度重复影响生殖细胞在减数分裂时染色体配对联会，使受精卵细胞分裂、分化异常，从而导致胎停育、缺陷儿出生[4]。小Y是由于Y异染色质部分或完全丢失，导致常染色质排列松散，结果造成其基因功能丧失和生成异常；还有研究认为是Y染色质排列过度紧密影响其基因功能发挥。D/G组染色体随体的结构、功能及变异均有可能在染色体不分离及三体的形成中起重要作用，发生机制可能是影响患者生殖细胞的分裂[5]。染色体的次缢痕异染色质区是易发和诱发断裂的部位，由于增加或减少的是异染色质，故对个体本身表型影响不明显，但减数分裂时可能引起其他染色体不分离导致胎儿染色体异常而流产。9号染色体臂间倒位，不能视为正常多态，应该引起高度重视。对在临床上检出的染色体臂间倒位携带者再次妊娠时应做好产前诊断，指导其生育，避免畸形儿的出生[6]。因此对异常孕产史的夫妇除做常规检查外，还要进行细胞遗传学检查，以得出明确的遗传学诊断，从而避免盲目治疗，进行正确的婚育指导。

参考文献

[1] 余云勋,马旭,余国斌.中国遗传咨询[M].合肥:安徽科学技术出版社,2003,142-147.

[2] 刘权章.遗传咨询[M].哈尔滨:黑龙江科学技术出版社,1999,63-64.

[3] 刘权章.临床遗传学彩色图谱[M].北京:人民卫生出版社,2006,59-62.

[4] 黄海燕,张香改,高羽,等.117例大小Y染色体临床意义分析[J].中国计划生育学杂志,2007,(2):106-107.

篇2

【关键词】不育症；男性； Y染色体； AZF；无症；少症

已婚育龄夫妇不孕症的发病率高达10%~15%，其中男性不育约占40%，特发性无症和严重少是男性不育的主要类型。引起无或严重少的原因极其复杂，遗传缺陷是其中的重要原因之一。男性无和严重少患者除染色体异常外，Y染色体长臂有控制生成的无因子（Azoospermia factor，AZF），这一区域的基因微缺失与无和严重少密切相关。我们通过对无症和严重少患者外周血染色体和Y染色体上AZF缺失的检测，探讨了引起无和少的遗传因素和AZF缺失与表型效应的关系，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

来自我院不育门诊就诊的男性不育患者。根据世界卫生组织标准进行常规分析、果糖测定、脱落细胞学检查等，并排除继发感染、输精管缺如、其它外伤等病症，经确诊为无或严重少病例作为研究对象。无症140例，严重少患者80例。按设计表格逐一填写个人一般状况、个人发育史、生育史、既往病史、体格检查等情况。无症和严重少病例年龄22~40岁，平均29.03±3.35岁。以我院优生门诊和沈阳市第一医院妇产科有正常生育史患者的丈夫30例为对照组，以10例正常女性为阴性对照组，年龄24~35岁，平均28.12±2.83岁。

1.2 方法

1.2.1 分析

根据世界卫生组织评估标准，每例患者重复两次以上检测，留取标本前应禁欲3~5天。无患者，经连续三次分析，并经离心沉淀均无者确诊为无症，并排除继发感染、输精管缺如、其它外伤等病症。密度低于5×106/ml为严重少症。

1.2.2 激素测定

采用SEROZYME I 磁分离酶联免疫测试仪（瑞士）测定血清中卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、睾酮（T）激素，试剂为SEROZYME专用进口试剂。

1.2.3 染色体检查

采用本室常规外周血染色体检查方法，镜下每例计数30个分裂相，G染色体显带核型分析5个。

1.2.4 Y染色体上缺失基因检测

1.2.4.1 无基因引物

根据文献资料，在Y染色体长臂5~6区30个基因片段位点分别选择了引物AZFa区sY84、sY86，AZFb区sY102、sY134，AZFc区sY147、sY153、sY157和RBM，引物由中国科学院微生物研究所合成。它们的PCR扩增产物DNA长度分别为326bp、320bp、218bp、301bp、100bp、139bp、285bp 和825bp。

1.2.4.2 PCR反应检测分析 1）标本DNA提取：采集患者外周血3ml，肝素抗凝，3000 rpm离心20min，取白细胞层加入等量的裂解缓冲液，充分混悬。15000rpm离心3min，去上清，沉淀加入1ml裂解液，重复1~2次，常规法提取DNA备用。

2）反应条件：25μl反应体系100 μl 10×缓冲液（10mM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl2），8μl dNTP混合物（每种核苷酸12.5mM），DNA聚合酶8μl（5UI/μl ），引物浓度按每反应体系50pmol加入超纯水295μl；混合后分装每反应管22μl，加入模板DNA3μl 。在PE480PCR扩增仪进行基因扩增。94℃预变性5min，94℃30sec，54℃45sec，65℃120sec，共完成45个循环，最后65℃5min延伸，PCR扩增产物置4℃冰箱中储存。3)产物检测分析：

每PCR反应管中加入载样缓冲液3μl，吸取10μl加样,用3%琼脂糖凝胶（含0.5μg /ml，溴化乙啶）电泳，电压8伏/cm，在紫外透射仪下观察结果。

2 结果

2.1 染色体分析

在140例无患者中，发现19例患者染色体异常，异常率为13.57%，其中47，XXY14例，46，XY，del（Yq12）2例，46，XY，del（Yq）1例，46，XY，inv（9）2例。此外还发现4例患者Y染色体长臂明显增大。80例严重少患者中未发现有染色体异常。

2.2 无基因检测

2.2.1 在140例无患者中，除14例47，XXY患者未做无基因检查外，其余全部进行8个基因位点的无基因测定。结果表明，有21例患者有AZF基因缺失，总缺失率为20.31%。其中2例sY84缺失，3例sY86缺失， 5例sY102缺失，6例sY134缺失、6例sY147缺失，15例sY153缺失，16例sY157缺失，4例RBM缺失。缺失率分别为1.59%、2.38%、3.79%、4.76%、4.76%、11.90%、12.70%和3.17%。AZFa、AZFb、AZFc、RBM缺失率分别为2.38%、4.76%、16.67%、3.17%。有3例同时存在AZFa、AZFb、AZFc缺失，有3例同时存在AZFb、AZFc缺失，15例为单纯AZFc缺失，RBM基因缺失同时伴AZFc缺失。

2.2.2 在80例严重少患者中，有14例患者有AZF基因缺失，总缺失率为17.50%。其中AZFb区域1例sY102和sY134缺失，AZFc区域5例sY147缺失、11例sY153缺失、12例sY157缺失，1例RBM缺失。缺失率分别为1.25%、1.25%、7.50%、13.75%、15.00%、2.50%。未发现AZFa区域的sY84和sY86s缺失，AZFb和AZFc的基因片段缺失率分别为1.25%和17.50%。

2.2.3 30例正常对照组未发现8种基因片段缺失；10例女性对照，8种引物未扩增出产物。

2.3 无症患者精浆脱落细胞检查

在126例无症患者中，有23例患者检查到有生精细胞，103例未见到生精细胞，21例AZF缺失患者中有4例中有生精细胞，占19.05%；105例无AZF缺失患者中有19例中有生精细胞，占18.09%。两者无显著差异（P＞0.05）。见表1。

2.4 睾酮、黄体生成素、促卵泡刺激素水平

患者血清中T、LH、FSH激素平均浓度均在正常范围，无症患者血清中T、LH、FSH分别为（4.11±1.05）ng/ml、（9.91±6.23）mIU/ml、（10.27±8.25）mIU/ml；严重少症患者血清中分别为（6.48±2.26）ng/ml、（10.45±5.61）mIU/ml 、（15.02±11.23）mIU/ml；AZF缺失患者分别为（5.04±1.34）ng/ml、（11.21±6.81）mIU/ml、（10.52±8.47）mIU/ml。除无症T浓度明显低于严重少症（P

3 讨论

引起无和严重少的原因很多，遗传物质改变是其中主要因素，其中染色体异常约10%~15%，主要以47，XXY占绝大多数，还有一些结构异常，包括常染色体和性染色体。但是，性染色体数目异常和Y染色体与常染色体易位均表现有第二性征改变，常染色体和Y染色体部分缺失、增加一般副性征正常。本文无患者染色体异常发生频率为13.57%，与文献报道[1]相吻合。

自从Tiepolo[2]等人首次发现Y染色体长臂荧光区缺失的病人生成障碍后，一些学者对AZF的基因定位、构成和遗传效应进行了大量的研究。Vergnaud[3]应用Y染色体DNA探针建立了人类Y染色体基因图谱，将Y染色体分为7个区，长臂为5、6、7区。Ma[4]对50例无症和严重少症缺失部分进行DNA探针筛查时发现4例6区缺失，且不重叠，揭示AZF是一个基因家族。并首先提出RBM（最初称YRRM）是无生成基因的候选基因。Vogt等[5]证实无因子（AZF）位于Yq11的第5、6区，这两个区域有较多的控制发生的基因片段，分为AZFa、AZFb、AZFc三个区。目前资料报道，在无症和严重少症的患者中，有AZF缺失的约占3%~29%，它是染色体异常导致的无以外的第二个重要因素。

在我们的研究中，126例无症有21例患者有AZF基因缺失，以AZFc缺失最多，缺失率高达16.67%。AZFa、AZFb、RBM缺失率较低，而且均伴有AZFc缺失。80例严重少患者中有14例患者有AZF基因缺失，主要以AZFc缺失为主，缺失率为17.50%，AZFb基因片段缺失仅为1.25%，而且未发现AZFa区域缺失。所以，Yq11的AZFb、AZFc区域的微基因缺失是引起无和严重少的主要原因。此外，我们的研究发现无症和严重少症中多数病例同时微缺失2个以上基因片段，说明AZF是个多基因的大家族，有许多不育基因与之有关。以往报道RBM基因族是无和严重少精的主要候选基因，RBM在AZFb区内，它的缺失对发生有影响。我们的结果是无中RBM缺失率仅占3.17%，而且，同时伴有AZFc缺失。本研究AZFa缺失很少，与以前报道的无与AZFa缺失有关不大一致，而主要是AZFc缺失,尽管我们对这个区域检测的数量有限，但也提示AZFc区域的缺失导致生精障碍要比AZFb和AZFa区域缺失更常见，也有类似文献报道[6]。

文献资料表明[7]，睾酮是间质Leydig细胞产生的，除维持男性第二性征和的作用外，睾酮分泌减少将导致发生减缓。FSH主要促进生成和成熟，在青春期FSH可促进重量增加和曲细精管直径增大。LH可刺激Leyig细胞合成和分泌睾酮，并将睾酮直接通过间质细胞作用于生精上皮细胞。我们对患者血清中激素水平测定结果表明，除无症睾酮明显低于严重少患者外，无、少和基因缺失患者的LH、FSH等激素水平均没有明显差异，没有发现基因缺失与激素变化的关系。

Vogt[5]等并通过病人的组织分析发现，AZF基因缺失在同一区域，发生受阻也在同一时期。AZFb缺失表现为生殖细胞成熟障碍，内只见精原细胞和初级精母细胞，中无。AZFc的表现有两种，可见精原、精母、精细胞、；仅见支持细胞，数量减少。我们对126例无患者进行脱落细胞检查，发现仅有23例患者检查到有生精细胞，103例未见到生精细胞，而且AZF缺失患者中有生精细胞人数和无AZF缺失患者中有生精细胞人数两者无显著差异。因此，AZF微缺失与无或少患者的表型效应关系需进一步探讨。

我们的研究支持AZF区域微缺失与无之间有着因果关系，尤其是AZFc区的缺失的报道[8]。但是，大部分生成障碍尚未检查出原因，可能受Yq11缺失多个基因位点影响，我们仅检测了部分基因片段。此外，AZF的点突变也可能对生成有影响。因此，有关生成基因的课题尚待深入研究。鉴于染色体异常和AZF微缺失与无、少关系密切，遗传学检查对男性不育患者的病因诊断有着重要价值。

参考文献

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2 Tiepolo L & Zuffardi O. Location of factors conrtolling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm[J]. Hum Genet,1976, 34:119.

3 Henegariu O, Hirschmann P , Kilian K , et al. Rappid screening of the Y chromosome in idiopathic sterle men,diagnostic for deletions in AZF ,a genetic Y factor expressed during spermatogenesis[J]. Andrologia ,1994,26:97.

4 Ma K, Inglis JD & Sharkey A .A Y .chromosome gene family with RNA-binding protein homology:candidates for the azoospermia factor AZF contrlling spermatogenesis[J]. Cell,1993,75:1287.

5 Vogt PH, Edelman A , Kirsch S, et al. Human Y-chromosome azoospermia factor (AZF) mapped to different subregions in Yq11[J]. Hum Mol Genet, 1996, 5:933.

6 Yao G, Chen G, Pan T. Study of microdeletions in the Y chromosome of infertile men with idiopathic oligo- or azoospermia[J]. J Assist Reprod Genet , 2001,18(11):612.

7 黄宇烽,许瑞吉.男科诊断学[M].上海：第二军医大学出版社,1999，388.

篇3

关键词：医学遗传学；教学方法；思维能力

中图分类号：G642.1 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2013）42-0129-02

医学遗传学是遗传学与医学相结合的一门边缘学科。随着现代生物学和现代遗传学研究的发展，医学遗传学成为医学教育中的一门重要基础课程，是基础医学与临床医学之间的桥梁课程。医学遗传学的研究对象是人类。人类遗传学探讨人类正常性状与病理性状的遗传现象及其物质基础。而医学遗传学则主要研究人类（包括个体和群体）病理性状的遗传规律及其物质基础。医学遗传学通过研究人类疾病的发生发展与遗传因素的关系，提供诊断、预防和治疗遗传病和与遗传有关疾病的科学根据及手段，从而对改善人类健康素质作出贡献。[1]笔者经过教学实践，切身体会到，在医学遗传学教学中注重以下几个方面的问题，可以取得较为理想的教学效果。

一、巧用启发式教学，激发学生学习兴趣

在讲授中多提几个“为什么”，往往能很好地开发学生的思维层次，当学生对这些问题产生兴趣时，就会孜孜以求，全神贯注。

例如在讲遗传学绪论部分时，告诉同学在高考之前都要进行常规色盲的检测，并出示幻灯片让学生观看，学生会看到一个色盲检测的卡片动态图，然后提出问题：“为什么高考的时候要做色盲测试呢？你们能辨认出色盲检测卡片的数字吗？色盲是否是遗传病？色盲的致病基因是显性还是隐性呢？色盲的致病基因是位于常染色体还是性染色体呢？”这一有趣的现象马上会激起学生的兴趣，这时告诉学生，解决问题的答案在本次课的讲授内容，当然学生在以后的听讲中学习的主动性就会提高起来。又如在讲授多基因遗传与多基因病这一章节时，理论性较强，比较枯燥，学生往往觉得索然寡味，笔者结合新闻媒体及报纸上关于高血压、糖尿病的发病率逐年上升而且年轻化的趋势事件的报道，以及生活中经常见到痤疮、小儿肥胖等症状，然后质疑：“为什么我国高血压、糖尿病发病率比较高？这些疾病是由单个基因控制还是多个基因控制？会不会受到后天环境因素的限制？父母患此类疾病，子病风险如何？”学生往往对日常生活中出现的这一现象会满怀兴趣，这样再介绍多基因遗传与多基因病的概念，多基因遗传特点，多基因病的遗传特点，多基因病发病风险的估计时，学生的学习积极性就被充分调动起来，能更加透彻地理解所学的知识，加深印象。在近几年教学实践中，我体会到精选一些有趣的问题，可以很好地激发起学生对医学遗传学的兴趣和学习的能动性，使学生从“要我学”转变为“我要学”，不再认为学习是一种负担。

