医学影像技术技能范文
时间：2023-08-10 17:35:26
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篇1
【关键词】 二恶英;学习记忆功能;跳台实验
Abstract Objectives: To assess the effect of TCDD on the learning and memorial function of mice. Methods: 24 male mice and 24 female mice were randomly pided into four groups according to the sex：high dose (100 μg/kg) groμp， middle dose (10 μk/kg) group， low dose (1 μg/kg)group and the control group. Each group has 6 mice. The mice were injected ip with TCDD(controls were injected ip with DMSO). After 24 hours and 48 hours， the step-down test was performed to evaluate the learning and memorial function of the mice. Results: Compared with the controls， there was a significant increase in the memorial latent time of the male mice(P
Key words 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD); Learning and memorial function; Step-down test
2001年5月，由包括中国在内的91个国家赞同的POPs公约(斯德哥尔摩公约)获得通过，这个公约要求各国立即控制和治理以二恶英为代表的12种在环境中具有高残留、高生物浓缩和高生物毒性的物质，也就是POPs(persistent organic pollutants)物质[1]。二恶英是一类化合物的统称，包括多氯二苯并二恶英(PCDDs)和多氯二苯并呋喃(PCDFs)。PCDDs有75种同系物，PCDFs有135种同系物。2，3，7，8-四氯二苯并二恶英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)是二恶英类物质中毒性最强的物质，也被认为是世界上毒性最强的化合物[2]。二恶英有很强的致畸、致癌和皮肤损害作用[1]，有持久残留性，能通过生物链逐级浓缩，对人体造成潜在的威胁[3]。很多毒物会影响动物的学习记忆功能，二恶英能否引起动物学习记忆功能的变化尚未见报道，本实验欲研究急性染毒条件下TCDD对小鼠学习记忆功能的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 清洁级昆明种小鼠48只，雌雄各半，体重18～22 g，由天津医科大学动物室提供。
1.1.2 仪器和试剂 跳台仪(中国预防医学科学院制造)、万分之一电子天平(JA61001，上海精科天平)，TCDD(购自Cambridge Isotope Laboratories，Inc.)纯度99 %，用二甲基亚砜(DMSO)配制成浓度为25 μg/mL的母液，取母液分别将其稀释成质量浓度为2.5 μg/mL和0.25 μg/mL的应用液，二甲基亚砜(DMSO)为国产分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 动物处理 对所选小鼠观察1周，确定其健康状况，然后将雌雄各24只小鼠分别随机分为4组：对照组和染毒高剂量组(100 μg/kg)、中剂量组(10 μg/kg)、低剂量组(1 μg/kg)，每组6只，腹腔注射一次染毒，对照组给予0.1 mL DMSO。
1.2.2 跳台实验 染毒24 h后，对小鼠进行学习能力测试;染毒48 h后，对小鼠进行记忆能力的测试。染毒24 h后，将动物放入反应箱内(台上、台下)适应3 min，然后将小鼠放置反应箱内的铜栅上，立即通以36 V的交流电。小鼠受到电击，其正常反应是跳回平台(绝缘体)以躲避伤害性刺激。多数小鼠可能再次或多次跳至铜栅上受到电击又迅速跳回平台上。训练一次后，将动物放在反应箱内的平台上，记录5 min内各鼠跳下平台的错误次数和第一次跳下平台的时间(潜伏期)，以此作为评价其学习能力的指标。染毒48 h后再次进行测验，将小鼠放在平台上记录其第一次跳下平台的潜伏期、3 min钟内的跳下次数，以此作为评价其记忆能力的指标。如果小鼠在5 min和3 min内未跳下平台，则其潜伏期以300 s和180 s记。
1.2.3 统计学处理 数据用SPSS11.0软件包进行统计分析，结果以均数±标准差(x±s)表示，用单因素方差分析(One-way-ANOVA)进行多组间比较及两两比较，对于不符合方差分析条件的用近似检验(Tamhane's T2，Dunnett's T3，Games-Howell， Dunnett's C)，P
2 结果
2.1 雄性小鼠 TCDD染毒24 h后与对照组相比，各组小鼠5 min内跳下平台的错误次数和第一次跳下平台的潜伏期的差异无统计学意义。染毒48 h后与对照组相比，低、中剂量组小鼠5 min内跳下平台的错误次数和潜伏期的差异无统计学意义，高剂量组小鼠第一次跳下平台的潜伏期差异有统计学意义(P
2.2 雌性小鼠 TCDD染毒24 h后与对照组相比，各组小鼠5 min内跳下平台的错误次数和第一次跳下平台的潜伏期的差异无统计学意义。染毒48 h后与对照组相比，低、高剂量组小鼠5min内跳下平台的错误次数的差异有统计学意义(P
3 讨论
长期接触TCDD，对于人的神经行为功能具有损害作用，如造成记忆力下降、反应力降低、正中神经传导速度减慢等[4-5]。本实验采用一次染毒，用跳台实验对小鼠的学习和记忆功能进行测定。从结果可以看出，染毒24 h后雄性小鼠的学习功能与对照组相比差异无统计学意义，但在低、中剂量组，第一次跳下平台的潜伏期有延长趋势，错误次数有减少趋势;在高剂量组，第一次跳下平台潜伏期有减少趋势，错误次数有增加趋势。这可能是由于在一定剂量范围内，小鼠受到TCDD的刺激后处于应激状态，兴奋性和反应性有所升高，而使其学习功能有所增强所致;而随着TCDD染毒剂量的增加，毒性也随之增加，造成小鼠的学习功能受到损害。在染毒48 h后的记忆功能测试中，其潜伏期也有延长趋势，其中高剂量组潜伏期比对照组显著延长，错误次数有减少的趋势，这可能是由于较低剂量的TCDD对小鼠的记忆功能的影响不明显，而高剂量的TCDD引起的小鼠的应激反应较明显造成的。
雌性小鼠中，染毒24 h后各组小鼠的学习功能与对照组相比差异均无统计学意义，但其潜伏期有缩短的趋势，错误次数也有增加的趋势，可能是由于TCDD对小鼠的学习功能损伤所致。在染毒48 h后的记忆功能测定中，各组小鼠第一次跳下平台的潜伏期与对照组的差异无统计学意义，但有减少的趋势，跳下的错误次数也有增加的趋势，其中，高、低剂量组跳下的错误次数比对照组显著增加，这可能是由于雌性小鼠对于TCDD比较敏感，在较低的剂量就对其记忆功能造成了损害。
从本次实验的结果可以看出，TCDD急性染毒对小鼠的学习记忆功能具有影响，且有性别差异，在学习记忆功能测定中雄性小鼠的功能增强而雌性小鼠的功能减弱，原因可能是雌性小鼠对于TCDD造成的损害比雄性小鼠敏感。TCDD对于小鼠的学习记忆功能影响程度及影响机制还有待于进一步研究。
参考文献
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[3] 尹龙赞，娄振宁，刘雁丽，等.二恶英对人类健康的影响[J].中国工业医学杂志，2001，14(2)：100-103.
篇2
语文教材蕴含着丰富的美育资源,语文教学中,可恰当地采用多媒体课件创设情境,让学生沉浸在美好的意境之中。当情感处于最佳状态时,教师再通过充满感情语言的启迪和导引,加上学生丰富的联想,脑海中就会再现生活和自然的美景,从而得到美的享受和情感的滋润,进而同审美对象发生感情上的交流,好像自己也是课文中的一个人物,或者成为审美客体中的一部分了。如在《安塞腰鼓》教学中,借助图片和音乐,在学生的眼前展现出一个美的境界:黄色的土地、白色的衣裳、红色的腰鼓、狂舞的后生,隆隆的鼓声……在阳光下,在厚重的黄土高原上,“骤雨一样,是急促的鼓点;旋风一样,是飞扬的流苏;乱蛙一样,是蹦跳的脚步……”安塞腰鼓舞起来时动与静的美、光与影的美、音与画的美就形象地展现在学生面前。借助多媒体,学生能更好地感受到一种勃发的力量的美。又如《紫藤萝瀑布》一文中,学生对藤萝花并不熟悉,教师可利用查找来的图片等资料做成课件,学生面对着一束束美丽的藤萝花,一种美的感受便会油然而生:何等繁茂的一束藤萝花!流光溢彩,铺天盖地,生机勃勃,一片辉煌的淡紫色的显现出明净的色调,像瀑布从空中垂下,显示出磅礴的气势,紫色条幅上的点点银光显露出生命的欢乐,“觉得这一条紫藤萝不只在眼前,也在我心上缓缓流过”“……不断地流着,流着,流向人们的心底。”这种审美的境界与感受不是学生凭空想象来的,但借助多媒体,就可以将学生的审美带到了一个新的美好领域。
语文教学的工具性、形象性、综合性、人文性等特点决定了语文课堂教学结构的多面性和复杂性。因此,要在深入分析各种类型的课文、各种知识和技能的教学特点的基础上,恰当地选用多媒体。为此,应该注意以下问题:
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二、认真备课是完成多媒体课堂教学的前提
篇3
（曲阜师范大学生命科学学院，山东 曲阜 273165）
【摘要】目的：探讨中药复方枳菊解郁汤对抑郁模型小鼠空间学习记忆能力的影响及其机制。方法：采用多种因素慢性轻度不可预见性应激方式建立抑郁模型小鼠，分别给予小鼠低、中、高剂量枳菊解郁汤处理。采用Morris水迷宫实验，检测小鼠的空间学习记忆能力的变化；通过免疫组织化学方法检测脑内基质细胞衍生因子（SDF-1）的表达。结果：与对照组相比，模型组小鼠的空间学习记忆能力明显下降（P<0.01），SDF-1在海马CA1，CA3，DG及前脑皮层的表达明显降低(P<0.05)；与模型组相比，枳菊解郁汤中剂量组小鼠的空间学习记忆能力明显增高（P<0.05），SDF-1在海马CA1，CA3，DG及前脑皮层的表达明显增加（P<0.05）。结论：枳菊解郁汤的抗抑郁作用可能与SDF-1的表达上调有关。
关键词 中药复方；慢性应激；抑郁症；SDF-1；学习记忆；海马；前脑皮层
Effects of Chinese Medical Prescription on Spatial Learning-Memory and Expression of SDF-1 in Brain of Depression Model Mice
DU Na CHEN Qian LI Yang XIAO Jing-shan YAO Meng-jiao LI Ya
（College of Life science, Qufu Normal University, Qufu Shandong 273165, China）
【Abstract】Objective：To explore the effects of Chinese Medical prescription of Zhijujieyu-tang on the ability of spatial learning-memory in depression model mice brain and its mechanism. Method：Using depression model mice induced by multivariate chronic unpredictable stressors, and give the animal different doses of Zhijujieyu-tang. The ability of spatial learning-memory of mice were determined by Morris Water Maze, and the expression of stromal cell-derived factor-1(SDF-1) in the brain were detected by immunohistochemical method. Result：Compared with the control group mice, the spatial learning- memory in model group mice were significantly decreased (P<0. 01). The SDF-1 expression in the CA1, CA3, DG regions of hippocampus (HP) and prefrontal cortex (PFC) were significantly reduced in the model group mice (P<0. 05). Compared with the model group mice, Zhijujieyu-tang medium dosage can improve the learning and memory function, and the expression of SDF-1 in HP and PFC (P<0. 05). Conclusion：Zhijujieyu-tang antidepressant-like property may be closely related to the up-regulation of SDF-1expression in HP and PFC.
