基因治疗的基本策略范文
时间：2023-06-29 17:26:22
导语：如何才能写好一篇基因治疗的基本策略，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
关键词：基本医疗 医保费用 增长 控制
目前我国基本医疗保险已经覆盖12.95亿人，覆盖95%以上人口。随着我国医疗卫生体制的改革，覆盖面已经基本涵盖了城镇居民、农民及外出打工人群。人们在享受医疗保险带给我们医疗保障的同时，医疗费用的快速上涨，也给医保基金带来了沉重的负担。因此，若何有效控制医疗保险费用的过快增长，是医疗保险制度健康、有序、稳步发展的前提，是保障人民群众健康的物质基础，同时，也是医疗保险事业平稳运行的基石。本文结合医疗保险管理的实际，对我国医疗保险运行机构如何控制医疗保险费用的过快增长进行分析和探讨。
一、医疗费用过快增长的原因分析
引起次均医疗费用和就医频率增加的因素很多，从对部分省份医疗基金运行的实际情况分析，主要影响因素包括以下方面：
（一）正常医疗需求的增加。
一方面，基本医疗保险制度从无到有，居民生活水平不断提高，使人们的医疗需求得以正常释放，直接影响到了就医频率的增加。同时，2009年开始，各统筹地区为了合理控制医疗保险统筹基金的结余规模，分阶段、不同程度地对本统筹地区医疗保险待遇政策进行了调整。例如：提高医疗保险统筹基金年度最高支付限额和共付段医保基金支付比例、增设门诊大病病种等。在降低参保人员个人负担的同时，提升了参保人员的就医意愿，从而影响到了就医频率的增加。
另一方面，我国城镇职工参保人群年龄结构处于一个逐渐老化的趋势中，各种慢性疾病、危重病发生概率增加，直接导致就医频率和次均费用的增加。统计数据显示，退休人员的次均门诊费用与在职人员差别不大，次均住院费用、门诊就诊率和住院率却差别明显。
（二）以量补价的过度医疗现象普遍存在，推动医疗费用大幅增加。
受国家价格政策因素的影响，医疗机构通过提高医疗收费项目价格的创收途径受到制约，同时又由于我国绝大部分统筹地区均采用项目付费的结算方式，刺激了各医疗机构通过增加医疗服务提供量和种类来创收。以量补价的过度医疗情况已成为我国医疗费用不合理支出快速增加的重要原因。
（三）先进医疗技术在临床推广，对高级别医院的次均费用影响较大。
随着科学技术的迅速发展，新的医疗仪器设备、药品和诊疗技术层出不穷，极大地提高了诊疗水平，在解决疑难杂症方面起到了重要作用。与此同时，医疗技术的进步，其本身的高科技价值也带来了医疗费用的攀升。
二、控制医疗费用上涨的应对措施
医疗卫生资源的有限性与医疗服务需求的不断膨胀之间的矛盾，医疗保险筹资与支出之间的矛盾，医疗保险支出与积累之间的矛盾，是关系到社会保险事业持续发展的关键。根据医疗费用上涨的特点，在保障医疗需求合理增加的前提下，结合电力行业实际，应从以下几方面采取措施，控制医疗费用的快速上涨。
（一）加大医保政策宣传力度。
我国现行的是“低水平、广覆盖、保基本”的医疗保障制度和“以收定支、收支平衡、略有结余”的基金管理原则。医保部门应加强医保政策的宣传，使参保人员明白基本医疗保险保的是基本医疗，而不是特需医疗。基本医疗就是因病施治，进行合理的检查、用药及治疗。不根据病情需要，盲目要求医生多开药、开贵药，不仅不能对症治疗，还会给自己和医保基金造成浪费。
（二）加强政策引导，合理分流病人。
建立双向转诊制度，合理分流参保人员到适合自身疾病治疗的相应级别医院就医。为促使双向就诊制度的有效实施，医疗保险经办机构应积极主动延伸服务，一方面将各定点医疗机构收治的各类常见病的治愈率、次均医疗费用、平均住院天数、个人负担、病人满意度等多种信息定期对外公布；另一方面，对我国医技高超、医德高尚的医务工作者，医疗保险经办机构可以主动进行宣传，尽量减少病人和医院之间的信息不对称程度。
（三）实施医疗保险定点医生管理制度，强化医务人员的自律性。
随着我国五险合一的金保工程二期信息系统在部分地区范围内逐步推广使用，对医疗保险定点医疗机构精确化管理程度提高，管理落实到医生的条件已基本成熟。可以建立部分地区医疗保险定点医生库，制定定点医生诚信评判标准和激励机制，建议全国各省份人力资源和社会保障管理部门将医保定点医生的诚信状况作为医生职称评定的标准之一，提升医生提供医疗服务的自律性。
（四）加强医保稽核管理，确保基金安全。
加强医保稽核管理，加大对违规行为的查处力度，对参保人员将医疗卡、证转借他人使用，恶意骗取医保基金等各种违规行为，要加大查处打击力度，以此强化就医管理，促使参保人员规范就医行为。如：把医保稽核作为医保工作重心之一，通过加强对监管，有效遏制分解住院、降低入院标准、挂床、冒名住院、虚拟住院、过度治疗等不规范医疗服务行为，促进医疗服务质量的提高，维护参保人的权益。
（五）完善医疗保险定点医疗机构管理质量评价机制，实施定点医疗机构分级管理。
通过实施定点医疗机构分级管理，进一步改进定点医疗机构年度考核指标，并建立定点医疗机构管理激励和约束机制，变被动管理为主动管理。
篇2
[中图分类号] R735.7[文献标识码] A[文章编号] 1005-0515（2011）-11-115-01
肝脏血供丰富，是恶性肿瘤转移的最常见的靶器官之一，在恶性肿瘤的发展过程中约25%-50%的原发肿瘤转移至肝[1]。如何提高转移性肝癌的治疗有效率一直是肿瘤临床工作的重点之一，正确认识肝转移癌的一般规律和特点，对进一步提高该病的诊治水平具有十分重要的意义。
1 肝转移癌主要来源分析 常见肝转移癌以消化道恶性肿瘤来源为主，所有的消化系统恶性肿瘤均可经肝动脉、门静脉及淋巴途径转移到肝脏，其中以消化道腺癌经血行肝转移最多见。
由于消化道原发灶全部由门静脉回流至肝脏，且手术操作过程中牵拉、挤捏等常使脱落进入血管的肿瘤细胞首先进入肝脏，因而消化道癌易发生肝转移。从分子生物学的角度考虑，消化道癌细胞表面的糖蛋白CEA具有类似免疫球蛋白类细胞粘附分子功能，它由肝脏清除，在肝内与肝细胞结合后，可作为粘附循环中肿瘤细胞的受体，而致肿瘤易在肝脏中滞留，进一步激活新生血管而形成转移灶[2]。从环境土壤学说来看，肝脏血供丰富，能够为肿瘤的高代谢特点提供营养保障。
2 肝脏病理损伤与肝转移癌关系
2.1 肝纤维化/肝硬化与肝转移癌关系 众多的实验及临床研究表明肝纤维化/肝硬化患者很少发生肝转移癌。大多学者认为肝硬化时形成诸多假小叶，由于再生的肝细胞结节的压迫和结缔组织的收缩，使肝内血管、胆管均发生扭曲和闭塞，酶学系也发生相应的变化，以及肝硬化时门静脉压力升高，肝脏收纳胃肠系统的血流量减少。这些变化使已到达肝内的癌细胞不适宜“着床”及生长。
2.2 肝炎病毒感染与肝转移癌关系 UtsunormiyaT[3]报告感染乙肝或丙肝病毒的结直肠癌肝转移率(3/37,8.1%)较非感染者的肝转移率(85/401,21.1%)明显降低。HBsAg感染后出现肝功能损害、肝硬化可能是结直肠癌肝转移的不利因素。病毒感染本身和其引起的局部免疫变化可能起着重要作用。肝炎病毒能够引起特异性免疫反应，有效地抑制和杀灭循环中的肿瘤细胞；同时微环境中NK细胞和吞噬细胞的增加，大大增强了局部组织的免疫功能。
2.3 脂肪肝与肝转移癌关系 Karube等[4]通过向患有脂肪肝的大鼠体内注入鼠结肠直肠癌细胞(RCN-9)，观察到出现转移性肝脏病变的大鼠数量明显少于无脂肪肝的对照组，同时检测到脂肪肝大鼠转移病灶中的微血管密度(microvesseldensity,MVD)低于对照组大鼠，提示脂肪肝的环境不利于癌细胞的生长，转移灶不易形成。
3 肝转移癌的治疗现状分析
3.1 外科手术治疗 结肠癌等原发病灶切除术后，尽可能行肝转移灶切除术，外科手术依然是可切除病灶的标准治疗，一旦有切除可能时，即应进行手术，从而最大程度减轻患者负担，延长生存期。
3.2 局部治疗方法 主要有射频消融(RFA)、无水酒精注射、激光导热治疗(LITT)、微波凝固治疗(MCT)、高功率聚焦超声疗法(HIFU)、冷冻治疗、电化学治疗等方法，其原理主要是采用物理或化学的方法导致癌细胞死亡。
3.3 化疗 肝脏出现转移灶是原发肿瘤发生远处转移的晚期症状表现，已处DukesD期，不管能否切除转移灶，原则上均需根据转移癌的病理类型选择敏感药物化疗。给药途径有全身和区域性。
3.4 放疗 肝转移癌的癌细胞大多数是消化道来源的腺癌，对放疗低度敏感，肝脏组织对放射线的耐受性差，全肝区放疗已基本放弃不用，病灶聚焦放疗有时仍在应用，如γ刀、光子刀等的治疗。
3.5 生物治疗 生物治疗包括免疫治疗和基因治疗两大类，免疫治疗是调动机体各种积极防御因素，提高机体免疫力，能过免疫机制达到治疗肿瘤的目的。基因治疗是应用基因工程技术，干预存在于靶细胞的相关基因表达水平以达到治疗目的，包括直接或间接抑制或杀伤肿瘤细胞，归纳为细胞因子、肿瘤疫苗、肿瘤药物基因治疗及调整细胞遗传系统的基因疗法，目前研究较多的是杀伤或抑制肿瘤细胞生长的基因、增强肿瘤细胞免疫原性的基因、耐药基因等。
3.6 中医药治疗 中医药治疗恶性肿瘤病人,应用祛邪、扶正、化淤、软坚、散结、清热解毒、化痰、祛湿及通经活络、以毒攻毒等原理，以中药补益气血、调理脏腑，配合手术后、放疗和化疗的治疗、还可减轻毒副作用。
4 肝转移癌的现代治疗策略 近年来，围绕提高肝转移癌手术切除率和延长生存期，提出多学科专家组(multidisciplinaryteam，MDT)治疗模式[5]。在病人治疗前、治疗中和治疗后，由多个学科专家组成诊疗小组，定期进行会议，以病人为中心，讨论决定适合每个病人不同病期的诊断治疗方案，以使病人获得最佳的预后。
5 展望 各种治疗方法均有不同程度的缺陷，比如手术及各种局部治疗方法包括动脉栓塞化疗在内，对于潜藏在门脉系统内的微小病变不能处理，从而导致复发；全身静脉化疗往往因药物副作用不能使病灶内药物浓度达到最佳水平，致使肿瘤细胞出现耐药性等。相对而言，利用气囊导管实施的经皮肝隔离灌注术值得研究[6]。
参考文献
[1] Quaia E,Bertolotto M,Forgacs B,et al.Detection of liver metastases by pulse inversion harmonic imaging during Levovist late phase:comparison with conventional ultrasound and helical CT in 160 patients[J].Eur Radiol,2003,13:475-483.
[2] Yoshioka T,Masuko t,Kotanagi H,et al.Homotypic adhesion through carcinoembryonic antigen plays a role in hepaticmetastasis development[J].Jpn J Cancer Res,1998,89(2):177.
[3] Utsunomiyat, Matsumata T.Metastatic carcinoma in the cirrhotic liver[J].Am J Surg,1993,166:776.
[4] KarubeH,MasudaH,HayashiS,et al. Fatty liver suppressed the an-giogenesis in the livermetastatic lesions[J].Hepatogastroenterology,2000,47(36):1541-1545.
篇3
【摘要】 目的： 用骨形态发生蛋白2(BMP2)腺病毒表达载体(AdBMP2)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs)，研究转染对其增殖、成骨分化的影响。方法： 用AdBMP2转染兔BMSCs，利用免疫细胞化学法、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP2的表达。流式细胞仪观察细胞周期的变化，分析转染对BMSCs增殖的影响。酶标法检测ALP活性；免疫荧光检测骨钙素（OCN）、Ⅰ型胶原表达，分析转染对BMSCs成骨分化的影响。结果： BMP2基因在转染细胞内mRNA水平和蛋白水平均有较高表达，蛋白印迹法检测到培养液中有BMP2蛋白阳性表达。流式细胞仪检测G1期、S期细胞比例与空白对照组无差异。ALP活性明显增高，骨钙素、Ⅰ型胶原免疫荧光检测，见胞浆内有大量显绿色荧光的阳性物质。结论： 在腺病毒载体介导下BMP2基因成功导入BMSCs，细胞增殖未因转染而受影响，并可持续表达基因产物，向成骨细胞分化。
【关键词】 腺病毒；骨形态发生蛋白2；骨髓基质干细胞；基因治疗
BMP2是最主要的骨形成调控因子之一，在体内和体外能够诱导干细胞分化和骨形成。骨组织工程中应用缓释技术将BMP2加入载体的方法虽然取得了一些成果，但从理论到技术均有尚不完善之处。本实验采用体外基因治疗策略，将携带BMP2基因的重组缺陷型腺病毒表达载体（AdBMP2）转染骨髓基质干细胞(BMSCs)，检测BMP2基因表达，观察基因转染对BMSCs增殖及成骨分化的影响，探讨其作为内源性BMP2的“生物发生器”以及骨组织工程种子细胞的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 腺病毒载体及细胞 AdBMP2、携带β半乳糖酐酶基因的腺病毒对照载体（AdLacz）和人胚肾293细胞，由中国医科大学附属盛京医院骨科李建军博士提供。通过感染293 细胞扩增病毒，测定AdBMP2滴度为2×1010 PFU·ml-1。
1.1.2 实验动物 新西兰大耳白兔，雌雄不限，体质量2.0～2.5kg，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（辽2003-0013）。
1.1.3 主要试剂 DMEM细胞培养基（北京海克隆生物制品有限公司）；胎牛血清（天津灏洋生物制品有限公司）；BMP2单克隆抗体、原位杂交检测试剂盒和免疫组织化学试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；骨钙素、Ⅰ型胶原单克隆抗体（Santa Crus公司）；二抗FITC标记IgG（北京中杉金桥）；Xgal（大连宝生物公司）;碱性磷酸酶检测试剂盒（南京建成生物工程公司）。
1.1.4 主要仪器 垂直电泳仪（BioRad）；转印电泳仪（Amersham公司）；可调温摇床（哈尔滨东联公司）；台式低温离心机（Eppendorf公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；酶标仪（芬兰雷勃集团MK3）；荧光显微镜（日本 Olympus）。
1.2 方法
1.2.1 兔骨髓基质干细胞培养及转染 用全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs，2周左右贴壁细胞基本长满单层，即得到原代培养细胞。按1∶3或1∶4比例分瓶传代培养。BMSCs（P2）长至基本融合时，更换成含2%FBS的DMEM培养液，细胞计数，根据病毒滴度按感染倍数（MOI）为100（即1个细胞用100个病毒颗粒感染）加入相应体积的AdBMP2，过夜。次日换成含10%FBS的DMEM正常培养液培养2 d。同等条件下AdLacz转染细胞（MOI=100），Xgal免疫染色检测转染效率。实验组：AdBMP2转染；实验对照组：AdLacz转染；空白对照组：未转染。
1.2.2 原位杂交、免疫细胞化学染色检测细胞内BMP2基因表达 取各组细胞，以1×105 ml-1的密度接种于多聚L赖氨酸处理过的盖玻片上，待贴壁细胞密度达到50%左右时取出盖玻片，PBS漂洗3次，4％多聚甲醛固定。分别按BMP2原位杂交、免疫组化试剂盒操作步骤进行操作，DAB显色，苏木素复染，透明，封片，光镜观察。
1.2.3 Western blotting检测培养液中BMP2蛋白 各组细胞换无血清培养液孵育12h，收集培养液20ml，冻干机冻干后加入50μl上样缓冲液。取10μl样品，煮沸5min，离心5min，上清以12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（12%SDSPAGE）分离。SDSPAGE电泳在恒压条件下进行，浓缩胶中为120V，分离胶中为160V。常规转膜，封闭，然后按膜面积计算一抗用量（0.1ml·cm-2），使用Tween 20PBS按比例稀释一抗（BMP2单克隆抗体），与滤膜4℃温浴3h；以TPBS按比例稀释二抗（辣根酶标记抗体），与滤膜室温温浴1h；加入生色底物溶液（PBS 9ml+二氨基联苯胺9mg+0.3%LiCl2 1ml，最后加入H2O2至0.14%），室温摇动观察条带颜色清晰，PBS终止显色反应，洗涤，干燥，避光保存。rhBMP2标准蛋白20ng作为阳性对照组。
1.2.4 流式细胞仪分析细胞周期 每组细胞各取6 瓶（1×106瓶-1），胰酶消化收集细胞，用1ml PBS制成单细胞悬液，加入75%冰乙醇4ml固定12h，100μg·ml-1碘化丙啶避光染色30min，震荡混匀，上机检测，联机软件测定分析细胞周期各时相比例，数据采用SPSS统计软件处理，方差分析比较。
1.2.5 ALP活性检测 每组细胞弃去培养液，加100μl 2％Triton100，4℃过夜，按ALP活性检测试剂盒说明操作，测定吸光度，计算酶活性值。同时设空白对照。计算均数，组间差异用 t 检验行统计学分析。
1.2.6 免疫荧光检测骨钙素（OCN）、Ⅰ型胶原表达 将各组细胞接种于预置有盖玻片的6孔板内，2周后取出玻片，PBS漂洗3次，4％多聚甲醛固定。免疫荧光法分别检测OCN、Ⅰ型胶原表达，0.2% Triton X100透化处理，10% BSA室温封闭，一抗4℃湿盒孵育过夜，二抗FITC标记IgG室温避光孵育2 h，PBS漂洗3次，95%甘油封片，荧光显微镜下观察实验结果。
2 结
果
2.1 AdBMP2转染BMSCs及转染率检测
转染后细胞形态无明显变化，边界清晰，生长旺盛，细胞核较大，呈圆形或椭圆形，胞浆中颗粒较多，随培养时间延长多角型细胞增多。AdLacz转染后，细胞可编码产生β半乳糖酐酶，作用于生色底物Xgal，反应产物呈蓝色。与AdBMP2转染同等实验条件下（MOI=100），腺病毒转染效率高达90%以上（图 1）。
2.2 BMP2基因在BMSCs内的表达
原位杂交及免疫细胞化学染色均显示实验组细胞质中有较多棕黄色强阳性染色颗粒（图 2、3），而实验对照及空白对照组则为阴性。结果表明：AdBMP2转染的BMSCs中BMP2基因在mRNA和蛋白水平均呈高效表达。
2.3 Western blotting检测培养液中BMP2蛋白
Western blotting检测显示AdBMP2转染组有BMP2强阳性条带，AdLacz转染组和未转染组为弱阳性条带。AdBMP2转染BMSCs后，分泌的BMP2蛋白含量远高于实验及空白对照组（图 4）。结果表明：AdBMP2转染的BMSCs中分泌性BMP2蛋白高效表达。