二、在教学中注重学生思维能力的培养

学习知识的目的在于应用。在教学中教师不仅要教给学生知识，更重要的是要让学生运用正确的思维方法去分析问题，解决问题，使知识和能力得到同步提高，这将有利于学生理解和了解遗传学的基本概念和基本内容，培养学生的科学思维方法。[2]（1）培养学生的对照和比较能力。对相似又有联系而又不完全相同的概念我们可以进行比较，找出他们的异同点，以澄清易混淆的概念，寻求概念的联系和对相关概念的加强。如在不规则显性遗传中出现的表现度和外显率这两个概念，学生往往容易混淆，首先外显率是指一定基因型个体形成一定表型的百分率。即某一显性基因在杂合状态下或纯合隐性基因在一群体中得以表现的百分比；群体中如带有某一致病基因的个体100%发病称完全外显，外显率低于100%时，为不完全外显或外显不全。而表现度是指一定基因型所形成表型缺陷的严重程度。表现度不一致是指具有同样基因型的个体，其表型缺陷严重程度有差异。如成骨不全患者家系中，有的患者仅有蓝色巩膜或骨折，有的有蓝色巩膜和骨折，有的有蓝色巩膜、骨折和耳聋。所以表现度要说明的是在致病基因已经表达的前提下表现的程度如何，是属于“量”的问题；外显率阐明基因表达与否，是属于“质”的问题。通过这种比较就找出了两者的区别，抓住了各自的特点。（2）培养学生的分析综合能力。全面分析综合是把事物各部分、各特性结合成一个整体，有利于对知识的理解以及复结。如染色体畸变根据畸变的类型不同，可分为两大类即数目畸变与结构畸变，又可根据其特点对其进一步细分，引导学生找出它们的区别，作出图表（图1），在对知识的掌握以及以后的复习中就可以一目了然。（3）抓内因与外因关系，培养学生的科学思维能力。事物的发展是由内外因共同作用形成的，内因是根本，外因是条件。内因决定着事物的根本属性，外因推动发展。任何孤立内外因的关系的说法都是错误的。利用内因与外因的关系有利于学生理解和了解遗传学的基本概念和基本内容。我们知道多基因遗传是指一种遗传性状或遗传病受两对或两对以上基因的控制，每对基因彼此间没有显性和隐性的关系，每对基因对表型的效应都很小，但是各对基因的作用有积累效应，但是多基因性状或遗传病的形成除受微效基因影响外，也受环境因素的影响，所以这种遗传方式称为多基因遗传或多因子遗传，又称复杂疾病。其中的决定遗传形状的多对微效基因也是我们所理解的内因，起着关键性的作用，而其中的环境因素也就是我们所理解的外因，则起着条件性的作用。这样对多基因病的理解就更深入透彻。总之，启发学生用正确的思维方法来学习，可以提高教学效率，事半功倍。

三、注重多媒体教学与传统教学的结合

随着多媒体技术的日渐成熟，多媒体的传播技术已进入千家万户。这使得学校里一只粉笔，一张嘴的传统教学手段显得落伍了，多媒体课件应运而生。[3]如在讲授医学遗传学的21三体综合征这一章节时，在放映患儿图片的同时附有视频资料，就能增强学生对该遗传病的感性认识，帮助学生理解和掌握，还可以为学生以后在临床上进行遗传病的诊断打下基础，并由此引发学生的兴趣，充分调动他们学习的主动性和积极性。计算机辅助教学系统已成为高校教学改革的热点。尽管多媒体技术作为现代教学的重要手段正以它的优势挑战传统的教学模式。但在使用多媒体的同时不应忽略传统的教学手段，应使两者相辅相成，取长补短，达到教学过程的最优化。传统教学方式有着悠久的历史和丰富的经验，尤其是其以人为本的教学理念正是现代机器的盲点。教师在黑板上边写、边画、边讲解，某些公式和定理的推导过程、某些经典题目的解题过程，甚至可以把解决此问题时的思路和争论融会在讲解中，这样才会引出学生对知识的兴趣，才会将所学的知识消化、理解。教学效果会好得多。如在讲授两种单基因病的致病基因位于同一对同源染色体上的传递规律这一章节时。课本常通过举例计算子病风险情况。以往教师主要对着多媒体课件来进行讲解，往往是老师已讲述很多遍，而学生仍未理解。现在通过教师亲自板书演示整个演算推理的过程使其生动的展现在学生面前，再附以讲解，就迅速地拉近了多媒体课件与学生之间的距离，使他们有了身临其境的感受，情绪被充分地调动起来，从而增强了学生对两种单基因性状的独立与联合传递规律及发病风险的认识，学习兴趣和积极性也被激发起来。多媒体教学和传统板书的联合应用，使得课堂教学形象化、生动化，提高了学生的学习兴趣，学生对课堂所授内容的掌握率也大大提高。

四、注重将遗传学的基础理论与疾病案例相联系

医学遗传学授课始终强调以疾病为中心，以遗传为基础，深刻理解遗传与疾病的内在联系。[4]因此在各类遗传病教学时，引入临床真实病例，不仅激发了学生学习兴趣，而且使学生在分析讨论过程中理解和巩固基本概念、基础理论，加深对疾病本质的认识。例如，我们在讲授常染色体以及性染色体遗传病时选取大量的真实病例，在课堂上引导学生逐步分析家系信息，使学生理解和掌握典型遗传方式和延迟显性、遗传印记、早现遗传等特殊现象。结合本教研室老教师多年收集积累的病案多媒体素材，包括遗传性震颤、遗传性共济失调、舞蹈病、进行性肌营养不良、结肠息肉、18三体、猫叫综合征、唐氏综合征等多媒体，图文并用，加大了课堂信息量，增加了直观性。通过这种方式的教学，课堂教学质量高，教学效果明显，得到学生好评。

五、以教学带科研，科研促教学，教学科研互进

“在教学中研究”，更应该“在研究中教学”。[5]作为医学遗传学的一线高校教师，面对教学与科研的双重任务。应该明确其中教学是最主要的任务，科研是为教学服务的任务。如果把科研理解为简简单单写几篇论文那还是肤浅的，教师只有针对教学实际问题而有所选择地学习教育理论，且将自己的领悟应用于教学实践中，自己的科研才能表现出其价值。脱离教学的科研是没有生命力的。为此我时时将自己的科研成果渗透在教学中，具体我是这样做的：首先，我在课堂教学中既讲述前人的论述，也介绍自己在科研中形成的观点。这样，缩短了教师、教材、学生之间的距离，有利于激发学生的学习兴趣，启发学生独立思维、培养学生分析能力与创新精神。其次，从自己的研究体会出发，引导学生进行相关课题研究。训练学生做一个有心人，懂得如何围绕选定的专题系统地收集、整理资料。比如讲到单基因与多基因遗传病时，我就向学生详细阐述了基因治疗的研究思路，例如血友病系X连锁隐性遗传病，通过转基因的方法使患者持续表达缺失的凝血因子，那么患者的症状就会明显改善。又如，糖尿病属于多基因遗传病，通常是由于患者体内胰岛素含量绝对或者相对不足，疾病发展到后期，最终常需要借助于胰岛素治疗，而目前的干细胞与基因治疗的结合使得糖尿病的根治成为可能，尽管目前还处于临床前期的研究阶段。

医学遗传学发展很快，新内容不断增加。因此，教师既要把握好教学大纲所要求的基础知识、基本理论的教学，同时又要引导学生了解学科进展，培养医学生能准确有效地分析、诊断遗传病的能力和较强的遗传优生咨询能力，因此教学中渗透现代教学理念，把传统的以教师为中心的指令性课堂向以学生为主体的非指令性课堂转换，把教师从单纯传授知识向培养学生学习能力转换，加强与临床病例的联系，提高学生的医学遗传学素养，培养出高质量的医学生，以崭新的知识体系适应分子医学的时代。[6，7]

参考文献：

[1]蔡丽琼.浅谈医学遗传学教学的体会[J].安徽医药，2007，11，（7）：671-672.

[2]姜泽群，赵凤鸣，詹秀琴，等.医学遗传学教学改革探索[J].中华医学教育探索杂志，2012，11，（9）：937-939.

[3]曾新.医学遗传学教学实践与课程建设[J].中国高等医学教育，2005，6：55-56.

[4]张成宁，俞萍，祁鸣，等.医学遗传学课程建设浅析[J].中国高等医学教育，2007，1：18-19.

[5]彭翠英，刘俊，.医学遗传学课程教学的思考[J].西北医学教育，2012，20，（4）：739-741.

[6]刘鹏，张责寅，高佩琦，等.医学遗传学理论教学改革探析[J].中华医学教育杂志，2008，28，（5）：29-30.

篇4

表观遗传修饰(epigenetic modification)，如DNA甲基化、组蛋白乙酰化和甲基化、RNA相关性沉默与细胞生长、分化、凋亡、转化及肿瘤进展相关基因的转录密切相关。白血病的发生和发展与表观遗传修饰异常直接相关。本文综述细胞周期调节基因甲基化，组蛋白翻译后修饰异常及siRNA对白血病细胞的作用，为白血病治疗提供新策略。

【关键词】表观遗传修饰；白血病；表观遗传学

Epigenetic Modification in Human Leukemia ——Editorial

Abstract Epigenetic modification，which involve DNA methylation，RNA-associated silencing and histone modification，is implicated in cell proliferation，differentiation，survival，apoptosis and malignant transformation. Some leukemogenesis has been shown to be aberrance of epigenetic modification. This paper discussed the potential causes of some of leukemias correlating with the methylation of cell cycle regulation genes，small interference RNA and modification abnormality of histone after translation. The study on epigenetic modification abnormality of leukemia cells provides a new strategy for treatment of leukemia.

Key words epigenetic modification; leukemia; epigenetics

表观遗传学（epigenetics）是指非基因序列改变所致基因表达水平的变化。表观遗传学研究基因表达变化，这种变化可通过减数分裂或/和有丝分裂遗传，不涉及编码的DNA序列改变，却能引起基因表达水平的异常［1］。表观遗传修饰（epigenetics modification）包括三种调节性机制：DNA甲基化，RNA相关性沉寂和组蛋白翻译后修饰，这些机制常与启动和维持表观遗传沉寂有关［2］，三者不是孤立而是相互作用的。研究表明，表观遗传修饰，如DNA甲基化、组蛋白乙酰化和甲基化等影响细胞生长调节、分化、凋亡、转化以及肿瘤发展相关基因的转录等。白血病的发生和发展与表观遗传修饰异常密切相关。

目前认为白血病的发生是复杂的多步骤的，涉及与细胞增殖、分化、存活、基因组整合有关的原癌基因、肿瘤抑制基因和其他细胞内的重要基因。在器官和细胞水平，机体对细胞的转化有内在的抵抗或保护作用，所以肿瘤的发生是多因素积累的结果。白血病是一组异质性疾病，除了细胞遗传学变化外，还发现它们都存在一种或多种基因的失活，肿瘤抑制基因不能表达。因此，白血病的发生是细胞遗传和表观遗传改变的结果。

DNA甲基化与白血病

DNA甲基化是表观遗传学上研究最深入的一种机制，是一种酶介导的化学修饰过程。在人类和大多数哺乳动物，DNA甲基化转移酶（DNMT）以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到DNA上胞嘧啶5碳位置，形成CpG位点，富含CpG区域称为CpG岛。在大约40%的哺乳动物这些CpG岛延伸到DNA的启动子区域，导致稳定的可遗传的转录沉寂，对基因表达有明显抑制作用［3］。启动子区域的CpG岛甲基化能沉寂基因转录，在正常细胞中是一种调节基因表达的手段。然而抑制肿瘤生长的基因发生异常甲基化是在肿瘤早期就发生而且一直进行的，导致恶性肿瘤表型的表达。抑癌基因能被这种表观遗传机制沉寂。98种不同原发性人类肿瘤的基因组筛查揭示，在每种肿瘤平均存在600个异常CpG岛甲基化位点［4］，很多甲基化CpG岛存在于尚未确定的基因组区域，也许在肿瘤发生中扮演重要角色。

肿瘤抑制基因启动子区域过甲基化常常是白血病/淋巴瘤发生的一种重要机制。白血病细胞周期异常、增殖失控与细胞周期蛋白异常表达或缺失相关。有学者研究发现，在78%的急性髓系白血病（AML）、67%的浆细胞疾病、46%的骨髓增生异常综合征（MDS）、40%的急性淋巴细胞白血病（ALL）、13%的非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）存在p15INK4B（p15）基因高甲基化，在B细胞NHL存在p16INK4A（p16）的高甲基化。追踪MDS进展发现，7例p15基因正常的早期患者随疾病进展有5例发生了甲基化［5］。另一项研究显示，7例p15基因正常的MDS转化为白血病后5例发生了甲基化［6］。还有学者报道，153例NHL中低恶性的41例p16表达正常，71例高恶性者中41例全部或部分丧失p16的表达，而发生由低恶性向高恶性转化的41例在转化前p16表达正常，转化后35例全部或部分丧失p16的表达［7］。Reddy等［8］研究蛋白酪氨酸磷酸酶基因SHP1、蛋白激酶基因SYK、细胞因子信号抑制因子基因SOCS1发现，在93%（119/130）的白血病/淋巴瘤和多发性骨髓瘤至少存在一种基因的甲基化，在100%的NHL和94%的白血病细胞株存在SHP1甲基化，SOCS1甲基化率达30%。应用去甲基化处理后可见到SHP1重新表达，STAT3磷酸化水平降低，结果提示细胞因子信号紊乱与这些基因甲基化沉默有关。细胞周期蛋白基因甲基化与细胞因子信号抑制因子基因甲基化导致其表达异常，白血病/淋巴瘤细胞增殖失控，MDS细胞恶性转化，导致血液恶性肿瘤的发生。

不仅细胞周期蛋白和细胞因子信号抑制因子基因发生甲基化，白血病/淋巴瘤细胞促凋亡基因同样也存在过甲基化，而在抗凋亡基因有低甲基化现象。Murai等［7］发现，在15%的急性淋巴细胞白血病、17%的急性髓细胞白血病、21%的多发性骨髓瘤病人存在促凋亡基因BNIP3基因位点的高甲基化，并且使该区域组蛋白乙酰化时也能直接促使该基因表达，因此作者认为，BNIP3基因的沉寂是该基因组DNA异常甲基化和组蛋白去乙酰化作用的结果。van Doorn等［9］在T细胞淋巴瘤中发现肿瘤抑制基因P73和凋亡相关基因BCL7a启动子区域过甲基化，与DNA修复有关的肿瘤抑制基因失活，凋亡信号传导异常而使细胞增殖失控。Nakatsuka等［10］在对白血病/淋巴瘤的研究中发现，促凋亡蛋白激酶DAP（death-associated protein）启动子基因在B细胞白血病/淋巴瘤甲基化率为79.4%（27/34例），在T细胞和NK细胞白血病/淋巴瘤甲基化率为47.4%（9/19例）和62.5%（15/24例），并发现DNA甲基化程度高的白血病/淋巴瘤细胞均耐受凋亡诱导作用，联合应用去甲基化处理则恢复对凋亡诱导的敏感性。Chen等［11］应用DMBA诱导小鼠口腔鳞状细胞癌的实验中发现，DMBA处理组抗凋亡蛋白survivin明显表达，mRNA合成增加，在药物未处理组则未测到。同时发现在DMBA未处理组，survivin基因高甲基化，而DMBA处理组未发现survuvin基因甲基化，表明survivin的表达是通过表观遗传机制控制的。这些研究说明表观遗传修饰异常是白血病发生发展的一种重要机制。

组蛋白乙酰化转移酶和去乙酰化酶与

白血病

一些证据表明组蛋白乙酰化转移酶（HAT）具有肿瘤抑制功能。如果HAT活性缺失或失调可能导致癌症的发生。在许多类型的癌症中，编码HAT的基因发生易位、扩增、过表达和突变。在已知的HAT中，P300和CBP认为是肿瘤抑制因子。P300和CBP基因分别位于16p13和22q13，在白血病或治疗相关性MDS中表现染色体移位、重排。在80%的恶性角质瘤和急性白血病中发现P300的杂合性缺失。在急性髓细胞白血病（AML），因t（8；16）（p11；p13）染色体异常使CBP移位，并和乙酰化酶基因MOZ或同源盒基因MLL融合，在此两种融合蛋白中，CBP的HAT结构域保持完整。在另一种AML中，t（11；22）（q23；q13）异常导致P300基因重排。MLL基因位于11q23，分别和P300、CBP形成t（11；22）（q23；q13）、t（11；16）（q23；p13）移位融合基因，产生MLL-P300和MLL-CBP融合蛋白。这些染色体异常证明，HAT错误靶向的乙酰化在白血病发生的原因方面起重要作用。在小鼠中发现MLL-CBP融合蛋白能形成MDS综合征，并进展为髓性白血病［12］。CBP的嗅结构和乙酰化酶活性区域是致白血病必须的，认为MLL的N端部分直接被CBP乙酰化导致白血病的发生。MLL-CBP的潜在靶点是HOX基因家族，可能导致这些基因异常表达，引起白血病［13］。