【Key words】Chinese Medicine; Chronic stress; Depression; Learning-memory; SDF-1; HP; PFC
抑郁症（depression）是一类严重威胁人类身体健康的常见精神卫生疾病[1]，可以造成身体器官的功能紊乱，其程度可以从轻度的忧伤到重度的绝望、自杀企图等。抑郁症发病机制复杂，病程长，易复发。对于抑郁症的治疗，西药的疗效较有限，易产生耐药性和不良反应明显等缺点，而中药复方具有多成分、多环节、多靶点的特点，辨证施治；同时，国内外在抗抑郁药物的研制与开发方面逐渐重视传统药物和天然药物[2]。基质细胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）在神经元发育过程中有重要作用，可影响海马神经元突起延伸和凋亡效应[3]，对神经干细胞的迁移、轴突分支及神经细胞损伤修复有重要作用[4]。本研究通过多因素慢性轻度不可预见性应激方式建立抑郁小鼠模型，检测小鼠空间学习记忆能力的变化，并通过免疫组织化学方法检测海马及前脑内SDF-1的表达。探讨中药复方枳菊解郁汤对抑郁模型小鼠空间学习记忆能力的影响及其机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
昆明品系小白鼠，体重18-21g，2月龄，雌雄各半，由济宁鲁抗药业实验动物中心提供。实验小鼠分笼饲养，每日按灌胃手法抓取抚摸，使小鼠适应1周。
1.2 实验药物
中药复方枳菊解郁汤配方：石菖蒲15g、枳实10g、夜交藤20g、15g、炒枣仁30g、勾藤30g、郁金15g、柏仁30g、胆星10g，由曲阜市中医医院提供。用量：按人鼠等效剂量（生药量175g）换算为低剂量，其二倍量为中剂量，四倍量为髙剂量。每日一次灌胃给药，每鼠每天0.2 ml。阳性药物对照组采用盐酸氟西汀胶囊，20mg/粒，由常州华生制药有限公司提供，国药准字：H19980138。用量：按人鼠等效剂量换算，3.6mg/kg.d，溶于0.2ml蒸馏水中，每日一次灌胃给药，每鼠每天0.2 ml。
1.3 动物分组
小鼠适应一周后随机分组：对照组，模型组，氟西汀组，中药低、中、高剂量组。每组12只。对照组和模型组小鼠每天蒸馏水灌胃；氟西汀组小鼠每天氟西汀灌胃；中药低、中、高剂量组，根据各自的剂量，每只小鼠每天中药灌胃给药。各组小鼠应激前1h灌胃给药。
1.4 慢性应激抑郁模型的建立
除对照组外，各组小鼠均接受7种不同应激方式，包括电击足底（每隔1分钟每次持续10秒刺激，电压38V，共计15次）、冷水刺激（8℃冷水，共计3min）、斜笼(24h)、禁食（24h）、禁水（24h）、通宵照明、高台（1h，高台直径10cm、高160cm）。每天选取一种应激方式，随机选择，持续应激21天。对照组小鼠正常饲养，不给予任何应激。
1.5 Morris水迷宫实验
Morris水迷宫视频跟踪分析系统由圆形水池、平台、视频跟踪设施、分析软件4部分组成。水池内分为4个象限。平台放置在第一象限（目标象限），在对面象限（第三象限）做好明显标记物。平台在水面以下约1 cm。水温控制在25oC。定位航行实验共进行4天，每天每只小鼠共接受4次找平台训练。每只小鼠依次从四个象限的入水点入水池，记录小鼠从入水至爬上平台的逃避潜伏期(escape latency)，检测小鼠的空间学习能力。空间搜索实验在实验第5天进行，平台撤除，小鼠从第三象限入水点入水，记录小鼠120s内在各个象限的游泳（停留）时间，检测小鼠的记忆保持能力。
1.6 小鼠海马和前脑皮层SDF-1的表达
水迷宫实验后立即进行灌流取脑，用戊巴比妥钠对小鼠进行腹腔麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，经左心室快速灌注37℃生理盐水和预冷4%多聚甲醛磷酸盐（PFA）缓冲液，开颅取脑，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，行冠状切片（5μm）。按照SDF-1免疫组化试剂盒说明(武汉博士德生物工程有限公司提供)进行免疫组织化学染色。选取每只小鼠海马CA1、CA3、齿状回(DG)和前脑皮层(PFC)切片3 张，每个玻片各随机取两个视野，用Motic Images Advanced 3.2 图像处理系统检测SDF-1阳性细胞平均目标灰度值。
1.7 统计学分析方法
实验数据采用平均数±标准误（M±SE）表示。定位航行实验的逃避潜伏期采用重复测量的方差分析(Repeated-measures ANOVA)；其它数据均采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间比较用N-K法，以P<0.05表示有统计学显著性差异。
2 结果
2.1 各组小鼠空间学习记忆能力的变化
定位航行实验结果显示（表1），对照组和模型组小鼠的逃避潜伏期迅速降低（P<0.01）；氟西汀组、枳菊解郁汤低、中、高剂量组小鼠的逃避潜伏期均明显减少(P<0.001, P<0.01)。表明各组小鼠随着训练周期的增加，空间学习能力得到提高。与对照组小鼠相比，模型组小鼠4天的逃避潜伏期均显著增多(P<0.01, P<0.05)；与模型组小鼠相比，氟西汀组和枳菊解郁汤中剂量组小鼠4天的逃避潜伏期均显著减少（P<0.01），高、低剂量组小鼠在第4天出现显著减少（P<0.05）。表明模型组小鼠的空间学习能力减弱，而枳菊解郁汤能改善抑郁小鼠的空间学习能力，且中剂量效果更好。
表1 各组小鼠的逃避潜伏期 (秒，M±SE)
*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较；+P<0.05，++P<0.01，与模型组比较；n=12.
空间搜索实验结果显示（表2）：对照组小鼠在第一象限（平台所在象限）停留时间明显高于其他象限（P<0.01）；而模型组小鼠在第一象限停留时间明显低于第二、三象限停留时间（P<0.001）。与对照组小鼠相比，模型组小鼠的第一象限停留时间明显减少（P<0.01）；与模型组小鼠相比，氟西汀组小鼠、枳菊解郁汤低、中、高剂量组均显著增加（P<0.01, P<0.05）。表明抑郁模型小鼠空间记忆能力减弱；枳菊解郁汤能改善抑郁模型小鼠空间记忆，且中剂量效果最明显。
表2 各组小鼠在四个象限的停留时间 (秒，M±SE)
*P<0.05，与对照组比较；+P<0.05，++P<0.01，与模型组比较； n=12.
2.2 各组小鼠海马和前脑皮层SDF-1的表达
各组小鼠免疫组化结果显示（表3）：SDF-1在海马各区及前脑皮层均有不同程度的表达，与对照组相比，模型组小鼠CA1、CA3、DG和前脑皮层SDF-1的平均目标灰度值明显增高（P<0.01），模型组SDF-1的表达减弱；与模型组相比，氟西汀组、中药各剂量组SDF-1的平均目标灰度值均不同程度降低(P<0.01, P<0.05)，SDF-1的表达增强。
3 讨论
有研究报道，慢性、低强度、长期的日常压力是引发抑郁症的主要原因[5]，慢性应激抑郁动物模型被广泛应用于抑郁症的研究。英国心理学家Morris创建了水迷宫实验以评估动物的空间学习记忆能力，Morris水迷宫实验模型已经成为研究学习记忆的常用方法之一。定位航行实验是动物通过空间视觉线索找到隐匿平台，从水中逃生的程序，用于动物空间学习能力的检测；空间探索实验则用于评价动物空间记忆能力。本研究显示，模型组小鼠的逃避潜伏期均显著增多，空间搜索实验中在第一象限停留时间也明显减少，表明抑郁模型小鼠的空间学习和记忆能力均减弱；氟西汀组、枳菊解郁汤中剂量组的逃避潜伏期均减少，空间搜索实验的第一象限停留时间均明显增多，表明枳菊解郁汤能有效改善抑郁模型小鼠空间学习、记忆能力减退的现象，从而起到一定的抗抑郁效果。
慢性应激导致神经化学方面的改变可能参与了抑郁症的发生，尤其是神经内分泌、神经递质、神经可塑性的改变在抑郁症的发生中起到重要作用。研究发现慢性应激动物脑区海马及前脑皮层的整体形态发生改变[6]，从而导致神经细胞受到损害。我们先前的研究表明，多因素慢性应激可引起小鼠脑内神经元的损伤[7]。SDF-1是一种表达于多种细胞和组织的基质细胞衍生因子[4]，在胚胎发育、肿瘤转移、免疫系统、循环系统及中枢神经系统的发育和修复中起着重要作用，可影响海马神经元突起延伸、凋亡效应及神经干细胞的迁移。本研究结果显示，SDF-1在海马各区及前脑皮层均有不同程度的表达，模型组小鼠CA1、CA3、DG和前脑皮层SDF-1的平均目标灰度值明显增高；氟西汀组、中药各剂量组SDF-1的平均目标灰度值均不同程度降低，且中剂量有显著差异，表明枳菊解郁汤通过上调抑郁模型小鼠SDF-1在脑区的表达，对损伤的神经元进行修复，进而起到一定的抗抑郁作用。
参考文献
［1］Belmaker RH, Agam G. Major depressive disorder[J].N Engl J Med, 2008, 358: 55-68.