2.4 流式细胞仪检测细胞周期
分析细胞周期结果显示，实验组与实验对照组及空白对照组的G1期、S期细胞比例无显著差异（P>0.05），表明AdBMP2转染后，BMSCs的DNA合成以及细胞的增殖未因转染受影响(见表1)。表1 细胞周期流式细胞仪分析结果 AdBMP2转染组ALP活性为(30.21±1.85) U·ml-1，AdLacz转染组为(19.56±2.09) U·ml-1，未转染组为(20.65±1.93) U·ml-1，经 t 检验分析，AdBMP2转染细胞组ALP活性较实验对照组及空白对照组明显增高，差异有显著性（P﹤0.01）。
2.6 免疫荧光检测OCN、Ⅰ型胶原表达
AdBMP2转染细胞的胞浆内有大量阳性绿色荧光物质（图5、6），而实验对照组及空白对照组细胞均为阴性。结果表明，AdBMP2转染后，细胞内有骨钙素、Ⅰ型胶原的高效表达，提示BMSCs向成骨细胞表型分化。
3 讨
论
BMSCs因其取材方便，易于分离，体外增殖能力强，具有多方向分化潜能，经诱导可成骨分化，是目前骨组织工程中应用最为广泛的种子细胞。研究表明，单纯BMSCs作为种子细胞向成骨分化过程较慢，并非是一个自发的过程，需要细胞因子及特定的体内环境作用，而且成骨分化后细胞表型的维持也需要细胞因子的作用［1］。体内移植后早期细胞外基质形成不足时，植入的细胞也会失去依托和紧密的细胞间黏附，局部的成骨微环境形成将受到阻碍，不能及早确立优势成骨细胞群而将阻碍成骨。本实验中也观察到 BMSCs的ALP活性较低，OCN、Ⅰ型胶原含量少，提示成骨活性较弱。因此，BMSCs需经改造以增强成骨活性才能成为理想的种子细胞。
图 6 Ⅰ型胶原免疫荧光（×100）
BMP2是被公认最强的成骨诱导因子之一，是调控BMSCs向成骨方向定向分化的主要因子，而且已开始应用于临床［2］。但BMP2的制备过程复杂，产量低；活性不稳定，在体内环境代谢快，骨诱导时间短；作为外源性蛋白植入体内，用量大时可能会产生毒性反应，还可能引起免疫排斥反应［3］；有报道致力于采用缓释技术来解决这些缺陷，然而支架材料中能否整合足够量的BMP2并持续稳定释放，而且BMP2对理化处理是高度敏感的，在支架材料中能否保持生物活性，成为难以解决的问题［4］。应用基因治疗技术可将成骨诱导因子的目的基因导入靶细胞，经过基因修饰的细胞可持续表达细胞因子，可在局部根据需要持续、稳定、靶向释放内源性细胞因子，促进成骨，并起到维持成骨细胞表型的作用，克服直接应用外源性细胞因子可能产生的上述缺点。
重组复制缺陷型腺病毒因其毒性低、靶细胞范围广泛、转染率高、不与靶细胞发生基因整合等优点，成为基因治疗中常用的载体之一。本研究在重组缺陷型腺病毒载体介导下将BMP2基因导入BMSCs，与实验对照组比较，AdBMP2转染的BMSCs中BMP2基因在mRNA及蛋白水平呈高效表达，培养液中BMP2含量较高。而且观察到AdBMP2转染的BMSCs中ALP活性增强，OCN、Ⅰ型胶原呈阳性表达。ALP活性被认为是衡量BMSCs向成骨细胞方向分化程度和成骨细胞功能状态的一个重要指标［5］。Ⅰ型胶原蛋白主要由成熟的成骨细胞合成分泌，是成骨细胞的重要标志物之一［6］。OCN是骨代谢细胞分化成熟、处于功能状态的标志［7］。因此根据实验结果可以认为，BMP2基因修饰的BMSCs向成骨细胞表型分化，提示BMP2基因的转染使BMSCs高效表达、分泌的内源性BMP2，通过自分泌或旁分泌增强了自身的成骨活性。BMP2促进BMSCs向成骨细胞分化的机理还不十分清楚，目前认为BMP2并不直接作用于靶基因，而是通过BMP2、受体、信号途径和靶基因组成的一个较完整的信号系统发挥成骨诱导作用，BMP2处于系统的核心和启位点［8］。
细胞分化与增殖的矛盾是细胞生物学特征之一，即分化低的细胞增殖能力强，分化高的细胞增殖能力差。本实验观察到AdBMP2转染BMSCs促进了其向成骨细胞的定向分化，但通过流式细胞仪检测分析细胞周期的结果显示，AdBMP2转染的BMSCs的增殖能力并未受影响，与未转染细胞无差异，倒置显微镜观察细胞生长情况也证实了这一点。考虑除了与BMSCs强大的增殖能力有关外，可能还与BMP2对BMSCs增殖有促进作用有关。
综上所述，采用基因技术，通过重组复制缺陷型腺病毒载体介导，可将BMP2基因高效导入BMSCs，基因转染的BMSCs不仅提供了内源性BMP2的局部来源，而且提供了BMP2自身效应的靶细胞，实现了向成骨细胞的定向分化并保持了强大的增殖能力，有望成为骨组织工程中比较理想的种子细胞。至于基因转染的BMSCs能否在局部根据需要持续、稳定释放内源性BMP2，植入体内的转归，以及腺病毒载体的安全性等问题尚需进一步研究。
参考文献
［1］YAMAGUCHI A，ISHIZUYA T，KINTOU N，et al.Effects of BMP2，BMP4，and BMP6 on osteoblastic differentiation of bone marrowderived stromal cell lines，ST2 and MC3T3G2/PA6［J］.Biochem Biophys Res Commun，1996，220：366371.
［2］BODEN S D，GROB D，DAMIEN C.Ne2steo bone growth factor for posterolateral lumbar spine fusion:results from a nonhuman primate study and a prospective human clinical pillot study［J］.Spine，2004，29(5)：504514.
［3］CAMPER Y.Bone grafts and substitutes［J］.Orthop Network，1995，6：79.
［4］吴宗键，王继芳，卢世璧.诱导成骨的局部基因治疗［J］.中华骨科杂志，2001，21(12)：760762.
［5］RAWADI G，VAYSSIERE B，DUNN F，et al.BMP2 controls alkaline phosphatase expression and osteoblast mineralization by a Wnt autocrine loop［J］.J Bone Miner Res，2003，18(10)：18421853.
［6］HOSOI T.Bone and bone related biochemical examinations.Bone and collagen related metabolites.Structure and metabolisms of collagen［J］.Clin Calcium，2006，16(6)：971977.
篇4
[关键词]乙型肝炎病毒;HBV;药物
[中图分类号]R978[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）11（a）-028-03
乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)性肝炎是严重危害人民健康的常见传染病。自1964年被发现后的40多年里，它成为了无数人挥之不去的阴影。全世界乙肝病毒表面抗原(HBsAg)阳性者约4亿人，主要分布于亚洲、非洲和拉丁美洲地区[1]。据统计，全球每年约有100万人死于HBV感染相关性疾病，占疾病死亡原因的第9位[2]。我国HBsAg阳性者约有1.2亿人，其中3 000万人为慢性乙肝患者[3,4]。如何预防和有效治疗肝炎成为当今重要的医学课题。现将目前常用的治疗乙型肝炎的现代药物及临床应用作一综述，供医患参考。
1 生物类药物
1.1 干扰素-α
IFN-α结合于其特异的细胞表面受体，诱导细胞表达多种广谱的抗病毒蛋白，包括蛋白激酶A(protein kinase A , PKA)、2'，5'-寡腺苷酸合成酶(2'，5'-oligoadenylate synthetase, OAS)、脱氨酶(adenosine deaminase, ADAR) 和Mx蛋白等。PKA可被细胞内病毒RNA激活, 随后使翻译起始因子-2α(eukaryoteinitiation factor-2α,eIF-2α)磷酸化而失去活性，从而阻止病毒mRNA的翻译，使病毒蛋白合成起始受阻；OAS在细胞内被病毒单链RNA激活，合成寡腺苷酸，继而激活细胞内RNA酶L，病毒RNA降解；ADAR可催化病毒双链RNA中的腺嘌呤转变为次黄嘌呤，从而使病毒解聚。Mx蛋白是一类蛋白家族，可影响细胞内病毒核壳体的转运及RNA的合成[7]。此外，IFN-α通过免疫机制抗HBV[8]。对HBeAg阳性患者的疗效, IFN-α治疗3~6个月，停药6~12个月后，HBeAg转阴率为33%，血清HBV DNA转阴率为37%，HBsAg转阴率为8%。对于HBeAg转阴的患者，其疗效一般会长期维持。有研究表明，HBeAg转阴患者中80%~90%在4~8年内其HBeAg持续阴性[9]。长期的临床随访(7~10年)研究表明，IFN-α治疗可显著改善HBeAg转阴患者的预后，其肝硬化并发症及肝移植发生率显著降低，累积生存率显著提高[10]。目前，临床试验又应用新一代的聚乙二醇-IFN-α(PEG-IFN-α)治疗乙型肝炎，并取得了不错的疗效[11]。
HBeAg阴性的CHB患者，其体内感染的HBV DNA的前核心区发生了突变，从而不能表达HBeAg。这类患者对IFN-α的反应性比HBeAg阳性患者差，有报道显示，以HBV-DNA转阴和转氨酶水平恢复正常为标准，其IFN-α治疗的长期有效率仅为15%~18%[12]。对HBeAg阴性患者采用IFN-α治疗24个月，治疗结束21个月后，其有效率为30%。HBeAg阴性患者IFN-α治疗后，持续应答者发生肝硬化及其并发症的几率和死亡率与治疗无效，治疗后复发与未治疗者相比明显降低[13]。
1.2 胸腺肽α1
胸腺肽α1(thymosin alpha-1, Tα1,Zadaxin)是20世纪70年代末期从胸腺素第5组分(TF5)中分离纯化出的一种小分子生物活性多肽。Tα1分子含28个氨基酸, 广泛存在于机体的胸腺上皮细胞、外周血、大脑、垂体、、滤泡液和羊水中。Tα1在机体免疫应答过程中充当十分重要的角色，其抗HBV的作用机制尚未明确，目前认为可能和增强T细胞及NK细胞应答功能及增强IL-2及IFN产生有关。
Chan HL[14]等实验证明，胸腺肽组与安慰剂组相比治疗结束，治疗结束后6个月、12个月生物化学反应无差异。结论认为，对于慢性乙型肝炎病毒感染胸腺肽能有效抑制病毒复制，但此影响延迟直至停止治疗后12个月。现有剂型为注射剂，疗程6个月，基本和干扰素相似，无任何副作用。胸腺肽α1还可以作为疫苗辅助药来加强乙肝疫苗的效果，其作用特点表现为延迟效应。在治疗结束时对胸腺肽α1的效应率很低，但随访观察中完全效应的病例逐渐增加。单用胸腺肽α1治疗的效应率不高，主张与其他抗乙肝病毒药物联合应用。
2 化学类药物核苷类似物
2.1 拉米夫定(lamivudine,3TC)
拉米夫定是新型核苷类药物，全称2',3-二脱氧-3-硫代胞嘧啶(3TC)。其进人细胞后，磷酸化为三磷酸拉米夫定而发挥作用。拉米夫定作用的靶位是HBV聚合酶反转录活性YMDD(酪氨酸、蛋氨酸、门冬氨酸)基序。在HBV复制周期中，HBV侵入细胞内，其核心部分进入胞核，部分双链的环状DNA分子转变成超螺旋共价闭合环状DNA(cccDNA)，然后合成前基因组RNA，再以此为模板在HBV聚合酶作用下反转录负链DNA，最后复制成部分双链的环状DNA，HBV聚合酶的抑制将抑制前基因组RNA反转录为负链DNA，阻断新合成HBV-DNA的链化，从而抑制HBV的复制。 拉米夫定可快速高效抑制HBV-DNA复制。香港、台湾等地的双盲、安慰剂对照研究[15]发现，每天100 mg拉米夫定口服治疗2周，病人血HBV-DNA比基础值下降97%。每天100 mg拉米夫定治疗52周和安慰剂的HBV-DNA阴转率(
拉米夫定特异性抑制HBV聚合酶反转录活性部位，故毒性极低。迄今为止的临床试验中不良反应的发生率及严重程度和安慰剂组相比无显著性差异，试验病人耐受良好。在临床前动物实验中，使用大于临床治疗剂量几十和几百倍的拉米夫定对大鼠、猫和狗的主要器官无毒性。拉米夫定治疗中存在的问题：停药后反跳，胆红素升高。长期拉米夫定治疗，随着敏感株迅速被抑制，耐药株会逐渐出现。对拉米夫定耐药的HBV突变主要是HBV聚合酶C区的酶活性区YMDD基序的变异，其中蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)替代。YMDD突变株的复制能力低于野生株[17]，因此，继续应用拉米夫定，HBV-DNA的回升往往低于治疗前的水平，一般不出现临床病情加重或恶化。
2.2 阿德福韦(adefovir)
阿德福韦酯在体内迅速完全代谢为母体药物阿德福韦，在细胞激酶作用下磷酸化为活性代谢产物二磷酸盐-PMEApp，此产物与酶的自然底物三磷酸脱氧腺苷(dATP)竞争，抑制HBV-DNA聚合酶(HBV逆转录酶)或通过整合到病毒DNA链后使其发生链终止；PMEA本身也可直接整合到HBV-DNA链中，形成DNA链终结子[18]，使HBV-DNA链停止复制，因而它具有较强的抑制HBV-DNA复制的作用。在为期48周的随机、双盲、安慰剂对照临床试验(序号分别为437及438)中阿德福韦口服剂量为10 mg/d (n=700)[19,20]。试验结果表明，437研究中治疗组与对照组发现肝活检病理改善率分别为53%和25%，血清HBV-DNA对数值分别下降lg(3.57±1.64)和lg(0.98±1.32)，ALT正常率分别为48%和16%。438研究中治疗组与对照组发生肝活检病理改善率分别为64%和35%，血清HBV-DNA对数值分别下降lg(3.65±1.41)和lg(1.32±1.25)，ALT正常率分别为72%和29%。HBeAg阴转率在437研究中分别为12%和6%，继续给药阿德福韦至72周，在此期间HBV-DNA下降程度同前48周的治疗期相同。同时437研究中ALT正常率增加，肝移植病人的临床试验中也取得相似疗效。虽然拉米夫定是抑制HBV的有效的核苷类似物，但在长期应用之后，病人经常出现耐药性，并且随用药时间的延长发生耐药性的比例增加，导致其疗效明显降低[22]。阿德福韦对于拉米夫定耐药病毒株有显著的抑制作用[23]。在迄今为止的实验中，阿德福韦显示了良好的安全性及有效性。
2.3 恩替卡韦(entecavir)
恩地卡韦为新型碳环2-脱氧鸟苷，在体内在磷酸激酶的作用下形成活性的三磷酸化合物，拮抗HBV所需要天然底物脱氧鸟苷三磷酸（dGTP），在细胞内作用半衰期为15 h，在人体内不被肝细胞代谢，主要从肾脏排出。恩地卡韦的作用靶点为HBV的逆转录酶，可以在所有3个环节抑制HBV逆转录酶活性，包括碱基引导（base priming）、从mRNA前体反转录成负链以及HBV-DNA正链合成。
在体外HBV-DNA转染的HepG32细胞的药物抗HBV实验中发现，它是现有抗HBV核苷类似物中作用最强的一种。其抗HBV作用大于LAM 1 000倍，并可降低肝组织中cccDNA量和病毒抗原量。不但对野毒株具有显著抑制作用，而且对基因突变株也具有同样的抑制作用，并且对拉米夫定、泛昔洛韦的耐药病毒株仍然敏感。美国FDA公布的资料表明[24]，对于核苷类似物处治者，无论HBeAg阴性还是阳性，治疗48周后，恩地卡韦治疗组患者的组织学改善比率均显著高于拉米夫定对照组；HBV-DNA较基线的降低幅度以及血清ALT复常率，实验组均显著优于对照组[25]。Wong等[26]对Ⅲ期临床研究组的部分病例进行了肝细胞内HBVcccDNA的检测，初步结果显示治疗48周后恩地卡韦降低肝细胞内HBVcccDNA的作用强于拉米夫定。国内外对恩地卡韦的临床研究结果相似，在未经抗病毒治疗的患者中，总的不良时间发生率为：恩地卡韦0.1 mg组45%、恩地卡韦0.5 mg组40%，安慰剂组42%，无1例发生药物相关的不良事件[27]。
基本适应证为有HBV活动性复制和血清学或肝组织学炎症指标的成年慢性乙肝患者。其疗程在1年以上，目前对停药指征尚无明确规定。治疗期间和停药后密切监察和随访[28]。
2.4 其他
其他抗HBV病毒的核苷类似药物还有泛昔洛韦( famcictovir)、利巴韦林(ribavirin) 、阿糖腺苷(Ara-A)、单磷酸阿糖腺苷(Ara-AMP)，它们通过作用HBV复制不同的阶段来抑制病毒。在临床验证的核苷类似物新品种还有替诺卡韦(tenofovir）、特必夫定(telbivuding)、克来夫定(clevudine)和恩曲他滨(emtricitabine)等，它们比拉米夫定有相同或更高的抗病毒效果，而且对拉米夫定耐药株有效。
3 免疫调节药物
3.1 胸腺因子D
胸腺因子D 对HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg有剂量依赖的抑制作用。对HBsAg的抑制效果要优于对照药物IFNα-2b，对HBeAg的抑制效果要略低于对照药物IFNα-2b。现在发现热休克蛋白gp90或它的N-末端片段注入乙肝患者，细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫应答加强，显示其可能通过增加CTL免疫应答增加机体抗乙肝病毒和原发性肝癌的能力[29]。
3.2 树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗
树突状细胞作为抗原提呈细胞在激发抗病毒免疫应答中起着重要的作用。利用HBV特异蛋白在体外预先制备的DC而制成的自体疫苗可望成为未来的治疗方法[30]。
4 其他药物
抗肝炎病毒基因治疗的药物或策略包括反义技术、核酶、基因免疫、干扰肽或蛋白质、负性突变体、单链抗体、RNAi等目前正在研发之中。
5 结语与展望
抗病毒治疗的成败是慢性肝炎能否治愈的关键，由于乙肝病毒进入肝细胞后产生的cccDNA对各种药物的耐药性，细胞核内的cccDNA难以清除，造成停药后，病毒复制的反弹以及长期药物治疗所导致的乙肝病毒突变株的产生，使得到目前为止，对HBV的治疗尚没有一种特效的药物能够达到满意的治疗效果。
随着分子生物学和重组DNA技术的迅速发展，基因治疗及基因疫苗的进一步研制，清除HBV，彻底治疗慢性乙肝将成为一种可能，但总的说来，HBV基因治疗的研究仍有相当长的路要走。尽管HBV基因治疗困难重重，但基因技术仍为HBV治疗带来了新的希望，通过广大学者不懈的努力，相信在不久的将来会取得一定的突破。
[参考文献]
[1]Mc Mahon BJ. Selecting appropriate management strategies for chronic hepatitis B: who to treat[J].Am J Gastroenterology, 2006, 101(S): 7.