组蛋白去乙酰化酶（HDAC）参与癌症发展的证据来源于急性早幼粒细胞性白血病中的融合蛋白PML-RARα和PLZF-RARα，利用融合蛋白中的RARα部分，PML和PLZF募集组蛋白去乙酰化酶复合物至维甲酸（RA）受体α的靶基因阻抑转录和细胞分化。在t（8；21）M2b白血病中，AML1-ETO失去了AML1作为调控造血和细胞周期转录因子的功能，它们招募组蛋白去乙酰化酶复合体作用于AML1靶基因，抑制AML1介导的转录活性。AML1-ETO融合蛋白中ETO的CRD功能域介导的转录抑制活性占到50%左右，主要通过与mSin3A结合而起作用［14］。因此，AML1-ETO致髓系细胞分化受阻和白血病转化作用可能是通过如下模式实现的：AML1-ETO仍与DNA上的AML1特异序列结合，但与野生型AML1不同，融合蛋白AML1-ETO不能启动P300/CBP引导的组蛋白乙酰化和转录激活。相反，通过融合蛋白中ETO的锌指结构域，AML1-ETO募集N-CoR和HDAC，使该复合物持久地固定于AML1反应基因的启动子区，维持该区的组蛋白去乙酰化构象，DNA和转录复合体不能接近，主动阻抑分化基因转录［15］。

组蛋白修饰与白血病

组蛋白修饰是表观遗传学修饰的另一机制，包括组蛋白乙酰化修饰和甲基化修饰。组蛋白赖氨酸的N端乙酰化或去乙酰化修饰改变着核小体的结构，组蛋白中去乙酰化的赖氨酰带正电荷，被吸引到带负电荷的DNA中，产生一种紧密的染色质结构，抑制转录。另一方面，组蛋白乙酰化酶使赖氨酰乙酸化移走它们的正电荷，从而导致开放的染色质结构，加速基因转录。HDAC从赖氨酸移走乙酰基，可以逆转这一过程从而抑制转录。核小体中组蛋白的异常去乙酰化可能与HDAC专一性的错误调节有关，也与肿瘤转化相关。组蛋白中赖氨酸被特异性组蛋白甲基化转移酶甲基化，一方面核小体中组蛋白 H3的赖氨酸 4甲基化与染色质开放构象和基因表达相关；另一方面，组蛋白 H3中赖氨酸 9的甲基化与染色质的浓缩和转录抑制相关。这种组蛋白甲基化修饰和组蛋白乙酰化及去乙酰化对基因表达的影响称作组蛋白密码［16］，与基因转录表达相关，异常时与肿瘤发生有关。

人类hDoT1L基因和AF10（一种与MLL和AML有关的融合蛋白）结合，通过AF10的OM-LZ区域介导MLL白血病的发生，MLL-hDoT1L和MLL-AF10介导的白血病细胞转化，导致一系列白血病相关基因的上调，并伴有组蛋白H3 K79的高甲基化［17］。MLL蛋白具有组蛋白H3甲基化转移酶活性，可以通过直接结合或使Hox基因甲基化而调节Hox表达，在白血病细胞转化和发生中有重要作用［18］。Lukasova等［19］研究CML的表观遗传学发现，CML患者的粒细胞存在不同程度的组蛋白H3甲基化现象，在CML加速期和白血病期，组蛋白H3甲基化作用明显增强。在CML慢性期，组蛋白甲基化水平、疾病进展和用药方式没有明显相关性，甚至在“治愈”的患者仍可见到组蛋白H3甲基化现象，提示在这些患者粒细胞的染色质变构调节是不完全的。白血病细胞组蛋白H3甲基化现象提示其染色质浓缩的不完整性，可能与白血病细胞增殖、疾病预后和复发有重要相关性。

人类端粒酶逆转录酶（hTERT）基因在正常分化细胞是失活的，而在肿瘤细胞被再激活。研究在细胞分化过程中hTERT启动子活性减低的机制，发现是由于hTERT启动子基因进行性的组蛋白低乙酰化和甲基化积累的结果［20］，说明细胞进化过程中表观遗产修饰的复杂性，低乙酰化和高甲基化对维持细胞正常功能也是必须的。在急性早幼粒细胞白血病细胞，PML-RARα移位基因产生的融合蛋白募集DNA甲基化转移酶到分化基因启动子靶点诱导该基因高甲基化和沉默。这种高甲基化作用与白血病发生直接相关，维甲酸处理后显示启动子基因去甲基化，分化基因在表达，白血病表型逆转［21］。这个研究结果提示在白血病细胞转化过程中，遗传学异常和表观遗传学异常是互相联系的，而表观遗传学的积累对白血病发生的早期阶段是至关重要的。

RNA相关性沉默与白血病

RNA沉默（RNA silencing）是一种在真核生物体内普遍存在的、发生在RNA水平的、基于核酸序列特异性的相互作用来抑制基因表达的调控机制，在动物中称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。双链（ds）RNA是RNA沉默起始的关键分子，dsRNA首先被降解为不同长度的小RNA，其中具有21-26个碱基的双链小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）在介导对病毒、转基因和转座子等外来入侵核酸序列特异性的RNA降解，在防御病毒感染和监视外来核酸中起重要作用［22］。RNAi是转录后水平的基因沉默机制，高效抑制基因表达，能封闭病毒生存和繁殖所必需的基因，产生抗病毒效应。RNAi与白血病发病关系的研究未见报道，推测在与病毒密切相关的白血病/淋巴瘤的发病中应存在RNAi机制缺陷，未能对入侵的核酸分子（如HTLV，EBV，C型病毒等）起到应有的作用，而使这些外来核酸分子复制整合导致恶性血液病的发生。

RNAi对白血病实验性治疗已有报道。Wohlbold等［23］应用bcr/abl断裂融合点基因设计的siRNA能明显减少bcr/abl蛋白表达，对抗bcr/abl蛋白的生化特性，能选择性抑制依赖bcr/abl的细胞的生长，而且bcr/abl同源的siRNA能增加伊马替尼对bcr/abl阳性细胞的敏感性。Cioca等［24］应用C-raf 和bcl-2基因设计的dsRNA转染入HL-60，U937，THP-1和K562细胞，结果均可以降低C-raf 和Bcl-2蛋白表达，诱导这些细胞的凋亡和增加其对伊托泊甙及柔红霉素化疗的敏感性。Heidenreich等［25］应用靶向AML1-MTG8位点的siRNA，能明显减低AML1-MTG8蛋白水平而不影响野生型AML1的活性。McCarthy等［26］设计IL-10的siRNA作用于CLL 的B-1细胞株LNC，显示降低IL-10的表达，使LNC细胞阻滞在G2/M期，有效地诱导LNC细胞凋亡。siRNA作为一种使异常基因沉默的理想靶点，其有效性得到公认，但还需进一步深入研究。

尽管多数肿瘤是克隆性起源，但同种或同类肿瘤间巨大的异质性提示肿瘤的发生是遗传因素、表观遗传因素和微环境的选择性压力联合作用的结果。表观遗传修饰在肿瘤相关基因表达中的重要性逐渐被重视，对白血病细胞表观遗传学异常的研究将为白血病的治疗提供新的策略。

【参考文献】

Epigenetic Modification in Human Leukemia ——Editorial

CHEN Yan，LI Xin-Gang

Institute of Hematology，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Key words epigenetic modification; leukemia; epigenetics

DNA甲基化与白血病

组蛋白乙酰化转移酶和去乙酰化酶与

白血病

组蛋白修饰与白血病

RNA相关性沉默与白血病

篇5

一般意义上的遗传学指基于DNA序列改变导致基因表达水平的变化,如基因突变、基因杂合丢失和微星不稳定等,表观遗传学指非DNA序列改变,是细胞内除了遗传信息以外的其它可遗传物质发生的改变。表观遗传学研究主要包括染色体重塑、组蛋白修饰,DNA甲基化,非编码RNA调控等。

真核细胞的特征是有细胞核,细胞核包含了真核生物几乎所有的遗传物质。真核生物基因组DNA储存在细胞核内的染色质中,核小体( nucleosome) 是构成真核生物染色体的基本结构单位。各核小体串联而成染色质纤维,核小体DNA长度约为165个碱基对,其中缠结在组蛋白八聚体周围的核心DNA( core DNA) 约1. 65圈,约合147个碱基对,而相邻的核小体之间的自由区域( linber DNA) 为20 - 50个碱基的长度,也就是基因组的75% ~ 90% 被核小体所占据。组蛋白八聚体由H2A、H2B、H3和H4各2个拷贝组成,每个核心组蛋白都有两个结构域: 组蛋白的球形折叠区和氨基末端结构像一条尾巴( tail) 位于核小体的球形结构以外,可同其它调节蛋白和DNA发生相互作用,染色体的高级结构和基因的转录调控都与组蛋白密切相关。核小体组蛋白的尾巴可以发挥信号位点的作用。

上面已谈到表观遗传学是指非DNA序列改变,而是改变染色质结构导致基因表达水平的变化。那么,染色质结构改变如何导致基因转录和表达水平改变的呢?

其一,在细胞里,DNA-染色质的形式存在,核小体是染色质的基本结构单位,75% ~ 90% 的基因组存在其中,核心组蛋白的尾巴的各种位点通过多种转移酶的作用,发生共价修饰,组蛋白通过电荷相互作用( 组蛋白尾巴带正电荷,DNA带负电荷) 如组蛋白乙酰化修饰可以通过电荷中和方式削弱组蛋白-DNA或核小体 - 核小体的相互作用,或引起构象的变化,破坏核小体结构,使DNA接近转导机构,激活转录。

其二,为保证染色质的DNA与蛋白质的动态结合,细胞内产生了一系列特定的染色体重塑复合物,也称重塑子,它们利用水解ATP的能量通过滑动、重建、移除核小体等方式改变组蛋白与DNA结合状态,使蛋白质易于接近目标DNA。依据重塑子包含的ATP酶中催化亚基结构域的不同,把重塑子分为SWI/SNF、ISWI、CHD、IN080四大家族。组蛋白修饰后如乙酰化的组蛋白可以募集转录复合物进入到一个基因位点,影响转录。

2 认知过程中的表观遗传学机制

通过新信息或经验获得的记忆可保持数月、数年,甚至终生,而长时间保持存活的蛋白质或mRNA的半衰期只有24 h,显然,二者之间存在很大的矛盾,那么记忆的物质基础到底是什么? 1984年,Crick提出了一个假设,即记忆编码在染色体的DNA上,虽然当时他并不是十分确信,但现已澄清,染色体是信息的携带者,而且可以代代传下去,染色体结构或化学上的改变与认知功能的关系可作如下的理解: 表观遗传学的改变是对来到大脑的信息、应激和神经元活性改变做出结构上的适应,最终将信息带至并激活特异性基因表达程序。目前研究证明,在脑的一些区域发生的表观遗传学改变如组蛋白的乙酰化、甲基化、磷酸化可以稳定地改变动物的行为,包括学习、记忆、抑郁、药物依赖、突触可塑性等等,为长记忆的形成、巩固和突触可塑性的形成、维持提供解释[5,6,7,8]。

阅读近十几年发表的有关表观遗传学文章后,解决了长期以来认知过程中令人费解的一些问题,本文着重介绍在脑的不同区域( 主要是海马和脑皮层) 组蛋白修饰和DNA甲基化在认知过程中的作用及其可能的机制。

2. 1组蛋白乙酰化[9,10,11]一系列表观遗传学改变都能影响记忆过程,其中组蛋白乙酰化,具有明确、显著地促进记忆的形成和巩固。组蛋白乙酰化是通过组蛋白乙酰化酶( HATs) 催化完成的。HATs将带正电荷的乙酰基转移到组蛋白N末端尾区内赖氨酸侧链的-氨基。组蛋白乙酰化酶被分成3个主要家族: GNAT超家族,MYST家族和P300 /CBP家族。将乙酰基从组蛋白移走,由组蛋白去乙酰化酶( HDACs) 催化完成,HDACs被分成4类: Ⅰ类,锌依赖型HDACs,Ⅱ类和Ⅳ类HDACs,Ⅲ类NAD依赖性HDACs。在哺乳动物中,海马在记忆形成中起重要作用。许多学者以海马区域作为研究对象,研究了组蛋白乙酰化对条件性恐惧中的背景记忆( contextual memory) 和空间记忆的影响。研究证明组蛋白乙酰化或抑制HDACs活性都能增强条件性恐惧中的背景记忆和Morris水迷宫中的空间记忆以及增加突触可塑性( synaptic plasticity) 。应当指出的是,脑中组蛋白乙酰化不是独立于其它组蛋白修饰而存在,而是在组蛋白乙酰化的同时,也往往存在组蛋白磷酸化、甲基化。组蛋白乙酰化削弱了组蛋白与DNA之间的静电亲和力,从而促进染色体结构接近转录基因机构,引起基因持续性改变,增加神经元活动,乙酰化修饰后的组蛋白也可以募集其它相关因子[10,11,12,13],如转录复合物,进入到基因位点,影响转录。

2. 2 组蛋白乙酰化的调节机制[14,15,16]

2. 2. 1神经元活性与组蛋白乙酰化组蛋白乙酰化可由许多类型的神经元活性所调节,例如,KCl介导的神经元去极化引起海马培养中的核心组蛋白H2B乙酰化的增加,再如,特异性受体激动剂可兴奋多巴胺能、乙酰胆碱能、谷氨酸能途径,增加小鼠海马H3K14和H3S10的乙酰化,在所有这些情况下,组蛋白乙酰化都伴有细胞外调节激酶ERK( MAPK家族中的一员) 的激活,直接激活MAPK-ERK信号途径可增加组蛋白乙酰化,而MAPK-ERK抑制剂则可阻断组蛋白乙酰化[16,17,18],这些研究表明,神经元活性引起组蛋白乙酰化是通过MAPK依赖性途径的激活,而且也可能是通过H3S10磷酸化之间的对话。后者常与在蛋白乙酰化同时存在,从染色体脱离的HPAC2引起的神经活性,也能改变组蛋白的乙酰化,用BDNF刺激皮层神经元,能引起HDAC2在胞嘧啶262和274位的硝基化及随后组蛋白的高乙酰化及随后组蛋白的乙酰化,并伴有神经营养因子依赖性基因表达的增强。已知MECP2可增加BDNF的表达,但被HDAC2负面调节。因此,神经活性参与了以HDAC2和BDNF为中心的正性反馈,该系统导致组蛋白乙酰化和基因自身的持续表达。

2. 2. 2突触可塑性与组蛋白乙酰化长时程突触可塑性涉及突触维持和交流有关基因表达的改变,已有充分材料证明,组蛋白乙酰化促进这一改变,例如在海兔( Aplysia) 组蛋白乙酰化能诱导长期易化 ( LTF) 并伴有CREB结合蛋白CBP的增加[19],类似的改变也在突触素( synapsin) 的启动子区域观察到,突触素与LTF和LTD均有关。不过,伴有CREB乙酰化的减少,正常情况下,诱导LTF需施加强电刺激,但如果提前给予RNA干扰( RNAi) ,弱的电刺激也能诱导LTF。这一发现提示,组蛋白乙酰化程度与突触可塑性程度密切相关,HDAC1能增加天然存在的突触传递过程,在哺乳动物的LTP也与组蛋白乙酰化水平有关。LTP诱导可平行出现H3和H4组蛋白乙酰化的增加,从研究中还明显看出LTP促进乙酰化,改变特异地存在于与突触传递有关基因如Reelin和BDNF启动子区域,这一结果与前述看法一致,即在组蛋白乙酰化过程中存在一个基因自身持续性改变的正性反馈系统。此外,有关HATCBP的研究表明,增加组蛋白乙酰化能促进LTP,部分或完全缺失CBP功能的小鼠出现组蛋白乙酰化水平的下降和LTP形成受阻。不过,不依赖转录的早期LTP不受影响。