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篇4
【摘要】 目的探讨中药草苁蓉提取物对AD模型大鼠学习记忆能力及神经元凋亡的影响。方法将60只健康SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和中药高、中、低剂量组。采用Aβ140建立AD模型，中药组予以草苁蓉提取物按高、中、低3种不同剂量灌胃治疗，治疗结束后测定其学习记忆能力和神经元凋亡百分比。结果中药组大鼠学习记忆能力高于模型组（P
【关键词】 阿尔茨海默病； 学习记忆能力； 神经元凋亡； 草苁蓉
Abstract：ObjectiveTo investigate the influence of Boschniakia rossica extract on learning， memory and neuronal apoptosis in AD model rats. Methods60 healthy SD rats were randomly pided into normal group， sham group， the model group and the group of traditional Chinese medicine with highdose， mediumdose and lowdose. To establish the AD model by Aβ140， give the traditional Chinese medicine groups were administered three different treatment doses of Boschniakia rossica extract:high， medium and low dose. After the treatment， rats learning，memory capability and the percentage of neuronal apoptosis were tested. ResultsThe learning and memory capability in the group of traditional Chinese medicine rats is better than in the model group (P
Key words： Alzheimer's disease; Learning and memory capability; Neuronal apoptosis; Boschniakia rossica
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种以进行性智能衰退为主要临床特征的多因性疾病，目前认为β淀粉样蛋白（amyloidbeta protein，Aβ）神经毒性作用所致中枢上行胆碱能系统损伤是AD认知功能障碍的重要决定因素。越来越多的证据显示神经细胞的凋亡参与AD的发病，而且APP突变对细胞凋亡的引发起重要作用，其中聚集性Aβ对神经细胞的毒性更大，并且其他一些致病因素都是通过Aβ对神经元的直接作用而引起细胞损伤的［1］。为此，本实验采用流式细胞仪观察中药草苁蓉对AD大鼠的学习记忆能力及神经元凋亡的影响，以证明草苁蓉在AD治疗中的价值，为其保护和研究开发提供实验依据。
1 材料与仪器
1.1 动物取健康SD大鼠60只，体质量200～250 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
1.2 仪器与试剂
WDTⅡ微电极推进器脑立体定位仪（国营西北光化学仪器厂）、Morris水迷宫自动控制仪装置和XCS2大鼠自动穿梭控制仪(中国医学科学院药物研究所)、岛津 UV265型紫外可见光比色计、LG3A型高速冷冻离心机(北京医用离心机厂)、DK8AX型恒温水浴箱(上海一恒仪器)、G6805Ⅱ型电针仪（上海产）。Aβ140（美国Biosource公司）；标准品氯化乙酰胆碱为美国ACROS公司生产；毒扁豆碱(ALEXIS公司)；氯化羟胺、盐酸羟胺、三氯乙酸、三氯化铁等均为国产分析纯。1∶6草苁蓉提取物（江汉大学医学院提供）。Aβ孵育：Aβ140加入0.1%三氟乙酸后放入37℃水浴恒温箱孵育48 h，使其成为凝聚状态备用。
2 方法
2.1 分组与治疗正常组大鼠10只，不进行任何处理及治疗。假手术组，中药高剂量组、中药中剂量组和中药低剂量组各10只。假手术组注射等量生理盐水，手术方法同模型组。将造模成功的动物随机分为模型组，中药组。模型组不进行任何治疗。中药组分为低剂量组、中剂量组和高剂量组，分别给予中药草苁蓉提取物1 ml（折合生药0.03 g/ml），2，4 ml灌胃，1次/d，每6 d为1个疗程，每疗程后休息1 d，连续治疗4个疗程。
2.2 动物模型的制作各组大鼠在10%水合氯醛380 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定向仪。脑立体定位仪固定平颅头位切开皮肤及皮下组织，用棉签蘸取少量双氧水轻拭颅骨表面，清除泡沫能清晰显现前囟。参照大鼠脑立体定位图谱［2］，以前囟为原点，向后1.4 mm，旁开3.0mm为穿刺点转穿颅，自脑表面进针7.0 mm分别至双侧Meynert基底核，用微量注射器将聚集状态的Aβ140各1 μl（5 μg）在2 min内缓慢注入，留针10 min，以使Aβ140充分浸润局部组织，注射完毕后将微量注射器在7 min内缓慢抽出。假手术组注射等量的生理盐水。所有操作均在无菌条件下进行，术后每只大鼠腹腔注射青霉素1万U，缝合切口，常规饲养。
2.3 指标观察及检测治疗结束后检测大鼠学习记忆能力及神经元凋亡百分比。
2.3.1 学习记忆能力观察治疗后进行Morris水迷宫训练，首先进行定位航行试验，历时3天，将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中若干次，记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间，即逃避潜伏期。如果大鼠在120 s内未找到平台，需将其引至平台。这时潜伏期为120 s。然后撤除平台进行水迷宫测试，以检测其学习记忆能力，任选一个入水点将大鼠放入水池中，考察大鼠对原平台的记忆，记录其穿过原平台所在位置的次数及在原平台象限的游泳时间以计算其游泳时间百分比。训练及测试期间水温在（26±1）℃，迷宫外参照物保持不变。数据采集和处理由Morris水迷宫图象自动监视处理系统完成。将各组测试成绩进行比较。
2.3.2 海马及皮质部位神经元凋亡百分比的测定采用PI单染法测定。大鼠处死后迅速在冰台上分别取海马及皮质部位脑组织。将脑组织剪为细小部分（尽量避免破坏细胞结构），1 000 r/min离心5 min，弃去培养液，用3 ml PBS洗涤1次，离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃下避光放置12 h。然后离心弃去固定液，加入3 ml PBS重悬5 min。再用400目的筛网过滤1次，1 000 r/min离心5 min，弃去PBS。加入1 ml PI染液染色，4℃避光30 min。流式细胞仪检测其凋亡百分比。
2.4 统计学处理实验数据用 SPSS 13.0软件进行统计学处理。数据以±s表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析(ANOVA)及q检验。
3 结果
3.1 各组水迷宫测验成绩的比较结果
见表1。表1 各组水迷宫测验成绩的比较(略)
从表1可以看出，模型组和中药各组水迷宫测试成绩均低于正常组（P
3.2 各组大鼠海马及皮质部位神经元凋亡百分比的比较结果
见表2。表2 各组大鼠海马及皮质部位神经元凋亡百分比的比较(略)
从表2可以看出，模型组海马、皮质部位神经元凋亡比例高于正常组（P
4 讨论
草苁蓉(Boschniakia rossica Fedtsch et Flerov)为列当科草本植物，俗称不老草，具有滋补强身、益寿延年之功及补肾壮阳、润肠止血之效。近年来文献报道，草苁蓉具有抗炎、抗缺氧、抗疲劳、促进记忆及增强免疫功能的作用［3～5］。朴龙等［6］通过实验发现草苁蓉提取物可提高D半乳糖所致衰老大鼠脑组织SOD活性，降低MDA含量，抑制MAO活性，电子显微镜观察到草苁蓉提取物可以减轻D半乳糖导致的线粒体等超微结构的改变，证实草苁蓉提取物对D半乳糖致衰老大鼠的脑组织自由基代谢具有抑制作用。
老年人在增龄的过程中，人体的防御体系功能减弱，脑内自由基的清除能力降低。因此，在脑老化过程中，神经元细胞膜上不饱和脂肪酸被氧化而产生大量自由基，包括超氧化物阴离子自由基、过氧化氢、脂质过氧化物和自由羰基等含量增加［7］。这些自由基能损伤细胞膜、细胞器，诱导神经元凋亡，导致其功能严重破坏，从而促使AD的形成。氧自由基能促进Aβ的毒性和聚集，使其在脑内过度活跃，导致神经元退行性变而发生AD［8］，而Aβ也使自由基生成增多。
本实验采用草苁蓉提取物灌胃治疗，观察其对AD大鼠学习记忆能力及神经元凋亡的影响。实验结果证明，草苁蓉治疗能显著降低AD大鼠脑内神经元凋亡百分比，提高学习记忆能力，起到了很好的抗衰老和促智作用。其作用机制有可能是通过清除Aβ1～40脑内注射所致自由基而发挥治疗作用的，其具体有效成分和作用机理有待进一步研究探讨。还可从实验看到，草苁蓉的治疗效果与其剂量有一定关系，剂量越高，治疗效果越好，但剂量与疗效之间是否存在线性关系，以及最佳剂量的选择有待进一步研究。
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篇5
【摘要】
［目的］探讨针药合用刺激嗅觉系统对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及海马自由基系统的影响作用。［方法］成年SD雄性大鼠48只，体重（300±10）g。随机分为正常对照组、VD模型组、VD嗅球损毁模型组、嗅三针组、丁香酚刺激组和针药合用组，每组8只。制作VD大鼠模型和VD并损毁嗅球大鼠模型，分别通过嗅三针电刺激、丁香酚刺激、针药合用方法，测试大鼠水迷宫学习记忆能力并测定海马MDA含量、GSHPx和SOD活性。［结果］定位航行试验显示，平均逃避潜伏期和平均游泳路程比较，正常对照组明显短于VD模型组（P
【关键词】 针药