[2]Mohamadnejad M, Alekzadeh R, Hepatitis B. Type B hepatitis[J].N Eng J Med, 2004, 350(26):2719.
[3]孙伟, 李静, 李亚娟.慢性肝炎治疗药物新进展[J].中国药房,2002, 13(5): 308.
[4]Maddrey WC.Hepatitis B:An important public health issue[J]. J Med Virol, 2000, 6(1): 362-366.
[5]骆抗先. 乙型肝炎基础和临床[M].第2版.北京：科学出版社，1997.
[6]Yeh CT, Chi HT, Chu CM, et al. GI phase dependent nuclear localization of relaxed circular hepatitis B virus DNA and aphidicolin induced accumulation of covalently closed circular DNA[J]. J Med Virol, 1998, 55(1): 42.
[7]Samuel CE. Antiviral actions of interferons[J]. Clin Microbiol Rev, 2001, 14(4): 778-809.
[8]Tang TJ, Kwekkeboom J, Mancham S, et al. Intrahepatic CD8+ tlymphocyte response is important for therapy induced viral clearance in chronic hepatitis B infection[J]. J Hepatol,2005, 43(1): 45-52.
[9]Manns MP. Current state of interferion therapy in the treatment of chronic hepatitis B[J]. Semin Liver Dis, 2002, 22(11): 7-13.
[10]Angus P, Vaughan R, Xiong S, et al. Resistance to adefovir dipivoxil therapy associated with development of a novel mutation in the HBV polymerase[J]. Gastroenterology, 2003, 125(2): 292-297.
[11]Cooksley WG, Piratvisuth T, Lee SD, et al.Peginterferon alpha-2a (40kDa): an advance in the treatment of hepatitis B eantigen positivechronic hepatitis B[J]. J Viral Hepat, 2003, 10(4): 298-305.
[12]Brunetto MR, Oliveri F, Coco B, et al.Outcome of anti-HBe positive chronic hepatitis B in alpha- interferon treated and untreated patients: a long term cohort study[J]. J Hepatol, 2002, 36 (2):263-270.
[13]Papatheodoridis GV, Manesis E, Hadziyannis SJ. The long-term outcome of interferon-α treated and untreated patients with HBeAg-negative chronic hepatitis B[J]. J Hepatol, 2001, 34(2): 306-313.
[14]Chan HL, Tang JL, Tam W, et al. The efficacy of thymosin in the treatment of chronic hepatitis B virus infection: a meta 2 analysis[J].Aliment Pharmacol Ther, 2001, 15(12): 1899-1905.
[15]Lai CL, Chien RN, Jeung NWY, et al. A one-year trial of lamivudine for chronic hepatitis B[J]. N Eng 1 Med, 1998, 33(9): 61.
[16]Sokal E, Roberts EA, Mieli-Vergani G, et al. Dose-finding and safety of lamivudine in children and adolescents with chronic hepatitis B[J]. Hepetology,1998,28(42): 489.
[17]Niesterm HGM, Honkoop P, Hangama EB, et al. Idenification of more than one mutation in the hepatitis B virus polymerase gene arising during prolonged lamivudine treatment[J]. J Infect Dis, 1998,1377-1382.
[18]Wolters LM, Niesters HG, De Man RA, et al. Nucleo-side analogues for chronic hepatitis B[J]. Eur J Gastroenterol Hepatol, 2001, 13 (12): 1499-1506.
[19]Marcell in P, Chang TT, Lim SG,et al. Adefovir dipivoxil for the treatment of hepatitis Be antigen-positive chronic hepatitis B[J]. N Engl J Med, 2003, 348 (9): 808-816.
[20]Hadziyannis SJ, Tassopoulos NC, Heathcote EJ, et al. Adefovir dipivoxil for the treatment of hepatitis Be antigen 2 negative chronic hepatitis B[J]. N Engl J Med , 2003, 348 (9): 800-807.
[21]Yang H, Westland CE, Del aney WE 4th, et al. Resistance surveillance in chronic hepatitis B patients treated with adefovir dipivoxil for up to 60 weeks[J]. Hepatology, 2002, 36 (2): 464-473.
[22]Perrillo R, Schiff E, Yoshida E, et al. Adefovir dipivolxil for the treatment of lamivudine resistant hepatitis B mutants Hepatology[J]. 2000, 32 (1): 129-134.
[23]Delaney WE 4th,Edwards R，Coll edge D, et al.Cross resistance testing of antihepadnaviral compounds using novel recombinant baculoviruses which encode drug-resistant strains of hepatitis B virus[J].Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45(6):1705-1713.
[24]Cheng TT, Gish RG, Hsdziyannis SJ,et al.A dose-ranging study of the efficacy and tolerability of entecavir in lamivudine-refractory chronic hepatitis B patients[J]. Gastroenterology, 2005, 129:1198-1209.
[25]US Food and Drug Administration.Drug Approval Package Entecavir[Z]. July 12,2005.
[26]Wong DK, Yuen M, Ngai V, et al. One year treatment of enlecavir results in reduction in intrahepatic covalently closed circular DNA level. Abstract of 56th annual meeting of the American association for the study of liver diseases (AASLD)[G]. 2005, San Francisco, California, USA.
[27]姚光弼，张定凤，王宝恩，等. 恩地卡韦抗乙型肝炎病毒剂量和疗效的研究[J].中华肝脏病杂志, 2005, 13: 484-487.
[28]姚光弼. 慢性乙型肝炎长期抗病毒治疗的目标和策略[J].中华传染病杂志，2005, 2(3): 710.
[29]Li H, Zhou M, Han J, et al. Generation of murine CTL by a hepatitis B virus specific peptide and evaluation of the adjuvant effect of heart shock protein glycoprotein 96 and its terminal fragments[J]. J Immunol, 2005, 174(1): 195.
篇5
吉林省四平市伊通满族自治县第一人民医院普外科，吉林四平 136000
[摘要] 甲状腺癌是常见的内分泌系统恶性肿瘤，而且目前我国的甲状腺癌发病率呈上升趋势，虽然我们还没有掌握甲状腺癌的病因，但调查结果显示，大部分甲状腺癌的恶性度并不高，治愈率较高，而且愈后良好，所以对于甲状腺癌的早期诊断和治疗手段就显得尤为重要。
[
关键词 ] 甲状腺癌；发病机制；诊断；治疗
[中图分类号] R736.1
[文献标识码] A
[文章编号] 1672-5654（2014）09（c）-0137-02
在人体中，甲状腺是重要的内分泌腺，帮助调节机体的新陈代谢，是发病率最高的内分泌系统中的器官。甲状腺癌多发于青壮年，这和一般恶性肿瘤在老年人中多发不同，且甲状腺癌的发病率呈逐年增高的趋势。
1导致甲状腺癌发生的有关因素及发病机制
2.1导致甲状腺癌发生的有关因素
①良性的甲状腺疾病。许多甲状腺癌出现前的甲状腺癌患者都患有其他的甲状腺疾病，这些甲状腺疾病包括有甲状腺良性结节、毒性弥漫性甲状腺肿、散发性或地方性甲状腺肿、自身免疫性慢性甲状腺炎等。
②射线辐射。甲状腺癌的发生和射线辐射有明显的相关性，可以看到甲状腺癌的发病率在原子弹爆炸后的幸存者中明显提高，一些儿童为治疗良性病症而接受了头颈部的放射，这明显提升了甲状腺状癌的患病率，和外放射不同，当儿童尤其是10岁以内的儿童受到放射性碘131及其它快速衰变的放射性碘的内放射，是甲状腺癌的致病因素，在成人中没有见到相同结果。放射线的照射量和甲状腺肿瘤的发病呈线性关系，年龄越小，长时间接触射线，都存在着较高的发病率。
③家族遗传。在甲状腺癌患者中，髓样癌患者有20%存在家族遗传背景，而甲状腺滤泡上皮癌很少有家族史。
④甲状腺癌和碘的关系。增加碘的摄入量可能会增加甲状腺癌的发病率，能够使甲状腺癌组织类型发生变化，减少了滤泡状甲状腺癌的发病率，增加了状甲状腺癌的发病率。在缺碘和富碘地区都有较高的甲状腺癌的发病率，但是有着不同的组织类型，甲状腺状癌是富碘地区多发的，滤泡癌和间变癌在缺碘地区多发。
⑤激素。其一是性激素，研究显示甲状腺癌组织内存在雌激素受体、孕激素受体、雌二醇受体、雄激素受体，其中可以肯定的是甲状腺癌和雌激素受体的联系尤其是甲状腺状癌与其的联系。其二是促甲状腺激素，促甲状腺激素受体在正常人和恶变甲状腺组织中都可以查到，经实验证明甲状腺的正常代谢、甲状腺细胞的生长、DNA的合成都有促甲状腺激素的刺激，而同样刺激着滤泡癌细胞制备FTC133细胞。
此外，抗甲状腺药物可能和甲状腺癌的发生有关。
1.2发病机制
和其它的肿瘤类似，甲状腺癌的发生、演化和癌基因及抑癌基因有关。甲状腺滤泡细胞肿瘤和结肠肿瘤，两者都有一个多基因参与、多步骤的类似的癌变过程。如果有射线辐射或其他事件影响到甲状腺滤泡细胞时，癌基因会发生重排，但是滤泡细胞的恶性变还不会出现，当癌基因突变发生在此基础上时，会使克隆性得以进一步的发展，导致出现了恶性变，状甲状腺癌便形成了。如果此时出现抑癌基因的缺失，就会使未分化癌由状甲状腺癌转变而形成。基因表达的改变和DNA甲基化异常会在癌变的过程中出现。在甲状腺癌发病的过程中，除相关的癌基因或抑癌基因外，以血管内皮细胞生长因子家族为首的有一些细胞因子同样在起作用。血管生成因子中以血管内皮细胞生长因子为代表，直接促进血管内皮细胞生长或使血管的通透性增加，基质两种方式提供给了成纤维细胞与内皮细胞生长，促进了肿瘤血管的形成。
2甲状腺癌的分类
①状癌。是一种恶性上皮细胞肿瘤，由滤泡细胞分化、有典型的滤泡结构以及核特征性改变，可分为混合性甲状腺癌和单纯性状癌。这是临床最常见的类型，其恶性程度轻，分化度高。大多数的病例表现为有一无痛肿块在甲状腺区，而较少出现其他症状，由于它病变的过程缓慢，有很长的病程，致使就诊的时间被延误，病程都有5~10年。有的甲状腺原发灶小，不易发现，形成隐癌。有的形成囊性肿物，被误诊为先天性囊肿。
②滤泡细胞癌。有滤泡细胞分化的恶性上皮性肿瘤，没有状癌的诊断特征，较状癌少见，其恶性度高于状癌，和甲状腺腺肿相似应细致鉴别。在包膜外的腺体组织或血管中常有癌细胞侵入，因此区别滤泡状腺瘤和腺癌的一个重要依据是看包膜是否完整。其生长缓慢病程长，多为单个有时也为多个原发灶。少见单纯的甲状腺滤泡状癌，多为夹杂状癌而形成的混合类型。
③未分化癌。在临床较少见，是高度恶性的肿瘤，对邻近的组织侵犯迅速，并且出现全身广泛转移。瘤体生长迅速，无完整包膜，广泛浸润生长。巨大的甲状腺肿块可使颈部严重畸形、疼痛，会引起声音嘶哑、吞咽困难、呼吸窘迫。患者会因肿瘤压迫气管而引起窒息死亡。
④髓样癌。是发生在甲状腺滤泡旁细胞的癌变，属于中度恶性肿瘤，在间质中存在淀粉样物质沉着，所以也称其为淀粉样间质髓样癌。分为散发性，其病灶位于一侧腺叶；和家族性，常发生在双侧腺叶。其质地较硬、呈圆形或椭圆形结节，没有状及滤泡状癌的特征，一般无包膜，易侵犯甲状腺内淋巴管。
3甲状腺癌的诊断
3.1病史和症状方面
早期的甲状腺癌大多没有明显症状，对于任何年龄患者出现的甲状腺肿大或结节，都要重视起来。要仔细询问患者的病史，是否有家族史、头颈部及上纵隔放射史，碘的摄入情况，是否有腹泻、心悸、面色潮红、血钙降低等甲状腺髓样癌的症状。颈部触诊要仔细扪诊肿块的形态，通常的癌结节是圆形或椭圆形，呈现不规则形态，表面不平，没有显著的压痛感，质硬，出现组织粘连而活动度差或固定，注意淋巴结转移出现的淋巴结肿大。
3.2实验室诊断
包含甲状腺功能检查，其中最主要的是对血清TT3、TT4、TSH、FT3和FT4的测定，除此之外有时还需要对TPOAb、TGAb或TSAb进行检测。通常，甲状腺癌症患者是不会存在甲状腺功能异常的现象，但也不排除有些甲状腺癌会伴随甲状腺功能亢进的情况。当肿瘤发生出血或坏死的情况时，患者也有可能出现一过性甲亢，甲状腺功能检查也有助于医生的诊断；还包含血清甲状腺球蛋白测定，这是诊断甲状腺癌症的必要必要手段，但也要注意，有时候良性甲状腺疾病患者也会出现血清Tg水平异常的现象，而且如果甲状腺癌症患者存在正常甲状腺组织这时其血清Tg水平也会升高，但当这些正常的甲状腺组织被消除后，也就是已经治愈的患者体内应该只存在低浓度或检测不出Tg，这时血清Tg的检测主要用于疾病随访或判断分化型甲状腺癌症患者的复发；除些之外血清CT水平的测定也是术前诊断的一个必要环节，它将预示着肿瘤的发生、复发和转变。
3.3影像学检查
①B超和彩色多普勒超声检查是一种简便、快捷、无损伤而且可重复对比的一种检查方法，随着科技的不断发展使彩色多普勒得到了广泛的应用，这也大大提高了诊断甲状腺癌症的准确率。在检查时，超声图像存在边界形态欠规则，无包膜现象，同时肿块呈现低回声、后方回声衰减现象，内部还出现细小的钙化点现象，而且内部血流供应丰富，还存在高阻力型血供现象，有时还存在劲部转移性淋巴结肿大现象等其中四种现象同时出现时，则检查者患甲状腺部癌的机率较大。
②CT扫描能够清楚地显示检查者的甲状腺，当其甲状腺组织发生变化或癌变时，其组织中的含碘量将呈下降趋势，这表明检查者的储碘细胞已经被破坏，在CT图像中也会有相应的表现，其病变区呈现低密度区，特别是螺旋CT扫描它能够快速地形成高质量三维图像，这也是判断甲状腺病变的一种简单、有效的手段。
③还可以通过MRI多方位成像来断定肿瘤的具置，这种方法具有扫描面广、软组织分辨率高的优点，能够突出显示出肿瘤组织的信号变化，通过用于监测术后甲状腺患者的复发和转移。
④核素显像是应用特殊的显像装置通过探测放射性碘所发出的Y射线分布情况，形成核素分布图，这样就可以了解到患者甲状腺的基本情况。核素检查常用药物也包括多种，其中由于99Tc-MIBI的显像方法简单、成像质量好而且对检查者应用的辐射剂量少，使其成为临床应用较为广泛的一种甲状腺显像手段。
⑤FNAB是术前诊断甲状腺疾病的一种最好的检查方法，而且对于检查者来说其创伤较传统组针穿刺要小，较容易被患者接受。目前临床诊断时通常会通过B超引导来进行FNAB检查，这样不仅能够有效地减少并发症的发生还能够提高检查的成功率。
4甲状腺癌的治疗
4.1手术治疗
不同类型的甲状腺癌其采取的治疗方法不同，大部分学者认为分化型甲状腺癌应该以手术治疗为主，其他治疗方法辅助治疗，要根据患者的实际情况，当诊断患者无明显手术禁忌证时应及时对患者的原发灶和颈部转移灶进行彻底的清除，尽量彻底地根治肿瘤。同时在手术中要对患者的颈部淋巴结进行仔细的探查，当发现为转移阳性者时要对其进行及时的清除，而当检测患者颈淋巴结呈阴性时要根据实际情况来决定是否实施清除术。随着科学的不断发展，由于内镜手术拥有切口小、术后并发症机率小等优势逐渐引起医学界的关注和重视；对于髓样癌患者也是以手术治疗首选，由于髓样癌的转移早、影响大，所以早期诊断和彻底手术治疗显得尤为重要，对于病灶多发或范围较大的患者建议为其实施甲状腺全切或次钱切除术，同时要根据患者颈部淋巴结果的实际情况来判断是否实施淋巴结清除手术。对于未分化的甲状腺癌由于其病情发展比较迅速而且其恶性程度也较高，大多发现时患者已处于晚期，运用手术通常会在短期内复发，很难彻底根治，所以通常在术后还要采取放化疗的综合治疗法。
4.2药物治疗
状癌和滤泡状癌的部分肿瘤细胞内存在促甲状腺激素受体，应用甲状腺激素抑制垂体产生促甲状腺激素，有可能抑制这两种类型甲状腺癌的生长。使用新鲜甲状腺提取的甲状腺片有明显的蓄积作用；左旋甲状腺素钠的使用要根据个体的耐受程度进行差异化给药。
4.3放射性治疗
使用放射性碘131来治疗分化型甲状腺癌，清除术后残留的甲状腺组织，针对转移灶要进行多次阶段性的大剂量碘131治疗，对手术治疗状癌和滤泡状癌不耐受的患者可直接选用碘131治疗。
4.4基因治疗
对患者细胞中有缺陷的基因使用DNA重组技术进行修复，使细胞正常的功能得以恢复，实现疾病的治愈。目前甲状腺癌的基因治疗策略有，重新表达NIS，使摄碘能力得到大幅提高，提升碘131的治疗效果；免疫基因治疗，导入基因使肿瘤细胞的免疫原性增强，或使免疫细胞的抗原呈递和识别能力得到提高，致使肿瘤细胞的杀伤能力得到提高，实现预防或治疗的目的；自杀基因导入治疗，将其导入细胞后，会产生有毒性的物质，使DNA的合成受到抑制，达到破坏肿瘤细胞的目的。
[
参考文献]
[1] 鲍宗旋.慢性淋巴细胞性甲状腺炎合并甲状腺癌的研究进展[D].蚌埠医学院，2014.
