分子遗传学综述范文

导语：如何才能写好一篇分子遗传学综述，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

关键词：动物遗传学 动物科学 遗传检测 细胞遗传学 分子遗传学

中图分类号：G642.0 文献标识码：C DOI：10.3969/j.issn.1672-8181.2013.23.150

动物遗传学是动物科学专业的重要专业基础课程。遗传学具有基础理论抽象、逻辑思维强、知识面涵盖广等特点，是动物育种的理论基础。遗传学的基本概念和原理来自于生产、生活和科学研究的实践，遗传学实验是遗传学教学中重要的环节，是理论教学的深化和补充。近些年，随着遗传学的不断发展，取得了很多的进展，特别是随着分子生物学的发展，遗传学进入了全新的分子遗传学时代，较之之前的形态遗传学、细胞遗传学而言，分子遗传学更为抽象，因此，长期沿用下来的经典遗传学实验显然已经不能满足遗传学快速发展的需求，从而对遗传学相关实验课提出了更高的要求。

针对以上情况，结合我校动物科学专业设置的实际情况，经过长期的摸索和创新，我校动物科学学院近年来开始开设了实用遗传检测技术课程，学时120学时。主要通过实验制备和观察，使学生从细胞、分子及群体水平上掌握遗传学的实验操作方法；学会基本仪器设备的使用技巧；了解遗传学研究方法和手段，进一步加强学生独立分析问题和解决问题的能力，独立操作和创新能力及培养学生的动手能力。同时注意培养学生实事求是，严肃认真的科学操作和良好的实验习惯，为今后的工作和研究打下良好基础。本文将就本课程的设置进行综述，旨在为相关学科今后在遗传学相关实验课程的开设方面提供借鉴。

1 细胞遗传学篇

细胞遗传学是研究细胞中染色体遗传规律的学科。 同时也是在细胞层次上进行遗传学研究的遗传学分支学科。着重研究细胞中染色体的起源、组成、变化、行为和传递等机制及其生物学效应。

围绕细胞遗传学，设立了如下实验项目：①细胞培养。主要讲解细胞的体外培养原理、条件、技巧和注意事项。主要通过采集动物外周血培养2个周期，用以观察培养细胞在体外分裂情况；②培养细胞的同步化处理。主要讲解在体外培养条件下同步化处理的原理、条件、技巧和注意事项。处理培养细胞分裂中期同步化；③外周血淋巴细胞染色体标本制作。主要包括以下过程：收集细胞低渗处理固定涂片染色观察；④骨髓细胞染色体标本的制备。主要包括以下过程：秋水仙素处理取管状骨冲取骨髓细胞低渗处理固定涂片染色观察；⑤果蝇唾液腺染色体标本的制备。主要包括以下过程：培养果蝇三龄幼虫解剖分离唾液腺水解处理染色压片观察；⑥染色体显G带。主要包括以下过程：制备染色体标本片胰蛋白酶处理染色观察；⑦各种显微镜的调试实用实践。主要包括熟悉普通研究显微镜，相差显微镜，暗场显微镜，荧光显微镜的光路合轴、聚光器调焦、滤镜选用等操作；⑧染色体标本的观察照相。主要包括以下过程：显微镜下观察制备好的染色体标本片统计分裂相的比例数细胞染色体数选形态良好数目占众数的分裂相拍照；⑨染色体核型分析。主要包括以下过程：染色体照片photoshop软件裁剪整理同源染色体配对排序测染色体臂长计算相对长度和臂比。

2 分子遗传学篇

随着遗传学的迅猛发展，分子遗传学已经渗透到了遗传学的各个角度，分子遗传学也因此在教学中已经占有了相当大的比重。分子遗传学实验技术也成为研究者使用得最多的分析手段，这就进一步要求我们的实验教学也要适应遗传学的发展。

围绕分子遗传学，设立了如下实验项目：①动物组织（肌肉）中DNA的提取。主要包括以下过程：采集动物组织材料破坏细胞膜和核膜白和DNA分离抽提纯化DNA乙醇沉淀DNA检测DNA纯度和量；②动物性别鉴定。主要包括以下过程：提取动物组织DNAsry特异引物PCR扩增电泳判断；③DNA酶切电泳。主要包括以下过程：λDNA限制性内切酶酶切琼脂糖凝胶电泳检测；④动物来源物种鉴定。主要包括以下过程：样品采集基因组DNA提取PCR-RFLP琼脂糖凝胶电泳检测判断；⑤动物组织总RNA的提取。主要包括以下过程：样品采集RNA提取琼脂糖凝胶电泳检测；⑥Total RNA质量的检测及cDNA的制备。主要包括以下过程：紫外分光光度计检测Total RNA质量反转录cDNA检测；⑦microRNA指纹图谱技术（MTFP）在肉品质检测中的应用。主要包括以下过程：样品采集总RNA提取及检测cDNA的制备及检测PCR反应及检测PAGE电泳检测和分析；⑧PCR-RFLP鉴定ABO基因型。主要包括以下过程：毛囊（毛发）中总DNA的提取及电泳检测糖基转移酶基因片段扩增及电泳检测扩增片段限制性酶切及电泳检测。

遗传学是研究生物遗传和变异的科学。随着现代生物科学技术的发展，遗传学已成为生命科学领域中发展最为迅速的基础学科之一，而实验实践教学环节为培养学生的科学思维、探索思维和实践创新能力提供重要途径，并且可以提高学生的实际动手能力和分析问题、解决问题的能力。遗传学实验技术和方法是遗传学建立和发展的基础，如今现代的遗传学实验技术已广泛渗透到生命科学的各个分支领域，并正在发挥其独特的作用。本文通过数名长期工作在遗传学本科教学一线的教师多年的教学实践经验，结合动物科学专业设置的特色，摸索了一套适合动物科学专业本科生实际的实验课教学体系，旨在为培养理论与实践兼备的高素质动物科学方向的本科生做出一定的贡献，也期望为国内同行遗传学教学相关实验课的开设提供一定的借鉴作用。

参考文献：

[1]郭玉华，曹敏建，曹秀云等.农业高校遗传课印证实践教学的新探索[J].高等农业教育，2003，（6）：73-75.

[2]李婉涛，王文静.遗传学教学中学生创新能力的培养[J].高等农业教育，2003，（6）：61-62.

[3]易乐飞，王萍，程汉良等.遗传学实验教学改革与创新型人才培养[J].中国现代教育装备，2011，（3）：93-94.

[4]闫绍鹏，王秋玉，王晶英.遗传学实验教学改革的思考与实践[J].实验室研究与探索，2010，29（7）：275-277.

[5]杨友才，刘目前，王水莲.加强实践教学，提高人才培养质量[J].高等农业教育，2003，（4）：81-83.

[6]任大明，吕淑霞，张立军等.改革生物技术专业实验课教学模式的探索与实践[J].高等农业教育，2003，（5）：60-61.

作者简介：苏蕊，内蒙古农业大学动科院，内蒙古呼和浩特 010018

张燕军，内蒙古农业大学动科院，内蒙古呼和浩特 010018

篇2

【关键词】胃癌；分型；进展

胃癌是消化系统的常见恶性肿瘤，为全世界范围内发病率最高的癌症之一，根据世界卫生组织癌症研究中心2002年的统计，我国胃癌发病率仅次于日本，位于全球第2位。2007年中国肿瘤登记提示：我国胃癌的发病居第二位，仅次于肺癌，死亡据第三位，仅次于肺癌、肝癌。胃癌在演进过程中随着附加的基因突变会产生不同的亚克隆，使其不断异质化导致其侵袭和转移能力不断加强，而这是胃癌治疗困难和致死的主要原因。国内外学者都在寻求能指导临床方案选择及判断预后的胃癌分型，传统的癌症诊断对病理学依赖性较大，有时会因为肿瘤的不典型或临床信息的不完整而造成诊断困难。应用基因分析技术所产生的信息，特别是应用高通量芯片技术所产生的信息可以为胃癌分型提供更多的参考，因此对目前胃癌相关的分型予以综述。

1 胃癌的传统分型

胃癌病理分型是以组织形态结构和细胞生物学特性为基础，不同类型的胃癌，其形态结构和生物学行为各异，流行病学和分子机制亦不同，以致现有的胃癌分型系统众多。目前，常用的是WHO型、Lauren分型，大体分型主要使用Borrmann分型。

1.1 WHO胃癌包括以下常见组织学类型

状腺癌、管状腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌、腺鳞癌、鳞癌、小细胞癌、未分化癌。此外，胃内还可以发生类癌。WHO分型将Lauren分型的肠型、弥漫型纳入腺癌之下。其管状腺癌还可进一步分成高分化、中分化与低分化腺癌。少见类型或特殊类型胃癌有：实体型变异、肉瘤样变异等。