Abstract：［Objective］To explore the effect of combined acupuncture and medicine on learningmemory abilities，and free radical system of hippocampus in vascular dementia（VD）rats.［Methods］The 48 Sprague Dawley rats were randomly pided into control（1），VD model（2），VD plus removed olfactory bulb model（3）and XIU Three Needles（4），Eugenol（5），combined acupuncture and medicine（6）groups.Morris maze tests were conducted for valuating the learning and memory abilities.The contents of MDA，SOD and GSHPx activity of hippocampus were detected.［Results］In comparison with group 1，the average escape latency and travel distance prolonged significantly in group 2.In comparison with group 2，it shortened remarkably in groups 4 and 5.No significant differences were found between groups 1 and 2.In comparison with group 6，it prolonged in groups 4 and 5.No significant differences were found between them.The MDA content of hippocampus in VD model group was higher than that of control group（P
Key words：vascular dementia；olfactory；learningmemory；MDA；SOD；GSHPx；XIU Three Needles；Eugenol；combined acupuncture and medicine
血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）是由脑血管疾病因素导致脑组织损害而引起的痴呆综合征。研究表明，自由基的过氧化损伤是VD的主要病理机制之一［1］。笔者依据多年来治疗VD的经验［24］，选择血管性痴呆大鼠作为对象，探讨针药合用刺激嗅觉系统对VD大鼠学习记忆能力及海马自由基系统的影响作用。
1 材料和方法
1.1 动物及分组
成年Sprague Dawley雄性大鼠48只，体重(300±10)g，由第四军医大学实验动物中心提供。实验动物随机分为正常对照组、VD模型组、VD嗅球损毁模型组、嗅三针组、丁香酚刺激组、和针药合用组，每组8只。
1.2 主要仪器
SDQ30双极射频电凝器（上海手术器械厂出品）；Morris水迷宫实验系统，（北京现代太极电子有限公司出品）；722型光栅分光光度计（上海第三分析仪器厂出品）。
1.3 大鼠模型制作
1.3.1 VD大鼠模型制作
按照经典的四血管阻断（4—Vesselocclusion，4VO）方法制作血管性痴呆模型［5］。用10%水合氯醛（0.4ml/100g体重）腹腔注射麻醉大鼠，常规无菌操作。颈部背侧后正中切口，暴露第一颈椎横突孔，电凝烧灼双侧椎动脉，造成永久性闭塞。24h后，颈部腹侧前正中切口，分离双侧颈总动脉，用微动脉夹可逆性夹闭双侧颈总动脉5min，共夹闭3次，每次间隔1h。手术部位施以适量青霉素抗感染，仔细缝合，常规饲养。
1.3.2 VD损毁嗅球大鼠模型制作
参照陈志蓉报道的损毁大鼠嗅球的方法［6］，将VD造模成功的大鼠用水合氯醛麻醉后，固定在立体定位仪上。在大鼠颅顶正中切开皮肤，小范围分离暴露前囟。在大鼠颅顶正中线位于前囟前面5mm两侧旁开2mm处，分别钻两个直径为1mm的小孔。将HS—80型电烙铁的烙头插入颅内，电凝损毁双侧嗅球。嗅三针组、丁香酚刺激组和针药合用组大鼠均制作VD模型。
1.4 实验方法 实验时间为45d。
1.4.1 嗅三针组
嗅三针穴定位：两侧迎香及印堂穴。依据李忠仁教授主编的《实验针灸学》动物选穴标准［7］，“迎香”穴：大鼠鼻孔外侧上端，有毛与无毛交界处；“印堂”穴：大鼠两眼眶上缘中点连线与正中线交点。操作：选用“华佗牌”不锈钢针，30号0.5寸毫针。迎香穴向内上方斜刺0.3cm，印堂穴向鼻根部平刺0.3cm；电针仪：G6805电针仪，上海医疗仪器厂出品；刺激参数：疏密波，频率80～100Hz，刺激强度以保持针刺局部轻微抖动为度（电流强度：13mA，电压：13V）。时间：留针10min，持续电刺激，1次/d。5d为1个疗程，休息2d，共进行6个疗程。
1.4.2 丁香酚刺激组
操作：制作1个仅留有2个小通气孔的实验盒，在实验盒底部铺1薄层药棉，将丁香酚溶剂均匀地喷洒在药棉上，在其上放置1个金属网架。待药味充分弥散在整个实验盒时，将实验动物放在金属网架上，然后加盖封闭。10min后，将实验动物取出。1次/d，5日为1个疗程，休息2d，共进行6个疗程。丁香酚试剂购自江西樟树市本草天然药用油厂，纯度99%。
1.4.3 针药合用组
先行嗅三针刺激再行丁香酚刺激。
1.4.4 VD嗅球损毁模型组
同针药合用组
1.4.5 正常对照组及VD模型组
1次/d采取与以上3组相同的捉拿固定，但不施加任何干预措施。
1.5 检测指标
1.5.1 Morris水迷宫定位航行试验［8］：治疗结束后，开始水迷宫测试。水迷宫内水深41cm，水温22℃～26℃。在水池壁标明4个入水点，由此将水池等分为4个象限，任选一象限正中放置平台，没于水下1cm，水面覆盖塑料泡沫。将受试大鼠按顺时针方向依次由E、S、W、N4个入水点顺序面向池壁放入水中。记录2min内寻找平台的时间（逃避潜伏期）。如果大鼠在2min内找到平台，记录其实际逃避潜伏期及游泳路程；如果大鼠在2min内未找到平台，由测试者将其引上平台并停留10s，逃避潜伏期记录为2min。历时6d，1次/d。用6d找到平台的平均逃避潜伏期和平均游泳路程评价动物的学习记忆能力。
1.5.2 海马自由基系统测定；大鼠断头后快速取出全脑，置于冰盘上分离海马，称重后加入预冷生理盐水，制成10%的脑匀浆，4℃离心（3000r/min，20min），取上清液置于—80℃冰箱内保存待检测。海马MDA含量测定采用硫代巴比妥酸钠（TBA）比色分析法；海马GSHPx活性测定采用二硫代二硝基甲苯酸法（DTNB）；SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法。三项指标测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究院，按照药盒说明书操作。
1.6 统计方法
采用SPSS12.0软件，实验数据用x±s表示，采用单因素方差分析、组间均值进行t检验。
2 结果
2.1 Morris水迷宫定位航行试验结果 见表1。表1 各组大鼠Morris水迷宫定位航行试验结果比较（略）
2.2 各组大鼠海马MDA含量及GSHPx、SOD活性的比较结果显示 见表2。表2 各组大鼠海马MDA含量及GSHPx、SOD活性的比较（略）
3 讨论
血管性痴呆（VD）属于中医“善忘”、“呆病”、“痴证”等范畴。依据现代医学理论，VD是由于心脑血管病变，因缺血性或出血性脑组织损害所导致的认知功能障碍，是老年痴呆的常见类型。国内外有关脑血管疾病的临床及实验研究发现，自由基的过氧化损伤是VD主要病理机制之一［1］。
现有的研究结果表明，自由基是VD脑缺血后神经细胞损伤的主要因素。自由基对学习记忆有明显的损伤作用，它对智力的损害主要表现为对细胞膜上不饱和脂肪酸的破坏和过氧化以及MDA的产生。MDA是一种大分子交联剂，它能交联蛋白质和核酸，直接影响生物信息的传递、转录和复制，表现为记忆及智力下降。SOD和GSHPx均为机体内重要的抗氧化金属酶类，它们作为机体内在抗氧化体系，能够直接清除自由基，免除其过氧化损伤［9］。
本研究结果显示，嗅三针和丁香酚均能够明显增强VD模型大鼠学习记忆能力，并且能提高VD模型大鼠海马SOD和GSHPx活性同时降低MDA的含量。然而，对于VD损毁嗅球模型大鼠，嗅三针和丁香酚均未能增强其学习记忆能力也没有明显影响海马SOD、GSHPx活性及MDA的含量。这表明嗅三针和丁香酚均对于VD大鼠的疗效是通过嗅觉传导路对中枢神经系统产生作用的，这恰好与笔者先前的研究结果相一致［2］。
本研究证实了嗅三针和丁香酚均对VD具有确切的治疗作用，其作用机理与调节海马自由基系统密切相关，针药合用效果更显，其疗效的发挥有赖于嗅觉传导路的完整性。
参考文献
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［7］李忠仁.实验针灸学［M］.北京：中国中医药出版社，2004：327329.
篇6
[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项（2013ZX09103002-008）；四川省杰出青年学术技术带头人资助计划（2011JQ0014）；四川省学术和技术带头人培养资金项目（重点）；四川省“十一五”支撑项目（2010SZ0195）；四川省教育厅自然科学重点项目（12ZA041）；成都市产业发展技术支撑计划――高校院所应用基础研究（12DXYB321JH-002）
[通信作者] *徐世军，Tel：（028）61800231，E-mail：
[作者简介] 胡勇，Tel：（028）61800231，E-mail：
[摘要] 目的：考察通络醒脑泡腾片对慢性脑缺血致学习记忆障碍模型大鼠学习记忆及海马Na+-K+-ATP酶表达的影响。方法：采用双侧颈总动脉结扎法（2-VO）制作SD种大鼠慢性脑缺血致学习记忆障碍模型。将造模成功大鼠50只随机分为模型对照组、甲磺酸双氢麦角碱片组（0.7 mg・kg-1）、通络醒脑泡腾片高、中、低剂量组（7.56，3.78，1.59 g・kg-1），另取10只假手术动物作为对照组。10 mL・kg-1・d-1连续灌胃90 d。给药第86天进行Morris水迷宫训练，第90天进行学习记忆能力测试；脑组织用10%甲醛固定，常规制片、染色后进行病理形态学观察；采用免疫组化和图像分析技术检测海马区Na+-K+-ATP酶的表达。结果：通络醒脑泡腾片各给药组与模型组比较均能显著缩短训练第5天的逃避潜伏期，显著增加第一象限进入次数、经过逃逸平台次数和进入有效区域次数（P
[关键词] 通络醒脑泡腾片；学习记忆；病理形态学；Na+-K+-ATP酶
脑缺血导致的学习记忆障碍与阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）病理和临床表现具有高度关联性，近年引起研究者的高度关注。有脑血管病的患者AD 发病率高于正常人，而且临床上有不少AD患者同时合并血管性痴呆和脑供血不足等情况[1]。AD患者葡萄糖代谢率明显下降是AD的一个显著特征[2]。研究表明AD患者葡萄糖/能量代谢障碍往往出现在行为学、电生理或器质性损伤之前，表明能量代谢障碍是AD的早期信号[3]。慢性脑缺血导致认知功能损害的病理生理基础在于：能引起能量代谢障碍、葡萄糖代谢减少、蛋白质合成异常、神经递质改变、胆碱能受体缺失、脑白质损害和神经元缺陷等。因此慢性脑缺血引起的学习记忆障碍模型，可作为AD的研究模型[1]。课题组前期在分析AD病机演变规律后提出了AD是一个“渐进的、三维的、由脑能量代谢障碍启动的、由功能性改变缓慢演变为器质性改变的、存在物质流、能量流和信息流障碍并相互影响的慢性神经退行性疾病”的认识[4-5]。Na+-K+-ATP酶是细胞膜上重要的膜蛋白，其活性是反映机体生理功能衰退极为敏感的指标，是体内能量代谢的重要检测指标[6]。通络醒脑泡腾片是以古方芎归汤为基础创制的专利方药，由川芎、黄芩、当归组成，具有活血通络，醒脑通窍，解毒益智的作用[7]。本文采用双侧颈总动脉永久结扎法致脑慢性脑缺血行学习记忆障碍模型，以Morris水迷宫，脑组织病理形态学及免疫组化法评价通络醒脑泡腾片抗痴呆作用及其对海马Na+-K+-ATP酶表达的影响。