[2] 乔法敏.全反式维甲酸诱导再分化治疗分化型甲状腺癌的临床研究[D].郑州大学，2010.
[3] 张鹏.结节性甲状腺肿与甲状腺癌并存的诊断与治疗回顾性分析[D].河北医科大学，2011.
[4] 于媛媛.高频彩超引导下微创早期诊断甲状腺微小癌的临床价值[D].大连医科大学，2012.
[5] 谢传信.瘦素及其受体在甲状腺状癌组织中的表达与临床特征之间的相关性研究[D].蚌埠医学院，2014.
篇6
达，促进HSC-3细胞的凋亡。方法 合成针对survivin基因的小干扰RNA（siRNA），转染对数生长期的HSC-3细胞。
采用半定量逆转录聚合酶链反应检测HSC-3细胞中survivin mRNA的表达，MTT法测定细胞活性，tunnel分析和流式细胞术检测HSC-3细胞的凋亡，并设阴性对照组和空白对照组。结果 转染siRNA组survivin mRNA的表达明显低于阴性对照组和空白对照组；MTT法测定细胞活性，阴性对照组和空白对照组没有明显差别，但siRNA组的细胞活性明显下降；tunnel分析显示，转染siRNA组的凋亡细胞明显多于阴性对照组和空白对照组；流式细胞术分析，转染siRNA组的凋亡率（24.99%±1.33%）明显高于阴性对照组（1.24%±0.13%）和空白对照组（0.10%±0.02%）。结论 采用siRNA沉默survivin基因能促进口腔鳞状细胞癌细胞的凋亡，survivin siRNA基因治疗有可能成为口腔鳞状细胞癌治疗的新技术。
[关键词] 口腔鳞状细胞癌； RNA干扰； survivin基因； 凋亡
[中图分类号] R 730.5 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.004
Effects of survivin gene silencing by small interfering RNA on apoptosis of oral squamous cell carcinoma Liu Shifeng， Liang Xinhua， Bao Chongyun. （State Key Laboratory of Oral Diseases， West China Hospital of Stoma-tology， Sichuan University， Chengdu 610041， China）
[Abstract] Objective To apply the small interfering RNA（siRNA） targeting survivin to inhibit expression of sur-
vivin gene in HSC-3 oral squamous cell carcinoma and to increase the apoptosis of HSC-3 cells. Methods siRNA was synthesized and transfected into oral squamous cell carcinoma HSC-3 cells. Compared with negative control group and blank control group， semi-quantitive reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR） was used to detect
survivin mRNA. Cellular viability was detected by MTT and HSC-3 cell apoptosis was determined by tunnel and flow cytometry. Results Expression of survivin mRNA was decreased significantly in siRNA group compared with negative control group and blank control group. Cellular viability was not affected in negative control group and blank control group， but cellular viability in siRNA group was significantly decreased. As to the cellular apoptosis rate， the trans-fected group（24.99%±1.33%） was significantly higher than negative control group（1.24%±0.13%） and blank control
group（0.10%±0.02%）. Conclusion Survivin gene silenced by siRNA might promote apoptosis of oral squamous cell
carcinoma. Survivin siRNA gene therapy would become a new target point for oral squamous cell carcinoma.
[Key words] oral squamous cell carcinoma； RNA interference； survivin gene； apoptosis
Survivin是一种核穿梭蛋白，在细胞核中为染色体信使蛋白，在细胞质中是微管结合蛋白，正常表达于细胞周期的G2/M期，对细胞周期有调节的作用。若Survivin过度表达，可使细胞迅速通过G2/M期，快速进入有丝分裂期，使细胞异常增殖，在肿瘤的发展中起着重要作用[1-3]。RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是近几年发展起来的一种沉默基因表达
的新方法，其原理是以双链RNA为中介降解具有相同序列的RNA。
Survivin在正常成人分化成熟的组织中表达缺失，在多种常见恶性肿瘤中的表达稳定上调，并与肿瘤的生物学行为密切相关[4]。Survivin主要通过直接抑制caspase级联反应下游的终末子caspase-3和caspase-7的活性从而发挥抗凋亡作用[2-3，5]，survivin基因可通过加快肿瘤细胞由G1期到S期的转换，并使肿瘤细胞在
G2/M期逃避对凋亡的识别而促进肿瘤细胞的增殖和分化。Lo Muzio等[6]报道，Survivin在正常口腔组织
中不表达，而在大多数口腔鳞状细胞癌中高表达，因此本研究采用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）技术，通过干扰survivin基因的表达来治疗口腔鳞状细胞癌，为survivin在口腔癌治疗中的应用提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
口腔鳞状细胞癌细胞株HSC-3，由口腔疾病研究国家重点实验室（四川大学）提供；LipofectamineTM 2000脂质体转染试剂和Trizol试剂（美国Invitrogen公
司），逆转录试剂盒和聚合酶链反应试剂（美国Prome-ga公司），siRN段（上海吉玛制药技术有限公司）。
1.2 细胞培养
HSC-3细胞培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃ 5%CO2培养箱中培养，每2 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
1.3 survivin siRNA序列转染
survivin siRNA序列实验分3组。空白对照组：即正常组；阴性对照组：即转染阴性对照的siRNA序列；实验组（siRNA组）：即成功转染survivin siRNA序列。收集HSC-3细胞（细胞密度为每毫升5×105个）铺在6孔板内过夜，取5 μL siRNA和100 μL不含血清的RPMI-1640培养基共同孵育5 min，同时取5 μL LipofectamineTM 2000 siRNA和100 μL不含血清的RPMI-1640培养基孵育5 min，然后再把这两份混合孵育20 min。把6孔板中的培养基换成每孔800 μL不含血清的RPMI-1640培养基，加入上述混合液，4 h后换液，48 h后做后续分析。
1.4 半定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcrip-
tion-polymerase chain reaction，RT-PCR）测定
survivin mRNA的表达
收集处于对数生长期的细胞（细胞密度为每毫升1×106个），按Trizol Rengent说明提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳初步评价RNA质量。按Promega两步法试剂盒提供的说明书进行RT-PCR，测定survivin mRNA的相对表达量。survivin上游引物序列为5’-CAGG-CGGTGATGTGGATC-3’，下游引物序列为5’-GTT-TGGCTI’GCTGGTCTC-3’，扩增产物为398 bp；内参照β-actin的上游引物序列为5’-ATCTGGCACCACA-CCT-3’，下游引物序列为5’-CGTCATACTCCTGC-TT-3’，产物大小为838 bp。
1.5 MTT法检测细胞活性
取HSC-3细胞（细胞密度为每毫升5×103个）铺在96孔板内，过夜后进行转染，转染48 h后加入MTT，用酶标仪在570 nm下检测吸光度值。
1.6 tunnel分析和流式细胞术检测细胞凋亡
采用常规方法制备细胞爬片，用体积分数为95%的乙醇固定10 min，PBS冲洗3次，每次3 min；根据tunnel试剂盒说明，观察细胞凋亡情况。通过流式细胞术测定细胞凋亡率。
1.7 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件，进行单因素方差分析及两个独立样本的t检验，检验水准为双侧α=0.05。
2 结果
2.1 细胞转染
细胞转染结果见图1：转染红色荧光标记的siRNA 6 h后，荧光显微镜下观察，80%的细胞都发红色荧光，说明多数细胞都已经转染了survivin siRNA。
图 1 细胞转染 荧光显微镜 × 10
Fig 1 Cell transfection fluorescence microscope × 10
2.2 半定量RT-PCR检测细胞中survivin mRNA的表
达情况
半定量RT-PCR检测细胞中survivin mRNA的电泳结果见图2，空白对照组、阴性对照组和实验组的相对表达量分别为0.65、0.64和0.05。实验组转染siRNA后，survivin mRNA的相对表达量明显低于阴性对照组和空白对照组（P
A：空白对照组；B：阴性对照组；C：实验组。
图 2 干扰效率的测定
Fig 2 Determination of the interference efficiency
2.3 MTT法检测细胞生长活性
MTT法测定结果见图3。
图 3 细胞活性的测定
Fig 3 Determination of the cellular viability
阴性对照组与空白对照组相比，转染后48 h细胞生长未受影响，而实验组细胞生长受到明显抑制（图3），细胞活性下降至47.16%±3.19%。
2.4 细胞凋亡检测结果
tunnel分析结果见图4：与阴性对照组和空白对照组比较，实验组转染siRNA后，细胞中出现很多绿色亮点，表明有大量的细胞凋亡。实验组、阴性对照组和空白对照组的细胞凋亡率分别为24.99%±1.33%、1.24%±0.13%和0.10%±0.02%，实验组的细胞凋亡率明显增加，高于其他两组（P
沉默survivin的表达可增加细胞凋亡。
3 讨论
本实验成功转染了siRNA，并成功干扰了survivin基因的表达；采用MTT法测定细胞活性发现，干扰survivin基因可以降低口腔鳞状细胞癌的细胞活性；tunnel和流式细胞术测定结果可见，干扰survivin基因可以诱导癌细胞凋亡。
口腔鳞状细胞癌是口腔最常见的恶性肿瘤。目前，诱导凋亡已成为癌症研究中的基本工具，可以据此建立新的抗癌策略。凋亡或程序性细胞死亡是一种基因控制的过程，它保持有机体形态的发生发展[7]，通过消除不必要的或者危险的细胞来保持生物
体的动态平衡。诱导凋亡的方法有很多，本研究采用RNA干扰的方法，经过tunnel和流式细胞术检测，结果发现干扰survivin基因可以明显诱导口腔鳞状细胞癌细胞的凋亡。
Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员。1997年由Ambrosini等[8]在人类基因组数据库的杂交筛选中
首先分离出来。与凋亡抑制蛋白家族的其他成员一样，Survivin有杆状病毒重复结构，是其发挥抗凋亡作用的必需结构[9]。Survivin的组织分布有特异性，
仅表达于胚胎和发育期的胎儿组织，终末分化的成人组织（胸腺、生殖腺除外）不表达，而在大多数肿瘤组织中均有表达[10]。研究[6]证实，survivin基因在口腔鳞状细胞癌中高度表达，并且明显高于正常黏膜组织。有文献[11-12]报道，survivin可能在肿瘤细胞凋
亡抑制的过程中发挥重要作用。survivin基因持续高表达可促进细胞表型的恶性转化，可能是某些恶性肿瘤发生的关键因素。综合上述研究的结果，本研究选择survivin作为本实验的靶基因。
RNAi作为近年来发展起来的一种在mRNA水平上诱导特异性序列基因沉默的基因调控技术，可作为哺乳动物基因功能研究的工具，在功能基因组学研究领域得到越来越多的重视。近年的研究也表明，利用RNAi技术是使survivin基因沉默的有效手段。Kappler等[13]应用siRNA技术分别降低5种具有野生型及突变p53基因的肉瘤细胞的survivin表达，结果提示，不论肉瘤细胞是否表达野生型p53基因，靶向survivin的siRNA均可以将其特异性杀灭。
Williams等[14]发现，无论是体外的结肠癌细胞
HCT116还是体内的HCT116异种移植物，应用RNAi技术阻断survivin基因表达可显著抑制其生长。目前应用RNAi靶向survivin来促进口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的研究还较少。本研究发现，阻断survivin基因可以诱导癌细胞凋亡，抑制癌细胞的生长和增殖，提示survivin是治疗口腔鳞状细胞癌极有潜力的肿瘤分子标记和治疗靶点；但是RNAi如何有效应用于人体内干扰survivin的表达以治疗口腔鳞状细胞癌及预防复发尚需进一步研究。通过RNAi靶向包括survivin在内的多个靶点，从多基因角度治疗口腔鳞状细胞癌也是今后研究工作的重点。
[参考文献]
[1] Li F， Brattain MG. Role of the survivin gene in pathophysiology
[J]. Am J Pathol， 2006， 169（1）：1-11.
[2] Shin S， Sung BJ， Cho YS， et al. An anti-apoptotic protein human
survivin is a direct inhibitor of caspase-3 and -7[J]. Biochemistry，
2001， 40（4）：1117-1123.
[3] Suzuki A， Ito T， Kawano H， et al. Survivin initiates procaspase
3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to
resist Fas-mediated cell death[J]. Oncogene， 2000， 19（10）：1346-
1353.
[4] Tanaka K， Iwamoto S， Gon G， et al. Expression of survivin and
its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas[J]. Clin
Cancer Res， 2000， 6（1）：127-134.
[5] Deveraux QL， Takahashi R， Salvesen GS， et al. X-linked IAP is a
direct inhibitor of cell-death proteases[J]. Nature， 1997， 388（6639）：
300-304.
[6] Lo Muzio L， Pannone G， Staibano S， et al. Survivin expression in
oral squamous cell carcinoma[J]. Br J Cancer， 2003， 89（12）：2244-
2248.
[7] Vaux DL， Haecker G， Strasser A. An evolutionary perspective on
apoptosis[J]. Cell， 1994， 76（5）：777-779.
[8] Ambrosini G， Adida C， Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene，
survivin， expressed in cancer and lymphoma[J]. Nat Med， 1997，
3（8）：917-921.
[9] Sohn J， Khaoustov VI， Xie Q， et al. The effect of ursodeoxycholic
acid on the survivin in thapsigargin-induced apoptosis[J]. Cancer
Lett， 2003， 191（1）：83-92.
[10] Li F， Ambrosini G， Chu EY， et al. Control of apoptosis and mi-
totic spindle checkpoint by survivin[J]. Nature， 1998， 396（6711）：
580-584.
[11] Idenoue S， Hirohashi Y， Torigoe T， et al. A potent immunogenic
general cancer vaccine that targets survivin， an inhibitor of apop-
tosis proteins[J]. Clin Cancer Res， 2005， 11（4）：1474-1482.
[12] Cong XL， Han ZC. Survivin and leukemia[J]. Int J Hematol， 2004，
80（3）：232-238.
[13] Kappler M， Bache M， Bartel F， et al. Knockdown of survivin ex-
pression by small interfering RNA reduces the clonogenic survival
of human sarcoma cell lines independently of p53[J]. Cancer Gene
Ther， 2004， 11（3）：186-193.