2. 2. 3记忆形成与组蛋白乙酰化[20,21]在低等生物和哺乳动物进行的研究证明,不管哪种记忆类型或哪种记忆时相( 记忆获得,巩固和再现) 都能对组蛋白乙酰化进行调节,例如背景性和线索性恐惧记忆( fear memory contextual and fearmemory cued) 都能增加H3乙酰化,小鼠眨眼条件反射( eyeblink conditioning) 和大鼠潜伏抑制 ( latent inhibition) 能分别增加组蛋白H3和H4乙酰化,大小鼠物体识别记忆( Objectrecognition memory) 伴有H3和H4乙酰化的增加,此外优先食物转换( social transmission of food preference) 和食物厌恶记忆( food aversion memory) 等均能增加H3乙酰化,空间记忆( spatial memory) 伴有H2B,H3和H4乙酰化。

从上述组蛋白乙酰化研究的论述可得出以下几点结论:

( 1) 组蛋白乙酰化,不是脱离开其它组蛋白修饰而独立存在,即在发生组蛋白乙酰化的同时,也有组蛋白磷酸化、甲基化等的发生,其它表观遗传学改变对组蛋白乙酰化起了协同作用。

( 2) 神经元活性可调节组蛋白乙酰化,神经元活性的启动需要MAPK-ERK信号途径的激活。

长记忆和突触长时程增强均涉及许多基因的转导和表达,最常见和最重要的基因包括即早基因Zif/268,Creb,Bdnf和Reelin等。

( 3) 许多种类的神经活性存在一个以BDNF和HDAC2为中心的正性反馈系统,该系统可导致组蛋白乙酰化和基因自身持续表达程序。

( 4) 在多种生物体和细胞研究中观察到各种不同类型的记忆模式和不同记忆时相都能引起组蛋白乙酰化,进而促进记忆和有关基因的转录和表达。

( 5) 组蛋白乙酰化能引起长记忆的形成和巩固,但对无须转录的短记忆和早期LTP没有影响。

2. 3神经元活性是如何引起组蛋白乙酰化,它的作用机制是什么?[11]途径之一,神经元活性包括LTP和学习激活G蛋白偶联受体( GPCRs) ,然后依次激活腺苷环化酶( AC) 产生c AMP,后者激活PKA,PKA磷酸化MEK( MAPK家族中的一员) ,MAPK的家族成员能直接磷酸化组蛋白,随后启动组蛋白乙酰化。

途径之二,神经元活性可通过钙内流引起膜去极化,然后激活CAMKⅡ,后者磷酸化甲基-CPG结合蛋白2( MECP2) ,使MECP2从染色体脱离出来,Calmodulin刺激BDNF启动子区域的基因转导。BDNF激活一氧化氮合酶导致组蛋白乙酰化酶2( HDAC2) 的硝基化,在硝基化作用下,HDAC2从染色体中脱离出来并强化硝基化,结果引起BDNF表达并参与正性反馈系统,进而促进记忆 - 持续性基因表达的改变( 见Fig 1) 。

其他一些学者的研究工作指出: 激动NMDA受体,抑制磷酸二酯酶( PDE) ,增加细胞内钙等多种途径均可激活PKA,PKA则可直接激活CBP,如前所述。含有乙酰转移酶活性的CBP与CREB结合,是提高突触可塑性形成长记忆的必备条件; NO启动组蛋白影响记忆的机制有二,一是激活N0-cG MP-Ca MKII-CREB磷酸化的信号转导途径; 二是NO依赖性的HDAC的5-硝基化,可增加组蛋白乙酰化,而NO供体与5-硝基谷胱甘肽,可抑制HDAC活性,因而,也能增加组蛋白乙酰化。此外,神经元活动或突触活动引起胞外钙内流入神经细胞内,使Me CP2的S421磷酸化,S80去磷酸化,后者从染色质分离出来,发挥对神经可塑性和记忆的调控作用。

2. 4 RNA干扰 ( RNA interference,RNAi)指内源性或外源性双链RNA( dsRAN) 介导细胞内mRNA发生特异性降解,导致靶基因表达沉默,产生相应功能表型缺失,RNA干扰下的基因沉默是表观遗传学的重要内容,人工合成的小RNA( SiRNA) 包括miRNA和SiRNA。小RNA序列较短,能指导Argonaute蛋白识别的靶分子并导致基因沉默。

已证明,组蛋白去乙酰化酶HDAC阻遏学习记忆,并在细胞内有广泛分布,人工合成HDACi显然有重要的治疗价值,HDAC2的结构很接近HPAC1,尽管如此,科学家们还是合成许多类型的HDACi,上述各种类型学习记忆和突触可塑性模型证明使用HDAC2i可促进记忆,增强LTP,阻遏记忆下降。

3 组蛋白和 DNA 甲基化[20,21]

甲基化可发生在组蛋白,也可发生DNA上。尽管这二种甲基化产生的方式、调节机制和涉及的酶与蛋白等有所区别,但二者甲基化的结果是一致的,即他们都能激活基因的转录与表达,从而促进长记忆的形成和提高突触可塑性。这点学术界的看法一致,没有任何异议。下面将重点介绍组蛋白和DNA甲基化是如何形成,又如何影响基因转录及长记忆和突触可塑性的?

真核细胞中,甲基化只发生在胞嘧啶第五位碳原子上,是由甲基转移酶所催化,以S-腺苷甲硫氨酸( S-adnosylmethionine,SAM) 作为甲基供体,将甲基转移到胞嘧啶上,DNA甲基化主要发生在Cp G双核苷酸序列的胞嘧啶上,哺乳动物异染色质的DNA约有80% 的CPG被甲基化,根据作用方式和反应酶不同,DNA甲基化分为两种: 维持甲基化( maintenance methylation) 和从头甲基化 ( de novo methylation) ,前者与DNA复制相关联。当甲基化的双链DNA被复制生成两条的新的双链DNA后,只有亲代链是甲基化的,甲基转移酶是DNMT1,后者则是DNA上甲基化状态的重新构建,它不依据DNA复制在完全非甲基化的DNA碱基位点上引入甲基,是甲基化的建立机制。甲基转移酶依赖于DNMT3a和DNMT3b的活性。

对基因转录的影响: 目前研究发现,组蛋白精氨酸甲基化常伴随转录的激活,赖氨酸残基上的甲基化则因赖氨酸所在的位置不同而有差别,赖氨酸甲基化发生在组蛋白H3的第4,第9,第27,第36,第79( K4,K9,K27,K36,K79) 位及H4K20位上,其中,在酵母和哺乳动物细胞中H3K4和H336位点被甲基化可以激活转录,而H3K9 K27 K79和H420的赖氨酸甲基化则可抑制转录。

DNA甲基化对基因表达的调节主要表现为抑制转录活性,一种可能的机制是由于DNA甲基化直接抑制了转录因子的结合,不能形成转录复合体,从而也就抑制了基因转录活性[16,18,20]。

对记忆的调节作用: Swati Gupta及其同事[21]研究了组蛋白甲基化对成年动物海马部位记忆形成的影响,他们的研究得出如下主要结果: 恐惧记忆能触发海马CA1区H3K4三甲基化( 转录激活标志) 和H3K9二甲基化( 转录抑制标志)的变化; H3K4特异的甲基化转移酶MⅡ缺失的小鼠出现长记忆形成障碍; 改变组蛋白甲基化与去乙酰化酶( HDAC) 抑制相偶联; H3K4三甲基化明显增加两种基因 ( Zif/268和Bdnf) 的启动子,这一事件出现在记忆巩固期间,已知这两种基因在记忆形成和神经可塑性中起重要作用。这些发现支持组蛋白甲基化在长记忆巩固中扮演重要作用,其他许多学者也都证明DNA甲基化与记忆形成和储存有关,如甲基化CpG结合蛋白1( methyl-Cp G-binding protein1) 基因缺失出现空间记忆能力丧失,甲基化CpG结合蛋白2 ( methyl-Cp Gbinding protein 2) 基因缺失的突变小鼠出现恐惧记忆、空间记忆和物体识别记忆的障碍。

海马DNA甲基化,对记忆形成起重要作用,但海马的改变是短暂的,训练后1 d之内便恢复到基础水平,长记忆以及记忆的巩固和储存依赖于脑的不同区域,据信长记忆的形成和巩固主要依赖于背侧前额叶前扣带皮层( dm DFC) ,为此探讨皮层组蛋白甲基化是否能促进长记忆的形成和巩固十分必要。Miller等采用背景性恐惧记忆试验探查皮层DNA甲基化对长记忆的影响,报道认为大鼠恐惧条件化环境中的背景记忆可维持数月,在这期间,近期( recent) 记忆会转变成远期( remote) 记忆,也即记忆从海马( HPC) 转变成依赖于dmP FC的记忆。首先,采用Me DIP即甲基化DNA免疫沉淀法测定皮层三种基因Zif/268,reln和Ca N的甲基化水平。动物试验则观察训练后7 d的背景记忆,将动物分为背景组( C) 、休克组( S) 和背景加休克组( CS) 。结果表明,在所有组和所有测定时间点,即早基因Zif/268均为去甲基化,说明环境刺激能广泛地改变dm PFC Zif/268的甲基化状态,相反的,一个记忆正性调节基因Reln仅在受训练的动物即CS组动物训练后1 h内出现高甲基化,随后即回归对照水平,训练后短时间内Ca N( 一种记忆抑制基因) 的甲基化无改变,但在训练后1 d,这一基因出现持久的甲基化,随后用BSP描绘训练后7 d Ca B甲基化的改变,发现仅CS组动物有显著的Ca N甲基化。为了解皮层DNA甲基化是否能反映联合学习,动物在训练前注射NMDA受体拮抗剂MK-801,证明MK-801干扰了训练后7 d动物恐惧记忆的获得( acquisition) ,也阻断了训练后2 d dmP FC Ca N和Reln的高甲基化,但不影响Zif/268的甲基化,进一步支持Ca N和Reln高甲基化是一种对联合性环境信号的特异性反应。Frankland等前期研究观察了训练后不同时间对ACC( anterior cingulate) 恐惧记忆再现( retrieval) 的干扰。结果证明ACC在18 ~ 36 d( 近期记忆) 经干扰失去记忆再现,但不是训练后1 d或3 d( 近期记忆) ,从这一结果估计记忆的巩固出现在训练后3 ~18 d,研究还证明皮层DNA甲基化可能在训练后1周内出现,该时段也是皮层留下记忆痕迹的时间,随后的实验证明训练后立即向背侧HPC( CA1) 注射NMDA受体选择性抑制剂AVP,证明APV不但能干扰学习,也能阻止训练后7 ddmP FC Ca N和Reln甲基化,表明一次性海马 - 依赖性学习经验就足以驱动皮层长时间、基因特异性甲基化改变,为了进一步探讨皮层DNA甲基化是否伴随长记忆的形成,观察了训练后30 d的皮层甲基化及记忆巩固的情况,结果证明在CS动物皮层的Ca N甲基化仍十分明显,而且与长记忆的出现和维持的时间段相吻合,此外还观察到在HPC有快速甲基化,而在dm PFC有持久的甲基化,以上研究阐明了以下几个问题: 第一,海马HPC可启动学习记忆,产出过渡性短记忆,第二,长记忆的形成和巩固依赖于dm PFC,第三,海马和皮层记忆的形成均缘于海马和皮层DNA的甲基化,或甲基化与其它组蛋白修饰的协同作用,第四,重要的记忆相关基因和受体包括Zif/268,Reln,Bdnf和NMDA受体。组蛋白甲基化是如何调整认知过程,它的生物学机制是什么?Day和Sweatt提出了阐明组蛋白甲基化是表观遗传学标志的假说[20],如在细胞内转变成功能性后果,出现三种可能性: 第一、DNA甲基化驱使神经细胞的反应状态发生了改变,即它允许、容纳其它机制参与进来产生协同效应和维持更加长远的改变; 第二、甲基化事件积极参与和改变基因的读出,促进记忆的进行,例如增加突触强度和突触可塑性; 第三、表观遗传学机制帮助神经细胞无增殖( aplastic) ,在神经元无增殖的情况下可以以稳定突触数量( synaptic weight) 的分布,后者是稳定记忆的必需条件,这一假设强调了突触可塑性在记忆过程中的重要性,事实上,国际上近年的研究表明老年痴呆认知功能的衰减与老年斑、A脑内沉积及神经纤维缠结无明显相关,由于突触在信息传递、信息加工中的重要作用,许多学者都支持突触功能降低( 包括突触效能下降和突触丢失) 是造成认知功能障碍乃至老年痴呆的主要原因,当前治疗老年痴呆和各种认知障碍的治疗方向都在寻找加强突触效能,防止突触丢失、增加突触新生的新药。

3. 1组蛋白磷酸化[25,26,27]组蛋白磷酸化修饰跟乙酰化和甲基化修饰一样具有调节认知功能的作用,这一修饰发生在组蛋白的H3、S1和S10丝氨酸残基上,由一组蛋白激酶包括丝裂原和应激激酶( MSKI) 和Aurora激酶家族催化完成。组蛋白磷酸化可被蛋白磷酸酶PP1和PP2a所逆转,这两种脱磷酸化酶又可被其它分子级联包括多巴胺和c AMP调节的磷酸蛋白32( DARPP32) 所抑制。最具特色的磷酸化标志存在于H3第10位( H3K10) 丝氨酸上,这一修饰招募了含有HAT活性的GCN5,因而能增加邻近组蛋白赖氨酸残基K9和K14的乙酰化,这解释了为什么组蛋白乙酰化和磷酸化常常同时存在。另外,H3S10磷酸化通过改变DNA和组蛋白尾部间的交互作用增加转录因子的结合。

许多研究工作已揭示组蛋白的磷酸化具有调节记忆形成的作用,编码RSK2的基因突变能产生低咖啡摄入综合症( coffin-lowry) ,有精神迟缓、精神异常等表现。在动物模型上的研究,背景性恐惧条件反射形成后,H3S10磷酸化和H3S10 / K14磷酸乙酰化迅速增加,但ERK抑制后可阻断其增加。同样的,缺失MSKI的小鼠出现恐惧记忆和空间记忆障碍,这一缺陷却不因给予HDAC抑制剂所逆转,提示组蛋白磷酸化途径与组蛋白乙酰化并行而不是位于乙酰化的下游,与此相协调的是,组蛋白磷酸化酶PPI受抑制,能改善长时程物体识别记忆和空间记忆而不影响短记忆,从这些发现推测: 通过抑制PPI来增加组蛋白磷酸化对治疗学习记忆障碍可能是一个有明显特色甚至是互补的治疗策略。

除学习记忆外,H3S10磷酸化也与药物成瘾行为学反应有关联。可卡因可引起纹状体H3S10磷酸化的增加,敲除MSKI的小鼠出现对服用可卡因行为反应的障碍。核内积累的DARPP-32能影响对可卡因和蔗糖奖励的行为反应。组蛋白磷酸化也已被证实是抗精神病和抗巴金森氏症下游的一个重要靶标,针对表观遗传学这一组蛋白磷酸化修饰设计和开发有治疗潜能的化合物是很有意义的。一项有意义的研究指出,MSKI主要存在于神经元和纹状体、杏仁核、海马等脑区,MSKI这一选择性分布是治疗干扰药物成瘾的一个很好的候选者。

哺乳动物细胞Aurora激酶家族成员的结构和功能在进化上保守,根据该家族成员在细胞内的定位可分为3种: Aurora-A,Aurora-B和Aurora-C。Aurora-B是有丝分裂中组蛋白H3的第四位丝氨酸磷酸化所必需的激酶。组蛋白H3磷酸化主要由Aurora-B激酶控制,除MSK和Aurora外,IB激酶( nuclear,IKK) 复合物中的异构体( IKK) 也可以调控海马区域组蛋白的磷酸化修饰,IKK是核因子B的一种去抑制调控子,抑制IKK可以阻止背景性环境下长期记忆的再巩固( reconsolidation)[24]。