1 材料
1.1 药物与试剂 通络醒脑泡腾片（原生药4.5 g/片，由本课题组自制，批号20100304）；甲磺酸双氢麦角碱片（天津华津制药有限公司，批号2C834T）；Na+-K+-ATP酶一抗：兔抗大鼠IgG（美国Santa cruz公司，批号SC-30538）；二抗：生物素化山羊抗兔IgG（H+L），ZB-2010（北京中山金桥生物有限公司，批号V0527）；三抗：辣根过氧化酶标记链霉素卵蛋白（HRP/A-V），批号V7023；DAB显色试剂盒：Kit ZL1-9032，批号753223A ，均由北京中衫金桥生物有限公司提供，其余所用试剂均为国产分析纯。
1.2 动物 SD大鼠，SPF级，雌雄各半，体重220～260 g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，动物合格证号SCXK（川）2008-24；实验场地为国家中医药管理局成都中医药大学中药药理三级实验室，编号TCM2032043。大鼠均在室温22～24 ℃，明暗周期12 h/12 h条件下，自由饮水摄食。
1.3 仪器 WMT-100 Morris水迷宫（成都泰盟科技有限公司）；切片机（徕卡-2015，德国）；TSJ-Q型全自动封闭式组织脱水机；BMJ-Ⅲ型包埋机；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪；Motic BA400显微摄像系统（麦克奥迪公司）；Image-Pro 6.0图像分析系统（美国Media Cybernetics，Inc.）。
2 方法与结果
2.1 造模、分组及给药方法[8-10] 取健康SPF级SD大鼠，雌雄各半，适应性喂养3 d后，以Morris水迷宫实验筛选学习记忆良好者用于造模。采用2-VO法永久性结扎双侧颈总动脉法[8-10]制备慢性脑缺血性学习记忆障碍模型，假手术组除不结扎外，其余造模步骤与模型组相同。手术后动物连续3 d肌肉注射硫酸庆大霉素注射液每只0.3 mL。术后恢复1个月后，取存活大鼠50只，称重后随机分为5组，即模型对照组、甲磺酸双氢麦角碱片组（0.7 mg・kg-1）、通络醒脑泡腾片高、中、低剂量组（7.56，3.78，1.59 g・kg-1），每组10只，另随机取10只假手术组大鼠为平行对照组。给药体积为10 mL・kg-1，每日1次，连续给药90 d，假手术组、模型组给予10 mL・kg-1生理盐水。
2.2 大鼠学习记忆能力测试 给药第86天开始进行Morris水迷宫训练。平台放置在第一象限，测试方法参考文献进行[11]。每天以4个象限放入后的逃避潜伏期的均值作为该天的逃避潜伏期成绩进行统计分析，给药第90天进行定向航向和空间探索测试，行为学测试均在晚上进行，见表1，2。模型组较假手术组的训练第3，5天的逃避潜伏期显著延长（P
2.3 标本制备及病理形态学检测 Morris水迷宫行为学检测完成后，股动脉放血处死大鼠，无菌条件下取出脑组织，10%甲醛固定，逐级乙醇脱水、修剪、包埋、切片、HE染色、封片等，进行大鼠脑组织病理形态学观察并分级分析，病理分级标准为：未见病变“-”。小灶性灰、白质水肿，细胞溶解；小灶性灰、白质细胞萎缩，胞浆及核深染；灶性少许细胞增生（增生细胞主要为胶质细胞）；轻度血管周水肿；轻度血管充血、出血；少许炎细胞浸润；轻度灰质萎缩薄；少许室管膜细胞增生，符合其中一项者，即判定
为“+”。多灶性灰、白质水肿，细胞溶解；灶性灰、白质细胞胞萎缩，胞浆及核深染；灶性较多细胞增生（增生细胞主要为胶质细胞）；中度血管充血、出血；较多炎细胞浸润；中度血管周水肿；符合其中一项者，即判定为“”。弥漫性灰、白质水肿，细胞溶解；多灶性灰、白质细胞萎缩，胞浆及核深染；灶性大量细胞增生（增生细胞主要为胶质细胞）；重度血管充血、出血；大量炎细胞浸润；符合其中一项者，即判定为“”，结果见表3。模型组可见灰质区细胞层次欠清楚，海马神经元细胞层次减少，排列稀疏、紊乱，部分退变的神经元为紫蓝色小体（密集嗜碱性深染不规则梭形结构），细胞浆、核不清，胶质细胞增生；白质区灶性致密红染（可能为神经纤维变性所致），细胞内可见脂褐素颗粒（老年斑）及神经纤维缠绕，可见退行性病变，与假手术组比较，有显著的统计学意义（P
2.4 海马Na+-K+-ATP酶表达测定 无菌条件下取出脑组织，常规固定，泡蔗糖溶液后，行连续冠状切片，片厚20～30 μm，每隔5片取2片，切片反复漂洗后SP法行免疫组织化学反应。具体方法参照说明书进行。选取海马切片采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统进行图像分析，所有平均吸光度A测定均在相同的光学条件下完成。阳性：棕黄色-黄色表达于细胞浆，阴性细胞核为蓝色，见图1和表4。Na+-K+-ATP酶阳性表达为棕黄色-黄色颗粒，主要表达与细胞浆中，模型组Na+-K+-ATP酶免疫染色变浅，阳性表达减弱，明显低于假手术组，平均吸光度较假手术组显著降低（P
3 讨论
脑能量代谢障碍是AD早期的始动因素，也是AD的特征性病变之一。虽然脑质量只有身体质量的2%左右，但其耗氧量与耗能量却占全身的20%，
A.假手术组；B.模型组；C.甲磺酸双氢麦角碱片组；D.通络醒脑泡腾片高剂量组；E.通络醒脑泡腾片中剂量组；F.通络醒脑泡腾片低剂量组。
图1 2-VO大鼠海马Na+-K+-ATP酶的表达的影响（10×40）
Fig.1 Effect of Na+-K+-ATPase expression on 2-VO rat（10×40）
且99%以葡萄糖为能源，耗糖量占全身供糖量的25%[13]，而脑内储存的糖原酵解供能维持大脑正常活动的时间少于5 min，一旦血流供应终止，5～7 min后ATP 贮库耗竭，脑组织神经细胞不能进行主动过程（转运、合成等）[14]。Aβ沉积形成老年斑也是AD的特征病变之一，由于Aβ前体蛋白的降解受ATP不足的影响，当氧化/能量代谢率下降超过50%时，即可触发脑内Aβ的沉积[15]，而Aβ与亲环素D结合亦可导致线粒体渗透性通道的开放，从而加重了线粒体能量衰竭[16]。此外，当AD脑血流量减少，脑能量障碍时，无氧酵解增加，有氧氧化所需的PDH和α-KGDH活性下降，GSK-3活性增加，导致tau过度磷酸化，形成神经纤维缠结。研究表明，海马是对脑缺血最敏感的区域之一，也是学习记忆的关键结构，海马缺血的动物记忆力明显下降[17]。Na+-K+-ATP酶活性是神经细胞质膜功能状态的标记，其活性是反映机体能量代谢水平及脑缺血损伤程度的一项重要指标[18]。Na+-K+-ATP酶是依赖ATP功能的酶，ATP生成减少或耗竭时，该酶活性降低，细胞膜依赖其转运的离子泵活性受到抑制，细胞内Na + 排出减少而水钠潴留，造成神经细胞水肿。
本次实验研究表明，通络醒脑泡腾片能显著缩短Morris水迷宫大鼠定向航行测试的逃避潜伏期，且显著增加空间搜索测试第一象限进入次数、经过逃逸平台次数和进入有效区域进入次数，与模型组比较有显著的统计学意义（P
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篇7
关键字：日语专业；一级证书；就业；影响
中图分类号：G648 文献标识码：B 文章编号：1672-1578（2014）01-0001-01
1.日语一级证书的广泛认同
日语能力考试目前已成为世界范围内检测日语学习者水平的重要工具，在考查母语非日语的日语学习者语言水平方面有着不可动摇的权威性。2011年，全球有62万余人参加了日语能力考试。
首先，对于一个日语专业的学生来说日语能力考试最具有说服力的无疑就是日语能力一级了。2006年日本国际交流基金会在中国部分高校日语专业学生中就学习日语目的做了一项问卷调查。调查内容如下15 项， 要求从中选择5 项。
（1）为获得有关日本文化知识 （2）为获得有关政治经济社会知识
（3）为获得有关日本的科学技术 （4）为获得参加大学入学考试资格
（5）为去日本留学 （6）由于现在工作的需要
（7）为将来求职的需要 （8）为去日本观光旅游的需要
（9）为与日本进行友好交流的需要 （10）为使用日语进行交流
（11）为了不忘母语或者父母方的母语 （12）处于对日语的兴趣
（13）作为国际理解和异文化交流的一环 （14）为了不辜负父母的期望 （15）其它
调查结果表明，我国高校日语专业学生的首要目的就是要将来求职需要，而日语一级成为日语专业学生证明自己学习能力的唯一手段。当然，如果日语专业学生想要进一步深造，无论是国内院校还是日本的一些相对有知名度的学校，几乎全部要求求学者持有日语一级证书。
其次，在招聘过程中80%以上的日资企业会要求应聘者必须持有日语一级证书，部分日语要求没那么严格的企业也都会要求求职者通过日语能力二级考试。而这只是想要获得有面试资格的第一步。对于学校而言，日语一级过级率无疑成了学校就业率的砝码，以及和其他相关高校竞争的有力说明。于是，学校在学生过级问题上也同样重视。
2.日语人才与企业需求的矛盾
笔者通过对智联招聘，应届生求职网等大型应届生招聘网站进行调查，分析了50个招聘日语人才的职位主要可以分为以下几种：（1） 日语翻译； （2）日语培训老师；（3） 日销售、管理、技术人才； （4） 日语软件工程师等。从调查结果中可知，有85%的企业要求日语能力一级水平，要求毕业生或者无需工作经验的站40%，要求有工作经验的达到67.8% 。但是有100%的企业要求日语沟通能力良好，能够和日本人进行畅通的沟通，同时要求应聘者会运用日语之外，会英语，或者具有会计、贸易、会计、计算机等等技能，简而言之，日本企业最需要四类人才分别是； 具有日语能力的营销人才、懂日语的IT人才、会日语的财务人才、日语同声翻译。
但是，再看看我们的日语专业的毕业生，令人失望的是他们当中一部分手持一、二级证书的专业毕业生在实际工作中运用能力较低。在与日商的交流和谈判中难以听懂和表达自己的意图， 甚至连最基本的日常交流都难以进行。甚至不得不从事其他与日语无关的工作，有大量的日语人才找不到合适的工作，大量的企业招聘不到理想的日语毕业生，这样就产生了"企业无人才可用，日语人才就业难"的尴尬局面。
3.导致日语人才与企业需求的矛盾的原因
首先，日语专业学生对于市场需求认识不足。部分学生认为只要通过日语能力一级考试，拿到证书就万事大吉。于是以此为目标，再次进入应试教育的魔掌。特别是日语能力测试本身的局限性，并没有设置口语方面的考核。同样也导致了日语专业学生一心只为考试，忽略了语言学——应用。毕业生整体呈现出持有证书，但是交流能力上严重不足的矛盾。
专心于证书的取得同样也忽视了自身综合素质和技能的培养以及提升。如果日语专业学生能够认识到日本企业最需要四类人才分别是； 具有日语能力的营销人才、懂日语的IT人才、会日语的财务人才、日语同声翻译，并且以此为目标，相信会有很好的施展自己才华的舞台。
其次，一些高校在人才培养方面过于功利化。为了追求能力考试的过级率，打乱教学安排，不惜牺牲优秀的教学资源，把宝贵的时间花在应试教育上，忽略语言运用能力的培养，忽略了学生全面发展的必要性， 偏离了设立日语能力考试的初衷。传统的日语人才培养模式，已经滞后于社会的需求，不能满足于学校、企业等对于日语人才的要求。培养出适合社会需要的高层次复合型日语人才，必须在原有的人才培养目标基础上有所突破才行。
并且过多的强调证书的重要性，形成不良的社会影响。尽管证书是一个人语言学习能力的重要证明，但是并不代表全部。作为一个语言学习者更重要的是熟练应用语言的能力和与人交流沟通的能力，以及对对象国文化社会习俗等等一系列方面的了解。大部分企业以日语一级证书为面试的敲门砖，否则连面试的机会都没有，这样无疑也会加重社会对于证书的推崇，而忽略了实际运用的重要性。