1.2 1923年德国病理学家Borrmann提出的一种胃癌大体形态分型方法，此分型主要根据癌瘤在黏膜面的形态特征和在胃壁内的浸润方式进行分类，将胃癌分为4型：Ⅰ型（结节型），II型（溃疡局限型），III型（浸润溃疡型），是最常见的类型，约占50%。Ⅳ型（弥漫浸润型），由于癌细胞弥漫浸润及纤维组织增生，胃壁呈广泛增厚变硬，称“革囊胃”。Borrmann分型是胃癌经典的分型方法，既能反映胃癌的生物学行为，又简洁实用，国际上广泛采用。

1.3 Lauren分型将胃癌分成两大主要类型，即肠型与弥漫型，当肿瘤内两种类型成分相当时就称为混合型。胃癌发生是一个多步骤的过程，弥漫型和肠型在肿瘤发生各个阶段会产生多种基因及表观遗传学方面的变异。常见的包括抑癌基因的点突变和杂合性丢失，常见的表观遗传学异常包括CPG岛的甲基化引起的肿瘤抑制基因沉默和肿瘤促进基因转录水平的增高。

2 胃癌分型与分子病理学

胃癌分型研究的意义在于探索其是否对判断预后有价值或者对于今后的治疗有指导意义。当前，国内张树华采用组织病理与组织化学和免疫组织化学技术相结合的方法，兼顾宿主的免疫防御反应，把胃癌分为两型：限制生长型和促进生长型。限制生长型预后较促进生长型好。

根据黏蛋白标记的差异，胃癌组织被分为4型：1）胃型：胃型黏蛋白标记的胃癌细胞>10%；2）胃肠型：胃型黏蛋白标记的胃癌细胞> 10%且肠型黏蛋白标记的胃癌细胞>10%；3）肠型：肠型黏蛋白标记的胃癌细胞>10%；4）未分类：胃肠黏蛋白标记的细胃癌细胞

Solcia等对对294例平均随访时间长达150个月的胃癌进行研究显示，如果将胃癌的组织学结构、细胞异型性程度、p53基因突变、18q杂合性缺失、微卫星不稳定性以及有无脉管神经浸润等因素与预后综合分析，可以将胃癌恶性程度分成三级。胃癌I级（预后良好型）包括：大量肿瘤内/旁淋巴样细胞反应型、高分化管状腺癌、黏液结节型和促纤维结缔组织增生性弥漫型胃癌，I级胃癌约占全部胃癌病例的37%。胃癌III级（预后不良型）包括：高度异型性胃癌、浸润型黏液腺癌、肿瘤细胞异型性中等但具有p53基因的第7或第8外显子突变、伴有血管淋巴管浸润以及神经浸润者，III级胃癌占全部胃癌病例的19%。其他胃癌则归属于预后中等的胃癌Ⅱ级，占全部胃癌的44%。这一关于胃癌恶性程度评价体系虽然是不依赖于临床分期的胃癌预后判断新标准，但实际操作中涉及到微卫星不稳定性的分子遗传学检测、p53基因突变检测以及EB病毒原位杂交检测等实验技术，在临床普及以及操作流程标准化控制等方面均有待统一。

3 微卫星不稳定性与胃癌分型

微卫星不稳定性[MSI]是胃癌发生过程中的一个常见事件，反应了肿瘤潜在DNA错配修复缺陷，常常由Hmlh1启动子区甲基化引起，胃癌合并MSI者其临床病理因素特别，预后相对良好，胃肠道肿瘤中MSI的测定是最先被广泛利用的预后分子检测之一。MSI的检测常采用荧光定量多重PCR进行，费用相对低，适用性广。以往的很多观察表明，胃癌中MSI的存在不仅仅是与已知的与组织病理特征强关联的分子分型标志，同时MSI能能区分预后良好好亚组。因此Simpson等建议将MSI作为一个有效的分子分型工具。葡萄牙的一项研究表明，胃癌患者并低度MSI五年生产率为30%相比，而高度MSI者则为70%。韩国的一项大型研究也表明在胃癌分期为II、III期的患者MSI与预后良好有关。

4 胃癌的分子分型

以分子特征为基础的新型分类体系即分子分型。高通量的基因分析可以是DNA水平的基因多态性分析、DNA甲基化分析和基因拷贝数分析.也可以是RNA水平的基因表达谱分析、微小RNA表达谱分析和蛋白表达水平的蛋白芯片分析等。

肿瘤分子分型的基础：目前可以在DNA、RNA和蛋白质水平上进行肿瘤分子分型的研究。在DNA水平，可以依据基因突变、基因组的细胞遗传学改变或甲基化差异进行分型。根据基因表达谱（RNA水平）的差异实施分型，是目前分子分型的研究主体，以表达谱芯片为基础的分子分型研究数据处理分二类：一是，unsupervised analysis；二是，supervised analysis。在蛋白质水平，可以根据蛋白质表达谱的差异，亚细胞结构蛋白组成的不同或蛋白质翻译后修饰的改变来进行分型。

分子分型的研究方法主要有：基因表达谱芯片技术：它可以同时观察成千上万个基因在不同个体、不同组织、不同发育阶段的表达状况。它的原理是在已建立的cDNA或寡核苷酸组成的芯片或微陈列上，用不同颜色荧光标记的cDNA制备的探针与之杂交，扫描及计算机处理所得的信号就代表了样品中基因的转录表达情况。基因芯片技术在肿瘤的分子分型、基因功能、信号通路及代谢与调控途径研究等方面有显著的优势；比较基因组杂交（CGH）技术：是在染色体荧光原位杂交基础上发展起来的一种新的分子细胞遗传学研究技术。它主要是用不同的荧光体系来标记肿瘤组织DNA和正常对照DNA，与正常中期分裂象染色体进行竞争性抑制杂交，荧光信号摄取及软件分析所得的比值可判断染色体区段的扩增、缺失还是正常。它仅需少量肿瘤组织DNA即可在整个基因组水平研究不同基因组间DNA拷贝数差异，并将这些异常定位在染色体上。CGH与微芯片技术结合的芯片CGH，以cDNA作为杂交靶，可使得基因组水平遗传物质异常的分辨率达到几十个kb，并可对关键基因改变进行精细定位；蛋白芯片技术：基因突变和基因表达差异不一定导致相应的蛋白表达，而且蛋白质还存在磷酸化，乙酰化等复杂的翻译后修饰过程，这些改变在转录水平上是无法检测的。以高通量结合生物信息学为特点的蛋白质组学分析技术可以从细胞整体水平上检测到这种变化，为肿瘤分子分型以及治疗标志物的筛选带来巨大的便利与可能。蛋白芯片技术主要包括双向凝胶电泳技术、质谱技术以及生物信息学技术。

篇3

随着对白血病发病机制的深入研究及其治疗方案的改进,白血病的完全缓解率也有明显的提高,但仍有一部分患者最终会复发。近年来的研究发现, 白血病的复发与微小残留病密切相关。微小残留病(minimal residual disease, MRD )是指经过诱导治疗达临床缓解时，白血病患者体内残留的少量白血病细胞。对患者进行微小残留病监测对白血病的治疗和预后判断具有非常重要的意义。检测MRD的关键是寻找分子基因标志。细胞免疫表型及遗传学的异常改变在急性白血病MRD 检测中占有重要地位。令人遗憾的是，这些方法只适用于少数患者，大多数患者并不具备遗传学的预后指标。随着对急性白血病分子生物学发病机制研究的进步，人们把急性白血病的发生归结为抑癌基因和原癌基因通过遗传学和表观遗传学机制的发生异常改变［1］。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传调控机制，其与肿瘤发生、发展以及检测相关机制的研究逐步成为研究的热点。表观遗传学生物标记（Epigenetic biomarkers），特别是DNA 甲基化相关标记检测拥有遗传学标记、抗体等标志不具备的优势。本文就MRD细胞分子遗传学的检测方法及DNA甲基化检测MRD的临床应用进行综述。

1 常用白血病MRD检测方法的研究进展

1.1 分子生物学方法：遗传学的改变，包括染色体易位/缺失、基因突变等是白血病发生的基础，其所导致的正常基因表达调控紊乱和功能异常是白血病发生的主要原因。异常的遗传学改变，已成为急性白血病临床检验资料的重要组成部分。

实时定量聚合酶链反应( RQ-PCR ) 方法结合了PCR和荧光探针两种技术，通过定量检测白血病细胞中标志性基因实时观测MRD，是目前检测MRD最为敏感的方法，灵敏度可达10-4-10-5，已成为临床实验室建立MRD检测方法的首选。其检测的基因标志包括：（1）染色体异位形成的融合基因。如t(9:22), t(15;17),inv(16), and t(8;21)，T 细胞受体（T-cell receptor ，TCR）重排等，常见的融合基因包括: TEL /AML1、BCR /ABL、E2A /PBX1、MLL /AF4等。（2）在白血病中表达增高的肿瘤基因(如PRAME、 WTI 、PRAME、NPM1、STC- 1 等基因。（3）发生突变的基因(如FLT3 /ITD)。融合基因直接反映了白血病的病理特征,他在疾病发展过程中比较稳定,以其作为PCR检测MRD的分子标志具有特异性强、敏感度高的优点［2］。但是这些检查不仅价格昂贵，其检测的标本为RNA，存在不易保存，结果不稳定的缺点。更令人遗憾的是,由于白血病是一组异质性很大的恶性血液病，各亚型之间遗传背景不同，这些遗传学基因标志只能覆盖1/3的白血病类型，还有2/3类型的白血病不具备遗传学基因标志，无法在临床上进行MRD的检测。即使联合应用多种基因仍有40%～50%的患者无法找到适当的基因标志检测MRD，使其疾病状态缺乏准确的判断依据。