[14] Williams NS， Gaynor RB， Scoggin S， et al. Identification and va-
lidation of genes involved in the pathogenesis of colorectal cancer
篇7
1历史回顾
早在1847年Virchow首次报道了一家数人患有多发性神经纤维瘤病。到1849年Smith对神经纤维瘤的临床症状作了较为全面的描述。随后德国内科医生Von Recklinghausen于1882年通过病理学研究对其组织学特点及其与神经系统的关系作了详细的阐述。因此,本病也称Von Recklinghausen病。1896年又加入色素变化的描述,以后Yakovler及Guthrie(1931)、Lichtesfein(1949)、Growe、Schull(1956)等也从临床、病理、病因等方面作了全面研究。Lisch(1937)又注意到眼睛有错构结节,1964年,Crowe报道了腋窝雀斑痣,但直到1981年本病极为常见的Lisch结节才被人们所认识。最近确认此结节在20岁以上的神经纤维瘤I型患者中的出现率为100%[1]。
2病因病理
本病是中胚层和神经外胚层的病变,为常染色体显性遗传,现已明确,神经纤维瘤病I型和Ⅱ型的遗传缺陷在不同染色体上。NF1是第17对染色体,NF2是第22对染色体[2]。本病主要是由于神经系统结缔组织增生所引起的各种肿瘤,包括错构瘤。其典型病理改变是由棱形细胞组成的神经纤维瘤,肿瘤成分主要是增生的神经胶质和雪旺氏细胞。最常见的肿瘤为听神经纤维瘤。且多为双侧,也可发生三叉神经纤维瘤、视神经胶质瘤、脑胶质瘤及多发性脑膜瘤等。椎管内肿瘤好发于脊神经根及马尾部。皮肤及皮下神经纤维瘤多位于真皮和侵入皮下,并累及结缔组织。神经纤维瘤一般不会形成神经纤维肉瘤。在一组病例研究中,678例患者有21例出现神经纤维肉瘤,而且在伴有丛状神经瘤或皮下神经瘤时最常见。
有学者将神经纤维瘤分为5个病理类型:I型(局限性神经纤维瘤病):以丛状神经瘤为特征,即以某一区域的神经干扭曲、增生过长、伴有结缔组织及神经组织增生为主;Ⅱ型(全身性皮肤神经纤维瘤病):以多发性皮肤结节及皮肤色素斑为主要特征;Ⅲ型(深部周围神经干的神经瘤,神经纤维瘤和神经鞘瘤):以深部神经干受累为特征。IV型(颅神经干的神经瘤、神经鞘瘤)常与Ⅲ型并存,V型(并发脑瘤和脑瘤样变)多与上述各型并存[3]。
3分子遗传学水平
NF1基因于1990年被克隆出来,定位于17q11.2,其全长约350kb,包含60个外显子,可以转录形成ll～l3kb的mRNA,编码2 818个氨基酸的蛋白,称之为神经纤维蛋白。NFl基因的肿瘤抑制功能被认为主要是依赖它的下调原癌基因ras而实现的。NFl基因表达的丢失导致神经纤维素RasGAP功能的丧失,最终导致Ras活性的增加,细胞增生以及肿瘤的形成[4]。
NF2的遗传学特征不同于NF1,1993年Rouleau、Troffater同时报道了NF2基因的克隆,前者在D22S212和D22S32之间用位置克隆策略克隆出NF2基因,后者在D22S1和D22S26之间发现NF2基因。NF2基因的位点在22号染色体长臂。现已将NF2基因定位于22q12,并认为NF2基因为肿瘤抑制基因(根据基因对细胞生长、分化的影响分两类:对生长有正性影响的称原癌基因,有负性影响的称肿瘤抑制基因)。NF2基因定位于22号染色体长臂1区二带(22q12),含17个外显子,转录产物为4.5kb mRNA,编码一个含595个氨基酸的蛋白质,命名Schwannomin或Merlin。NF2的临床表现有两种:Wishart型,早期发病(20岁),症状较轻且局限于颅内[5]。
4激素与神经纤维瘤的发生
NF1患者神经纤维瘤的外显有明显的年龄依从性,即青春期后出现,成年期明显增加,晚年则停止或减少。Cunha等[6]也发现了这一现象,认为体内激素水平影响着NF1患者神经纤维瘤的发生发展。激素影响的根据还不清楚,有些研究者通过研究证实了NF1患者神经纤维瘤组织中有生长激素受体的表达,由于生长激素在其他一些良恶性肿瘤中有增生活性,可通过启动各种信号途径如STATS、Ras、MAP激酶、IRS等促进细胞增生,所以生长激素在NF1散发肿瘤的生长调控中可能起一定作用。神经纤维瘤的这种外显规律也与体内雌激素分泌的生理特征有明显的相关性,提示体内雌激素水平的变化可能也参与和介导了神经纤维瘤的形成和发展[7]。宫洪基(1985)曾报道l例妊娠6次的妇女,每妊娠一次,肿瘤的数目就增多1次,首次妊娠前只有10多个,而第6次妊娠已达1 000多个。国内报道数目最多的是喻昭(1985)报道的l例患者,多达5 285个。国外报道有达到9 212个之多者。其他的皮肤肿瘤如血管瘤也可见于本病。
5临床表现
神经纤维瘤病有许多表现,致使其诊断和治疗对普外科和血管外科医师等提出了难题,约1O%病例有Sylvian管狭窄引起颅内畸形,如阻塞性脑积水。NF1型有25%～3O%侵犯头颈部,需要详尽检查,包括神经系统和影像学检查。
5.1 胃肠道表现:Ghrist在11年内收集了29例NF病例,其中发现部分病例有胃肠道症状。Davis统计11%～25%NF病例有胃肠道侵犯,但不足5%的病例有伴随症状。从组织学上,NF病的胃肠道表现有3种:肠道神经组织的增生、基质肿瘤、十二指肠或壶腹周围内分泌肿瘤。增生型主要表现为便秘,基质肿瘤多位于胃和空肠,多良性。
5.2 血管病变:NF1引起血管病变的病因是由于血管壁异常细胞的过度增生导致纤维的增生,平滑肌消失,而后发生纤维变性和平滑肌结节的增生。NF1患者血管的病理改变取决于其管径的大小,大血管为壁内雪旺氏细胞纤维化所致,小血管是由于血管中膜层发育不全。NF1并发血管改变使血管中膜平滑肌减少,弹性成分降低,管壁脆性增加,支持、连接功能下降,在血管内血流冲击和周围组织牵拉下产生微小动脉瘤及动静脉瘘。病变继续发展,小动脉瘤破裂、膨出就可形成大的假性动脉瘤。动脉瘤、动静脉畸形可破裂,严重者会发生失血性体克并危及生命。Reubi[8]最早描述了NFl的动脉病变,并认为所有NF1患者均有不同程度的血管病变,其特征性的改变包括血管内膜的向心性生长、弹性纤维的破裂和结节的增生。综上所述,NF1是累及全身多系统、多器官的疾病,如并发血管病变,可出现血管狭窄、闭塞、动脉功能不全、动脉瘤、假性动脉瘤、动静脉畸形或动静脉瘘等并发症,而这往往被临床医生所忽视。这些可引起严重的临床后果,如发生血管破裂,患者的死亡率较高。血管造影在NF1并发血管病变诊断中具有重要作用,往往在患者症状出现前就具有高度提示性。NF1引起血管病变的血管造影特征为血管节段性狭窄,狭窄处近端渐进性膨大,呈漏斗状改变,血管壁光滑[9]。目前,对于预防和治疗NF1并发的血管病变尚缺乏行之有效的方法。
5.3 心胸表现:有人认为NF伴有心血管畸形,如先天性心脏缺损,有报道心血管畸形的发病率为2%,且有肺动脉狭窄发生的倾向性。NF很少直接侵及心脏本身,但丛状NF可以侵及心脏及其周围结构。胸内非心脏肿瘤是胸腔中NF的常见表现,引起气促、吞咽困难,侵犯肺或腐蚀肋骨。迷走神经受侵者,尤其是左侧,可引起心律不齐和猝死。自发性气胸是致命性并发症,也有发生血胸者。
5.4 肿瘤:NF患者常患有肿瘤,颅内肿瘤最常见的是视神经胶质瘤(15%～2O%),颅外肿瘤则为皮肤肿瘤,即发生于皮肤及皮下的多发性皮肤神经纤维瘤或纤维性软瘤。在儿童期即可出现,到青春期后进展明显,大多数分布于躯干、四肢和面部。肿瘤为一圆顶状软结节,有蒂或无蒂,表面光滑,皮肤完好,颜色为正常肤色或淡红色、粉红色、黄褐色,位于真皮或皮内。位于皮内的肿物可隆起呈囊样,用手压之下陷放手后复平,有疝样感,一般无疼痛及压痛。但位于浅表神经的神经纤维瘤可有疼痛,偶有压痛,甚至出现沿神经干的疼痛和感觉异常。肿瘤的大小不一,一般为数毫米到一厘米或更大,且具有随年龄增加而增大的倾向。儿童NF患者的恶性肿瘤有星状细胞瘤、横纹肌肉瘤、恶性周围神经鞘瘤和白血病。但多数肿瘤是良性的,比常人有更大的恶变倾向性,发生第二种恶性肿瘤的机会也高。已知NF基因是抑癌基因,一旦突变易发生恶性肿瘤,有报道其发生率高于人群4～5倍。在NF的最显著肿瘤是特征性神经纤维瘤,有分散的和丛状两种。
5.5 丛状神经纤维瘤:丛状神经纤维瘤(Plexiform neurofibroma)是神经干及其分支的弥漫性神经纤维瘤,约占NF的30%,常伴有皮肤和皮下组织过度增生,表面皮肤增厚、褪色。并引起颈、面、唇、舌、颈后或一个肢体的弥漫性肥大。质软而有弹性,可自由移动,又称橡皮病样多发性神经纤维瘤(Elephantiasis Neurofibromatosis)。多在儿童期出现,逐渐增大,可有压痛。肿瘤数目不等,多在数个到数十个。多者可达数百个,且多随年龄的增长而增多,可受妊娠的影响,可恶化成恶性周围神经鞘瘤,生长迅速,并有压痛。主张在病灶较小时切除,但彻底切除常不可能,易复发。
5.6 牛奶咖啡斑(Cafe-au-lait spots):牛奶咖啡斑为本病的一个重要体征。约有40%～50%的患者于出生时即已存在,为棕色或牛奶咖啡色斑疹。由于出生时颜色较浅,故常不被家长注意,只有当出现其他症状时才就诊。研究表明,牛奶咖啡斑随年龄的增长而逐渐变大,颜色变深且数目增多。据报道,80%的患儿年龄每增长l岁,此斑则增加1个,4岁的患儿则100%的出现。多见于躯干、四肢,也可见于其他部位,但以非暴露部位多见。其大小不一,一般直径l～2cm或更大,边界清楚,多呈卵圆或其他形状,不突出皮肤。约20%的患者在腋窝与会有雀斑样色素沉着,称为腋部雀斑(Axillary fleelding),具有诊断意义。牛奶咖啡斑在正常人也可见到,但数目很少。一般而言,正常小儿可有l～2个牛奶咖啡斑,直径多在0.5cm以内,3个以上者则属异常,应考虑本病的可能性[10]。
6神经纤维瘤病的Riccardi分类
按照Riccardi的分类[11],神经纤维瘤病分为8个类型。NFl型(Von Recklinghausen型)的诊断标准具备下列2条或2条以上:①6个或6个以上牛奶咖啡斑。在青春期前最大直径超过5mm,青春期以后和成年人最大直径超过15mm;②2个或2个以上任何类型的神经纤维瘤或一个丛状神经纤维瘤;③在腋窝或腹股沟区有雀斑;④视神经胶质瘤;⑤2个或2个以上Lisch结节(虹膜错构瘤);⑥特殊的骨性损害,如蝶骨发育异常或长骨皮质变薄,伴有或不伴有假性关节病;⑦根据以上标准,与NF1型有关的一级亲属(双亲、兄弟姐妹或子孙后代)。NF2型(听觉型),具备下列任何一条者即可诊断:①适当的影像技术检查(如CT或MR)可见双侧第8对颅神经瘤;②与NF2型有关的一级亲属以及单侧第8对颅神经瘤或下列两种:神经纤维瘤、脑膜瘤、胶质瘤、雪旺氏细胞瘤、青年后囊下晶体混浊;NF3型(混合型)的临床特点是多发性脑和脊髓肿瘤,伴有牛奶咖啡斑和神经纤维瘤;NF4型(变异型)的特点是牛奶咖啡斑和弥漫性神经纤维瘤,不能进一步分类;NF5型(局限型)的临床特点是牛奶咖啡斑或神经纤维瘤,或两者均有,局限于某部位;NF6型(牛奶咖啡斑型)特点是多发牛奶咖啡斑而无神经纤维瘤;NF7型(迟发型)的临床特点是20岁以后发生的神经纤维瘤病;NF8型仅有神经纤维瘤而无任何其他类型的特点。在以上8种类型中,NF1型约占神经纤维瘤病的85%～9O%。局限性神经纤维瘤病(NF5)是NF1型的局部表现,且是8型中唯一非遗传性的。
7鉴别和诊断
当发现患者有皮肤牛奶咖啡斑及皮下结节时,诊断多不困难,下列方法有助于进一步确定诊断:①详细询问病史,并对其家庭成员进行体格检查;②皮肤活检;③详细地进行神经系统检查及眼科检查;④X线检查:如颅骨平片、内听道、胸片、脊柱片等;⑤CT或MR检查(有助于早期诊断);⑥脑电图检查;⑦脊髓造影。
尽管NF1和NF2是位于不同染色体的不同的基因突变所致,其临床表现差别很大,但NF1和NF2之间诊断仍可能发生混淆,所以需要予以明确:①NF1患者可患有认知障碍(智力发育迟钝、学习障碍),有显著数量的Lisch结节,而NF2患者没有。周列民等[12]通过中国修订的韦氏成人智力量表对中国人NF1患者进行智力损害和影响因素的研究发现NF1患者言语理解能力和知觉组织能力受损较重,而记忆力与注意力受损相对较轻且受病程及受教育程度影响;②NF2患者神经鞘瘤很少发生恶变形成神经纤维肉瘤;③NF2没有明显数量的牛奶咖啡斑,但可能比正常人数目多;④脊根部的哑铃型肿瘤最容易引起诊断上的混乱,此类肿瘤在NF2为神经鞘瘤,在NF1为神经纤维瘤[13]。
8治疗
NF1患者临床表现千差万别,根据肿瘤和病变的位置和数目,可以选择相应的手术和非手术治疗。如肿瘤过大,妨碍身体活动或面部肿瘤影响容貌,或有压迫症状时,可行手术切除。若肿瘤生长迅速并有剧痛时,应及时切除,以防恶变。
3.1手术治疗:①瘤体较小而局限者可直接切除缝合;②瘤体较大,但与深筋膜和深部组织界限清楚者可基本切除瘤体,植皮封闭创面;③瘤体巨大无法完全切除,且与深筋膜和深部组织界限不清者尽可能切除瘤体,并设计皮瓣,直接缝合。对于瘤体特别巨大而分布广泛者,我们进行血管造影检查,明确瘤体的营养动脉并给予栓塞,术中采用控制性低血压和自体血回输等方法,有效地降低了出血量,提高了切除巨大瘤体的安全性;④如直接切除预计无法直接缝合或局部皮瓣无法转移修复者,预先埋置扩张器、二期手术切除瘤体并行扩张皮瓣转移修复。为减少术中出血采取的措施有:①在瘤体周围用粗丝线预先环扎,以尽量减少切口渗血并阻断肿瘤血供;②切口选在正常组织处;③用电刀向瘤体剥离时,尽量在帽状腱膜、筋膜或骨膜上进行;④术中边剥离边止血,用大号温热盐水纱布压迫创面,并置止血明胶海绵,减少创面渗血;⑤从瘤体基部将整个肿瘤大块掀起后,再从皮下切除肿瘤[14];⑥术中局部采用肿胀麻醉技术止血;⑦术后72h内间断拆除环扎缝线;⑧低压麻醉。
3.2非手术治疗:1987年有人用肥大细胞膜稳定剂酮替酚治疗NF,发现能阻止皮下肿瘤生长,减轻神经纤维瘤的瘙痒和疼痛。进行外科治疗的患者,同时服用酮替酚不出现过量出血。但近期疗效如何,目前仍在观察中。皮肤病变的激光治疗只在短期内有效。据报道H1和H2受体阻滞剂治疗本病无效,深部X线放射治疗通常无效。展望未来,基因治疗可能是本病治疗的一个方向 [15]。NF2的首选治疗方法是手术,立体定位放疗如伽玛刀也是候选治疗方法。针对儿童患者的放疗需要慎重,以免引起肿瘤恶变、诱发产生其他肿瘤等后果。治疗还应包括针对平衡失调和耳聋的治疗。
9并发症及预后
NF并发症较为常见和复杂,其中35%伴中枢神经系统异常,如脑肿瘤、癫痫、精神病、反应迟钝、学习能力差等。5%伴周围神经肿瘤。除此之外,NF尚可伴发其他肿瘤:白血病、胃肠道平滑肌瘤。而NF本身尚有一定恶变率,具体原因尚不清楚,可能与本病病因中基因异常有关。本病预后不一,大部分患者发展缓慢,有时呈静止状态,可生存多年乃至终生。但也有个别患者发生恶变而危及生命。一般认为周围神经肿瘤远期预后较好,而颅内肿瘤不论单发或多发,其预后取决于其部位、性质及治疗措施等。手术治疗后,如果肿瘤过大,含有不成熟成分时,术后常有复发,且复发次数愈多,恶性程度亦逐渐增加。由于目前产前还没有可靠的方法予以诊断,且本病患者子女发病率约为50%,故婚后绝育为最佳预防措施。
10小结
目前,对于NF的治疗方法虽然很多,但无论是手术治疗还是非手术治疗,要达到彻底治愈都十分困难,对于体积较大位置较差的瘤体,术中仍显得较为被动。近几年来基因治疗NF虽已取得长足发展,但由于NF基因有许多潜在突变位点,突变类型复杂,而且病变涉及全身多种器官,我们尚不能完全纠正NF突变的基因,因此,对于NF的治疗我们还需要进一步的研究及探索。
[参考文献]
[1]Mackool BT,Fitzpatrick TB.Diagnosis of neurofibromatosis by cutaneous examination[J].Semin Neurol,1992,2(4):358-362.