4.对我们的启示
4.1 对于日语专业学生本身来说，改变观念，加强对于市场需求的了解，明确认识企业需要，弥补自身不足。可以通过网络报纸杂志等途径，加强对相关方面的了解，关注相关信息，明确相关需求。认清形势之后针对自身不足进行弥补和学习，拓展知识面，学好本专业的同时多涉猎其他知识。多参加培训讲座等，提升自身能力和竞争力，尽量学习出语言之外另外一门专业，来满足企业对于综合人才的需求。
4.2 对于高校来讲，要树立正确的人才培养观念，切记浮躁，追求功利化。在课程的安排上，应该本着培养学生应用语言能力为首要目的，加大听力和口语的课程量，切实提高学生的听说读写能力。在师资配备上，招聘具有良好社会经验的老师与学生进行就业知识的交流，重点培养学生的对于社会的认识。同时多开展日本企业文化经济等相关的活动，增加学生对于日本企业文化的了解，以便其更好的于日本人交流。
4.3 对企业而言，要宣扬正确的用人理念，尽管证书是一个很好的测试应聘者语言水平的重要手段，但是过度的强调，反而不利于企业用人的通畅。通过宣扬正确的价值导向，减小企业与人才的矛盾。
5.结束语
当前， 高校毕业生就业已成为社会普遍关注的问题。日语专业的毕业生的就业情景也不容乐观。因此作为日语专业的学生，在努力考取日语能力一级证书的同时，千万不能忽视了日语应用能力的提升，努力提高自身的综合素质，以市场需求为导向，践行语言+专业的模式，这样才能避免就业尴尬局面，创造属于自己的美好未来。
此论文为2012年广西高校大学生创新创业计划项目《关于提高日语一级过级率的探讨》的研究成果
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作者简介：
张惠莲 （1992-） 桂林理工大学外国语学院 2012年为日语本科4年级学生
篇8
【关键词】 围手术期；胃肠道恶性肿瘤；异体输血；免疫功能；生活质量
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2016.35.030
【Abstract】 Objective To explore influence of allogeneic transfusion on immune function and life quality of patients with gastrointestinal malignant tumors during perioperative period. Methods A total of 30 patients with gastrointestinal malignant tumors were randomly divided into group A and group B， with 15 cases in each group. The group A received allogeneic transfusion during perioperative period， and the group B received no special treatment. Comparison were made on postoperative immune function and life quality of two groups. Results Both groups had no statistically significant difference in interleukin-2 （IL-2） and prostaglandin E2 （PGE2） of 1 day preoperation， 1 day and 7 days postoperation （P>0.05）. Group A had 12 increased >10 points cases in Karnofsky performance status （KPS） score， 2 cases with no obvious change and 1 case with decreased points. Group B had 6 increased >10 points cases，4 cases with no obvious change and 5 cases with decreased points. Difference had statistical significance in cases of KPS score increased >10 points in two groups （P
【Key words】 Perioperative period； Gastrointestinal malignant tumors； Allogeneic transfusion； Immune function； Life quality
本研究2010年1月～2016年1月期间在本院接受治疗的30例胃肠道恶性肿瘤患者作为研究对象， 探讨异体输血对围手术期胃肠道恶性肿瘤患者免疫功能及生活质量的影响。现报告如下。
1 资料与方法
篇9
【摘要】 目的 观察异丙酚预处理对拟AD模型大鼠的学习记忆功能和海马损伤神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT）和bcl2表达的影响，分析异丙酚的脑保护作用。方法 大鼠海马CA1区微量注射冈田酸（Okadaic acid，OA），建立拟AD大鼠模型。异丙酚预处理组大鼠于拟AD模型制作前30 min，腹腔注射异丙酚100 mg/kg。然后用Morris水迷宫观察大鼠行为学变化，Bielschowsky染色观察NFT及免疫组化方法观察bcl2表达的变化。结果 与对照组大鼠相比，模型组大鼠学习记忆能力显著降低；Bielschowsky染色观察海马CA1区域出现大量NFT的特征性病理变化，免疫组化bcl2表达明显减少（P＜0.05）。与模型组大鼠相比，异丙酚预处理组大鼠学习记忆能力明显提高；海马CA1区NFT明显减少或消失，免疫组化bcl2表达明显增多（P＜0.05）。结论 拟AD模型建立前30 min异丙酚预处理能改善拟AD模型大鼠学习记忆能力，能降低NFT的表达，增高bcl2表达，有明显的脑保护作用。
【关键词】 阿尔茨海默病；异丙酚；冈田酸；学习记忆；神经原纤维缠结；bcl2
【Abstract】 Objective To study the effects of propofol pretreatment on learning and memory ability，and to investigate the expression of neurofibrillary tangles(NFT) and bcl2 of hippocampus tissues in Alzheimer’s diseaselike model rats，and to analyze the protective effects of propofol on brain. Methods Okadaic acid (OA) was injected into hippocampal CA1 region of rats in model group and pretreatment group to establish Alzheimer’s diseaselike model. Rats in the pretreatment group were abdominally injected with propofol (100mg/kg) before making ADlike model. The learning and memory abilities of rats were assessed through Morris water maze behavioral test. NFT were the characteristic pathological changes of AD，examined by Bielschowsky stain of hippocampus，and the expressions of bcl2 were examined by immunohistochemistry in hippocampus CA1 region of the rats. Results Compared with control group rats， the abilities of learning and memory decreased. Many NFTs were observed in hippocampal CA1 region. The expression of bcl2 in the CA1 region decreased (P＜0.05). Compared with model rats，the abilities of learning and memory of propofol group rats improved. NFT was reduced in hippocampal CA1 region. The expressions of bcl2 in the CA1 region increased(P＜0.05).Conclusion Treated with propofol at 30 minutes before injecting OA can ameliorate the neurobehavioral score of rat with hippocampus injury，reduce the level of NFT and increase the expression of bcl2 in brain tissues of rats with OA injury，which has significant protective effects on brain.
【Key words】 Alzheimer’s disease，propofol，Okadaic acid，learning and memory， neurofibrillary tangles，bcl2
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年人中发病率高、危害性大的中枢神经系统退行性疾病。到目前为止，其确切病因和发病机制尚不完全清楚，临床上首先表现为近期记忆力减退，继而表现为持续性智能衰退、失语、判断推理能力丧失以及运动功能障碍。脑药物预处理是通过药物激发或模拟机体自身内源性保护物质而呈现的脑保护作用，药物性预处理具有相对安全、方便、易于控制剂量等优点。异丙酚（propofol）为目前最为常用的静脉全麻药物，因其苯环上的结构与天然的抗氧化剂维生素E相似，因而具有了一定的清除自由基和抑制脂质过氧化作用［1］，一些在体动物实验证实了异丙酚具有脑保护效应［2～5］。本实验利用拟AD大鼠模型，观察了用异丙酚预处理海马组织中NFT及bcl2含量的变化，并结合学习记忆能力的改变，评价异丙酚的脑保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 3～5个月龄健康雄性SD大鼠36只，体重200～250 g，均购自山东大学实验动物中心。随机分为3组：正常对照组（简称对照组）、拟AD模型组（简称模型组）、异丙酚预处理组(简称异丙酚组)，每组12只，自然条件下饲养，自由饮食，光线湿度适中。