1.2流式细胞术( FCM)：FCM是通过检测在正常细胞上不表达或低表达而在白血病细胞上表达或高表达的白血病相关免疫表型来定量检测MRD，能够准确定量残留白血病细胞数，并且还能了解残留白血病细胞的凋亡情况［3］。其优势是每秒可检测5 000～10 000个细胞,并能用计算机记录处理,快速地对各个细胞进行多参数定量分析,灵敏度达到10- 4。但应用此法必须要对患者初发时的免疫表型特征有详尽了解,以便选择适当的标志检测MRD。因为白血病细胞与正常细胞相比, 通常低达10- 5～10- 6, 可能低于FCM检测范围而使这种方法缺乏特异性; 而且随着病程发展, 细胞表面的抗原发生改变, 会导致假阴性结果。

2 异常DNA甲基化检测白血病MRD的临床研究进展

DNA甲基化是指在DNA序列不变的情况下，通过影响基因转录活性以调控基因的表达。DNA甲基化作为一种表观遗传学改变与白血病的发生密切相关，在不改变遗传信息的前提下导致细胞遗传特性改变，作为肿瘤性疾病"二次打击"经典假说的重要补充，已成为白血病研究的新热点。DNA异常高甲基化导致抑癌基因的失活在白血病发生发展、诊断、监测微小残留病、预测病情以及指导治疗方面都有重要作用，这些表观遗传学标志作为MRD监测标志物的临床研究逐渐引起大家的关注。

P15基因甲基化与白血病的关系目前研究最为深入。73%～93%的急性髓系白血病(AML)和57%的急性淋巴细胞白血病(ALL)患者发生p15基因高甲基化，且持续p15基因高甲基化预示疾病复发。与p15基因甲基化患者相比，p15基因非甲基化患者5年DFS明显延长（15% v 62.5%；p＝0.02）［4］。

Au等［5］检测了l7例t-MDS/AMI 患者，l5例存在pl5甲基化。其中5例在发展为治疗相关的t-MDS/AML前即已存在pl5甲基化，最早为两年前。提示pl5甲基化发生在t-MDS/AMI 早期，检测p15甲基化有助于判断预后、指导治疗。在一组65例急性早幼粒细胞白血病的研究中，31例存在p15甲基化的患者5年无病生存率仅为29．64％ ，显著低于34例无甲基化的患者79%。p15基因甲基化与预后不良相关。

Id4和zo-1是我室新发现的两个血液系统相关候选基因，并对其在白血病发生、复发中的作用及应用于MRD检测进行了系列基础与临床研究。

采用MS-PCR的方法对完全缓解期白血病患者骨髓标本检测id4基因甲基化状态，结果发现：（1）58例完全缓解的急性白血病人MRD的检出率为41%，MRD阳性的患者12个月内复发率为62.5%，而非甲基化的患者12个月内复发率仅为10%。（2）16例异基因外周血干细胞移植后的白血病患者中，5例检测到MRD的患者中有4例在1年的随访期出现复发，而11例移植后MRD持续阴性的患者无一例复发。

研究对26例完全缓解的急性白血病患者进行zo-1基因甲基化检测，MRD检出率为34.6%，MRD阳性的患者12个月内复发率为57.1%，而非甲基化的患者12个月内复发率仅为15.4%，MRD阳性病人复发率明显高于阴性者。Id4和zo-1基因甲基化检测可能成为急性白血病新的生物标记用于预测疾病的预后以及复发。

随着PCR 技术的进步，将实时定量PCR（real-time PCR）与MSP 结合提高了甲基化分析检测的特异性和敏感性。高敏感性的甲基化定量PCR为MRD检测开辟了另一种解决方法。甲基化定量水平的变化对于细胞修复、肿瘤预后、肿瘤化疗后的耐药等提供了新的研究指标，可以从另一个层面上揭示其发生机制。因此，甲基化定量PCR技术被应用与临床各领域的研究。

Shuchi等［6］以启动子区高甲基化状态的雌激素受体α（estrogen receptor α;ER-α）和 p15INT4B 基因做为MRD标志，采用定量甲基化特异性PCR对180例急性白血病患者骨髓标本进行检测，结果发现：（1）临床缓解期的AML患者中, ER-α和p15INT4B基因启动子区呈现高甲基化状态的患者较低甲基化状态的患者有更高的复发风险，而且ER-α和p15INT4B基因启动子区甲基化水平的增高与患者无病生存期（disease free survival,DFS）缩短有明显相关性。（2）对5名儿童ALL患者ER-α基因启动子区甲基化程度进行了自诱导缓解后的追踪检测，结果提示疾病复发状态较缓解状态ER-α基因启动子甲基化水平增加。其结果与目前常用的MRD监测标志TCR/免疫球蛋白重排水平结果基本一致。

另一研究以启动子区高甲基化状态的p73、p15、p57KIP2基因为MRD标志，通过对199例Ph染色体和MLL阴性的处于完全缓解状态（complete remission,CR）的成人ALL标本进行定量甲基化特异性PCR检测，研究结果提示p73基因启动子区甲基化水平与第一次CR持续时间及无病生存期（DFS）及总生存期（overall survival, OS）缩短间有显著相关性［7］。因此，特定基因的定量甲基化PCR检测有可能成为一种评估急性白血病复发风险及MRD检测的有效手段。

结语

白血病作为一种恶性肿瘤，复发是影响其患者生存的主要问题。患者体内白血病微量残留病是复发的主要根源，对患者进行微量残留病监测在白血病的治疗和预后判断中具有非常重要的意义。遗憾的是，由于绝大多数患者缺乏明确的遗传标记作为早期检测和准确评估MRD的标志，在临床上常因治疗不足导致疾病复发或治疗过度引起严重并发症，绝大多数患者在发病后1~3年内死亡。因此，要在白血病MRD早期检测和指导治疗上有所突破，就必须寻找能够早期诊断白血病MRD的特异性强、通用性好的分子标志物。DNA 甲基化作为肿瘤相关标记，与遗传学标记、细胞表面抗体等标志具有更多的优势。首先，临床常规的肿瘤标记检测以蛋白或者RNA为对象，必须采集新鲜样本以确定检测结果的准确性。而甲基化检测则以DNA 为样本，很容易从各种体液中，甚至石蜡包埋组织中得到，极大地扩展了研究资源。其次，甲基化以DNA作为研究对象，较RNA 和蛋白更稳定，更容易保存。进而保证了检测结果的可靠性。因此，DNA甲基化定量水平的变化对于肿瘤预后、肿瘤化疗后的耐药等提供了新的研究指标，可以从另一个层面上揭示其发生机制。

参考文献

［1］ KrugU, GanserA, KoefflerHP. Tumor suppressor genes nnormal and m alignant hematopoiesis. Oncogene 2002; 21: 3475-95.

［2］ Mitelman F, Johansson B, Mertens F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nat Rev Cancer, 2007, 7:233-245.

［3］ Szczepaski T, van der Velden VH, van Dongen JJ. Flow-cytometric immunophenotyping of normal and m alignant lymphocytes. Clin Chem Lab Med, 2006, 44: 775-796.

［4］ Teofili L, Martini M, Luongo M, et al. Hypermethylation of CpG islands in the promoter region of p15(INK4b) in acute promyelocytic leukemia represses p15(INK4b) expression and correlates with poor prognosis. Leukemia 2003;17:919-24.

［5］ Christiansen DH, Andersen MK, Pedersen-Bjergaard J. Methylation ofp15INK4B is common, is associated with deletion of genes on chromosome arm 7q and predicts a poor prognosis in therapy-related myelodysplasiaandacute myeloid leukemia. Leukemia 2003;17: 1813-9.

［6］ Shuchi A, Matthias U, Steffen K, et al. DNA Methylation of TumorSuppressor Genes in Clinical Remission Predicts the Relapse Risk in Acute Myeloid Leukemia. Cancer Res 2007 ,Feb,671: 1370-1377.