组蛋白磷酸化促进长记忆形成和巩固的机制主要是磷酸基因携带的负电荷中和了组蛋白上的正电荷,造成组蛋白与DNA亲和力的下降,使DNA容易接近转录机构,激活基因转录,这是长记忆形成所必需的,也解释了为什么组蛋白磷酸化不影响短记忆。

在正常生理和表观遗传学的生化反应中,磷酸化使蛋白质和基因活化,随后的生化和生物学反应才能继续进行,所以在细胞繁殖、分化、细胞存活、DNA复制、转导和重组、细胞凋亡以及信号转导中发挥重要作用。

3. 2 其它组蛋白修饰与认知功能[27,28,29]

组蛋白泛素修饰涉及三类催化酶: 泛素激活酶( ubiquitin activating enzyme,E1 ) ,泛素接合酶 ( ubiquitin conjugatingenzyme,E2) 和泛素连接酶 ( ubiquitin protein ligase,E3 ) 。依赖这三种酶分三步进行泛素化修饰,第一步E1利用ATP形式存在的能量与泛素结合成高能硫酯键,构成泛素 - E1偶联物将泛素激活; 第二步,通过转酯作用将活化的泛素转移到泛素结合酶E2的活性半胱氨酸残基上; 随后,E2将活化的泛素转移至泛素连接酶E3上,形成高能量E3 - 泛素偶联物,最后E3可直接或间接地促使泛素转移到特异靶蛋白上,使泛素的羧基末端与靶蛋白的赖氨酸的-氨基形成肽链或转移到已与靶蛋白相连的泛素形成多聚泛素链,有一个去泛素酶大家族,从赖氨酸残基上移去泛素。

组蛋白泛素化有广泛的细胞功能,最著名的是控制转录的启动和延长,泛素酶/去泛素酶与其它组蛋白修饰,特别是与组蛋白甲基化有牵连,组蛋白泛素化与神经退性病变之间的关联来自亨廷氏病,Huntington与泛素连接酶h PRC12存在交互作用。在多个亨廷氏病动物模型上观察到泛素化的H2A的增加和泛素化的H2B减少,导致组蛋白甲基化模式的改变和基因转录下调,故以泛素连接酶为靶标设计药物对亨廷氏病可能有潜在的治疗价值。

多聚( ADP-核糖) 聚合酶[poly( ADP ribose) polymerases,PARPS]在与记忆行为有关的组蛋白修饰中起一定作用,PARPs可催化ADP核糖单位从NAD+转移到组蛋白靶位点上,不仅可影响染色质的局部结构,还可影响转录因子及染色质重塑复合体的结合,在操作性条件反射和位置回避实验中均证明PARP1可增加长记忆的形成。

3. 3衰老和神经退行性疾病的表观遗传学[27,28,29,30]衰老和年龄相关性神经退行性疾病是一个非常复杂的过程,过去有大量报道衰老与神经退行性疾病没有太多差异,如老年痴呆出现各种病理改变也在衰老过程中出现,但从未从表观遗传学方面去寻找原因,现有的研究揭示,表观遗传学的异常修饰是衰老和神经退行性疾病的主要机制,其主要病理特征表现在两个方面:

其一,组蛋白和基因组DNA甲基化的减少,在衰老和神经退化性疾病中表现突出,如神经细胞和基因组DNA亚甲基化( hypomethylation) 和甲基转移酶( HAT) 活性缺失,在AD患者的病理性神经元和基因组DNA的亚甲基化水平更低。Mastroeni等用免疫组化方法检测了死后AD和非AD( ND) 病人眶内皮层Ⅱ神经元的DNA甲基化和8种甲基化维持因子的免疫反应性,发现ND和AD神经细胞核具有甲基化胞嘧啶免疫反应阳性的神经细胞数分别为91. 7% 1. 3% 和39. 9% 3. 4% ,甲基化胞苷呈阳性的细胞数分别为91. 1% 1. 3% 和51. 8% 6. 1% ,即AD病人的两种甲基化模式比ND病人明显降低,DNMT,MOD2和P662均系甲基化维持因子,在ND病人神经元呈免疫反应阳性,而AD病人神经元免疫呈阴性,此外,RPL26和5. 8 SrRNA也有量的减少。

其二,HDAC2表达增加,研究证明神经退行性改变、衰老和长期应激都能引起HDAC2表达增加,如在神经退行性疾病和衰老时,神经毒性因子如A,氧化应激( H2O2) 和细胞内D25和CDK5激活,糖皮质激素受体( GR) 与临近组蛋白HDAC2启动子区的GR反应元件( CRE) 结合,增加脑内HDAC2水平,HDAC2优先与学习、记忆、神经可塑性有关的基因如BDNF结合,同时降低组蛋白乙酰化和基因的表达,破坏BDNF介导的正性反馈系统,从而降低神经可塑性和记忆的形成与巩固。

篇6

【关键词】生殖技术；辅助；不育

广义的辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）包括人工授精（artificial insemination，AI）、体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)及其衍生技术。目前，由IVF-ET及其衍生的新的辅助生殖技术形成人类生殖技术发展的新态势。卵母细胞浆内单注射术(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)可以帮助许多男性不育患者，甚至是无症患者获得生育机会；胚胎着床前遗传学诊断技术（preimplantation genetic diagnosis，PGD）使得许多遗传性疾病在胚胎植入前得以诊断，达到优生的目的；冷冻胚胎和配子复苏技术可以增加一次取卵多次移植的机会，减少移植胚胎的数目，减少多胎妊娠率；囊胚培养技术跨越了胚胎基因激活的阶段，与子宫内膜发育同步，种植率高；细胞核移植技术重建卵子，给卵子储备量少而产生卵子数少的患者带来了福音，但是对重构卵的遗传作用存在争议；人类未成熟卵母细胞体外培养成熟技术（in vitro maturation，IVM）适用于卵子成熟障碍的患者，避免了促性腺药物的副作用，创伤性小，减少医患负担。

1 体外受精-胚胎移植

19世纪末至20世纪中期，是IVF-ET的动物试验阶段，正是这些动物实验奠定了人类IVF-ET成功的基础。1976年，英国的Steptoe等［1］报道了人类首次IVF-ET妊娠，但不幸的是妊娠结局为异位妊娠；随后经过不懈的努力，于1978年获得了Louise Brown的出生。IVF-ET是指在自然周期或刺激周期，于卵泡成熟时将卵子从卵巢中取出，在体外与共培养形成胚胎并移植入子宫的一项技术。适用于输卵管性不育、免疫性不育、不明原因性不育等。IVF-ET治疗程序包括：

1.1 控制性超排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）与监测卵泡发育目的是诱导妇女产生同步发育的多个卵泡。COH是IVF-ET的关键，良好的COH方案可以获得高质量的成熟卵母细胞，从而提高受精率和妊娠率。近20年来，COH策略已经发生了许多变化。这些变化涉及到药物的使用，从克罗米芬，到人绝经期促性腺激素（human menopause gonadotropin，HMG），再到高纯度卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）和基因重组FSH。在20世纪90年代初，促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a）降调节被广泛采用。使用GnRH-a的COH方案可以避免过早的内源性黄体生成素（luteinizing hormone，LH）峰，防止卵泡过早黄素化，提高卵子质量，增加妊娠率。但是同时也增加了促性腺激素（gonadotropin，Gn）的用量，延长治疗周期，未能有效地抑制卵巢过度刺激综合征(ovary hyperstimulation syndrome，OHSS)的发生。近年来，GnRH拮抗剂（GnRH-A）的第三代制剂投入临床使用，GnRH-A的作用特点是：①与垂体GnRH受体竞争性结合；②即时产生抑制效应，降低Gn和性激素水平；③抑制效果剂量依赖性；④保留垂体反应性［2］。由于GnRH-A的作用机制与GnRH-a存在区别，它具有GnRH-a所没有的优点，减少了Gn的用量和用药时间，降低了OHSS的发生率及过早LH峰发生率，但是因为缺乏足够的临床资料验证，GnRH-A的安全性有待进一步研究。生长激素（growth hormone，GH）的使用：对卵巢功能、卵泡生长、类固醇激素的分泌作用是已知的，可能直接作用于卵巢，刺激卵泡生长、卵母细胞的成熟及卵巢雌激素的产生［3］。故往往与Gn联合应用以获得较好的超排卵反应，增加可移植胚胎的数目。

1.2 取卵于注射人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）后的36 h左右，卵泡成熟但未破裂时，抽取卵泡液找出卵母细胞。在IVF-ET的应用初期曾采取腹部切口或腹腔镜进行取卵手术，现在基本已被B超引导下经阴道穿刺取卵所替代。

1.3 体外受精-胚胎移植将取出的卵母细胞放入培养液中培养，使卵子进一步成熟，并与经过处理的混合受精培养。镜下观察到受精后，继续培养至细胞分裂至4~8个细胞时将胚胎移植入母体子宫内。

1.4 黄体支持应用黄体酮或者HCG支持至妊娠3个月。IVF-ET在临床上已经应用了20余年，有足够的资料证实其安全性，Anthony等［4］对4224例IVF-ET和314605例自然受孕的先天畸形率作对比，结果无明显差异。Hahn等［5］对IVF子代进行调查，认为其行为、精神神经、运动、社会适应等方面与自然受孕儿无差异。

2 卵母细胞浆内单注射术

2.1 适应证 ICSI技术是帮助直接穿过卵母细胞而发生受精，使那些曾经被认为丧失生育功能的夫妇获得自己的后代。近年来被成功应用于男性不育症的治疗。ICSI的主要适应证是：中前向运动＜1×109/L；未成熟，如取自或附睾的，常规IVF反复受精失败，不明原因不孕，卵子冷冻后受精等。

2.2 ICSI的安全性 1992年，Palermo等［6］将ICSI技术应用于临床并获得成功，成为辅助生殖技术发展的里程碑。随后相继出现附睾、甚至精细胞ICSI治疗技术，使得无症不育的治疗有了新的突破。ICSI技术治疗的有效性是肯定的，Tourmaye［7］进行了一项针对男性为中等程度的少弱症不育夫妇的实验：用同一批卵子随机采用IVF和ICSI，发现ICSI受精率比IVF高3.9倍。但是，因为ICSI所使用的越过了自然受精的屏障，并且在操作中可能损伤到细胞骨架或减数分裂中的纺锤体，它的安全性受到普遍关注。Causi等［8］针对2949例ICSI和10785例IVF临床妊娠结局分析，表明ICSI未增加妊娠失败或出生缺陷的概率。Bonduelle等［9］也报道ICSI后出生缺陷与一般人群的发病率相似。但是，这些证据并不能否定ICSI存在一定的遗传风险。

2.3 ICSI潜在的风险

2.3.1 使用遗传异常的风险 ①染色体异常。②囊性纤维化跨膜传导调节基因(CFTR)突变：先天性双侧输精管缺失的不育症患者有75%~80%至少可以检测出一个CFTR突变［10］。③Y染色体的微缺失：Y染色体长臂的无因子（azoospermia factor，AZF）分为3个功能区：AZFa、AZFb、AZFc。其中AZFa缺失常与精原细胞完全缺失有关；AZFb缺失通常与生殖细胞成熟停滞有关；AZFc缺失较常见，与多种无和严重少弱症有关。在存在AZF缺失的情况下进行ICSI治疗，会将AZF缺失遗传给男性子代，故应该考虑通过PGD进行性别选择。④雄激素受体（AR）基因三核苷酸重复：AR基因CAG片断的重复在ICSI应用过程中可以被遗传甚至于被扩增。过度扩增的CAG重复序列增加神经元变性疾病的发病风险，如延髓脊髓性肌萎缩超过50%表现为严重少弱症或无精症导致不育。

2.3.2 线粒体DNA(mtDNA)遗传风险 mtDNA突变率较高，可以引起人类功能障碍。但目前还没有证据表明ICSI会增加父亲mtDNA传递导致mtDNA疾病的风险［11］。

2.3.3 显微注射过程中以及外源性物质导入卵子的风险如聚乙烯一氯五环酮（PVP）液、病原体等。

2.3.4 机械损害的风险损伤细胞骨架或减数分裂中的纺锤体。

2.3.5 印迹基因改变的风险 Lucifero等［12］报道ICSI技术有可能干扰卵母细胞或早期胚胎中母系基因印迹的建立和维持。故为了减少ICSI的遗传风险，应进行严格的遗传学检测。

3 胚胎着床前遗传学

诊断技术PGD是辅助生殖技术与分子生物学技术相结合发展的产前诊断技术。通过显微操作获得来自卵裂球、囊胚或者胚泡滋养外胚层的单细胞，应用PCR和FISH技术进行遗传学诊断。PGD主要应用于性连锁隐性遗传病、单基因疾病、染色体数目与结构异常及与高龄相关的非整倍体检测等，以减少畸形胎儿的发生率。1990年，Handyside等［13］报道第1例植入前性别诊断婴儿出生。发展至今，应用FISH技术行PGD可针对性连锁遗传、胚胎非整倍体的筛选、染色体结构异常等做出诊断。Abdelhadi等［14］报道用适宜的探针与要求进行PGD监测染色体非整倍体的患者的活检细胞经历3个连续的荧光原位杂交过程，可同时检测13对染色体的异常。Munne［15］报道经PGD检测后的妊娠自发流产率从23%降至11%。理论上讲，只要有足够的序列信息，PGD能够针对任何遗传条件进行分析，即凡是能够被诊断的遗传病都可以通过PGD来防止患儿出生。但是，目前PGD在技术上尚存在难点，其细胞遗传学分析诊断的准确率和可靠性尚难达到100%。目前，PGD取材的主要来源有三：极体、卵裂球或滋养层细胞的活检以及单个或数个细胞。卵裂球活检是目前常用的方法，这种方法的缺点是卵裂阶段的胚胎嵌合体的发生率很高，卵裂阶段单个卵裂球的检测结果并不能代表整个胚胎的状态，可能造成误诊或者漏诊［16］。囊胚是胚胎进行活检的最后阶段，囊胚期滋养细胞可以获得充足的样本量，提高PGD的准确性。但是，胚胎必须在受精后5~6天移植，使得诊断时间受到严格限制。极体活检的优点是不影响卵子的正常发育与受精，而且取材较早，有更多的时间分析；缺点是不能分析父源性染色体异常。已经有学者应用极体和卵裂球胚胎联合活检进行PGD，提高诊断率［17］。目前尚无足够的资料证明PGD对子代安全性的影响，但在优生优育方面蕴含着巨大的潜力。随着人类对疾病基因认识的深化及诊断技术的提高，将某些遗传病从人群中筛选出来的希望仍然存在。

4 冷冻技术

在生殖领域中，冷冻技术应用广泛，包括：冷冻、胚胎冻存、成熟卵子冻存、幼稚卵细胞及卵巢组织冻存等。冻融胚胎移植的临床意义：冷冻胚胎和配子复苏技术可以增加一次取卵多次移植的机会，减少移植胚胎的数目，减少多胎妊娠率；在治疗中出现严重的OHSS时，可以推迟移植时间；发生治疗意外时，如移植困难等。冻融胚胎移植周期的妊娠率虽然低于新鲜移植周期，但累计妊娠率增加。尤其现在对移植胚胎的数目的限制及单胚胎移植的趋势，使得冷冻技术有了更大的潜力。胚胎冻存可在原核期、卵裂早期和囊胚期进行。胚胎冷冻的方法有程序冷冻、超快速冻融法和玻璃化法等。目前大多数采用玻璃化法技术。1986年，Chen［18］首次报道了人类卵子冷冻经体外受精后获得妊娠。卵母细胞的冻存处于排卵时，卵母细胞处于减数分裂的中期Ⅱ，含有23条染色体，每个染色体有2条染色单体组成，排列在赤道面上，与减数分裂纺锤体的微管相连，这个时期的结构对温度极为敏感，故卵母细胞的冻存难题至今尚未攻克。而未成熟卵母细胞具有相对静止、体积小、缺乏透明带及皮质颗粒的特性，比成熟卵子更易耐受冷冻和复苏过程中所造成的损伤。近年来，随着IVM技术的发展，已经可以采用幼稚的卵细胞甚至卵巢组织薄片冻存。