[2]Mulvihill JJ,Parry DM,Sherman JL,et al.Neurofibromatosis 1(Recklinghausen disease) and Neurofibromatosis 2(Bilateral acoustic Neurofibromatosis) [J].Ann Itern Med,1990,113:39.
[3]刘玉光.先天性颅脑疾病[M].济南:济南出版杜,1993:58.
[4]Gotfried ON,Viskochil DH,Fuhs DW,et a1.Molecular,genetic,and cellular pathogenesis of neurofibromatosis and surgical implications[J].Neurosurgery,2006,58:1-6.
[5]Huynh DP,Nechiporuk T,Pulst SM,et a1.Alternative transcripts in the mouse neurofibromatosis type 2(NF2)gene are conserved and code for schwannomins with distinct C-terminal domains[J].Hum Mo Genet,1994,3(7):1075-1079.
[6]Cunha KS,Barboza EP,Da Fonseca EC.Identification of growth hormone receptor in localised neurofibromas of patients with neurofibromatosis type 1[J].J Clin Pathol,2003,56:758-753.
[7]Margaret E,Mc Laughlin,Tyler Jacks. Progesterone receptor expression in neurofibromas [J].Cancer Res,2003,63:752-755.
[8]Kurien A,John PR,Milford DV. Hypertention secondary to progressive vascular Neurofibromatosis [J].Arch Dis Child,1997,76(5):454-455.
[9]李松华,吕立权,张秋林.Ⅰ型神经纤维瘤病血管病变的研究进展[J].中国矫形外科杂志,2002,9(3):278-280.
[10]傅诚强.神经纤维瘤病(编译)[J].国外医学外科学分册,2003,30(3):153-154.
[11]Riccardi VM. Neurofibromatosis,clinical heterogeneity[J].Curr Probl Cancer,1982,7:1.
[12]周列民.Ⅰ型神经纤维瘤病遗传学发病机制的研究进展[J].中山医科大学学报.1998,19(2):135-138.
[13]杨 华,陈晓巍,高志强.Ⅰ型和Ⅱ型复合型神经纤维瘤病一例[J].中华耳鼻喉头颈外科杂志,2008,7:544-545.
[14]许 彪,王卫红,黎 明,等.颌面部巨大神经纤维瘤的外科治疗[J].华西口腔医学杂志,2005,23(5):449-450.
篇8
[关键字] 骨髓间充质干细胞;股骨头坏死;治疗;进展
[中图分类号] R681.8[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)01(a)-016-04
股骨头坏死(osteonecrosis of femoral head,ONFH)是一种严重危害人类健康、致残率极高的常见疾病,常累及中青年,呈进展性和致残性发展,80%的患者在1～4年内进展为股骨头塌陷,最终因股骨头变形、毁损、髋关节剧烈疼痛而不得不行人工关节置换术。骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)具有良好的多向分化潜能、活跃的增殖特性、对外源基因的高效转染表达能力以及促进造血、在体外较易分离和培养等特性,较多地用于股骨头坏死的研究,显示了良好的应用前景。
1 股骨头坏死的机制
ONFH发病机制复杂多样,病因主要是创伤、应用激素、酗酒及结缔组织病因素等。微循环障碍是原发性股骨头坏死的共同病理机制,决定其病理演变的因素可概括为3个方面:病因、破骨细胞介导的骨吸收与骨的有效重建速度的平衡关系、生物力学作用。病因最终造成微循环损害,骨细胞、骨髓组织坏死、骨髓间充质细胞向成骨细胞分化能力下降,破骨细胞对失去保护的骨小梁吸收增强,骨小梁因而吸收变得稀疏、细小。另一方面,因骨小梁中的骨细胞坏死失去了矿物代谢功能,其机械强度随之下降。当应力传导时,骨小梁极易骨折,在骨坏死吸收的同时伴随修复,修复的强弱取决于供血状态及骨髓的功能状态。骨髓间质细胞分裂增生,在骨坏死区出现富含成纤维样细胞的结缔组织,毛细血管再生,成骨细胞及来自于骨髓间质细胞分化的成骨细胞合成骨基质,重建坏死的骨小梁,骨的吸收速度及新生骨的有效重建速度应保持一定的平衡关系,而这种关系最终由破骨细胞的活动、骨髓间质细胞向成骨细胞分化的能力及成骨细胞的功能状态决定[1]。总之,股骨头坏死的特征是股骨头缺血、坏死,随之出现修复反应,进而发生股骨头塌陷及髋关节退行性关节炎。
2 BM-MSCs的生物学特性
BM-MSCs来源于胚胎发育期中胚层,存在于骨髓组织中,较多用于ONFH的治疗研究中。在光学显微镜下BM-MSCs显示出类似成纤维细胞的外观,体积小,核浆比大;只有少数正在活跃地复制,细胞周期每个阶段的检控点和时间跨度均不明确;高比例的G0/G1期细胞暗示BM-MSCs具有高度的分化潜能;传代培养多数样本于P10代以后开始出现衰老现象。
BM-MSCs的主要生物学性状如下:细胞因子及生长因子有白细胞介素-1α、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-8、白细胞介素-11、白细胞介素-12、白细胞介素-14、白细胞介素-15、LIF、SCF、Flt23配体、GM-CSF、G-CSF、M-CSF;细胞活素及生长因子受体有:IL-1、RIL-7、RIL-4R、IL-6R、IL-7R、LIFR、SCFR、G-CSFR、IFNR、TNF-ⅠR、TNF-ⅡR、TGF-β1R、TGF-β2R、bFGFR、PDGFR、EGFR。目前尚未找到BM-MSCs的特异性标志物,通常以其较强的贴壁生长特性、不表达造血干细胞标志物(如CD14、CD34、CD45等)、形态似成纤维样细胞、具有多向分化潜能等特征来辨认。由于BM-MSCs可表达内皮细胞、表皮细胞和肌细胞等其他细胞的表面抗原,故常用SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等来筛选BM-MSCs[2]。
3 BM-MSCs向骨、软骨的定向诱导分化
Tamir等[3]用一个细胞来源的BM-MSCs分别进行骨、软骨和脂肪的定向诱导分化,结果显示BM-MSCs具有多向分化能力。细胞因子与骨形成、骨愈合及骨重建有着密切的关系。这些物质有胰岛素样生长因子(IGFs)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、转移生长因子-β(TGF-β)、血小板源生长因子(PDGF)和骨形态发生蛋白(BMPs)等。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)可刺激细胞分化和骨细胞基质合成。PDGF对骨细胞分化有着强大的作用。在兔胫骨缺损模型中,缺损处局部单纯注射PDGF可以提高伤处胶原的体积和密度。FGFs有多种调节作用,如细胞的有丝分裂、分化、蛋白酶的合成及受体的调节。有学者通过体外细胞培养发现碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对BM-MSCs有促进增殖作用[4]。TGF-β可刺激成骨细胞增殖,也是成骨细胞化学诱导因子和成骨细胞合成的抑制剂。实验表明,TGF-β可刺激兔颅骨缺损处成骨细胞的募集和增殖,从而导致骨愈合。BMPs家族由14个成员组成,它们可促进骨形成,而且能促进异位成骨[5]。李广恒等[6]将重组骨形态发生蛋白-4(BMP-4)加入体外培养的兔骨髓细胞内,发现其表达骨钙素和碱性磷酸酶。Lane等[7]做了重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)与骨髓修复鼠股骨缺损的实验研究,通过放射学和生物力学检测发现其无论在愈合率还是在生物力学性能上都比单纯自体松质骨组和单纯骨髓组优越。骨形成是多因子、多时相协调作用的结果,其详细调节机制尚有待进一步研究。
4 BM-MSCs与ONFH的治疗
目前对于股骨头缺血性坏死的发病机制尚未完全阐明。研究表明,股骨头坏死的发生与成骨细胞及骨髓基质细胞的功能下降有关。如Hernigou发现股骨头坏死患者的造血干细胞和骨髓基质细胞活性较正常人均有明显降低。Gangji等[8]比较了13例股骨头坏死,显示股骨头坏死患者转子部成骨细胞的增殖能力下降,结果提示,股骨头缺血性坏死可能是在多种因素的作用下,通过全身途径致使成骨细胞和骨髓基质干细胞的功能下降,进而导致股骨头再生血管和成骨能力降低。而BM-MSCs是具有成骨作用且能够自我复制的细胞,对促进股骨头坏死重建起到重要作用。Kocher等[9]通过实验证实,BM-MSCs或内皮前体细胞可以促进缺血模型的血流恢复。Kinnaird等[10]在给鼠缺血性后肢肌肉注射培养的骨源性干细胞后发现其可以促进侧支循环及肢体功能恢复,并且与血管生成有关的细胞因子(如VEGF、FGF-2、IL-6等)基因表达水平增高。BM-MSCs可诱导分化为成骨细胞也已在体内外实验中得到证实。可见通过BM-MSCs移植既有利于股骨头血液供应的恢复,又能提高局部成骨能力,从而促进坏死骨的修复,目前BM-MSCs的应用多与其他疗法联合应用[11]。
4.1 髓芯减压BM-MSCs移植
髓芯减压加BM-MSCs移植是临床治疗早期股骨头坏死的主要手段之一,已经有大量动物和临床实验报道都取得了良好的效果。刘长安等[12]在液氮造模后,采用髓芯减压并植入复合有自体BM-MSCs的明胶海绵,8周后钻孔区形成骨小梁结构,组织学显示钻孔区内充满新生骨小梁结构并成熟,小梁内骨髓组织填充。王江泳等[13]植入含有体外培养的自体BM-MSCs的明胶海绵和异体BM-MSCs的明胶海绵,8周时两组的钻孔区均出现骨小梁结构;骨小梁趋于成熟,可以看出同种异体和自体BM-MSCs移植均对兔股骨头缺血性坏死有良好的修复作用。
临床研究结果显示,骨髓干细胞移植治疗早期股骨头坏死,对缓解疼痛、阻止病变进展有较好的作用。Gangji等[14]对13例股骨头坏死患者18髋进行单纯髓芯减压和联合移植BM-MSCs髓芯减压的随机对照实验,60个月后实验组10髋中仅1髋行关节置换,而对照组8髋中有4髋不得不进行置换,生存分析表明,两组关节塌陷有显著性差异。Hernigou等[15]共治疗116例189髋,随访5~10年,平均7年,结果塌陷前期(Ⅰ、Ⅱ期)145髋中有9髋进行髓关节置换,塌陷后期(Ⅲ、Ⅳ期)的44髋中有25髋做全髋关节置换。结果显示,移植的细胞数量越多,疗效越好。郭小伟等[16]对Ficat分期为三期的20例患者进行自体周围血BM-MSCs移植,12个月随访显示,所有患者疼痛、关节功能显著改善、Harris评分与术前比较显著提高,且优于单纯髓芯减压术。汪学松[17]在病灶搔刮术后,直接自套管针内快速加压注入BM-MSCs到坏死区。治疗早期股骨头坏死27例,结果大部分患者疼痛、关节功能、X线片均有不同程度的改善。徐军等[18]应用髋关节镜及自体外周血BM-MSCs移植术,采用Harris髋关节评分评价优良率达94.7%,所有患者疼痛消失,行走正常,髓关节活动范围正常或接近正常,X线片示股骨头轮廓清晰,囊性变消失,为微创治疗ONFH提供了思路。上述研究说明股骨头髓芯减压BM-MSCs移植手术治疗早期ONFH具有损伤小、简便、准确、有效的优点,可改善关节功能。然而大规模、多中心样本试验长期疗效尚有待更多的临床观察进行验证。
4.2 BM-MSCs介入移植
近年来有学者采用介入方法移植BM-MSCs治疗ONFH,取得了很好的效果。杨晓凤等[19]分别向动物模型兔经DSA动脉注入BM-MSCs,移植后4周移植组兔右后肢股骨头区供血动脉较对照组股动脉明显增多。移植后12周右侧股骨头软骨、板层骨及骨小梁明显修复。季卫锋等[20]在DSA介入下向动物模型兔旋股内、外动脉插管分别注射BM-MSCs后,X线表现示骨质密度改变明显好转;病理组织学表现为空骨陷窝减少,成骨细胞增多,新骨形成;四环素荧光标记显示坏死修复区荧光带鲜亮,边界增宽。上述研究证明高选择性股动脉灌注BM-MSCs治疗股骨头坏死能加速兔股骨头的再血管化和再骨化进程,从而达到治疗ONFH的目的。
杨晓凤等[21]将导管超选择插入旋股内、外动脉及闭孔动脉,分次缓慢将自体BM-MSCs悬液注入动脉内。结果关节疼痛缓解85.7%,关节功能改善30.2%,旋股内、外动脉及闭孔动脉管径增粗,新生血管增多,股骨头区血液供应明显改善,2例18个月复查股骨头坏死区缩小,可见新骨形成。史沛等[22]采用介入方法将自体骨髓干细胞注入5例股骨头坏死患者治疗侧旋股内、外动脉及闭孔动脉内,1年随访结果显示,患者临床症状明显缓解,髋关节临床症状Harris评分显著提高,髋关节活动度无明显改变,未发生严重并发症。介入移植BM-MSCs治疗ONFH是一种安全有效、便捷的方法,还可以免除开放性手术的痛苦,为治疗早期ONFH开辟了新的思路。
4.3 基因转染BM-MSCs移植
将目标基因通过载体转入BM-MSCs内再与不同载体材料复合后植入股骨头坏死区治疗股骨头坏死,也是目前的研究方向,取得了许多令人振奋的结果。BMPs可促进骨形成,而且能促进异位成骨。陆斌等[23]利用人BMP-2基因转染的自体BM-MSCs复合多孔β-磷酸三钙材料治疗股骨头坏死,植入后1、2、3周BMP-2组在股骨头局部有BMP-2蛋白的高表达,有明显成骨;16周时坏死区被完全修复,且新骨体积明显大于对照组;BMP-2组股骨头形态规则,无塌陷,植入区松质骨标本的最大抗压强度、软骨下骨的最大抗压强度参数均与正常骨接近。Xiao等[24]联合rhBMP-2的BM-MSCs培养的支架材料干预,组织学也提示有正常骨修复,提示BMP-2基因转染的BM-MSCs是治疗ONFH的有效途径。张晔等[25]以脂质体介导Pcdna-Ang-1质粒转染兔BM-MSCs,与磷酸三钙(TCP)陶瓷复合,结果细胞与TCP材料复合生长良好。组织学检查见毛细血管生长及新骨形成活跃,电镜显示实验组成骨细胞和胶原纤维多于对照组,细胞器成熟,Ang-1修饰的BMSC预构人工骨也有助于股骨头坏死的修复。而陈超等[26]将hVEGF-165质粒转染BMSC与冻干松质骨作载体回植于兔股骨头坏死部位,在植入后2、4、8周对植入物进行形态学及组织学观察,结果显示股骨头坏死情况得到改善。杭栋华等[27]研究hVEGF-165基因转染的犬BM-MSCs移植、BM-MSCs移植对修复自体股骨头坏死的效果实验中,实验第2、4、8周骨小梁定量分析提示转基因的间充质干细胞移植组成骨修复好于单纯干细胞移植组;12周时,转基因间充质干细胞移植组中血管数量最多。余开湖等[28-29]报道,携带血管生成素基因(Ang-1)的BM-MSCs介入治疗不仅能促进毛细血管的生成,而且能定向进行骨分化,对ONFH有明显的修复作用。此外,温茜等[30]用重组方法产生重组腺病毒人肝细胞生长因子(Ad-HGF)转染BM-MSCs,转染后的BM-MSCs在mRNA和蛋白水平均有HGF高表达,为其用于早期ONFH的治疗奠定了基础。利用生物技术将转染某些基因的BM-MSCs细胞用于治疗ONFH将是我们今后的研究方向之一。
4.4 联合填充材料BM-MSCs移植
BM-MSCs联合什么样的载体到目标区域也值得我们探索,并且也有很多学者做了相关研究。在支架材料的选择上,Fialkov等使用聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(polylactic/glycolic acid copolymer,PLGA)作为体内研究的支架材料,徐晓良等使用骨形成蛋白/胶原/珊瑚复合人工骨用于股骨头缺损模型。由于PLGA降解产物酸性过强,对组织有副作用;胶原/珊瑚复合人工骨很难降解等缺点,限制了它们的使用。孙伟等[31]在兔双侧股骨头内骨缺损区填充纳米人工骨和BM-MSCs的复合材料。术后4周即有明显的成骨反应和新骨形成,填充纳米晶胶原基骨(nHAC)和BM-MSCs的复合材料组骨小梁结构形成,12周基本修复股骨头的骨缺损区,说明nHAC有较强的传导成骨作用,是修复兔股骨头骨缺损的良好移植材料,适合MSCs细胞黏附、生长、增殖和分化,有较强的组织相容性和适当的可降解性,能在降解过程中逐渐被新骨替代;复合BM-MSCs后能促进骨缺损的修复,对股骨头坏死的治疗有较大价值。付松等[32]则证实牛松质骨可以作为一种较好的载体应用于骨组织工程学。黄炎等[33]将小牛脱钙松质骨(DBCB)作为载体联合一定量的BMPs与不同浓度的含有BM-MSCs的单核细胞悬液治疗股骨头兔模型也取得了很好的效果。陈观华等[34]证实使用自体松质骨及BMP联合自体BM-MSCs治疗股骨头坏死实验兔效果良好。陆骅等表示作为BM-MSCs载体,目前冻干松质骨要优于羟基磷灰石。陈双涛等植入复合同种异体BM-MSCs的胶原蛋白海绵,同时植入腹壁浅动、静脉束,12周后缺损区可见成熟的骨小梁组织及新生骨髓。股骨头冠状截面的血管密度及新生骨小梁在骨缺损区所占的面积大,说明定向诱导的同种异体骨髓基质干细胞与腹壁浅动、静脉束相辅相成,联合应用可以快速、有效地修复股骨头坏死骨缺损,防止股骨头塌陷。目前对于局部联合材料移植BM-MSCs也是治疗ONFH的一个方向,但寻求组织相容性高、副作用少、便捷有效的材料依然值得探索。
5 目前BM-MSCs在治疗ONFH中存在的问题
BM-MSCs治疗早期ONFH是目前骨科研究热点,有很好的应用前景,但是也存在很多问题,如:①不同个体、不同疾病状态和不同部位的BM-MSCs数量和质量均可能有差异。因此,必须建立一套高效率的BM-MSCs体外扩增或活化技术,保证有足够数量的细胞满足临床需要。②移植治疗策略是BM-MSCs临床应用的关键。目前已经报道的治疗策略有BM-MSCs动员、静脉输入、靶器官动静脉血管介入、定位移植等,这些方法各有所长,针对不同的疾病采用哪种方法最合适还值得深入探讨。③目前有部分研究用不同类型的填充材料作为载体,但究竟哪种更加有利于BM-MSCs发挥作用且副作用小,值得我们继续研究。④临床疗效、体内可控性和安全性评价问题是BM-MSCs特别是转入某些基因后临床治疗需要明确的根本问题,虽然没有人报道BM-MSCs移植治疗的负面影响,但体外长期培养的BM-MSCs移植到体内后是否会发生突变和导致肿瘤或者畸胎瘤可能是BM-MSCs临床治疗中最令人担忧的问题,因此,必须建立可靠的技术方法和评价体系。⑤BM-MSCs治疗是一种有别于常规药物和手术治疗的新技术,需要有相应的技术规范和管理机制,保证BM-MSCs治疗技术健康发展。
尽管目前BM-MSCs在治疗股骨头缺血性坏死方面应用较少,但我们相信随着研究的深入,BM-MSCs的应用必将为广大股骨头坏死患者带来巨大的福音。
[参考文献]
[1]Suh KT, Kim SW, Roh HL, et al. Decreased osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in alcohol-induced osteonecrosis [J]. Clin Orthop,2005,(431):220.