篇4

关键词基因治疗;治疗方式;发展前景

中图分类号r459.9文献标识码a文章编号 1007-5739(2010)01-0025-01

美国是世界上最早开展基因治疗的国家,也是目前开展基因治疗最多的国家。我国在1991年7月开始基因治疗的临床研究,最早的工作是对b型血友病的基因治疗及利用抑癌基因对癌症的基因治疗[1]。基因治疗目前主要用于治疗对人类健康威胁严重的疾病,包括遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等[2]。

1基因治疗的方式

1.1体内基因治疗

体内基因治疗是指将具有治疗功能的基因直接转入病人的某一特定组织中。利用反转录病毒载体已成功地将真核基因转入动物细胞,但通过质粒dna的直接操作,将更加省时而且产量较高;采用温和病毒载体的体内基因治疗主要是通过腺病毒和单纯疱疹病毒来完成的,即将载有矫正基因的载体直接注射入需要这些基因的组织。以腺病毒为载体的体内疗法在遗传性疾病方面,目前主要见于囊性纤维变性的基因治疗研究。多数研究表明,基因治疗纠正了呼吸道上皮的氯离子转运缺陷,使跨上皮基础电位下降,肺功能有所改善[3]。

1.2反义疗法

反义疗法主要是通过阻遏或降低目的基因的表达而达到治疗的目的。反义疗法是通过引入目的基因的rna的反义序列而达到上述目的。当引入的反义rna与mrna相配比后,用于翻译的mrna的量就大大减少,因而合成的蛋白的量也相应大大减少。引入的反义序列也可能与基因组dna互补配对,从而阻遏mrna的转录。这2种情况都会使细胞中靶基因编码的蛋白合成大大减少,以达到基因治疗的目的。

1.3通过核酶的基因治疗

20世纪80年代初,美国科学家cech和altman发现了核酶,核酶是指由rna组成的酶,能够序列特异性地抑制靶mrna。近年来,核酶在抑制癌基因的表达[4]、增强肿瘤对药物的敏感性及抑制肿瘤血管的生成等方面的应用得到了广泛的研究。

1.4自杀基因疗法

自杀基因疗法是恶性肿瘤基因治疗领域最有希望的方法之一,已广泛用于各种恶性肿瘤的基础研究和临床试验性治疗。它是用药物敏感基因转染肿瘤细胞,其基因表达的产物可以将无毒性的药物前体转化为有毒性的药物,影响细胞的dna合成,从而引起该肿瘤细胞的死亡。

2基因治疗存在的问题

2.1基因治疗的社会和伦理问题

基因治疗不仅仅是一种医疗方法,它还涉及很多其他问题。因为当人们试图“纠正”人类自身“不正常”的基因时,这种纠正的后果是无法预料的。由于人类的遗传信息非常复杂,转基因也可能带来不可预料的后果,没有人能保证这种基因结构的改变绝对不会造成人类某一未知功能的缺失。另外,当人们试图把基因治疗引入生殖细胞时,又涉及后代基因结构的改变问题,且改变将直接影响这个“未来人”,这是一个很难解决的伦理问题。

2.2基因治疗的技术问题

目前,基因治疗的对象是单基因的缺陷,但许多疾病涉及多个基因之间复杂的调控和表达关系。对这类疾病的基因治疗难度很大,因为向细胞中导入多个基因后,使几个基因之间能保持正常的调控关系几乎是不可能的。即使是单基因缺陷症,使导入细胞的基因能正常表达也是一个较复杂的问题。将基因导入细胞后,其表达量的多少是直接影响能否达到治疗的目的和有无副作用的关键。但这个问题将会在人类基因组计划完成的基础上,对人类后基因组计划的开展,弄清了人类基因之间复杂的调控联系后而最终得到解决。只有这样,才能在基因治疗中尽量做到使导入的基因处于正确的调控下,取得治疗效果,消除副作用。

3展望

以基因转移为基础的基因治疗要在临床上很好地应用,还有待理论和各种技术的进一步发展。过去20~30年基因治疗的发展已取得了巨大成就,已被看成是对先天和后天基因疾病的潜在有效的治疗方法,不过其依然存在缺少高效的传递系统、缺少持续稳定的表达和宿主产生免疫反应等问题。今后基因治疗研究将向2个方向发展:一是基础研究更加深入,以解决在临床应用中遇到的一些困难及基因治疗本身需要解决的一些难点;二是临床试用项目增多,实施方案更加优化,判断标准更加客观,评价效果更加精确。总之,随着分子生物学、分子遗传学以及临床医学的发展,基因治疗也会不断发展,日趋成熟,很多难题会得到解决,并在临床上得到广泛应用。整理

4参考文献

[1] 李立家,肖庚富.基因工程[m].北京:科学出版社,2004.

[2] anderson w.human genetherapy[j].nature,1998(392):25.

篇5

骨髓细胞形态学检查是一门具有百年悠久历史的血液病诊断技术，一百多年来一直都是使用瑞氏及其先驱者发明的涂片染色法，它是血液病理学重要的诊断工具。因为其制片的过程容易简单，能快速的对样品做出初步检查，即使在血液病检测手段与日俱进的今天，传统的骨髓细胞形态学检查仍然具有独一无二的魅力，它为现代血液病理诊断的发展奠定了基础。本文通过骨髓细胞形态学检查对其本身的不断完善进步，并结合其他现代血液病诊断技术，在MICM方法上对各种白血病的发病机理的研究现状作一综述。

一、血细胞的生成，发育规律及正常形态学特征

(一) 血细胞的生成

目前认为，所有血细胞均起源于共同的造血干细胞。造血干细胞是造血组织中一类目前尚无形态学特征描述的功能细胞。其功能特点为：①具有高度自我更新的能力；②具有多向分化的能力。

血细胞的生成过程可划分为三个连续的阶段，即造血干细胞，造血祖细胞和形态学上可辨认的各系原始幼稚细胞阶段，然后进一步成熟为具有特定功能的各系血细胞。

(二) 血细胞发育过程中形态学演变的一般规律

1、细胞大小及外形

(1)大小：从原始细胞到成熟细胞，胞体由大逐渐变小。但巨核细胞则与此相反。

(2)外形：红细胞系始终呈圆形，粒细胞和淋巴细胞系保持圆形或椭圆形不变；单核细胞系和巨核细胞系则均由圆形或椭圆形变为不规则形。

2、核质比例(N/C)胞核逐渐缩小(巨核细胞例外)，胞质量逐渐增多，由核大质少变为核小质多。

3、细胞核

(1) 大小：由大变小，巨核细胞的胞核则由小明显变大。

(2) 核形：幼红细胞胞核始终呈圆形，核逐渐缩小，核染质固缩，最后脱核而消失，成熟红细胞无细胞核；粒细胞系原始及早幼粒细胞阶段呈圆形或椭圆形，随着细胞成熟，胞核的一侧逐渐凹陷，最后形成分叶状。

(3)核位置：居中，常偏位，侧这边。

(4)核染色质：结构由细致疏松逐渐凝集变为紧密粗糙，着色则由浅变深。

(5)核膜：由不明显到明显。

(6)核仁：由清晰可见到消失。

4、细胞质

(1)胞质量：一般由少逐渐增多，淋巴细胞例外。

(2)着色。

(3)颗粒：多从无到有，从非特异性颗粒到特异性颗粒。

(4)空泡：正常情况下，浆细胞胞质中可见小空泡，其他细胞系列中一般无空泡，出现空泡多由于细胞退行性变。

二、常见血液病的形态学特征[1]

(一) 贫血

1.缺铁性贫血 是因体内贮存铁缺乏而使血红蛋白合成不足所致。

【血象】

(1)红细胞，血红蛋白均减少，以血红蛋白减少更为明显。

(2)轻度贫血时成熟红细胞的形态无明显异常。中度以上贫血才显示小细胞低色素性特征，红细胞体积减小，淡染，中央苍白区扩大。

(3)网织红细胞轻度增多或正常。

(4)白细胞计数和分类计数，以及血小板计数一般正常。

【骨髓象】

(1)骨髓增生明显活跃。

(2)红细胞系统增生活跃。

(3)贫血早期程度较轻时，幼红细胞形态无明显异常。中度以上贫血时，幼红细胞内血红蛋白合成不足，细胞体积减小，胞质量少。

(4)粒细胞系相对减少。

(5)巨核细胞正常。

2、再生障碍性贫血(AA)简称再障，是由于多种原因所致骨髓造血干细胞减少和(或)功能差异常及造血微环境损伤，导致红细胞，粒细胞和血小板生成减少的一组综合征。

(1)急性期：急性型再生障碍性贫血(AAA)又称重型再障I型(SAA-I)，起病急，发展迅速，常以严重出血和感染为主要表现。

【血象】呈全血细胞减少。①红细胞，血红蛋白显著减少，两者平行性下降，呈正常细胞正常色素性贫血；②网织红细胞明显减少，绝对值

【骨髓象】急性型再障的骨髓损害广泛。①骨髓增生明显减低；②粒、红两系细胞极度减少，淋巴细胞相对增高；③巨核细胞显著减少；④浆细胞分类比值增高。

(2)慢性型：CAA起病和进展缓慢，以贫血和轻度皮肤，粘膜出血症状多见，严重出血和感染少见。

【血象】①红细胞，血红蛋白平行性下降，血红蛋白多为中度或重度减低，呈正常细胞正常色素性贫血。②网织红细胞减少，绝对值低于正常，常小于15×109/L；③白细胞减少，多在(2、0~3、0) ×109/L；④血小板减少，多在(30~50) ×109/L。【骨髓象】慢性型再障的骨髓中可出现一些局灶性代偿性造血灶，故不同部位骨髓穿刺的结果可有一定的差异。①骨髓增生程度多为增生减低；②巨核细胞、粒细胞、红细胞三系细胞均不同程度减少。巨核细胞减少常早期就出现，治疗有效时恢复也最慢，故在诊断上的意义较大。③淋巴细胞相对增多。