5 囊胚培养技术

囊胚期胚胎经过了人类胚胎发育阻滞阶段（8细胞期）的筛选，可以获得最具有活力的胚胎进行移植；囊胚期移植更符合生理状况，有利于增加子宫内膜与胚胎发育的同步性［19］；为PGD的实施提供了时间，使得胚胎在活检后有更长的时间恢复再进行移植［20］。囊胚期胚胎培养的发展经历了3个阶段：单一培养、共培养和序贯培养。近年来，序贯培养已经基本取代了前两者。1998年，Gardner等［21］在哺乳类胚胎生理学基础上，根据人类生殖道液糖类的含量和胚胎进入宫腔时宫腔液的成分，设计配置了不含血清的G1、G2序贯培养液，新近又推出G3系列培养基，培养时间可以延长至5天，使得胚胎在体外发育至囊胚期成为现实。囊胚移植的适宜人群尚无定论，目前临床上将第3天8细胞胚胎数目作为决定的一个关键条件。第3天8细胞胚胎数＜3个在第3天移植，≥3个可继续培养至第5天移植。Racowsky等［22］经过回顾性分析发现，第3天8细胞胚胎数≥3者第5天移植较第3天移植的妊娠率明显提高，第3天8细胞胚胎数＜3者第5天移植较第3天移植妊娠率无明显差异。研究证明，选用高质量的囊胚移植不但显著提高胚胎着床率，还可以减少多胎妊娠发生的风险［23］。随着人们对胚胎发育认识的不断深入及实验室技术的不断发展，囊胚期移植的优势导致它有可能会取代现行的胚胎培养体系成为IVF治疗的常规方法。

6 卵子重建

细胞核移植技术是近几年来发展起来的新技术，为卵子的重建提供了新的方法。女性到37~38岁，卵母细胞减少的速度增快，不仅卵母细胞存储数量减少，而且质量也随着年龄的增长而下降。目前没有办法能够修复或挽救这些卵子。设想它的部分细胞结构能被正常卵子所替代，可提高卵子质量。途径之一是胞质置换，但是这种胞质置换发生在成熟卵子，并不能解除减数分裂过程中可能发生的染色体失衡。这一问题可通过转移生发泡（GV）期卵子核到一去核年轻妇女的未成熟卵子内来解决，即核移植。然后通过体外培养使这些卵子成熟，以排出第一极体作为核成熟的标志。核移植技术的应用，将会使制造卵子成为可能，给那些由于卵子储备量少而产生卵子数少的患者带来福音。但是，因为线粒体具备一种特性——拥有独立于核DNA的线粒体DNA（mtDNA）、Barritt等［24］报道移植后供者的mtDNA持续存在；大部分学者对这项技术持谨慎态度：胞质内含有遗传物质，重构卵的遗传物质已经发生变化！

7 人类未成熟卵母细胞体外培养

成熟技术自1991年Cha等［25］从因为良性病变而被切除的卵巢中获取不成熟卵母细胞，在体外培养成熟并成功妊娠以来，IVM技术无论在实验室还是临床方面的研究都取得了一定的进展。2004年Chain等［26］报道世界上已有300多例采用IVM技术妊娠的婴儿分娩。IVM技术主要是针对一些卵子成熟障碍的不育症患者，尤其是对于多囊卵巢综合征（PCOS）无排卵者已经有较多的研究并获得了较高的临床妊娠率(25%)［27］。IVM技术是指在不经过超促排卵或少量应用促性腺激素后从卵巢中获取未成熟卵，在体外经过适宜的条件进行体外成熟培养，使卵母细胞成熟并具有受精能力。在IVM过程中，培养环境对卵母细胞的成熟至关重要，在培养系统添加促性腺激素、表皮生长因子、葡萄糖和丙酮酸、卵泡液等有助于卵子成熟，另外，卵泡的直径大小、取卵时间、年龄等因素也会影响卵母细胞的成熟。IVM尽管取得了很大的进步，但仍然存在许多问题和不足：卵子成熟率低、成熟后卵子受精率低、种植率低、IVM卵子质量不能保证。经IVM妊娠分娩的子代尚缺乏足够的临床资料验证其安全性。但是，IVM具有显而易见的临床意义，在于：与IVF/ ICSI技术结合治疗多囊卵巢综合征即卵巢发育不良等疾病；避免患者接受超促排卵导致的卵巢过度刺激综合征的发生；节省医疗费用和就医时间；解决卵巢组织冷冻保存后卵细胞的成熟问题及未成熟卵冷冻保存后的应用问题，将会对癌症患者在化疗或者放疗之前拯救其遗传物质，为高龄妇女建立卵母细胞库具有重大意义；为卵母细胞成熟机制的研究建立体外模式。由此可见，IVM技术的研究对治疗人类不育、推动辅助生殖技术的发展有着深远的影响。经过近20年的发展，我国的辅助生殖技术已经取得了惊人的进步，许多新技术对不育症的治疗产生了很大的作用。在掌握社会和医学伦理以及本领域相关规范的保障下，相信辅助生殖技术会得到健康可持续发展。

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篇7

关键词：基因组编辑；CRISPR-Cas9；猪；基因功能；网络调控

中图分类号：R34；S828 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6510-07

最新的CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）分类表将其描述为三大类型和多个亚型，结合生物化学与分子遗传学方法揭示了不同CRISPR-Cas（CRISPR associated protein）类型的特征[1]，其中II型系统Cas9比其他更为简便。基于CRISPR-Cas9系统的作用原理，研究人员模拟细菌的成熟crRNA和tracrRNA，在体外人工合成gRNA（guide RNA），同样可以达到特异地切割靶标DNA，从而将该系统简化成核酸酶Cas9和人工合成的sgRNA两个组分，在靶标位点导致所期望的插入、删除或替换，由此开创了新型基因编辑技术，这是该系统的“基因工程功能”。更进一步地，通过点突变得到缺乏核酸酶活性的Cas9突变体，命名为dCas9。突变的dCas9可在gRNA的引导下，实现与DNA结合，但不能切割DNA。而dCas9具有融合异源模块的结构域，利用dCas9这3点特性，将其与一系列具有功能的异源模块融合，实现不同研究目的：转录激活与抑制、探索未知基因及其调控元件的功能、全基因组扫描等，这是该系统的“基因调控功能”。不论是基因工程/基因调控，其工作过程是相同的：gRNA通过序列互补原则将核酸酶带到基因组特定位点，使其与靶标结合。不过，基因工程与基因调控是利用Cas9蛋白的不同形式，包括野生型Cas9与人工突变的dCas9蛋白，以实现各自目的[2，3]。该技术能够快速地构建遗传改造的动物，使得在过去要花费数月或数年的工作现在只需几周完成。CRISPR技术与PCR技术类似，正在给生物工程研究带来革命性的改变，从各个方面影响着生命科学的发展[4]。目前基因组编辑CRISPR-Cas中也主要是应用Cas9系统，下面简称“Cas9系统”。

2013年初以来，Cas9系统的快速创新及其拓展应用，使其成为可替代ZFN和TALEN的第三代基因组编辑工具。2013年Science杂志将Cas9系统选为年度十大突破之一（亚军）；2014年美国加州大学伯克利分校生物化学家Doudna博士和德国的Charpentier博士因此共同获得了美国硅谷“科技突破奖”与“阿尔珀特奖”；2015年被Science杂志评选为年度十大突破之首；2016年具有小诺贝尔奖之称的盖尔德纳国际奖授予了三位科学家：Doudna，Charpentier和麻省理工学院的张锋三位博士。几大公司看好Cas9系统的成果商业化前景。Editas Medicine、Intellia Therapeutics和CRISPR Therapeutics等公司已经收到数亿美元的投资。例如，2015年比尔・盖茨等大佬宣布为促进基因编辑技术的蓬勃发展，共投资1.2亿美元参与基因编辑公司 Editas Medicine的B轮融资，Cas9先驱之一张锋是该公司的联合创始人。Editas Medicine计划于2017年采用基因编辑疗法对先天性黑蒙症进行临床试验，这是一种罕见的视网膜疾病，基因突变可能导致眼睛中的感光细胞逐渐消失。据麻省理工W院Broad研究所网站最新报道，农业生物技术巨头杜邦（DuPont）公司宣布对Caribou Sciences公司进行投资，且将获得其专利在农作物使用的独家授权。而Caribou Sciences是Cas9技术首创之一Doudna博士实验室的附属公司。目前，杜邦公司正在温室中种植Cas9编辑的玉米、大豆、水稻和小麦，期望在5～10年内出售Cas9技术的产品。位于明尼苏达州圣保罗的动物生物科技公司Recombinetics正在开发同类动物，包括无须抑制牛角生长的牛和不需要被的猪。2016年6月底，美国国立卫生研究院（NIH）顾问委员会批准了一项申请：利用Cas9系统强化依赖于患者T细胞（一种免疫细胞）的癌症疗法。由于其易用性和通用性，Cas9已经被世界各地的实验室用来改写基因组和重塑细胞，其在医学和农业领域的潜在应用是无穷无尽的，它将开启该行业新一波的产品浪潮和利益追逐。根据瑞士洛桑附近的咨询机构IPStudies介绍，全球已有超过860项CRISPR专利，平均每天新增加一项专利。世界许多遗传学家和生化学家普遍认为，Cas9系统可对所有的生物进行改造，这是一项可改变生命未来的伟大技术，当然，该技术也面临许多伦理挑战。

1 CRISPR-Cas9系统的拓展性应用研究

最初的Cas9只能实现剪切的基因工程功能（CRISPR1.0版本）。每次只能执行一种功能的dCas9是CRISPR2.0。现在研究人员将突变dCas9蛋白与一系列具有功能的异源模块融合，成为能够执行多重功能的CRISPR3.0。这种平台能够执行复杂的程序，适用于研究基因网络机理和更深入探讨复杂性状/疾病[5]。

1.1 同时激活多基因表达/同时抑制多基因

Chavez等[2]设计了三方转录激活子（VP64-p65-Rta）融入dCas9，可探讨一连串基因回路对生物过程（比如组织发育或疾病发生）的影响，也可以精确指导干细胞分化，生成再生医学所需的移植器官。Konermann等[6]应用改造后的Cas9系统成功激活了十个基因，包括长非编码RNA（LncRNA）。这些基因转录效率得到了两倍以上的增长，该研究的意义在于，人们可以用这一技术在活细胞中有效启动任何基因表达[7]。Cas9系统已被成功地用于同时干扰小鼠2个基因和敲除猴与蚕的两个基因[8，9]。多位点编辑将促进多方面研究，包括上位效应的检测和基因组中物理距离非常接近的多基因操作。Ma等[10]同时靶向基因家族的多成员（多至8个位点），突变率平均为85.4%。Zalatan等[11]应用架RNA（scaffold RNA，scRNA），成功在酵母中重新定向了一个复杂的多分支的代谢通路，其中一些基因被激活，另一些基因被抑制（CRISPRa/i）。多基因的组合控制可以帮助人们灵活操纵细胞中的通路，例如，改写细胞命运或者设计代谢通路。Cheng等[5] 报道其CRISPR 3.0版本是Casilio，该系统可结合多个蛋白模块，包括基因激活、基因抑制、染色体荧光标记、组蛋白乙酰转移酶等，以实现不同的目的。

1.2 运用Cas9实施表观遗传学编辑

Kearns等[12]报道dCas9-组蛋白脱甲基酶LSD1 在鼠胚胎干细胞中靶向转录因子Oct4的远端增强子，抑制Oct4转录并失去多能性。许多酶能以不同的机制催化DNA去甲基化，其中，TET（Ten-Eleven Translocation dioxygenase）双加氧酶家族有3个成员：TET1、TET2和TET3，催化的5-甲基胞嘧啶氧化，可启动DNA的去甲基化。Xu等[13]首先向传统sgRNAs中插入两个拷贝的噬菌体MS2 RNA元件，构建了修饰后的sgRNA2.0，这有利于Tet1催化结构域（TET-CD），与dCas9或MS2外壳蛋白融合，以靶向基因位点。结果证明，dCas9/sgRNA2.0指导的去甲基化系统能有效地将靶基因去甲基化，可显著上调靶基因的转录，包括RANKL、MAGEB2或MMP2，而且这结果与它们启动子中相邻的CpG岛的DNA去甲基化密切相关。类似的工作与结果也由Choudhury等[14]报道于模式抑癌基因BRCA1启动子。这些结果不仅可以帮助我们理解在特定背景中DNA甲基化如何调节基因表达的机制，而且也使我们能够控制基因表达与功能，并带来潜在的临床效益。表观遗传效应模块的汇总详见文献[15]。

1.3 运用Cas9开展高通量全基因组遗传学筛选

全基因组 CRISPR 筛选克服了传统遗传筛选的缺点，可应用于几乎任何细胞系和任何遗传背景下的筛选[16]。应用其进行遗传筛选的基础是蛋白Cas9修饰后的多种形式融合和sgRNA文库。构建Cas9高通量筛选的文库有两种：阵列文库和混合文库。（1）细胞系中开展遗传学筛选。Wong等[17]创建了Cas9与CombiGEM结合的平台技术，可展望，该平台有着广泛的应用前景，加速系统鉴定控制人类疾病表型的遗传组合，并转化到新药物组合的发现。（2）体内开展遗传学筛选。Ma等[18]将活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶（AID）与dCas9融合成为dCas9-AIDx，在慢性粒细胞中靶标BCR-ABL，鉴定了赋予细胞伊马替尼抗性的已知突变和新突变。Zhu等[19]开发了配对的gRNAs（pgRNAs），产生大片段缺失，应用这种高通量方法确定了51条功能性的lncRNAs，并验证了其中的9个。该方法使科学家们能够快速识别哺乳动物非编码元件的功能。

1.4 光遗传学加CRISPR调控基因表达与靶DNA切割

东京大学和杜克大学基于光诱导的CRY2（色素）和CIB1（蛋白），开发出相似的光遗传学+CRISPR系统，其目的是利用光来开启和关闭基因表达，同时赋予时空控制和可逆性[20-22]。

1.5 通过荧光标记的dCas9对DNA实施标记

Deng等[23]w外构建“dCas9/荧光素”复合物作为探针，可视化基因组位点完全没有引起DNA变性，称为Cas9介导的荧光原位杂交（CASFISH）。dCas9/sgRNA能够在近着丝粒区、着丝粒、G富集端粒和编码基因等位点快速而有效地进行重复DNA元件标记，也适用于初生组织切片的检测。这种技术具有快速、有效、破坏性较少与成本低的特征，为基础研究和遗传学诊断增加了一种非常有潜力的工具。

1.6 CRISPR-Cas9系统同时实现基因工程和基因调控的双重功能

Kiani等[24]开发了Cas9系统一个新策略，能够同时实现基因组工程和基因调控的双重功能。其使用经过改造的gRNA和Cas9蛋白，在切割特定基因的同时调控其他基因的表达。这一技术大大增强了基因组编辑和基因调控的功能性，帮助我们进一步操纵细胞，以揭示重要生命过程背后的复杂机理，比如，癌症耐药性和干细胞分化，或者帮我们设计更高级的人工基因回路。更进一步地，双重功能Cas9可以促进基因工程菌株（例如大肠杆菌）大规模生产化合物和燃料。

1.7 多顺反子基因

Xie等[25]将tRNA与gRNA结合起来，开发合成了一个多顺反子基因，以提高Cas9系统的靶向能力和多重编辑效率，能够在水稻中高效实现多重基因组编辑和染色体片段删除（可达到100%）。Qi等[26]设计多个tRNA-gRNA单元，在玉米中的研究表明，该系统不仅增加靶向位点数目，也能更有效和准确地缺失染色体片段，这对基因功能的完全消除特别是lncRNAs的研究很重要。同时还表明，在一个表达盒中可容纳多达四个tRNA-gRNA单元，用来修饰同一基因家族中的不同成员或同一代谢途径中的不同调控基因。