1.2 实验试剂和仪器 实验试剂：Okadaic acid（OA）粉剂购自美国sigma公司，临用前溶解于10%二甲亚砜（DMSO），配制成0.4 mmol/L溶液；抗bcl2抗体、DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；静安（异丙酚），北京尤费森尤斯卡比制药有限公司分装（批号UI 152，进口编号H20060427）。主要仪器：研究用生物显微镜（带摄像装置及图像分析系统）为德国Leica公司产品；全自动Morris水迷宫，上海吉量软件科技有限公司；脑立体定位仪DYTⅠ，中国天津生产。
1.3 实验方法和步骤
1.3.1 拟AD模型制作：模型组、异丙酚组大鼠称重，选择右侧海马为注射靶区，10%水合氯醛腹腔麻醉（300 mg/kg）后，固定于脑立体定位仪上，颅顶皮肤常规消毒，剪去头皮，充分显露颅骨，参照George等［6］的《大鼠脑立体定位图谱》，于前囟后（A）3.6 mm，中线右侧（R）旁开2.4 mm处用直径1 mm的颅骨钻钻一小孔，垂直插入自行设计的十字形管，牙科水泥固定。通过十字形管用微量注射器进行海马CA1区微量注射（深度2.7 mm），模型组、银杏内酯组、联合组大鼠均经纵管缓慢注射0.4 mmol/L的OA 0.5 μl，5 min注射完毕，留针10 min。每隔2 d按同样方法剂量注射1次，共5次。对照组用同样方法注入等体积的对照液10% DMSO。术后大鼠肌注青霉素10万单位预防感染，连续5d。
1.3.2 异丙酚腹腔注射：异丙酚预处理组大鼠于拟AD模型制作前30 min，腹腔注射异丙酚100 mg/kg，对照组、拟AD模型组用同样方法腹腔注射生理盐水。
1.3.3 大鼠行为学检测：大鼠行Morris水迷宫定向航行实验（place navigation test）和空间探索实验（spatial probe test），Morris水迷宫由周围水池和自动录像、记录系统两部分组成。Morris水迷宫水池直径160 cm，深50 cm，摄像镜头安放于水池中心上方2 m高度。将各象限水池壁中点标为入水点，标记4个象限。站台直径12 cm，高30 cm，固定于第3象限，水池中水面高出站台平面1 cm。水中加入适量黑色素，以肉眼看不见站台为宜，保持水温（25±1）℃。周围环境安静，恒定光源。实验开始前1 d将每只大鼠单独放入未放站台的水池中2 min，使其适应水迷宫环境及学习游泳。实验时将大鼠分别从4个象限的固定入水点放入水池，自动录像系统记录大鼠找到平台的时间和游泳路径。水迷宫实验于海马CA1区首次注射后的第4周开始进行，共7 d。第1～6天进行定向航行试验：每日将大鼠按顺序ⅣⅢⅡⅠ象限从各入水点靠池壁放入水中（鼠头朝向池壁，鼠尾没入水中），记录60 s内大鼠从入水到爬上站台所需时间即逃避潜伏期（以在站台上停留达到或超过10 s为上台，不足10 s不作为上台）。每只大鼠每天训练4次，上下午各2次，每只每次间隔时间15 min，中午间隔2 h。训练过程中，若大鼠60 s内找到站台，让其在站台上停留10 s，若未找到站台，引导大鼠上站台，并停留10 s，潜伏期记为60 s；第7天进行空间探索实验：撤去站台，将大鼠从第1象限入水点放入水池，记录120 s内大鼠在各象限的游泳时间和穿越站台次数，作为评价大鼠学习成绩的指标。
1.3.4 灌注取材：水迷宫试验结束后，将各组大鼠经10%水合氯醛（按体重450 mg/kg，腹腔注射）深麻后，快速灌入生理盐水150 ml，然后改用10%中性缓冲甲醛（4℃）150 ml灌注，断头取脑，置10%中性缓冲甲醛中浸泡固定7 d。取海马注射点前后约3 mm厚标本，经脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋后行大鼠海马冠状位切片，片厚4 μm。同时观察每只大鼠标本海马注射轨迹，注射深度或位置未达要求者不纳入统计处理。
1.3.5 Bielschowsky染色：切片脱蜡至水化，用2 %硝酸银水溶液避光浸染于37℃水浴箱内孵育30 min；10%福尔马林液还原数秒钟至切片呈现黄色为止；用氨银溶液滴染20～40 s，倾去染液，直接用10%福尔马林液再次还原1～2 min，使切片呈棕黄色；用0.2 %氯化金溶液调色2～5 min；5 %硫代硫酸钠水溶液固定3～5 min；然后脱水、透明，中性塑胶封固。
1.3.6 免疫组织化学两步法：切片常规脱蜡至水；滴加3%H2O2，以阻断内源性过氧化物酶；热修复抗原：将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液（TBS，pH 6.0）中，微波炉“高火”加热至沸腾3 min，后改为“保温”10 min。冷却后磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2～7.6）洗涤2次；滴加适当稀释的一抗（兔IgG）， 37℃恒温水浴箱孵育30 min，PBS洗涤2 min×2次；滴加通用型IgG抗体（Fab段）HRP多聚体，37℃恒温水浴箱孵育20 min ，PBS洗涤2 min×2次；DAB溶液显色：使用DAB显色试剂盒，取1 ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片；室温显色，镜下控制反应时间，一般5～30 min；蒸馏水洗涤；苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。
1.3.7 显微镜观察 采用Leica摄像显微镜观察并照像。NFT可在海马CA1区形成并在轴突和胞体处染色较深并呈拖尾形状，bcl2免疫组化阳性细胞在光镜下可见胞质、胞膜和突起呈棕黄色或棕色。计数每张切片4个随机高倍视野中阳性细胞数后取平均值作为计数结果，每组10张切片计数结果取平均值作为最后结果。
1.4 统计学处理 应用SPSS11.5统计分析软件包，数据先进行单因素方差分析，多组之间差异两两比较采用SNK检验进行分析，P＜0.05有统计学意义。统计结果以x±s表示。
2 结果
2.1 实验动物数量分析 共有36只健康雄性SD大鼠接受实验，顺利接受麻醉、异丙酚预处理、拟AD模型建立、神经行为学评分和海马损伤NFT、bcl2测定的有33只。在接受海马CA1区OA注射和异丙酚预处理时，有2只大鼠死亡、1只出现偏瘫无法进行余下实验，这可能与动物的个体差异不能耐受实验有关。随机取30只作为实验样本，每组10只。海马注射深度或位置未达要求者不纳入统计处理，故剔除不合标准的，在测定海马组织损伤表达的时候，每组选取8只大鼠作为实验样本。
2.2 大鼠行为学检测 各组大鼠在Morris水迷宫中定向航行实验结果见表1。对照组及异丙酚预处理组的平均逃避潜伏期均渐缩短，从第1天开始，模型组与对照组比较，平均逃避潜伏期均明显延长（P＜0.05）；异丙酚预处理组与模型组比较，平均逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05）。撤去站台后，以在原站台象限（第3象限）的活动时间和穿越站台次数为指标，模型组与对照组比较，第3象限活动时间明显缩短（P＜0.05），穿越站台次数明显减少（P＜0.05）；异丙酚预处理组与模型组比较，第3象限活动时间明显延长（P＜0.05），穿越站台次数明显增多（P＜0.05）（见表2）。在第7天撤去平台之后，对照组、异丙酚预处理组大鼠以绕平台游泳和穿梭游泳方式为主，有少量环池游泳；模型组以穿梭游泳和环池游泳为主，有少量绕平台游泳。结果表明，与对照组相比较，模型组大鼠行为模式发生了改变，异丙酚预处理组的行为模式更接近于对照组。表1 各实验组大鼠定向航行实验中每日平均逃避潜伏期表2 各实验组大鼠空间探索实验第3象限活动注：*与对照组比较，P＜0.05；与模型组比较，P＜0.05
2.3 海马CA1区NFT表达 对照组大鼠海马CA1区神经细胞未见明显改变（图1A）；拟AD模型组大鼠海马CA1区锥体细胞层细胞神经原纤维增粗、粗细不等、排列紊乱，有的密集成团块状，呈编织状遍布细胞质并深入到细胞突起，形成NFT（图1B）。模型组与对照组比较，NFT明显增多（P＜0.05）；异丙酚预处理组同模型组比较，NFT明显减少（P＜0.05）（见表3，图1C）。 表3 各实验组大鼠海马CA1区NFT神经元计数
2.4 海马CA1区bcl2的表达 正常对照组大鼠海马CA1区bcl2阳性细胞表达较多，可见胞质、胞膜和突起呈棕黄色或棕色（图2A）；模型组大鼠海马CA1区bcl2阳性细胞表达明显减少（图2B），与正常对照组相比有显著性差异（P＜0.05）；异丙酚预处理组表达增多，与模型组相比有统计学意义（P＜0.05）（见表4，图2C）。 注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，P＜0.05
转贴于 3 讨论
众所周知，海马作为边缘系统的重要组成部分，是近期记忆回路的重要结构，是学习记忆的重要解剖基础和神经中枢，在学习、记忆、情绪反应及植物神经功能等方面发挥着重要作用［7］，更因其结构上具有高度的序化板层构筑和神经元相对独立分布等特点而成为最理想的学习记忆的研究模型［8］。许多研究表明，海马与机体衰老、阿尔茨海默病及癫痫发作有着非常密切的关系。由于海马不同区域的功能不尽相同，其中CA1和CA3区在学习、记忆中担负重要作用［9］。海马CA1区发育最晚，但是最早出现老化的部分。故本实验将注射部位定位于海马CA1区。我们评价学习记忆的设备是带摄像装置及分析软件的Morris水迷宫，实验数据不受人为因素的影响，结果更为客观、真实。本实验发现模型组大鼠在注射OA结束后的水迷宫行为学实验从第1天起就出现学习记忆能力下降。模型组海马CA1区GFAP免疫阳性神经元显著增多，银染结果显示模型组海马CA1区出现较多的NFT，这与AD的主要病理变化相吻合。
我们通过改进的Bielschowsky染色发现，OA可导致大鼠海马和皮层神经元内产生大量的NFT。异丙酚预处理组海马内NFT数量减少，与拟AD模型组比较差异显著（P＜0.05）。NFT是导致神经元纤维退化的主要原因［10］，目前认为NFT的形成与AD病人的认知功能障碍呈明显的正相关。NFT主要成分是过度磷酸化的tau蛋白和少量微管蛋白。正常tau蛋白是可溶性的，可将营养物质从胞体输送到突触末端，而过度磷酸化的tau蛋白则是不溶解的，扭曲变形的微管蛋白不能正常输送营养物质，导致神经元末端的树突和轴突发生营养不良性萎缩。我们推测异丙酚可能影响tau蛋白的异常磷酸化，减少NFT的形成，从而保证轴浆的正常运输。异丙酚组海马CA1区bcl2阳性细胞表达数量明显增加，表明bcl2在拟AD大鼠学习记忆改善过程中发挥作用。目前研究认为bcl2基因及其蛋白bcl2可以抑制或阻断多种因素引起的细胞凋亡，并认为bcl2抑制细胞凋亡的机制与bcl2能抑制Caspase的基因表达 ［11］，并具有稳定线粒体外膜，调节线粒体功能，阻止细胞色素C的释放［12］，降低钙离子从内质网的释放［13］，以及抑制自由基产生，抗氧化等作用有关。