如穿刺部位为代偿性造血灶，则骨髓象呈增生活跃，粒系百分率可呈正常或减低，红系细胞百分率增高，但巨核细胞仍显示减少或明显减少。

(二) 白血病

1、急性白血病

【血象】

(1)红细胞及血红蛋白中度或重度减少，呈正常细胞正常色素性贫血。

(2)白细胞计数不定：白细胞数增多者，多在(10~50) ×109/L之间，也有白血病计数在正常范围或减少。白细胞分类计数可见一定数量的白血病性原始或幼稚细胞，所占百分率不定。

(3)血小板计数常减少。

【骨髓象】

(1)骨髓增生在极盛期明显活跃或极度活跃，但在疾病过程中会出现岛状增生，非均一性增生，局部增生(混杂性浸润)及间质变，再障样变等多种变化需要通过骨髓活检来鉴定。

(2)一系或二系原始细胞明显增多。≥30%ANC(all nucleated cell,所有有核细胞)。

(3)因白血病细胞类型的不同，其他系列血细胞均受抑制而减少。

(4)涂片中分裂型细胞核退化细胞增多。在急诊白血病中，“蓝细胞”较其他类型白血病中多见；在急粒和急单白血病中，可见到Auer小体。

2、慢性白血病

慢性粒细胞白血病：CML为起源于造血干细胞的克隆性增殖性疾病，以粒系细胞增生为主。多见于青壮年，起病缓慢。突出的临床变现为脾明显肿大和粒细胞显著增高。细胞遗传学的特征为具有特异性的Ph染色体。

【血象】①红细胞及血红蛋白早期正常或轻度减少，随病情发展贫血逐渐加重，急变期呈重度贫血。一般为正常细胞正常色素性贫血；②白细胞显著增高为突出表现。疾病早期可在(20~50) ×109/L,多数在(100~300) ×109/L。分类计数粒细胞比例增高，可见各阶段粒细胞，尤以中性晚幼粒细胞为多见，原粒细胞和早幼粒细胞

【骨髓象】①骨髓增生极度活跃；②粒细胞系显著增生，原粒和早幼粒细胞

3、急性骨髓纤维化

急性骨髓纤维化临床进展迅速，脏器浸润轻，外周血常呈全血细胞减少，无泪滴状红细胞，但伴少量原始细胞；骨髓穿刺常呈干抽，骨髓象增生低下，可伴少量原始细胞。

【骨髓活检】骨髓增生极度活跃，红系前体细胞、粒系、巨核三系增生活跃；幼稚细胞簇状及散在分布，幼稚红细胞簇突出，巨核细胞较多，不同大小的均可见，核分叶少；大多数网状纤维增生显著，胶原纤维增生不明显。

4、多毛细胞白血病

外周血及骨髓涂片染色见直径10-15μm、胞浆 淡染有多毛状突起的毛细胞。相差显微镜下多毛突起最明显。外周血单核细胞减少(HCL 亚型时不减少)。骨穿常见干抽。骨髓活检是金标准。

【骨髓活检】毛细胞胞浆丰富、透明(HCL 亚型时嗜碱性)，核圆、椭圆，居中呈“煎蛋样，多无核仁，有的核呈粗块状似成熟浆细胞胞核，有胞核似豆形核。根据毛细胞浸润骨髓程度不同，可呈间质性、大片状或弥漫均匀分布，胞浆丰富，胞核彼此间距宽而类似“铺药片”样或“蜂窝”状是其特征，在骨髓“血湖样”改变不常见。粒、红、巨核三系细胞随毛细胞浸润加重而减少，网状纤维可增多。

5、冒烟型白血病

冒烟型白血病涂片检测可为阴性，仅表现为骨髓活检阳性。骨髓活检：见体积大，有异型的成片的幼稚细胞。由于成片存在，极易误诊为转移性肿瘤。这种早期白血病的诊断需要非常谨慎，必须结合相关特异性免疫标记，才可做出诊断。否则其诊断仅可作为参考，不能认为是最后诊断，更不能作为治疗依据。

三、骨髓检查的新进展：

1、骨髓活检是用一种环钻(trephine)切取骨髓作活组织检查，可观察骨髓完整的组织结构，真实反映骨髓局部的增生情况，发现局灶性坏死等。而抽吸取样破坏了骨髓原来的结构并被血液稀释，故骨髓活检被认为是观察骨髓各细胞系列比例和增生情况的金标准。

2、细胞免疫表型分析即细胞分化抗原簇(CD)分析。用各种荧光染料标记的抗CD单克隆抗体与流式细胞术结合，鉴定包括造血干细胞、各种淋巴细胞、髓系细胞、单核细胞、巨核细胞等的CD表型。目前在血液细胞学分析，特别是淋巴瘤和白血病分型方面应用越来越广。

3、细胞遗传学分析淋巴瘤，白血病、MDS等恶性血液病，往往有染色体异常。通过直接制片用荧光原位杂交(FISH)技术可以作细胞分裂间期的细胞遗传学分析或通过短期培养，即可进行常规染色体鉴定，目前以FISH和常规染色体鉴定为基础的细胞遗传学已逐步发展为诊断淋巴瘤，白血病乃至多种实体肿瘤的常规诊断手段。

4、分子遗传学分析从基因(DNA或RNA)水平研究和诊断血液系统疾病[2]，是当前热点，例如由于9号和22号染色体易位t(9:22)形成的，在慢粒白血病常见的Ph染色体，以往多用染色体分析法鉴定，后来发现这种易位形成了一个新的融合基因bcr-abl，从而可用基因探针技术或PCR进行定性和定量分析。

5、直接查找微生物如黑热病的利-杜体、弓形虫等。近年来，由于临床免疫抑制剂的大量使用和艾滋病的发生率增高，许多以往很少见的微生物如鸟分枝杆菌、组织胞浆菌(Histoplasma)等。这些病原微生物的检测近来多利用包括分子生物学技术在内的先进实验室检验技术进行，但也常可在骨碎片中找到。

随着时展，骨髓检查的内容愈加丰富，技术手段也越来越多。现代的骨髓检查已从早期单纯的细胞涂片发展到以细胞形态学和组织形态学为基础结合细胞化学、免疫组织化学、流式细胞分析，细胞遗传学和分子生物学、超微结构分析等诸多方面的综合诊断学。常规的形态学检查也逐步规范化。

参考文献

篇6

关键词：卵巢癌；浆液性癌；免疫组织化学；基因表达卵巢恶性肿瘤是女性生殖器三大恶性肿瘤之一，其病死率高居首位，上皮性卵巢癌是最常见的一种类型。由于缺乏有效的早期诊断方法，卵巢癌的五年存活率仍然较低，早期卵巢癌5年存活率可达75%以上，而晚期卵巢癌采用肿瘤细胞减灭术及化疗患者的5年存活率仅15%~20%。近年来，人们不断的对卵巢癌发生、发展机制进行研究。

1卵巢癌的分级

肿瘤的分级是评估肿瘤预后的重要指标。2002年，singer等[1]提出将卵巢浆液性癌分为高级别卵巢浆液性癌、低级别卵巢浆液性癌两类。高级别的卵巢浆液性癌的前驱病变不清，发展迅速；低级别卵巢浆液性癌则逐步进展。美国德州大学M.D.安德森癌症中心的两级分化标准：以核分裂指数为主要标准，坏死细胞、多核巨细胞数量作为辅助标准，将浆液性卵巢癌分为二型，即低级别卵巢浆液性癌：核分裂指数≤12个/10HPF，存在微结构，不伴有坏死及多核巨细胞；高级别卵巢浆液性癌：核分裂指数>12个/10HPF，具有中度以上的非典型增生。两种卵巢浆液性腺癌的临床病理特征见表1。

既往研究发现，卵巢癌常用的免疫标志物有CA125、ER、PR、TK1、WT-1、P53、Survivin、Livin、维甲酸类化合物、CD24、CD44、CD133等，这些标志物与卵巢癌的发生、发展以及预测预后等方面有一定的关系[2]。按二级法分类发现，低级别浆液性癌与高级别浆液性癌存在表型与遗传方面的差异。K-RAS、BRAF、ERBB2、p16基因在低级别卵巢浆液性癌组织中的阳性表达率高达68%，而在高级别卵巢浆液性癌组织中几乎不表达[3]；近期有研究发现，PAX2、PAX8、P53在低级别卵巢浆液性癌和高级别卵巢浆液性癌组织中的阳性表达率也存在明显差异。