1.8 Cas9系统应用于多能干细胞

诱导型多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）可无限地自我更新，而不会丧失分化成所有细胞类型的能力，且绕过了免疫排斥的障碍。iPSCs在再生医学中具有良好的前景，是用于致病突变原位校正的一种理想细胞群。将CRISPR应用到iPSCs中为纠正遗传缺陷疾病开辟了一条新途径，因为iPSCs很难采用传统的基因打靶策略进行操作，尤其是蛋白质介导的基因组编辑方法[27-30]。

1.9 染色体大片段和lncRNA编辑

Shechner等[31]介绍了以CRISPR-Cas9为基础的基因组靶向技术展示：CRISPR-Display（CRISP-Disp），将gRNA-ncRNA融合，能将大片段非编码RNA带到特定DNA位点，同时不影响dCas9的功能。CRISP-Disp系统可容纳约4.8 kb的RNA结构域，这相当于天然lncRNA的长度。除了lncRNA以外，研究人员还对各种天然和人工非编码RNA进行了测试，表明gRNA可以偶联多个非编码RNA结构域，这些结构域可同时且独立起作用。CRISP-Disp可用来解决如下问题：一个lncRN段是如何调控基因表达的？是这个片段的转录本在起作用，还是它本身的序列在起作用？揭示lncRNA在表观遗传学修饰、染色质重塑或者转录调控中做出的贡献。该系统除了研究非编码RNA机理外，对合成生物学来说，CRISP-Disp的灵活性、模块化和多重化特性是很有吸引力的。用CRISP-Disp招募RNA-蛋白复合体到特定位点，可以设计出复杂的基因调控回路。Yoshimi等[32]开发出了两种基因改造新技术：lsODN（long single-stranded oligodeoxynucleotide）和2H2OP（Two-hit two-oligo with plasmid）），来完成相对较长的DN段，如GFP（Green fluorescent protein）序列的靶向基因敲入，提高基因编辑的效率。第一种方法是利用lsODNs作为靶向供体。第二种方法是共同注射两个gRNAs作为“剪刀”切割基因组DNA和供体质粒DNA中的靶位点，两个短ssODNs作为“浆糊”连接切割位点的末端。利用开发出的两种基因改造方法，该研究小组成功实现了高效、精确敲入GFP基因，导入了近200 kb的大片段基因组区域，这是采取传统方法不可能做到的。并用人源基因替代了大鼠基因，构建出了基因人源化的动物。这两种基因敲入方法将会提高遗传工程改造的效率。研究人员高度期待这些遗传工程生物将用于药物研发、转化和再生医学等广泛的研究领域。

1.10 研究蛋白质工程

Hess等[33]开发了一种称为重利用体细胞超突变的原位蛋白质工程新技术，命名为CRISPR-X。研究人员利用dCas9召集胞嘧啶氨酶（AID）变异体，其携带有经过MS2修饰的sgRNAs，能特异地诱变内源靶标，限制脱靶伤害。它能产生不同点突变的多样文库，同时靶向多个基因组位点，结果从中找到了引发Bortezomib耐药性的已知和新突变。还利用超活化AID变异体，同时诱变了转录起始位点上游和下游的位点。这些结果均表明 CRISPR-X是一种强大的工具，能帮助科学家们创建复杂的原始遗传突变文库，分析完善蛋白质工程。

2 CRISPR-Cas9系统在猪中的研究进展

Cas9系统出现之前，已经有文献报道了其他技术的基因组编辑猪[34]，现在利用Cas9系统的报道层出不穷。这里重点综述Cas9系统在猪研究中的进展，因为猪不仅提供肉食，同时其在生理学、免疫学和基因组学上与人高度相似，器官大小也比啮齿动物有优势。

2.1 功能基因研究

Su等[35]合成sgRNA时用猪U6启动子代替人U6启动子，获得更佳的打靶效率；Wang等[36]显微注射Cas9 mRNA和sgRNA至猪原核期胚胎，筛选出打靶效率最高的sgRNA；He等[37]将携带GFP和红色荧光蛋白（RFP）的Cas9质粒先后转染猪胎儿成纤维细胞，通过双重荧光筛选提高打靶成功效率；吴金青等[38]应用SSA（Single-strand annealing）报告载体，使Cas9系统对猪胎儿成纤维细胞的打靶效率提高5倍左右。八聚体结合转录因子4（OCT4）是参与调控胚胎干细胞自我更新和维持其全能性的重要转录因子之一。Kwon等[39]研究表明Cas9系统可针对孤雌胚胎实现基因OCT4的敲除和敲入。Lai等[40]构建了一个猪OCT4的报告系统，其内源性OCT4启动子可直接控制RFP，因此荧光能准确地显示内源性OCT4的激活，并获得了在内源性OCT4基因启动子下游具有tdTomato基因敲入的猪胎儿成纤维细胞（PFF）系。Cas9系统编辑的PFFs被用作体细胞核移植（SCNT）的供体细胞，在SCNT胎儿的囊胚和生殖嵴中检测到了强大的RFP表达，并制备了两头有生命力的基因编辑猪。

2.2 提高生产性能

肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）基因对肌肉生长发育具有重要调控作用。Crispo等[41]、Cyranoski[42]、Wang等[43]和张冬杰等[44]利用Cas9系统获得了MSTN基因的双等位基因敲除猪。湖北省农业科学院畜牧兽医研究所Bi等[45]应用Cas9系统制备了无选择标记的MSTN基因敲除克隆猪。首先，利用Cas9系统介导的同源重组敲除猪初生细胞中MSTN的一个等位基因。然后，用Cre重组酶来切除选择标记基因，有效率为82.7%。免疫印迹显示，克隆猪MSTN大约有50%的降低，同时肌原性基因在肌肉中的表达有所增加。组织学显示，肌纤维数量增加，但是肌纤维大小保持不变。超声波检测显示，最长肌大小增加，背部脂肪厚度降低。该研究提供了一种可靠的途径用于家畜良种生产，也提出了一种策略来减少潜在的生物学风险。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所的李奎教授领导研究团队，首次利用Cas9系统获得了位点特异性的基因敲入猪模型[46]，得到一个新的基因组“安全港”位点：pH11位点，通过Cas9系统分别在细胞、胚胎和动物体内的该位点插入了大于9 kb的基因片段，实现了稳定高效的基因表达。

分化簇 163（Cluster of differentiation 163，CD163）被认为是猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的受体基因，分化簇1D（CD1D）是一类抗原递呈因子。Whitworth等[47]利用Cas9系统分别敲除CD163和CD1D的基因编辑猪；经过蓝耳病毒株攻毒后CD163双等位基因敲除猪未表现出临床症状，具有良好的抗蓝耳病能力。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所利用Cas9系统进行抗PRRSV和抗猪传染性胃肠炎（PEDV）的CD163和CD13双基因编辑猪的制备，正在开展相关验证鉴定工作。这些研究在养猪业引起了高度关注。

2.3 研究人类疾病的动物模型

猪是人类医学研究极佳的动物模型。vWF（von Willebrand factor）的基因是引起人血管性血友病的主因。Hai等[48]应用Cas9系统靶向猪vWF外显子，目的基因插入/缺失突变效率达到 68.8%（11/16）；单等位基因突变和双等位基因突变的vWF抗原水平均极显著低于野生型个体（P

再如，去除所有主要淋巴细胞的猪是研究人X-染色体连锁的严重联合免疫缺陷（SCID）患者病毒感染和免疫受损发病机理的理想动物模型。破坏IL2RG的猪比啮齿动物敲除IL2RG模型更接近于SCID表型。Lei等[50]利用Cas9系统快速生成双基因RAG2/IL2RG敲除猪，成功建立了人诺如病毒（HuNoV）感染的免疫缺陷的猪模型，因为RAG2/IL2RG缺陷猪缺乏B细胞、T细胞和自然杀伤细胞。Yu等[51]成功地通过Cas9系统在滇南小型猪产生人类DMD疾病动物模型。

2.4 医学生物反应器

猪除了作为人类疾病模型外，也可作为生产人类需要的产品反应器。例如，赖良学课题组利用精确Cas9系统对猪胰岛素基因进行了无痕定点修饰，3头可以分泌人胰岛素的克隆猪，其中2头完全分泌人胰岛素，而不含猪胰岛素；另一头既分泌人胰岛素也分泌猪胰岛素。牛泌乳量大、乳汁活性蛋白的产量高，因此其乳腺是理想的生物反应器，Peng等[52]通过CRISPR技术建立了人血清白蛋白的生物生产器。人成纤维细胞生长因子2（hFGF2）是一种多功能生长因子，在促进组织生长发育、新血管形成和参与组织修复过程中起着重要的作用，但其在人体内的表达量较低。Jeong等[53]借助Cas9系统将该基因导入到牛成纤维细胞的β-casein基因内含子中，为获得表达hFGF2蛋白的基因编辑牛奠定了基础。谷氨酸棒杆菌是工程化应用传统方法（同源重组）批量生产氨基酸的重要生物机体。Cleto等[54]采用CRISPRi降低该菌的基因PGI和PCK的表达高达98%，降低基因PYK高达97%，从而大大增强了L-赖氨酸和L-谷氨酸产品滴度的比率。这种新谷氨酸代谢工程方法只需要3 d时间，表明CRISPRi可用于快速且有效地代谢途径改造，而不需要对基因缺失或突变。

2.5 异种器官移植

据不完全统计，全世界大概有200万人需要器官移植，而器官捐献的数量远远低于需求数量[55]。尤其是老龄化和慢性疾病的多发，更加导致供体器官严重不足。猪被认为是人体异种器官来源的首选动物，因为猪与其他哺乳动物比较，无论从器官大小、生理结构和基因组相似度都更接近于人，因此，上世纪90年代应用猪生产人类器官项目一度在全球受到追捧，但受阻于猪内源性逆转录病毒（Porcine endogenous retrovi-ruses，PERVs）造成的重大医疗风险。哈佛大学利用Cas9系统对猪肾细胞系PK15中所有62个拷贝的PERV pol（多聚酶）基因敲除，使内源性病毒传递给人的风险降低了1 000倍以上[56]。该研究扫除了猪器官用于人体移植的安全障碍，为全世界亟需器官移植的上百万病人带来希望，也重新燃起了大家对异种器官移植的信心。

免疫排斥反应是猪器官移植另一障碍。α-1，3-半乳糖基转移酶（GGTA1）基因与异种器官移植后的超急性免疫排斥反应显著相关，Sato等[57]在猪胎儿成纤维细胞中通过Cas9系统获得了GGTA1双等位基因敲除的细胞系。Li等[58]针对3个与免疫排斥相关的基因GGTA1、胞苷单磷酸N-乙酰神经氨酸羟化酶（CMAH）和异红细胞糖苷酯合成酶（iGb3S）基因，共转染靶向这2个或3个基因的CRISPR/Cas9-PX330构质粒，最终获得了敲除单个基因及同时敲除2个或3个基因的胎儿或仔猪。利用类似的方法，Estrada等[59]对猪肝脏细胞分别敲除GGTA1、GGTA1/CMAH和GGTA1/CMAH/β4GalNT2（β-1， 4-N-乙酰半乳糖胺基转移酶2）基因。

3 CRISPR-Cas9系统的前景

CRISPR-Cas9系统在如此短的时间内极大地推动了生物学的各个方面研究，例如基因功能解析、基因治疗、人类疾病动物模型、生物生产反应器和农业动植物优质遗传育种。该技术生成的产品，定向改变但不含外源基因/片段，在验证其安全性的基础上，这种经过“基因组编辑”的产品更容易被消费者接受。理论上它不会带来健康或环境方面的风险，但是否应该受到转基因相关法律的约束，美国和欧盟的态度不一致。作为新兴的基因组编辑技术，有必要进一步完善其特异性、脱靶效应和输送方法，以及如何更好地激活细胞自身的同源重组，并探索新型基因组编辑技术及其应用，例如，新CRISPR-Cpfl系统[60]、新型NgAgo系统[61]；无序列限制的DNA编辑新工具[62]、纳米颗粒技术[63]等等。

r业动植物改良从来都是一个漫长而繁琐的过程，而如今，科学家因为有了CRISPR技术能够快速而轻松地实现。近两年，许多实验室将这种工具应用在动植物和微生物中，以期获得更高产、更适应环境和更优质的品种。有理由相信，CRISPR-Cas9系统将更好的服务于人类，包括动植物育种。

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篇8

一、微生物培养中的筛选问题

对于微生物来说，不同的微生物需要不同的培养基。培养基就是根据不同微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。从物理性质来讲，常用固体培养基通过平板划线分离法或稀释涂布分离法进行分离筛选目的菌种，如在以尿素为唯一氮源的固体培养基中，采用稀释涂布分离法可筛选出以尿素为唯一氮源的微生物；从目的用途上讲，常用选择培养基进行筛选目的菌种。选择培养基就是在培养基中加入某种化学物质，抑制不需要的微生物生长，以获得人们所需的微生物。如培养基中缺乏碳源可筛选出自养型微生物，培养基中缺乏氮源可筛选出自生固氮菌，培养基中加入高浓度食盐可筛选出金黄色葡萄球菌。利用微生物进行现酵生产，其首要任务就是通过上述方法从自然界中分离筛选出符合生产要求的单一优良野生菌种，然后再经过诱变育种、基因工程或细胞工程获得优良菌种。

二、基因工程中的筛选问题

基因工程的核心步骤是形成重组DNA，即用同一种限制酶处理目的基因和质粒，使其露出相同的粘性末端，然后在适量的DNA连接酶作用下，形成一个封闭式的环状DNA。这些环状DNA有两种是由一个DN段形成的，即目的基因环状物和质粒环状物；有三种是由两个DN段形成的，即质粒自连的环状物（即普通质粒）、目的基因自连的环状物、质粒与目的基因相连的环状物（即重组质粒或重组DNA）。

如何从这五种环状物中筛选出重组质粒，并将其导入到受体细胞呢？首先要选择质粒，选择的质粒应具备两种或两种以上抗生素抗性基因，如图1所示。然后将目的基因插入到其中的一个抗生素抗性基因，如将目的基因插入到四环素抗性基因（Tetr），导致Tetr结构破坏而无法表达。

在进行导入操作时，普通质粒和重组质粒都可能导入受体细胞，而目的基因自连的环状物无法导入，因此在导入操作后存在三种受体细胞的混合物：多数没有导入任何质粒的受体细胞（普通受体细胞）、很少导入普通质粒的受体细胞（不含目的基因）和导入重组质粒的受体细胞（获得目的基因）。

第一次筛选：将含有三种受体细胞的混合物接种到含氨芐青霉素的选择培养基中培养，普通受体细胞不含氨芐青霉素抗性基因（Ampr）无法生存，而导入普通质粒和重组质粒的受体细胞都具有Ampr，所以都能生存和增殖，长成菌落。从而筛选出导入普通质粒和重组质粒的受体细胞。

第二次筛选：采用影印接种法，即用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，构成印章（即接种工具，图2和图3A所示）；然后把前述经过第一次筛选长出菌落的母平板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下（图3B）；再把此印章在另一个含四环素抗性基因的选择培养基（图3D）的平板上印一下。这样，由于重组质粒的Tetr被目的基因破坏，不能形成菌落的即为含有重组质粒的受体细胞，根据对比（如图3C和3D所示），就能在母平板的培养基上筛选出含有目的基因的受体细胞。

三、细胞工程中的筛选问题

1. 植物体细胞杂交

在植物体细胞杂交过程中，将A和B两细胞去细胞壁后人工诱导原生质体融合形成融合体（AB），还有未融合体（A、B）、多元融合体（AA、BB）和嵌合体。但只有AB型细胞是植物体细胞杂交所需的杂种细胞。因此在杂种细胞形成后还应有一个筛选过程。筛选的方法有：（1）突变细胞系互补选择法：包括叶绿体缺失互补、营养缺陷互补、抗性互补和遗传互补等，前两种为隐性性状，其实施的关键是作为遗传标记的有关突变体的利用。遗传互补是一种很好的筛选方法，即两个突变的细胞融合后才能正常生长，但由于受到突变体不易获得的限制，且有些突变体不易再生，该法应用并不广泛；（2）物理特异性差异选择法：利用两个原生质体亲本的物理特异性差异的选择，例如根据愈伤组织的颜色、荧光特性等在显微镜下机械分离杂种细胞。当以荧光特性作为依据时，可采用流式细胞光度仪来分离杂种细胞，该法不但准确、效率高，而且用荧光化合物标记原生质体并不影响细胞再生植株的能力，但价格昂贵；（3）生长特异性差异选择法：根据两种原生质体亲本的生长特异性（如形态、色泽）来选择；（4）不对称融合法：不对称融合指一方亲本的全部原生质体与另一方亲本的部分核物质及胞质重组，产生不对称杂种。一般用碘乙酰胺处理受体使其酶失活，单独培养不能生长和分裂；而供体由于受到射线辐射，大部分染色体受到损伤，细胞不能生长；只有融合体发生互补作用才能生长，从而筛选出杂种细胞。