近年来，静脉麻醉维持和诱导药物异丙酚的脑保护效应尤为引人注目，大量动物实验和人体试验都发现异丙酚具有脑保护效应，它有良好的对抗应激性血糖升高作用，同时能保证脑氧供需平衡，通过阻滞或减轻继发性脑损害，改善脑创伤后的神经功能而产生脑保护作用。其脑保护机制可能是：①钙通道阻滞药作用：研究表明，异丙酚可其直接或间接地抑制Ca2+经NMDA受体耦联Ca2+通道和电压依赖性Ca2+通道进入胞内，减少自由基的产生［14］，通过解除缺血区脑微循环灌注，减少线粒体和内质网钙离子活化产生的细胞损伤。②自由基清除剂作用：异丙酚的活性成分的化学结构和已知的氧自由基清除剂丁羟基甲苯和维生素E一样具有酚羟基结构［1］，可有效地防止甲基（酰）门冬氨酸积聚，与氧自由基反应生成酚基氧自由基，从而抵抗氧自由基的作用。③激活γ氨基丁酸A受体：异丙酚可以增强氟硝基安定与中枢苯二氮艹卓类受体的结合，从而增加开启Cl通道的频率，增强γ氨基丁酸的效应；还可以下调NMDA受体拮抗剂所诱导的cfos基因和HSP70基因在后扣带皮质回的表达，从而阻断NMDA受体拮抗剂所致的神经毒性，减轻后扣带皮质回神经元的组织病理损害［15］。
本实验结果，异丙酚预处理的拟AD模型大鼠，空间学习记忆能力明显改善，海马CA1区少见或未见NFT，bcl2表达增高。表明拟AD模型建立前30 min异丙酚预处理能改善拟AD模型大鼠学习记忆能力，降低NFT的表达，增高bcl2表达，有明显的脑保护作用。
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篇10
关键词：游泳训练；学习记忆；海马；纹状体； 脑源性神经营养因子
中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1007-3612(2007)10-1352-03
近年来的研究发现，适宜的运动对学习记忆能力有一定的促进作用［1-2］，但是对其分子机制却并不明了。最近的研究发现，在神经元生长过程中起重要作用的脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)，可能在大脑的可塑性过程中起关键性作用，特别是在与学习记忆有关的海马和纹状体中，BDNF可能参与了突触功能和可塑性的调控［3］。本文以大鼠为实验对象，研究长期运动训练对大鼠学习记忆能力的影响，并从BDNF基因表达的角度探讨其可能机制。
1材料与方法
1.1动物分组及训练模型雄性2月龄SD大鼠36只，体重(284.0±12.8)g，由上海市药品检验所提供，常规分笼饲养（每笼4只）。国家标准啮齿类动物饲料喂养，自由饮食饮水。动物饲养环境：室温(23±1)℃，湿度85%，自然光照。
实验前，随机将大鼠分为安静对照组（C组，n=18）和运动训练组（T组，n=18）。所有大鼠进行3次适应性游泳训练，每次30 min。随后，T组开始8周无负重游泳训练，每周6次，每次60 min，游泳训练池为180 cm×60 cm×80 cm，水温(30±1)℃。在第八周最后一次训练结束后，将T组大鼠随机分为Ta组（即训练迷宫组，n=10）和Tb组（即训练生化组，n=8），同时，C组也随机分为Ca组（即安静迷宫组，n=10）和Cb组（即安静生化组，n=8）。Ta组和Ca组用于水迷宫的学习记忆能力测试，Tb组和Cb组用于基因指标测试。
1.2行为学实验程序Ta组和Ca组大鼠在第9周采用Morris水迷宫［4］测试其学习记忆能力，测试分两部分：1） 定位航行实验( place navigation)：共5 d。实验前1 d, 将大鼠放入不放平台的水池中自由游泳2 min, 让其熟悉水迷宫环境。平台放入第一象限中央，每天分上午和下午两个时间段进行大鼠的训练和测试，每个时间段测试3次，分别从固定的入水点将大鼠面向池壁放入水池, 电脑记录大鼠找到并爬上平台所需的时间，即潜伏期(latency)。若大鼠在120 s 内找不到平台，则由实验者将其引上平台，逃避潜伏期计为120 s。每次测试间隔60 s，让大鼠在平台上休息。2） 空间探索实验( spatial probe test )：实验在第6 d进行，撤走池内平台，将大鼠从原入水点面向池壁放入池中，通过系统记录并分析大鼠在120 s 内的游泳轨迹,计算出大鼠在平台象限中游泳路程和时间占总游泳路程和时间的百分比。
1.3样本采集Tb组大鼠在第八周最后一次运动结束之后即刻断头处死，Cb组与Tb组大鼠同时断头处死，两组交替进行。按文献的方法［5］迅速取其纹状体、海马，所有操作均在冰上操作，将取出的纹状体、海马放入冻存管中，迅速置入液氮中保存，待测。
1.4总RNA提取取冻存组织分别置于玻璃匀浆器中，加1 mL Trizol，匀浆充分，采用Trizol法提取海马和纹状体总RNA，将总RNA作适当稀释后，根据OD260/OD280光密度比值作定量分析。定量公式：RNA浓度（μg/mL）=OD260值×40×稀释倍数（本实验为400倍）。
1.5逆转录反应逆转录体系（总体积20 μL）包括：DEPC水与2 μg总RNA共8 μL, RNA酶抑制剂(50 U/μL)0.5 μL，5×buffer4 μL,10mMdNTP2 μL,0.1 mMDTT2 μL,随机引物(50 pM/μL) 0.5 μL，M-MLV逆转录酶（200 U/μL ）1 μL。37℃水浴反应1 h，90℃处理10 min灭活逆转录酶。PCR反应组成如下：灭菌水34.5 μL，MgCl2(TaKaRa) 5 μL，10×buffer (TaKaRa) 5 μl，10 mM dNTP1 μL，Primer(up 50 pM/μL) 1 μL，Primer(down 50 pM/μL) 1 μL,反转录产物2 μL, Taq酶(5 U/μL)0.6 μL。以看家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内参，PCR时各指标的退火温度以及循环数来自预实验，退火温度具体如下：（A程序结束后直接进行B程序）A程序（降落PCR）:a.94℃ 2 min,b.94℃ 30 s,c.61℃～57℃ 45 s,d.72℃ 1 min(注：其中b,c,d三个步骤持续20个循环。C步为降落PCR，每个循环降低0.2℃);B程序:a.94℃ 30 s,b.57℃ 45 s,c.72℃ 1 min,d.72℃ 6 min(注：其中a,b,c,三个步骤持续20个循环) 所用引物由上海赛百胜生物公司合成，序列为：BDNF: 上游 5'-CCA TGA AAG AAG CAA ACG TC-3'
下游 5'-CAG CAG AAA GAG CAG AGG AG-3'GAPDH:上游5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'
下游5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'电泳分析结果：取扩增产物10 μL，上样于1.5%琼脂糖凝胶（内含0.5 μg/mL溴化乙锭），在TBE缓冲液中，电泳时间30 min，电压90 V，凝胶成像系统观察电泳结果并在紫外光下观察照相。结果计算：凝胶电泳结束后用凝胶成像系统拍照并进行电泳条带净面积分析。标本靶基因条带净面积参数与内参基因（GAPDH）条带的净面积参数之比值作为该标本mRNA的表达水平参数。
1.6数据处理所得数据应用SPSS11.0统计软件进行统计分析，两组间采用双侧t检验，并进行显著性分析。
2结果
2.1定位航行实验结果如表1和图1所示，在迷宫测试的第一天和第二天，Ta组和Ca组大鼠的潜伏期无显著差异。在第三天和第四天，Ta组大鼠的潜伏期极显著低于Ca组的大鼠（P
Ta组与Ca组比较，*表示：P
2.3游泳训练对大鼠海马、纹状体内BDNFmRNA表达的影响如表3和图2所示，与Cb组相比较，8周游泳训练之后，Tb组大鼠海马内BDNFmRNA表达有显著增加（P
3讨论
Morris水迷宫广泛地运用在脑科学的研究中，是较为理想的测定动物空间学习记忆能力的实验方法［4］。本实验显示，从第二天开始，Ta组大鼠的潜伏期均比Ca组大鼠短，学习成绩优于Ca组，其中在第三和第四天Ta组大鼠的潜伏期与Ca组大鼠相比呈极显著性差异（P
海马在学习和记忆过程中起着重要作用，损毁海马影响动物的空间记忆，同样纹状体也与学习记忆过程密切相关，研究显示纹状体边缘区含有大量与学习记忆功能有关的物质，其神经投射也与多个学习记忆相关脑区相联系［6］。最近的研究发现与学习记忆相关脑区BDNF基因表达的增加对于学习记忆过程具有重要的意义，Thomas等［7］运用原位细胞杂交融合技术的研究表明，海马依赖的情景学习过程迅速并选择性诱导大鼠海马CA1区BDNF的基因表达。另有研究报道［8］敲除或阻断BDNF基因，可阻断LTP，LTP是学习记忆的神经基础，这种阻断作用在注射重组BDNF或过表达BDNF时得到纠正。那么BDNF是通过怎样的作用途径促进学习记忆的呢？有报道认为BDNF对学习记忆的促进作用可能是由于BDNF易化了某些学习记忆相关神经递质的合成和释放，提高了突触的传递效能［9］。除此之外，BDNF作为一种神经营养因子其本身对神经元突触的生成和结构的调节功能也有助于学习记忆过程。
我们的实验显示，经过长期游泳训练，Ta组大鼠海马BDNFmRNA表达量比Ca组显著性增加；同样，在纹状体内Ta组BDNFmRNA表达量也显著多于Ca组。这提示，适宜的运动训练同样可以促进脑内BDNFmRNA的表达，进而有益于学习记忆能力。国外已有少量关于运动与BDNF的报道，但他们多采用了跑轮运动，如Neeper等［10］的实验发现1周的跑轮运动即可显著增加大鼠海马和新皮层BDNF mRNA的水平，他们认为运动引起的这些与学习记忆相关的脑区BDNF的变化对包括学习记忆在内的认知功能起重要作用。Paul等［1］研究了大鼠跑轮运动1、3、5、7、14、28 d后BDNFmRNA的表达，发现从实验的第一天开始整个实验过程中BDNF mRNA的表达均显著增加，BDNF含量在运动4周后显著增加，并用Mirros水迷宫测试发现3周的运动增强了大鼠的学习记忆能力，表明运动以一种时间依赖的方式调节BDNF诱导，并且这也可能是改进中枢神经系统神经营养调节作用的方式。
本实验表明，8周的游泳训练促使大鼠脑内海马、纹状体BDNFmRNA表达量增加，从而促进了学习记忆能力。但是，目前有关有氧运动可增强BDNFmRNA 和蛋白表达的机制尚不清楚。另有研究发现，运动导致BDNF 表达的增强与去甲肾上腺素和5-羟色胺等神经递质有关，长期跑轮运动能增加海马等部分脑区和脊髓的去甲肾上腺素分泌［11］；还能增加5-羟色胺的释放和代谢［12］，增加的神经递质很可能通过引起脑内第二信使cAMP的增加，从而激活了对其有依赖性的蛋白激酶，并与蛋白激酶A(PKA)的调控亚基结合而释放能转移到细胞核的催化亚基，同时使CREB在特异的氨基酸（Ser-133）上磷酸化，促使CREB与另一个蛋白质结合，形成CREB-结合蛋白。CREB在Ser-133的磷酸化以及它与CREB-结合蛋白质的联合能够易化基本的转录机制，从而激活受CREB调控的基因。有研究表明，BDNF是CREB调节的靶基因［13］还为BDNF启动子的激活转录因子补体所调控［14］，通过诱导增强转录因子CREB的磷酸化从而使海马中BDNF的表达［15］。因CREB的修饰被认为是信号传输的中心环节，参与海马依赖的长时记忆的形成，故运动训练很可能就是通过这一途径诱导BDNF的表达从而促进学习记忆。
4小结
长期适宜的游泳训练可以提高大鼠的学习记忆能力，并能显著性的上调大鼠海马、纹状体内BDNFmRNA的表达。运动引起的大鼠海马、纹状体内BDNFmRNA表达的增加是运动促进学习记忆能力的可能机制之一。
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