2 PAX2、PAX8在低级别、高级别浆液性卵巢癌中的表达研究进展

PAX基因（核转录因子-Paired box gene）是对发育调控的基因家族，研究表明PAX基因表达的蛋白是一类重要的转录调控因子，他们在胚胎发育过程中对组织和器官的分化起着重要的调控作用。许多研究表明PAX基因改变会导致癌症发生。PAX2是控制早期泌尿生殖器发育的重要因子，它的表达异常会导致多种相关的恶性肿瘤的发生，已有文献报道PAX2过度表达会导致肾癌的发生，在肾母细胞瘤儿科肾癌和间充质细胞起源的肾癌均有PAX2表达不正常的上调；PAX8突变或失活就会引起甲状腺滤泡癌或腺癌。

2.1 PAX2是PAX基因族的一亚型，PAX2编码转录因子对泌尿生殖道、眼及中枢神经系统的发育起到关键作用。Tong等研究女性生殖系统中PAX2分布后发现PAX2在输卵管内膜、子宫内膜，宫颈管内膜一级卵巢表面衍生的异位纤体中均有表达，但卵巢上皮及卵巢性索间质中则未见PAX2蛋白表达，据此认为PAX2蛋白是一种可用于鉴别组织起源的分子标志物，并认为PAX2蛋白阳性的卵巢浆液性癌（OSAC）很有可能源于输卵管内皮。

2.2 PAX8也是核转录调节因子的配对盒子家族成员之一，是一种白。近来,转录因子PAX8被证明是一个敏感且相对特异的苗勒氏肿瘤的标记物。PAX8在甲状腺，副中肾管，肾脏等组织中存在表达，但正常卵巢的上皮细胞不表达。PAX8在卵巢癌表现出高敏感性和相当的特异性，与WT1仅表达在浆液性卵巢癌有所不同，PAX8在卵巢内膜样癌和透明细胞癌也呈阳性，但在粘液性卵巢癌中几乎不表达。PAX8除了在甲状腺和甲状腺腺癌中呈阳性外，在乳腺以及其它非妇科的原发性肿瘤中几乎无表达。这些特点奠定了PAX8在卵巢肿瘤中的应用。

2.3 p53基因是一种抑癌基因，定位于人类染色体17p13.1，编码393个氨基酸组成的53kD的核内磷酸化蛋白，被称为p53蛋白。p53基因是细胞生长周期中的负调节因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关。 P53分为野生型和突变型两型，野生型P53基因为抑癌基因，而突变型P53基因则是癌基因。野生型p53能维持基因的稳定，参与细胞周期的调控，组织细胞从G1期进入S期，识别并修复损伤的DNA，诱导受损伤细胞凋亡。P53突变后，失误了对细胞增殖的抑制作用，受损伤的衣长细胞不断增殖，最终导致突变。而突变型p53不但无抑癌作用，还抑制野生型p53的活性，引起细胞的转化。如若P53基因出现基因突变、等位基因的丢失、染色体重组等，可导致细胞进行过度的分裂从而促进了细胞的癌变[4]。有研究显示，p53在卵巢癌组织中阳性率冥想高于癌旁正常组织且与组织学分级呈正相关，提示p53异常表达在肿瘤细胞的增殖和发展中起重要作用[5]。在卵巢上皮性肿瘤中，国内研究显示，P53在上皮性卵巢癌细胞的表达部位为细胞核。上皮性卵巢癌P53阳性表达率为77%，交界性卵巢肿瘤阳性表达率为59%，而在正常卵巢中无表达，两者间的差异有统计学意义。

参考文献:

[1]Jernal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics,2009[J].CA Cancer J Clin,2009,59:225-249.

[2]刘冲，石群立.卵巢癌免疫标志物研究进展[J].医学研究生学报，2010,23（9）：985-988.

[3]Schlosshauer PW,Deligdisch L.Penault-Llorea F,et al.Loss of p161NK4A expression in low-grade ovarian serous carcinomas[J].Int J Gynecol Pathol,2011,30:22-29.

篇7

禽流感诊断技术

1病毒的分离培养

禽流感通常从人类感染者的结膜拭子、呼吸道样品（如咽喉或鼻分泌物和冲洗物）中分离到，无菌采集病料，经处理后接种9～11日龄鸡胚。因AIV的HA能使璃红细胞发生凝集，可用血凝实验作病毒的初步鉴定。若尿囊液为阴性则应继续盲传2～3代。对阳性尿囊液需先用新城疫（ND）抗血清做血凝抑制（HL）试验，以排除ND感染。然后用免疫扩散等方法来检测特异性核心抗原一核糖蛋白（NP）或基质蛋白（MP），再用血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验鉴定A型流感病毒亚型。鸡胚分离培养的特异性和敏感度均可以达到100%，但操作繁琐，耗时较长，需要一周左右时间。

2琼脂凝胶扩散试验（AGP）

抗原抗体在琼脂中由高浓度向低浓度自由扩散可以形成特异性肉眼可见的沉淀线。此法能用于检测AIV共同抗原NP或MP。由于所有的AIV都具有型特异性共同抗原，用一种AIV的抗原或抗血清就可对所有AIV的抗体或抗原进行鉴定。1970年Beard首次将AGP用于禽流感抗体的检测，此法虽然简便易行，但敏感性差，有假阳性且不能区分动物血清抗体阳性是病毒感染所致还是注射的疫苗所产生的抗体。赵增连等发现在琼脂板中加入3%的PEG6000，可提高AGP的敏感性，且快速省时。邓国华等利用杆状病毒表达禽流感病毒的重组白作为禽流感琼扩抗原，其特异性和敏感性有较大提高，生物安全性更可靠和生产成本更低廉。但该实验需要大量的抗原和抗体才出沉淀线，且需要至少24h才出结果，没有HI实验敏感、快速。

3血凝（IA）和血凝抑制（HI）试验

AIV能够与鸡红细胞发生凝集现象，即血凝实验。这种红细胞凝集现象又可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验。HA主要用于AIV的鉴定，HI主要是用已知单因子血清进行AIV的亚型鉴定，也可用来测定血清中的HI抗体滴度。该方法最早在1942年Hirst采用，后经改进并建立了标准操作程序。由于许多禽类血清中有非特异性血凝因子，导致假阳性出现，故通常在斌验中首先用受体破坏酶或高碘酸钠法去除非特异性抑制因子。有报道用马血球替代标准HA中的鸡或猪血球检测禽流感H7，可提高敏感性达85%，特异性达100%。HA、HI特异性好，是亚型鉴定的常用方法，但其操作过程繁琐费时，并且用已知HA亚型的抗血清不能检出新的HA亚型的AIV。

4病毒中和试验（VNT）

VNT试验是最特异的血清学方法之一，只有抗体与病毒颗粒上的表面抗原相对应，特别是与吸附到宿主细胞上的痫毒表面抗原相对应，才能在实验中取得满意的显示效果。因此，某一个血清型的中和试验抗体只与同组内的其他病原表现出有限的交叉反应。该实验还具有高度的敏感性，Thoms等建立的用于AIV H5N1检测的微量中和斌验的敏感性要高于HI试验，如同时结合运用H5型特异的westernblotting）试验，其敏感性可达80%，特异性达96%。VNT操作繁琐，费时间，耗材料，故在实际临床诊断中不常使用。但作为经典方法在病毒鉴定中起着重要作用，许多新的检测方法都要以此作为标准进行比较。

5免疫荧光技术（IFA）

IFA是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。最早用于流感病毒是鉴定和定位病毒感染细胞异性的抗原、白（NP）或基质蛋白（MP）抗原。用NP抗原的荧光抗体染色，主要出现核内荧光；用MP抗原的荧光抗体染色主要出现胞质荧光，核内也可出现部分荧光。1984年宾夕法尼亚州暴发禽流感时，Skeeles将IFA首次用于AIV的检测，其敏感性相当于病毒分离。现有一种微球免疫法（microsphere immunoassay，MIA）将重组NP结合于Luminex（聚苯乙烯微球）上检测禽流感，敏感性高达99.13%。秦爱建等研制的抗禽流感H5和H9亚型病毒的单克隆抗体，通过免疫荧光技术检测AIV，24h内检测出病毒的最小感染量为10个TCID50孔。IFA具有特异性强、敏感性好、简便快速的优点，但非特异性染色问题尚未解决、结果判定的客观性不足、技术程序比较复杂。