融合后的原生质体，在适当的培养条件下，可以再生出新的细胞壁，进而进行细胞分裂及分化，形成再生植株。获得再生植株后，还必须对其进行严格的鉴定，可以从基因组DNA和基因表达两方面来进一步确认。前者主要是利用各种已知的分子标记如限制性片段长度多态性、随机扩增多态性DNA、简单重复序列、扩增片段长度多态性等进行杂种鉴定，后者主要是通过同工酶、次生代谢产物的分析来确定杂种植株。例如Austin等通过对再生植株苹果酸脱氢酶、磷酸葡糖异构酶等酶的同工酶进行分析获得了杂种植株。此外，形态学（植株表现型）及细胞学（染色体的形态和数目）的观察和比较也是常用手段。

2. 单克隆抗体的制备

在单克隆抗体的制备过程中，首先用相应抗原刺激小鼠，当从小鼠脾脏中分离出能产生抗体的效应B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合时，将会形成多种细胞的混合体，包括B淋巴细胞、骨髓瘤细胞、B－B融合细胞、骨髓瘤－骨髓瘤融合细胞、B－骨髓瘤融合细胞（即杂交瘤细胞）和细胞多聚体（容易死亡，无需筛选），如何从混合细胞中提取到杂交瘤细胞呢？

第一次筛选：目的是获得代谢缺陷型骨髓瘤细胞。通过突变诱导次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞，并经过毒性培养基筛选出的HGPRT-或TK-骨髓瘤细胞。具体方法是将诱导突变的骨髓瘤细胞放入含氮鸟嘌呤或6－硫代鸟嘌呤的培养基上，含HGPRT的骨髓瘤细胞会将氮鸟嘌呤或6－硫代鸟嘌呤转变成相应的核苷酸形式参与DNA合成而发生毒性作用，使细胞致死。而HGPRT-骨髓瘤细胞由于HGPRT活性丧失，不能使用含氮鸟嘌呤或6－硫代鸟嘌呤，能生活在高浓度的含氮鸟嘌呤或6－硫代鸟嘌呤的培养基上。同理，在培养基中加入5－溴尿嘧啶脱氧核苷（BudR），可筛选出TK-骨髓瘤细胞。

第二次筛选（图4中A过程）：目的是从5种细胞中筛选出杂交瘤细胞（用HAT选择培养基）。HAT选择培养基是在普通培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物质配制而成。而细胞的DNA合成途径有两条：主要合成途径（D途径）是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为辅酶参与，而氨基蝶呤是叶酸的抑制物，可阻断细胞合成DNA。辅助途径（S途径）可直接利用外源核苷酸合成DNA，在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸存在情况下，经次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用下合成DNA。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞和融合的骨髓瘤－骨髓瘤细胞由于培养基中氨基蝶呤存在无法利用D途径合成DNA；又因缺乏HGPRT或TK，不能利用S途径合成DNA而死亡。未融合的B淋巴细胞和融合的B-B淋巴细胞虽具有HGPRT和TK，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有杂交瘤细胞从B淋巴细胞获得了HGPRT和TK，并具有骨髓瘤细胞无限增殖的特性，所以能在HAT培养基中存活和增殖，从而最终筛选出杂交瘤细胞。

第三次筛选（图4中B过程）：目的是获得产生特异性抗体的杂交瘤细胞。在实际免疫中，由于实验小鼠在注射目标抗原前，其体内已有大量病原体，会存在大量的针对不同类型抗原的效应B细胞，因此不同的杂交瘤细胞产生的抗体也不同。目前从杂交瘤细胞群中筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞最常用的方法是有限稀释法，将处于对数生长期的杂交瘤细胞用培养液充分稀释后，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个杂交瘤细胞，再由这些单细胞克隆生长，当细胞培养形成群落到覆盖10%～20%孔底时，吸取培养液的上清液用酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）测定，其原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在聚苯乙烯等固相载体上的可溶性抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应。利用上述方法可筛选出针对目标抗原的抗体的阳性杂交瘤细胞，并使其扩大培养或冷冻保存。

四、胚胎工程中的筛选问题

篇9

关键词：肝炎病毒，乙型；基因；变异(遗传学)

乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)的基因组由长度为3200个碱基对、部分双链的环状DNA分子构成，含有4个部分重叠的开放读码框架(OpenReadingFrame，ORF)，即SORF、CORF、PORF和XORF。HBV的聚合酶(Polymease，Pol)/逆转录酶(ReverseTranscriptase，RT)缺乏纠错功能，允许复制错误发生。复制错误将导致多种不同的HBV准种的出现。

1、SORF变异

HBVDNA的SORF包括前-S1区、前-S2区(两者合称前-S区)和S区，编码产物最基本的功能是构成HBVDane颗粒的包膜蛋白。目前的研究认为，SORF编码的大蛋白具有反式激活功能，与HBV的复制密切相关，而且血清大蛋白的检测对评估慢性乙型肝炎患者的病毒感染状况和隐匿性HBV感染患者的检出具有重要意义[1-2]。

前-S1区和前-S2区与P基因的空白区重叠，这两个区域都具有B细胞和T细胞的识别位点。一些前-S1区的变异可以导致被截断的大蛋白在胞浆内的积聚，这会抑制病毒的分泌并具有细胞毒效应。但是，Gao等[3]研究发现，在有的肝癌患者体内，大蛋白完全缺失的HBV也可以成为优势种群，他们认为，是患者体内的野生型前-S蛋白修复了这种缺陷，即体内的野生株HBV帮助了这种缺陷病毒株，确保了其在体内的存活。前-S2区变异包括前-S2ATG的缺失或错配，引起蛋白合成终止以及B细胞和T细胞表位的缺失或改变。前-S变异经常出现在应用干扰素治疗的患者中[4]。前-S区的缺失变异会影响大蛋白对小蛋白的比例，导致与肝病恶化相关的内质网压力过大，进而引发大蛋白或中蛋白与宿主染色体整合，增加了肝细胞癌变的可能[5]。Mun等[6]研究发现，前-S区缺失的频率随肝脏疾病的临床严重程度逐渐增加，但前-S1和前-S2的缺失频率是有差别的，前-S1缺失在肝细胞癌患者中发生率最高，而前-S2缺失在肝硬化患者中发生率最高。

S区点变异可导致逃逸变异株的出现，变异通常发生在HBsAga抗原决定簇区域，目前报道较多的变异形式多为sG145R[7]。此外，基因分析表明，sP120A变异与HBsAg血清抗体转换有关，这种变异降低了抗-HBs的结合作用，使HBsAg的检测失败[8]。文献报道，有10个S基因变异与疫苗免疫逃逸相关，分别是sP120T、sI/T126N/A、sQ129H、sM133L、sK141E、sP142S、sD144A、sG145R、sF158Y和sF161Y[9]，但这些变异的临床意义还有待进一步研究。

2、CORF与XORF变异

HBVDNA的CORF包括前核心区和核心区，有各自的翻译起始密码子ATG，分别编码前核心蛋白和核心蛋白。

前核心蛋白经过修饰最终形成可溶性抗原HBeAg。核心启动子变异和前核心变异均会影响HBeAg的表达。HBVDNA的XORF编码HBx蛋白。HBx蛋白是一种多功能病毒蛋白，具反式激活作用。

在从HBeAg-/抗-HBe+的患者体内分离到的病毒株中，A1762T和G1764A双重变异是最常见的BCP变异形式。

这种变异会引起HBx蛋白结构中两个氨基酸的变化进而影响HBx蛋白的活性以及改变病毒增强子的反转录作用[10]，与肝细胞癌的发生关系密切[11]。Fang等[12]通过3年的纵向病例分析得出，A1762T和G1764A双重变异与HBeAg+患者体内较低的病毒载量有关，但对HBeAg-患者体内的病毒载量没有影响。T1766/A1768变异与暴发性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的发生有关联。Ren等[13]的研究表明，慢加急性肝衰竭(无肝硬化基础)的患者与慢性乙型肝炎患者相比，A1762T/G1764A检出率显著增高。

前核心变异株则通过干扰前核心读码框架而完全终止HBeAg的表达，有时还伴随着起始密码子错配变异和前核心区的框架移位变异。最常见的前核心变异是前核心区28位密码子(Codon28)由TGG变为TAG(G1896A)。核心区发生变异会终止HBeAg的表达，引起HBeAg阴性肝炎。由于HBeAg与HBcAg有共同的抗原决定簇，缺少HBeAg有可能使表达HBcAg的肝细胞更容易受到免疫细胞的攻击，临床上表现为HBeAg阴性肝炎病情容易出现反复，发生暴发性肝炎(肝衰竭)的几率增高。有研究发现，慢加急性肝衰竭患者的G1896A变异率显著高于慢性乙型肝炎患者[13]。

A1762T/G1764A和G1896A检测有助于区分临床上慢性乙型肝炎急性发作和急性乙型肝炎[14]。

与以上研究相反，有研究者认为，核心启动子变异和前核心变异不会引起肝脏功能失代偿，而是对肝脏功能失代偿起保护性的影响，HBV基因型与肝脏功能失代偿也没有明显的关系[15]。Poustchi等[16]通过研究认为，在慢性乙型肝炎D基因型患者中，BCPA1762T和G1764A双重变异与肝脏疾病恶化相关，而G1757A变异却对宿主有一定的保护作用。

核心区编码基因相对保守，其编码的核心蛋白是宿主免疫反应攻击的主要靶抗原，它的变异可直接影响到宿主对HBV的免疫应答。有研究显示，核心区变异株(G87、V60)与野生株比较，前者可使宿主细胞内HLA-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平降低[17]。Sugiyama等[18]研究认为，核心区A2339G(codon147)变异在体外会增强HBV的复制；而且发生此变异的患有慢性乙型肝炎的儿童和没有此变异的患有慢性乙型肝炎的儿童相比，在血清HBeAg抗体转换之前，前者的ALT峰值较高。

3、PORF变异

从HBVDNAPORF的N-末端到C-末端，共涉及4个功能区，即末端蛋白区、间隔区、Pol/RT区、核糖核酸酶H区。RT区又包括7个功能亚区，从RT区上游第1个氨基酸起依次为A、B、C、D、E、F、G亚区。当前所有耐核苷(酸)类药物的基因变异位点都位于RT区。

拉米夫定为胞嘧啶左旋核苷类似物，其耐药变异位于RT区C亚区的YMDD基因序列，最常见的变异为rtM204I/V/S，而A亚区L80I变异以及B亚区rtV173L变异和rtL180M变异为其补偿突变，以维持病毒的复制力[19]。文献报道，拉米夫定也可诱导B亚区rtA181T/S变异[20]。替比夫定为胸腺嘧啶左旋核苷类似物，与LAM均为左旋核苷类药物，分子结构和作用目标位点相似，因此二者存在交叉耐药，常见变异为rtM204I。阿德福韦酯为无环腺苷类似物，RT区D亚区rtN236T变异与B亚区rtA181V变异是ADV的常见耐药变异形式。有文献将rtA181T变异也归为阿德福韦耐药变异，但还尚存争论[20]。恩替卡韦为鸟嘌呤核苷类似物，其耐药特点是发生在拉米夫定耐药的背景上，耐药位点是在LAM耐药位点基础上另加B亚区T184、S202和/或M250变异。

此外，在未应用过核苷(酸)类药物治疗的慢性乙型肝炎患者中，YMDD基因序列变异的发生率从1%-27%不等[21]。

因此，有必要在应用核苷(酸)类药物治疗前对患者进行HBV耐药变异检测[22]。

4、小结

HBV是一种高变异的嗜肝DNA病毒。HBV基因变异可以在宿主自身免疫应答、病毒复制适应性等内因的影响下发生，也可以发生于核苷(酸)类药物或疫苗接种等外因作用之后。HBV变异是影响其感染发生、发展和转归的重要因素。HBV基因变异常常引起病毒生物学特性的改变，在引发疾病的临床表现、诊断、预后和预防等方面带来很多新的问题。

5、参考文献

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7月11日下午5点左右，爱尔兰都柏林的物理学家尚恩·伯尔金及其同事捕捉到了科学史上最激动人心的一滴液滴滴落—沥青。这个实验开始于1944年，目的是为了展现沥青的高黏度和低流动性。澳大利亚布里斯班昆士兰大学更是早在1927年就开始进行这项实验，目前已滴下8滴沥青，遗憾的是一次都没有拍到。

植入记忆或成真

美国麻省理工学院脑与认知科学系利根川进教授的研究团队7月25日宣布，他们已成功给小鼠的大脑植入虚假记忆，从实验上证实了人为改造记忆的可能性。研究者通过光遗传学手段标记并激活与一个特定记忆相关的脑细胞，从而人为激活某个记忆过程。下一步，这个研究团队计划通过选择性地标记并关闭与某一个记忆有关的脑细胞，研究是否可弱化甚至抹除记忆。

实验室牛肉就要走上餐桌？

8月5日，澳大利亚和美国的两位美食家在伦敦受邀试吃了一个实验室培育的牛肉汉堡。这种牛肉由荷兰马斯特里赫特大学教授马克·珀斯特领衔的实验室培育，利用牛肉肌肉干细胞创造出了更多的肉类纤维。两位美食作家品尝完汉堡后评价道：有肉味，但质地比较干，味道也有些淡而无味。不过马克·珀斯特认为，该项目将为畜牧业找到一种可持续的替代行业。

最大病毒被发现

法国埃克斯-马赛大学的研究者在智利沿海和澳大利亚一处池塘发现了一种巨大的病毒，该种病毒有1微米（百万分之一米）大，是一般病毒尺寸的10倍。而且，它的基因与地球上其他生物的基因的相似度仅为6%。科学家认为它起源于一种已灭亡的古老的细胞形态，甚至有可能来自外星球。虽然这种病毒的个子很大，不过研究者认为，它只存在于水下，应该不会对人类构成严重威胁。

光速为零

光速每秒30万公里，但德国达姆施塔特工业大学物理学教授哈夫曼、胡布利克与博士生海恩斯让光停了下来。他们利用“电磁感应透明”效应技术，让光停留在水晶里长达60秒，打破了今年年初刚创造的16秒的世界纪录。这项研究也为专家把光加速到超越宇宙限制提供了线索，也许有一天人类可以把数据存在光里传到很远的地方。

木卫二或适合人类居住

火星上是否有生命迹象的探索尚未得出结论，美国科学家又将目标锁定到木星的卫星木卫二身上。加州理工学院的天文学家迈克·布朗教授和美国航天局喷气推进实验室的凯文·汉德共同编写的报告认为，木卫二海洋的构成可能与地球海洋非常接近，这对生命存在的可能性非常重要。而美国宇航局已经委派一个科学家小组考虑发射航天器在木卫二着陆后的具体目标。

如果孩子也可以“定制”

一个叫做康纳·列维的健康男婴近日在媒体曝光，他于5月18日出生在美国宾夕法尼亚州，是世界上首例基因筛查试管婴儿。列维的父母曾将胚胎细胞寄给了牛津大学的医学专家，后者对细胞进行了基因筛查，以查看是否存在染色体异常或缺失。根据筛查结果，美国的医生将染色体正常的胚胎移入母亲的子宫中，这名男婴因而诞生。这项技术的初衷是为了尽可能减少怀孕失败的概率，但是基因筛查技术的成熟和成本的下降，更多符合父母预期的“定制婴儿”或将出现。

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