[2]Johnstone B, Yoo JU. Autologous mesenchymal progenitor cells in articular cartilage repair [J]. Clin Orthop Relat Res,1999,(Suppl 367):156-162.
[3]Tamir A, Petrocelli T, Stetler K, et al. Stem cell factor inhibits erythroid differentiation by modulating the activity of G1-cyclin-dependent kinase complexes: a role for p27 in erythroid differentiation coupled G1 arrest [J]. Cell Growth Differ,2000,11(5):269-277.
[4]Demulder A, Suggs SV, Zsebo KM, et al. Effects of stem cell factor on osteoclast-like cell formation in long term human marrow cultures [J]. J Bone Miner Res,2002,7(11):1337-1344.
[5]Urist MR, Silverman BF, Busing K, et al. The bone induction principle [J]. Clin Orthop,1967,326(53):243-283.
[6]李广恒,侯筱魁,吴祥甫.重组BMP-4对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响[J].中华骨科杂志,2005,22(11):685-689.
[7]Lane Jm, Yasko A, Tomin E, et al. Bone marrow and recombinant human bone morphogenetic protein-2 in osseous repair [J]. Clin Orthop,2002,361(1):216-227.
[8]Gangji V, Hauzeur JP. Treatment of osteonecrosis of the femoral head with implantation of autologous bone marrow cells [J]. Bone Joint Surg Am,2005,1(1):106-112.
[9]Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ, et al. Neovascularization of ischemic myocardium by humanbone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodelingand improves cardiac function [J]. Bat Med,2005,7(4):430-436.
[10]Kinnaird T, Stabile E, Burnet MS, et al. Marrow-derived stromal cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms [J]. Clinc Res,2004,94(5):678-685.
[11]Mont MA, Jones LC, Hungerford DS. Nontraumatic osteonecrosis of the femoral head: ten years later [J]. Bone Joint Surg Am,2006,88(5):1117-1132.
[12]刘长安,王江泳.骨髓基质干细胞移植治疗兔股骨头缺血性坏死的实验研究[J].中国矫形外科杂志,2007,15(1):58-60.
[13]王江泳,王保芝,刘长安,等.同种异体BM-MSCs移植对家兔股骨头缺血性坏死的治疗作用[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(3):565-568.
[14]Gangji V, Toungouz M, Lambermont M, et al. Treatment of osteonecrosis of the femoral head with implantation of autologous bone-marrow cells: five-year follow-up [J]. Bone,2007,6(1):27-28.
[15]Hernigou P, Beaujean F. Treatment of osteonecrosis with autologous bone marrow grafting [J]. Clin Orthop Relat Res,2004,(405):14-23.
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(上接第18页)
[16]郭小伟,吴卫新,洪云飞,等.髓芯减压并自体骨髓干细胞移植治疗股骨头缺血性坏死[J].医药论坛杂志,2008,29(5):19-21.
[17]汪学松.经皮骨髓移植治疗早期股骨头坏死27例[J].滨州医学院学报,2002,25(6):435-436.
[18]徐军,田军,许超蕊.应用髋关节镜髓芯减压并自体外周血干细胞移植治疗早期股骨头缺血性坏死38例[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(3):515-517.
[19]杨晓凤,王红梅,许忆峰,等.经动脉骨髓干细胞移植治疗股骨头坏死63例[J].中国临床康复,2006,10(13):3-5.
[20]季卫锋,童培建.骨髓多能干细胞动脉灌注治疗股骨头坏死的实验研究[J].中国中西医结合杂志,2004,24(11):999-1002.
[21]杨晓凤,王红梅.干细胞移植改善股骨头坏死缺血状态的实验及临床效应:20只模型兔及188例患者资料分析[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(8):1558-1562.
[22]史沛,茹凤娟.经动脉骨髓干细胞移植结合介入治疗股骨头缺血性坏死[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(37):7345-7348.
[23]陆斌,汤亭亭,岳冰,等.BMP-2基因给药修复实验性羊股骨头坏死[J].中华骨科杂志,2005,25(10):603-607.
[24]Xiao ZM, Jiang H, Zhan XL, et al. Treatment of osteonecrosis of femoral head with BM-MSCs seeded bio-derived bone materials combined with rhBMP-2 in rabbits [J]. Chinese Journal of Traumatology,2008,11(3):165-170.
[25]张晔,曾炳芳.BM-MSCs预构人工骨对兔股骨头坏死的修复作用[J].中国临床康复,2004,8(20):3960-3962.
[26]陈超,张彦陵.骨髓基质干细胞转基因治疗兔股骨头无菌性坏死的研究[J].现代医药卫生,2006,22(14):2129-2131.
[27]杭栋华,阎作勤.VEGF-165基因修饰的BM-MSCs移植修复犬股骨头坏死[J].复旦学报:医学版,2007,34(6):806-811.
[28]余开湖,冯敢生,潘盛信,等.携带Ang-1的BM-MSCs双介入治疗ANFH的转染与表达[J].临床放射性杂志,2005,24(9):814-817.
[29]余开湖,冯敢生,潘盛信,等.携带Ang-1的BM-MSCs对ANFH模型实验修复过程的影响[J].临床放射性杂志,2006,25(1):79-82.
[30]温茜,马骊,金丹,等.重组腺病毒Ad-HGF转染骨髓基质干细胞及其表达的实验研究[J].南方医科大学学报,2007,27(11):1627-1631.
[31]孙伟,李子荣,史振才,等.纳米晶胶原基骨和BM-MSCs复合修复兔股骨头坏死缺损的研究[J].中国重建修复外科杂志,2005,19(9):703-706.
[32]付松,张元和.牛松质骨复合骨髓基质干细胞植入治疗兔股骨头坏死的实验研究[J].实用诊断与治疗杂志,2007,12(2):101-103.
[33]黄炎,孔荣,尚希福,等.浓集自体骨髓基质干细胞复合物成骨的实验研究[J].解剖与临床,2005,10(3):192-194.
篇9
胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）在神经系统的发育、生长、损伤及修复等过程中发挥重要的神经营养作用，在神经系统中的分布广泛，其神经营养活性较高，不仅可以保护多巴胺（DA）运动神经元，对于中枢及外周的运动神经元、感觉神经元及交感神经元等多种神经元具有同等的营养作用，在神经系统变性性疾病及缺血性脑血管疾病等治疗中发挥重要作用，已经成为当前神经科学领域研究的热点。
1 GDNF的基本结构
GDNF最先由Lin等［1］于1993年从大鼠胶质细胞B49的条件培养液中分离出来，因其主要来源于神经胶质细胞，故人们将其命名为胶质细胞源性神经营养因子。每个GDNF成熟蛋白质氨基酸序列中都有7个保守的半胱氨酸残基［2］，并且半胱氨酸出现的位置与转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的所有成员相似，故因其结构特点将其归属于TGF-β超家族的新成员。
2 GDNF及其受体的分布
GDNF在全身各种组织中均有表达［3］，并不单一表达于富含多巴胺能神经元的部位，如中脑的黑质。GDNF的mRNA在体内神经系统非多巴胺能神经元部位也可以检测到，在外周非神经组织中也有表达，在小脑蒲肯野细胞、三叉神经运动核等与运动有关的结构以及三叉神经感觉核、脊髓后角Clarksy核等与感觉有关的结构中也可以检测到。GDNF在机体各个组织及器官中的广泛表达均提示其作用广泛。
3 GDNF受体信号传导系统
GDNF发挥作用的机制主要是与其受体结合，从而发挥其生物学作用。GDNF 受体系统并不是TGF-β超家族的受体：跨膜丝氨酸或者苏氨酸受体，它们有自己的受体部分，为GDNF家族受体α（GDNF family receptor α，GFRα）和Ret蛋白组成的复合受体系统。一部分通过糖基磷脂酰肌醇（glycosyl-phosphatidylinositol，GPI）结合位点锚定于细胞膜外表面的GFRα，信号不能通过细胞膜；另一部分通过跨膜的酪氨酸激酶Ret蛋白，信号得以传递。GDNF受体α目前已知有4种亚型，分别为GFRα-1～4型。而其中GFRα-1是GDNF最主要的受体。跨膜的Ret蛋白是原癌基因c-ret的编码产物，它属于受体酪氨酸激酶超家族成员，由胞外区、跨膜区和胞内的酪氨酸激酶区构成，能够调节细胞的生长、分化［4］。GDNF与细胞表面的GFRα 结合形成GDNF-GFRα复合体后激活Ret受体［5］，促使细胞内Ret-Shc-Grb2蛋白复合体形成。而后，Ret-Shc-Grb2蛋白复合体激活相关蛋白，从而引起一系列信号传导，发挥其生物学作用。GDNF可能通过的信号传导通路［6-8］：①通过Ras/MAPK通路和PI3K/Akt信息系统刺激神经元的存活、增殖、分化、迁移和轴突的发生、生长。②通过神经营养因子（NTFs）/Src家族蛋白激酶（SFKs）信号通路促进脊髓背根神经元轴突生长。③GDNF通过MEK1/2或者ERK1/2等影响胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的分泌来调节星形胶质细胞的增生。④通过PLC-γ/IP3调控Ca2+释放。最新研究表明［9-10］，GDNF可以不依赖Ret而只通过GFRα-1或者神经细胞黏附因子（neural cell adhesion molecule，NCAM）激活细胞内信号通路。在缺乏Ret蛋白时，GDNF可以通过GFRα-1受体引起促分裂原活化蛋白激酶、磷脂酶C-γ、cAMP反应要素结合蛋白等蛋白磷酸化以及c-fos mRNA的表达［7］而发挥作用。
4 GDNF的生物学功能
4.1 GDNF对帕金森病(PD)的作用
GDNF一直被认为是对多巴胺能神经元具有高特异性、相对专一性的营养因子。GDNF能够保护和恢复轴索损伤或者1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropy-ridine，MPTP)损伤的DA能神经元的功能。研究表明［11］：腺病毒介导的GDNF基因脑内直接转移可阻止6-OHDA诱发的大鼠DA 能神经元进行性变性，在PD保护治疗方面起到重要作用；另外GDNF 直接注入黑质附近也能促进存活DA能神经纤维发芽及功能恢复。经GDNF处理后的纹状体DA能神经元酪氨酸羟化酶免疫活性可以升高。同时GDNF能够阻止或逆转PD动物模型中黑质纹状体DA系统的进行性退变，含有GDNF基因的质粒注射到PD病鼠的纹状体内，可以明显改善大鼠的功能［12］。因此GDNF是迄今为止所鉴定出的对中脑DA能神经元神经营养作用最强大的营养因子之一。
4.2 GDNF在脑缺血中的作用
在大鼠大脑中动脉闭塞模型中，缺血可诱导GDNF mRNA蛋白表达，且反应性星形胶质细胞可分泌GDNF。大脑缺血可以使GFRα-1、GFRα-2表达上升。短暂结扎大鼠大脑中动脉后检测到GDNF受体GFRα-1和Ret的表达，GFRα-1和Ret表达与同样条件下GDNF的诱导表达相关。所有研究均表明GDNF系统在脑缺血/再灌注损伤中被激活，从而发挥着内源性的神经保护作用。GDNF可能通过以下途径对缺血起到保护作用：①对于脑缺血后脑内微环境的研究提示，神经营养因子不仅可促进神经系统发育，还对脑损伤的修复起重要作用，其能够促进多种神经元的存活和分化，促进骨髓基质干细胞向神经元转化［13-14］。GDNF可以抑制一氧化氮合酶（NOS）活性，减少缺血激活NO本身诱导的毒性反应。导入GDNF重组腺病毒可以提高受损神经元的存活率。②抑制细胞凋亡。凋亡是细胞程序性自杀，凋亡的调节受到凋亡相关蛋白Bcl-2基因家族的控制，Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的重要成员，Bcl-2是抗凋亡基因，而Bax是促凋亡基因，二者比例决定着细胞的命运。Yu等［15］在短暂性前脑缺血模型中用GDNF预处理后，死亡的神经元数明显减少，证明GDNF可以通过抑制caspase-3的活性而并不是caspase-1途径抑制缺血刺激后星形胶质细胞的凋亡。有研究发现Par-4与神经细胞的凋亡密切相关，实验表明应用GDNF可以通过抑制Par-4的表达从而抑制神经细胞的凋亡［16］。此外，GDNF可以增强内源性神经干细胞（NSCs）增殖和分化［13-14］。Chen等［17］发现加入重组人类GDNF(rhGDNF)后，存活神经元数目明显增加， 呈现显著的神经保护作用。Gomes等［18］的研究也揭示了GDNF可以抑制谷氨酸受体NMAD，从而降低其毒性反应。以上途径均可以减少神经元的凋亡，同时促进神经元恢复。将GDNF目的基因与相关载体在体外连接形成的重组DNA分子转染至人骨髓间充质干细胞（hMSCs），通过静脉将其输注到体内，成为卒中治疗的新策略。③抑制星形胶质细胞过度增生。星形胶质细胞在神经系统发育、突触传递、神经组织修复与再生、神经免疫以及多种神经疾病的病理机制等方面起着十分重要的作用。在脑缺血缺氧发生后，胶质细胞在缺血区反应性的增生，一方面可以对神经元有一定的保护作用；另一方面，由于胶质细胞的过度增生引起胶质化，形成胶质瘢痕影响神经元的修复。Fukuda等［19］的研究表明GDNF可以部分抑制细胞周期蛋白，从而阻止细胞增生进程。研究指出NCAM成为GDNF的受体，Krushel等［20］研究表明NCAM无论在体内还是体外的实验中都可以抑制星形胶质细胞增生，是否二者有一定的相关性需要进一步探究。这与1993年Lin等［1］发现中脑培养物中加入GDNF后星形胶质细胞的密度并没有增加，其GFAP的表达也没有增加部分吻合。最近的研究还表明阻断P2Y1受体可以抑制GFAP的表达，但是同时可以促进GDNF的生成。这将为后续GDNF对细胞增生抑制的研究提供基础。④抑制钙超载。脑缺血后因为短时间内ATP即可耗尽，细胞膜Ca2+泵因此受到破坏，Ca2+平衡失调，Ca2+内流从而形成钙超载。进一步激活蛋白酶，破坏细胞膜和线粒体，导致细胞死亡。与此同时，一个细胞内游离钙的升高能够在相邻的细胞间传播，使周围的细胞胞内游离钙亦升高，形成细胞间钙波（interceellular calcium waves）。复杂的钙离子信号与星形胶质细胞钙波的存在给这些细胞提供了易兴奋的环境。缝隙连接介导的钙波传导参与了抑制性扩散（SP）的形成，引起了其周围的神经元细胞内钙的升高，使其去极化，激活的星形胶质细胞与神经元释放K+和谷氨酸，K+和谷氨酸则促进神经元与星形胶质细胞内钙的进一步升高，这一正反馈形成了SP的连续不衰减的传导。有实验证明，GDNF参与细胞内Ca2+稳态的调节，影响细胞膜Ca2+通道蛋白的表达，减少Ca2+内流和自由基引起的损伤，可以对神经元起到营养和保护作用。体外的实验也表明，在缺血的海马中加入GDNF能够有效地降低谷氨酸引起的Ca2+升高，对海马隔区及皮质神经元Ca2+的升高有抑制作用。
4.3 GDNF对运动神经元的作用
GDNF是一种运动神经营养因子，GDNF对发育或者成熟的运动神经元有神经营养活性，是目前发现的神经营养因子中作用最强的，其不仅能够促进正常运动神经元的存活，降低自然发生的细胞死亡，还能够阻止运动神经元的退行性病变，对轴突损伤后神经元胞体有保护作用，对已经受损的运动神经元有营养作用［21］。其功能目前考虑部分与GDNF能够阻止运动神经乙酰胆碱转移酶活性下降的因素有关。外源性的GDNF能够支持新生鼠面神经元横断后的存活，GDNF可以完全阻止新生小鼠脊髓运动神经元横断造成的运动神经元死亡和幸存的运动神经元的萎缩。研究发现在含有脑和脊髓运动神经元的培养液中加入GDNF基因转染载体细胞，可以延长这些运动神经元轴索的长度，减少正常凋亡。
4.4 GDNF对神经性疼痛和感觉纤维再生的作用
神经病理性疼痛是指由中枢或周围神经系统损伤或疾病引起的疼痛综合征，目前其发生机制尚未完全清楚，正越来越受到医学界的重视，如何更好地控制疼痛的发作成为研究的重点。虽然临床上已经采用了多种药物混合治疗和其他的镇痛手段，但疗效却并不十分理想。近来研究表明，GDNF对初级传入神经元具有营养和促进再生作用，而且与脊髓背角的伤害性感觉形成有关，因此与神经病理性疼痛有着密切的联系［22］。这为疼痛的治疗提供了一个新的平台。GDNF在缺血损伤后能减轻损伤部位炎症细胞的聚集，从而减少了损伤引起的后角Ⅳ～Ⅷ板层神经元丢失并提高了突触素的表达［23-24］。有研究显示GDNF在大鼠坐骨神经结扎(chronic congtriction injury，CCI)疼痛模型实验中具有明显的镇痛作用［25］。Boucher等［26］将大鼠的一侧坐骨神经或腰部脊神经结扎后使用GDNF，结果显示GDNF可预防神经痛，同时发现手术前后给予GDNF均可逆转手术所引起的感觉异常，考虑GDNF可能通过阻止了神经病理性疼痛时河豚毒素敏感型钠通道的过度表达而发挥作用。GDNF可以促进纤维生长并具有保护作用，从而可以促进感觉纤维的再生。在对大鼠面神经切断的动物模型的研究中发现，应用GDNF后有髓神经纤维长入8 mm长的神经断裂缺损沟。
4.5 GDNF对癫疒间的作用
局部神经元同步化的异常放电是癫疒间发病的重要机制，目前有证据表明在神经元间、神经元与星形胶质细胞间都存在缝隙连接，而缝隙连接是钙信号传导的主要通路之一。在癫疒间的发生中，钙波的传导起到明显的作用，同时在慢性癫疒间模型中可以看到星形胶质细胞普遍增生，有文献表明GFRα-2受体也是GDNF的受体之一，而GFRα-2受体敲除小鼠又可以明显减少癫疒间的发作。更好地调控胶质细胞增生，调控钙信号从而控制癫疒间发作成为治疗的一个方向。研究报道GDNF基因治疗可以明显控制癫疒间发作［27］。这使GDNF将来用于治疗癫疒间成为可能，有望为临床带来更好的治疗前景。
5 问题与展望
GDNF作为近年来发现的一种新的广谱、高效能的神经营养因子，临床应用还不是很完善，对于其作用途径还需要进一步探究。大脑是人的高级中枢，脑血管疾病目前已经成为第一位致死致残疾病，脑血管病的二级预防尤为重要，如何使难以透过血脑屏障的GDNF进入脑内，如何更好地调控GDNF蛋白及其受体的分泌和高表达，从而发挥其保护作用成为目前研究的热点及重点。随着对亚低温的深入研究，许多研究已证实亚低温对缺血/再灌注损伤后脑组织具有明显的保护作用［28-29］，亚低温是否可以调控GDNF分泌以及受体的表达从而在中枢、周围神经系统疾病以及其他临床疾病的治疗中更好地发挥作用，仍需要进一步的探讨与研究。
参考文献
［1］Lin LF， Doherty DH， Lile JD， et al. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons ［J］. Science， 1993， 260(5111): 1130-1132.