6酶联免疫吸附试验（ELISA）

它是20世纪70年代在荧光抗体和组织化学基础上发展起来的一种新的免疫测定技术，是在不影响酶活性和免疫球蛋白分子的条件下，使酶分子和免疫球蛋白分子共价结合成酶标记抗体。酶标记抗体可直接或间接通过免疫桥与包被在固相支持物上待测定的抗原或抗体特异性结合，从而特异的定性、定量检测病毒的存在。由于标记酶酶促反应的放大作用，其灵敏度比常规血清学检测要灵敏得多，尤其适合大批量的血清学调查。酶联免疫吸附试验具有较高的敏感性，既可以检测抗体，又可以检测抗原，可以标准化，且结果易于分析，在流感的控制、扑灭、检疫中很有用途。目前由于AIV全病毒作为包被抗原建立的ELISA方法存在生物安全性问题，应用AIV型特异性蛋白及其单抗建立ELISA方法成为了研究的热点。

7反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）

RT-PCR技术是指提取AIV总RNA，再加反转录酶合成cDNA，进行PCR扩增后，直接检查AIV基因。如果检测出了相应的扩增带则判为阳性反应；反之，无扩增带则为阴性反应。用于AIV检测的早期报道是在1986年Perdue等在接种鸡胚的尿囊液中检测AIV。近几年随着分子生物学的深入发展，用于AIV检测的RT-PCR方法不断得到改进和报道。2007年韩雪清等，根据禽流感病毒H1、H3、H5亚型的HA基因和N2亚型NA基因的保守序列，设计出四对RT-PCR引物，建立一步法多重RT-PCR，能够特异、敏感地对禽流感Hl、H3、H5、N2四亚型进行快速检测，且与禽流感其它亚型和NDV、IBV、ARV和IBDV的核酸均无交叉反应。同年张鹤晓等。进一步研制开发H5/H7和H5/N1多重荧光PCR技术，实现了在一次反应中对样本里的病毒进行快速定型，此法检测H5和H7的敏感性分别为10-6和10-5，而且与禽类其他常见病毒和禽流感病毒其他亚型未发现交叉反应。因此该检测方法将在大量检测H5和H7亚型禽流感病毒的混合感染方面，大大提高检测效率，节约检测成本。

篇8

关键词：牛；抗病基因 研究进展

中图分类号：S823 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2013）-04-0282-2

0 前言

动物可能对一些传染性疾病存在完全或部分的抗性，即抗病性。抗病性大多是由遗传因素来决定和控制的，动物自身的遗传性状决定着疾病的发病率。[1]抗病基因是动物抗病性的遗传基础，它是在外来因素的刺激下能够抵抗疾病入侵、能使动物体内产生抗体，即动物对疾病产生抗性的基因。抗病基因按照效应大小分为三类：第一是单一主基因，这种基因的功能主要是控制抗性状的表达；第二是微效多基因，这种基因控制的抗病能力是由多个基因共同完成的；第三是独立的多基因，一般抗病能力多受到独立的多基因控制，而特殊抗病能力主要受到单个主基因位点的控制。[2]

虽然预防接种在动物疾病控制方面起到了重要的防治作用，但仍未能完全遏制传染病的流行。当前可以利用分子生物学技术，进而找寻抗病基因进行抗病育种，从根本上改变动物的遗传性状，已成为控制和减少一些疾病发生的有效途径。而利用分子遗传学方法，采用基因图谱和数量性状位点扫描技术寻找与抗病力相关的基因，进行间接选择也日渐成为了新的方法。[3]目前，已经发现的在牛体内与免疫相关的抗病候选基因数量逐渐增多，主要有主要组织相容性复合物（MHC），天然抗性巨噬结合蛋白1（NRAMP1），甘露糖结合凝集素（MBL），Toll样受体基因（TLR），干扰素（IFN）等，这些抗病候选基因有望成为动物抗病育种的新靶点。

1 主要的抗病候选基因

1.1 天然抗性巨噬结合蛋白1（NRAMP1）

NRAMP1基因是一个比较保守的基因，主要存在于吞噬细胞，嗜中性粒细胞以及外周血液细胞中，为特异性表达，会影响动物自身的固有免疫，所以是综合抗病能力较好的候选基因。NRAMP1基因最初在小鼠体内发现，是在网状内皮细胞中的巨噬细胞表达。NRAMP1基因的存在可以抵抗多种细胞内病原微生物的入侵，发挥着重要的免疫功能。[4]通过把小鼠的基因敲除发现，NRAMP1基因与一些细胞内菌，病原微生物菌，例如分枝杆菌中的结核分枝杆菌、沙门杆菌、利什曼菌等的抗性和易感性有关。牛的NRAMP1基因位于第2号染色体上，研究表明其对牛布鲁氏病、乳腺炎等疾病有抵抗作用。对NRAMP1基因功能的研究表明可能是通过消耗含有胞内病原微生物吞噬体中的二价金属离子，使病原微生物缺乏繁殖必需的金属离子而达到抵抗胞内病原微生物的作用[5]，但具体的作用机制目前尚不清楚。Ciro Estrada-Chavez，Ana L. Pereira-Suarez[6]等人发现在人体中，NRAMP1基因已被确定与结核易感性有关。

1.2 主要组织相容性复合物（MHC）

MHC是由连接紧密的多态性基因组成的，是一个与抗病性和免疫应答有着紧密相关性的基因家族，在免疫反应中对细菌、病毒、寄生虫等的控制和清除起着重要的作用。目前已经证实MHC与多种疾病间存在着密切的联系，牛的MHC物位于第23号染色体上，1978年牛的MHC基因得到了首次报道，命名为BoLA基因。有关BoLA基因和疾病的报道很多，Gilliespie，Sharif等人研究出BoLA-DRB3第2外显子与奶牛炎的高发病率有显著相关性。Wei Lei，Qinglong Liang等人研究了牛BoLA-DRB3基因和皖北FMDV与牛口蹄疫易感性之间的关联，采用BOLA-DRB3基因扩增的半巢式聚合酶链反应，分析基因频率和基因型频率在健康和感染口蹄疫牛之间的差异，发现等位基因Hae III A在皖北牛中与口蹄疫易感性显著相关，而Hae III C则对口蹄疫病毒具有很强的保护作用。[8]牛的BoLA基因与肠道寄生虫病、高酮症的易感性相关，牛的白血病与BoLA-AW16相关，牛的慢性后脊椎轻瘫与BoLA-A8相关，牛眼癌与W6相关，W14单倍型与牛结核病易感性相关。

1.3 Toll样受体基因（TLR）

TLR基因是一类普遍存在于哺乳动物中已经被鉴定出来的跨膜蛋白家族，主要存在于巨噬细胞、树突状细胞中，Toll样受体的作用是作为膜受体来识别侵袭机体的病原体含有的保守蛋白，还起着传递识别信号，激活核转录因子，转录相应的效应分子以及影响机体天然免疫等作用。[9]自从2006年牛的TLR基因mRNA序列在GenBank上公布，对TLR基因家族和牛疾病之间的相关性研究便迅速增多。Colleen A. Fisher， Eric K. Bhattarai[10]等人运用自定义下一代测序方法以及等位基因分型检测方法对牛的10个TLR基因变体的280双等位基因进行SNP检测和验证。采用验证牛TLR识别细菌配体基因的病例对照研究发现有6个SNP位点可能与结核分枝杆菌的易感性和奶牛感染副结核病的易感性相关。还有研究认为，TLR基因可能与牛呼吸性疾病、肠道性感染疾病、牛炎、口蹄疫病毒感染疾病、败血病及子宫内膜炎等。

1.4 甘露糖结合凝集素（MBL）

MBL基因是人体和动物体内重要的天然抗感染免疫分子，是由肝脏合成后分泌到血液中的，在抗原抗体发生特异性免疫反应前，其可以诱导并激活机体的固有免疫反应。MBL基因与免疫调节、补体活化的介导等生物学效应有着紧密的关联，同时又是临床上介导多种疾病发生的基础结构，MBL基因在防御病原微生物侵袭的天然免疫中起着抗感染分子的作用。[11]研究发现MBL基因的多态性和免疫缺陷性疾病、病毒性疾病、类风湿性关节炎、细菌性疾病、真菌性疾病以及寄生虫性疾病等均有相关性。根据Gen Bank的数据，牛具有MBL1与MBL2两种基因，Andersen等人通过亲和层析法从牛的血清中得到了纯化的MBL基因。Kawai等人采用编码人MBL基因的胶原区、颈区及糖识别区域探针的方法，从牛肝cDNA文库中筛选编码牛MBL基因的cDNA克隆，同时从牛血清中分离得到了MBL基因。Capparelli R[12]等人研究发现MBL基因多态性与水牛抗布鲁杆菌病的能力密切相关，其作用机理为MBL基因突变导致甘露糖结合凝集素血清水平下降，影响了正常的免疫功能。Liu J， Ju Z， Li Q等人选择了MBL基因启动子区域的三个新SNP位点和两个已报道的MBL1基因外显子2的位点进行检测，采用PCR单链构象技术在中国奶牛的三个不同品种中进行性多态性分析，分析其基因型和单倍型频率，血清MBL-A的水平，补体活性等，结果表明MBL1基因与抗奶牛乳腺炎存在相关性。[13]