［2］Woodbury D， Schaar DG， Ramakrishnan L，et al. Novel structure of the human GDNF gene ［J］.Brain Res， 1998， 803(1-2):95-104.
［3］Rémy S， Naveilhan P， Brachet P，et al. Differential regulation of GDNF， neurturin， and their receptors in primary cultures of rat glial cells ［J］. J Neurosci Res， 2001， 64(3):242-251.
［4］Forrest SL， Keast JR. Expression of receptors for glial cell line-derived neurotrophic factor family ligands in sacral spinal cord reveals separate targets of pelvic afferent fibers ［J］. J Comp Neurol，2008， 506(6): 989-1002.
［5］Paratcha G， Ledda F. GDNF and GFRalpha: a versatile molecular complex for developing neurons ［J］. Trends Neurosci， 2008， 31(8): 384-391.
［6］Maeda K， Murakami H， Yoshida R， et al. Biochemical and biological responses induced by coupling of Gab1 to phosphatidylinositol 3-kinase in RET-expressing cells ［J］. Biochem Biophys Res Commun，2004，323(1):345-354.
［7］He Z， Jiang J， Kokkinaki M， et al. Gdnf upregulates c-Fos transcription via the Ras/Erk1/2 pathway to promote mouse spermatogonial stem cell proliferation ［J］. Stem Cells，2008，26(1):266-278.
［8］Paveliev M， Lume M， Velthut A， et al. Neurotrophic factors switch between two signaling pathways that trigger axonal growth ［J］. J Cell Sci， 2007， 120(Pt15)：2507-2516.
［9］Cao JP， Wang HJ， Yu JK， et al. Involvement of NCAM in the effects of GDNF on the neurite outgrowth in the dopamine neurons ［J］. Neurosci Res，2008，61(4):390-397.
［10］Paratcha G， Ledda F， Ibanez CF， et al. The neural cell adhesion molecule NCAM is an alternative signaling receptor for GDNF family ligands ［J］. Cell，2003，113(7): 867-879.
［11］Andereggen L， Meyer M， Guzman R，et al. Effects of GDNF pretreatment on function and survival of transplanted fetal ventral mesencephalic cells in the 6-OHDA rat model of Parkinson′s disease ［J］. Brain Res， 2009， 1276:39-49.
［12］Salvatore MF， Gerhardt GA， Dayton RD，et al. Bilateral effects of unilateral GDNF administration on dopamine- and GABA-regulating proteins in the rat nigrostriatal system ［J］. Exp Neurol，2009，219(1):197-207.
［13］李云涛，晋光荣，徐汉荣，等. GDNF对局灶性脑缺血大鼠SVZ和SGZ细胞增殖及学习记忆的影响［J］. 中风与神经疾病杂志， 2005， 22(2):111-114.
［14］晋光荣，李云涛，刘俊华，等. GDNF对局灶性脑缺血MRI及皮质和尾壳核神经干细胞增殖和分化的影响［J］.神经解剖学杂志， 2006， 22（5）: 499-506.
［15］Yu AC， Liu RY， Zhang Y，et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor protects astrocytes from staurosporine- and ischemia- induced apoptosis ［J］. J Neurosci Res，2007，85(15):3457-3464.
［16］EL-Guendy N， Rangnekar VM. Apoptosis by Par-4 in cancer and neurodegenerative diseases ［J］. Exp Cell Res， 2003， 283(1): 51-66.
［17］Chen B， Gao XQ， Yang CX， et al. Neuroprotective effect of grafting GDNF gene-modified neural stem cells on cerebral ischemia in rats ［J］. Brain Res， 2009， 1284:1-11.
［18］Gomes CA， Simes PF， Canas PM， et al. GDNF control of the glutamatergic cortico-striatal pathway requires tonic activation of adenosine A receptors ［J］. J Neurochem，2009，108(5):1208-1219.
［19］Fukuda T， Asai N， Enomoto A，et al. Activation of c-Jun amino-terminal kinase by GDNF induces G2/M cell cycle delay linked with actin reorganization ［J］. Genes Cells，2005，10(7):655-663.
［20］Krushel LA， Tai MH， Cunningham BA， et al. Neural cell adhesion molecule (N-CAM) domains and intracellular signaling pathways involved in the inhibition of astrocyte proliferation ［J］. Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(5):2592-2596.
［21］Zamburlin P， Gilardino A， Dalmazzo S，et al. Temporal dynamics of neurite outgrowth promoted by basic fibroblast growth factor in chick ciliary ganglia ［J］. J Neurosci Res，2006，84(3):505-514.
［22］Adler JE， Nico L， VandeVord P，et al. Modulation of neuropathic pain by a glial-derived factor ［J］. Pain Med， 2009， 10(7): 1229-1236.
［23］van Adel BA， Kostic C， Déglon N，et al. Delivery of ciliary neurotrophic factor via lentiviral-mediated transfer protects axotomized retinal ganglion cells for an extended period of time ［J］. Hum Gene Ther，2003，14(2):103-115.
［24］Liu S， Bohl D， Blanchard S，et al. Combination of microsurgery and gene therapy for spinal dorsal root injury repair ［J］. Mol Ther，2009，17(6):992-1002.
［25］Sakai A， Asada M， Seno N， et al. Involvement of neural cell adhesion molecule signaling in glial cell line-derived neurotrophic factor-induced analgesia in a rat model of neuropathic pain ［J］. Pain， 2008， 137(2): 378-388.
［26］Boucher TJ， Okuse K， Bennett DL，et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states ［J］. Science， 2000， 290(5489): 124-127.
［27］Kanter-Schlifke I， Georgievska B， Kirik D，et al. Seizure suppression by GDNF gene therapy in animal models of epilepsy ［J］. Mol Ther， 2007， 15(6): 1106-1113.
篇10
大量事实证明,癌症患者生命期不仅取决于病情和医疗措施,而且与患者自身的精神状态密切相关。调查结果表明:癌症患者确诊后产生否认、多疑、紧张、悲观、恐惧、绝望等负性情绪,对机体免疫功能有明显的抑制作用,严重影响生存率和生活质量。所以心理护理对癌症患者非常重要,也是整体护理的核心内容,心理护理质量的高低决定着护理质量的高低。和蔼的态度、精湛的技术、强烈的责任心是心理护理的基础。护士要尽可能和患者建立起良好的护患关系,为患者创造温馨舒适的生活环境,解开患者的心结医学|教育网搜集,激发患者生存欲望,使他们走出心理阴霾,树立和医护人员紧密配合的心理认同感。由于患者的思维层次、沟通意愿和对肿瘤认识存在的差异,实现与他们的心灵沟通,护士要有高度的同情心,理解患者的心理活动规律,运用一定的技巧,根据患者情况采用相应的方法。有移情法、暗示法、开导法、集体心理治疗等。要因人而异,有的放矢。
2、癌症饮食护理
由于癌症导致患者代谢紊乱、负氮平衡,免疫力低下,白细胞减少,脱发等,最终成为恶病质。因此对患者进行饮食护理,改善营养状况十分必要。护士要采取各种方法鼓励患者进食,经常更换食谱,变化烹调方式,注意色、香、味的调配,给予高热量、高蛋白,少油腻、易消化的清淡饮食,医学教|育网搜集少食多餐。每天摄入新鲜蔬菜水果,以提高食欲,补充微量营养素,对进行放、化疗的患者,要常吃动物肝脏、猪血、瘦肉、黑芝麻,莲子、大枣、枸杞子、桂圆等,以维持正常的血细胞数量和功能;建议多进食含钾高的水果,如苷橘、香蕉等,同时忌烟酒、浓茶、咖啡及粗糙的食物;如果出现咽喉有灼热感,口干,吞咽困难等口腔粘膜反应,应给患者经常漱口,保持口腔湿润,食物制成肉汁、肉汤一起进食,有助于吞咽,从而提高患者的进食量。尽力创造干净、舒适、清洁的病房进食环境。
3、癌症姑息护理
姑息护理是新兴的学科,是对根治性治疗无反应的患者积极的整体关怀护理,即通过早期识别、积极评估、控制疼痛和治疗其他痛苦症状,摆脱躯体、心理、社会和宗教的困扰,从而改变患者及亲人的生活质量。姑息护理强调四全服务,即全人、全家、全程、全队。通过团队的方法提供整体护理,把患者、家属作为照护单元。不主张实施可能给患者增添痛苦和无意义的治疗或过度治疗,强调减轻痛苦,让患者平静、安然、有尊严地离开人世,即优化生命末端质量。
姑息护理的基本内容有:
①控制症状,特别是控制疼痛,包括PCA技术,WHO推荐癌症镇痛三阶梯止痛法,药物阻滞,放射治疗,基因治疗等。
②支持患者,让患者参与决策,尊重其自。告知病情及进程,与患者商量护理计划,及时反馈治疗效果,提供必要的信息来源和社会支持。
③支持家属,姑息护理视患者和家属为整体。患者亲属存在迁就、绝望、厌烦、疑虑、恐惧死亡的心理,护士应同情和理解他们,耐心倾听他们意见和要求,并指导他们承认现实,从容应对,在患者面前保持良好心态。
④死亡教育:要让患者清楚,死亡是人生发展的必然结果,从某种意义上讲,死亡是痛苦的自然解脱方式。面对死亡,不要惋惜,要顺其自然,更无须后顾之忧,亲人自会平安生活,未尽事业后继有人,让患者达到“生如春之灿烂,死如秋之静美”的境界.
4、癌症音乐护理
音乐作为一种非语言性沟通手段,常常在进入人的深层意识时,能优于单纯于运用语言治疗的方法,起到普通心理疗法达不到的效果。不同乐曲作用于人的感觉器官,产生镇静情绪、改善睡眠、增进食欲、缓解疼痛等不同作用。
音乐护理的方法:
①音乐演奏法:由患者自己演奏音乐,以达到充分散发压力和感情的目的。也可以组合演奏。
②音乐欣赏法:护士根据情况安排一定的时间听音乐或播放歌曲。患者通过听觉、视觉等欣赏音乐,用音乐本身具有的内在涵义及魅力帮助患者康复。
音乐对癌症患者生活质量有较好的干预作用。李桂兰等报道:音乐疗法有助于癌症患者情绪稳定,减轻其在化疗过程中产生的焦虑、恐惧等不良心理反应,提高机体的自我调节能力。万永慧等?认为:音乐疗法可减少癌症患者的状态焦虑和特质焦虑,是一种受患者欢迎的辅助治疗方法。王保胜等研究结果表明:音乐疗法可较快改善癌症患者的焦虑、抑郁的心理状态,对患者有镇静、镇痛作用,并能减轻因放疗引起的恶心、乏力等症状。
5、癌症疼痛护理
据报道每天有350万以上的癌症患者有疼痛症状,晚期癌症患者70%左右以疼痛为主诉,其中5O%属于剧烈疼痛,对患者生存产生极大负面影响。近年来,国内外控制疼痛的方法不断发展及完善。
大家普遍认为,护士首先要掌握癌性疼痛的分级标准,英国的Weng—Baker面部表情量表,采用六种面部表情,从微笑到悲伤甚至哭泣来表达疼痛的程度,各年龄组从三岁至很虚弱的老人,该方法经大量使用后,都肯定了其实用性和合理性疼痛护理方法包括:①建立家庭式病室,给患者创造一个良好的环境,病室的布置要安静整洁,优美温馨。②建立良好的护患关系,护士要做到语言文明,医学教|育网搜集举止端庄,操作熟练,以取得患者的信任,使患者敢于面对现实,积极配合治疗,顽强地与疼痛作斗争。③药物止痛,在止痛药的应用上要有长期安排,打破按需给药的旧观念,采用分阶段复合给药方式,使疼痛在尚未开始或刚开始便得到控制,保证药物在体内维持一定浓度,这样不仅能避免剂量的逐渐增大,还可减少患者对疼痛的恐惧感。④其他方法:包括患者的自我控制止痛法(PCA)、药物阻滞,破坏神经痛觉通路法及神经外科手术方法等。
护士要掌握患者疼痛的信息,正确评估疼痛的程度,根据患者不同情况,做出及时有效的处理。
6、癌症社会支持护理
社会支持指来自家庭、亲属、同事、工会等社会各方面所给予的精神、物质上的帮助和支援。社会支持能促使患者使用更多的积极应对策略,提高患者免疫力和适应,减轻心身症状。癌症的诊断使几乎所有的患者产生适应困难,他们需要来自多方面的支持医学教|育网搜集。护士有责任做好这方面的工作,为患者提供社会支持的有效途径,调动有效的社会支持来源,指导患者积极寻求支持,让患者有心理归属感。在癌症护理中向患者提供有效的社会支持可以通过以下途径。
①学习有关社会支持及其与心身健康关系的知识,掌握有关社会支持及其与心身健康关系的知识是护士提供支持的前提。
②熟悉对社会支持进行评定的手段,护士通过观察、访谈,了解患者社会支持及其变化,护士还要使用社会支持问卷等专门的测评工具,以便更为精确地对患者的社会支持进行定量。
③使用支持、表达式心理治疗,护士本身就是患者的十分重要的社会支持来源。护士通过劝导、启发、鼓励、支持、解释、积极暗示、提供保证等,让患者发泄消极情绪,树立战胜疾病的信心,感受社会支持的强大力量。
④加强患者间的互相支持,护士在病房创建一种积极的气氛,让患者受到正性的影响。同时护士应主动地获得有关康复患者的资料,用典型事例,现身说法,使自己的说教更有说服力和权威性。