1.5 干扰素基因（IFN）

由于IFN具有抑制肿瘤细胞生长、抵抗病毒感染及调节机体免疫功能的作用，因此成为病毒学、遗传学、免疫学、以及分子生物学比较活跃的研究领域。IFN-γ在调节机体免疫系统功能、增加巨噬细胞杀菌力、影响细胞的增殖与凋亡等方面具有重要的研究意义，其主要是通过刺激或抑制相应的基因发挥作用。[14]孙仰峰等人2008年对牛IFN-α基因高效表达及纯化进行了研究。[15]张永红等人研究鲁西黄牛BoIFN-α基因，并获得了具有较高抗病毒活性的重组干扰素产物。[16]蔡进忠从我国环湖型牦牛和野牦牛基因组DNA中克隆了α干扰素基因，重组后的BoIFN-α基因对牛传染性鼻气管炎病毒具有一定的抑制作用。[17]Sweeney RW， Jones DE等人选取5只未受感染的成年荷斯坦奶牛，7只自然感染结核分枝杆菌的成年荷斯坦奶牛，屠宰时从每只牛体内取回肠和盲肠的淋巴结样品，运用逆转录-聚合酶链反应法测定IFN-γ和白细胞介素4在每个样品mRNA表达量。结果感染结核的牛IFN-γ基因的表达量显著高于未感染牛，因此，IFN -γ的表达量增加，可能会增强牛的抗感染性。[18]

2 抗病基因应用于动物抗病育种时可能存在的问题与前景展望

2.1 存在的问题

动物抗病能力的遗传机制很复杂，还有环境的影响也很大。病原微生物的遗传特性与宿主动物的关系也很复杂，同时对抗病性和易感性指标的测定也没有统一的规定，而且还缺乏用于选择的可靠性标记。研究表明抗病性性状是由微效多种基因所控制的，但基因之间还会存在相互的作用，单纯的使用某种标记辅助选择达不到全面性效果，基因工程育种虽然有很强的针对性，但成功率却极低，而且需要的花费也相当巨大，很难实现大规模的操作。[19]因此，单独应用某一种抗病育种技术都会呈现出很多方面的局限性，还有抗病性与生产性状之间存在着负相关作用，不同的疾病间也会存在拮抗作用，目前除了一些已知的疾病外，大多数疾病在抗性选择方面可以参考的数据还很少，抗病机理也不是很明确和清楚，这些问题也同样在制约和阻碍着抗病育种的发展和应用。

2.2 前景展望

抗病育种并不是育种的最终目的，还需要与动物的生产性能、疾病的生理学特征、流行病学、免疫机制等多方面的综合因素相结合考虑，才能产生最适合经济需要的效果。在目前畜牧业抗病育种的方法中，应当充分将常规的表型选择和标记型的辅助选择有效的结合起来，让两者的优势得到互补，有效的提高家畜机体的一般抗病能力和特殊抗病能力。[20]对此，应该将分子学技术与抗病基因结合，开展动物基因组的基础研究工作，采用现代生物学技术和转基因工程技术系统地对基因的结构和功能进行全面性的研究。随着抗病基因作用机制研究不断的深入，抗病育种进展缓慢的局面将会得到逐渐的改善，综合性抗病育种研究将对我国畜牧业发展产生巨大的推动力。

参考文献

[1] 袁峥嵘.动物抗病育种研究进展[J].畜牧与兽医，2007，9

（39）：68-70.

[2] S.C. Bishop，C.A. Morris，et al.Genetics of disease resistance in sheep and goats [J].Small Ruminant Research， Volume 70，Issue 1，June 2007，Pages 48-59.

[3] 张世栋，金维江.动物抗病育种研究进展[J].中国畜牧杂志，1999，4（35）：55-57.

[4] 薛尚军，贾静敏，刘宏等.NRAMP1基因的研究进展[J].畜牧与饲料科学，2011，32（1）：28-30.

[5] 张利博，王洪梅，王长法等.牛Nramp1基因5′调控区序列的克隆及序列分析[J].中国兽医学报，2009，9（29）：1175-1178.

[6] Ciro Estrada-Chavez，AnaL.Pereira-Suarez，Marco A.Meraz，et al.High-Level Expression of NRAMP1 in Peripheral Blood Cells and Tuberculous Granulomas from Mycobacterium bovis-Infected Bovines [J].Infect Immun.2001 November，69（11）：7165-7168.

[7] 王兴平，许尚忠，昝林森，高雪，任红艳，陈金宝， 牛抗病基因BoLA-DRB3的新等位基因的发现[J].畜牧兽医学报，2006，37（7）：722-726.

[8] Davies CJ，Anders son L，Mikko S，et al.Nomenclature for factors of the BoLA system，1996： report of the ISAG BoLA Nomenclature Committee [J].Animal Genetics，1997，28：159-168.

[9] Arbournc，Lorenze，et al.TLR4 mutations are associated with endotox in hypo responsiveness in humans [J].Nat Genet，2000，25（2）：187-191.

[10] 邓存良.甘露糖结合凝集素的研究进展[J].国外医学（免疫学分册），1998，5： 238 -242.

[11] Holmskov U，Thiel S，Jensenius JC，et al.Collectin

-sand ficolins：humoral lectins of the innate immune defense[J].Annu，Rev.Immunol，2003，21：547-578.

[12] Liu J，Ju Z，Li Q，et al.Mannose-binding lectin 1 haplotypes influence serum MBL-A concentration，complement activity，and milk production traits in Chinese Holstein cattle[J].Immunogenetics.2011 Nov；63（11）：727-742.

[13] Domeika K. Porcine immunoregulatory cytokines wit h special reference to t heir induction by Cp G containing DNA [D].Uppsala：Swedish University of Agricultural Sciences，2003.

[14] 夏伦斌，王新华，连宏军等.Γ干扰素及其在动物疾病防控中的应用[J].动物医学进展，2007，28（5）：74-78.

[15] 孙仰峰，李文辉等.牛INF-a基因高效表达及纯化的研究[J].中国预防兽医学报，2008，30（11）：889-892.

[16] 张永红，王长法，杨少华等.重组鲁西黄牛a干扰素融合蛋

白的表达及其抗病毒活性研究[J].生物工程学报，2007，23（4）：

730-734.

[17] 蔡进忠，史喜菊，李少勇等.耗牛INF-a基因的克隆表达及抗病毒活性研究[J].中国兽医杂志，2006，42：3-6.

[18] Sweeney RW， Jones DE，Habecker P，et al.Interferon

-gamma and interleukin 4 gene expression in cows infected with Mycobacterium paratuberculosis [J].Am J Vet Res.1998 Jul，59（7）：842-847.

[19] 李林召，张龙超.国内外抗病育种技术研究进展[J].中国畜牧兽医，2009，9（36）：104-106.

篇9

关键词 噪鹛属；蓝冠噪鹛；研究现状

中图分类号 Q958 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）03-0294-02

Abstract The blue-crowned laughingthrush（Garrulax courtoisi）is a critically endangered bird and its wild population is now known only could be found in Wuyuan，SE China.The blue-crowned laughingthrush is considered to be yellow-throated laughingthrush south China subspecies，after upgraded to separate species.At present，the part of the zoo in Europe and the United States have captive population，in the domestic，Hong Kong Ocean Park and Nanchang Zoo have captive population，synthesize domestic and international research experience of captive population and research situation of wild condition，refer to the literature，from the study on blue crowned laughingthrush and blue crowned laughingthrush congeneric species，the current situation of the development trend on the blue crowned laughingthrush research study was comprehensive reviewed.At present，laughingthrush research of the birds is already relatively deep，in macro and micro research，and analysis was comprehensive，the blue crowned laughingthrush studies only stay in the study habitat，it isn′t related to reproductive ecology and micro research.

Key words laughingthrush；bule crowned laughingthrush；research status

1 研究目的和意义

蓝冠噪鹛（Garrulax courtoisi）属雀形目画眉科噪鹛属，为中国特有物种，分布于江西婺源一带，极度濒危。迄今已知的野生种群仅现于江西婺源。基于传统的形态学、声学、动物地理学等分类方法，蓝冠噪鹛曾经被视为黄喉噪鹛华南亚种（Garrulax galbanus courtoisi），后升格为独立种，何芬奇将其更名为“靛冠噪鹛”[1]，而目前鸟类学界比较通用的中文名为“蓝冠噪鹛”。

20世纪80年代，由于国际与国内对野生动物贸易立法的缺失，中国有大量蓝冠噪鹛经由香港被贩卖到欧洲和北美。目前在一些欧美动物园以及香港海洋公园其人工饲养历史已超过20年，全球圈养持有的数量超过200只，接近野外种群数量，但是总体上面临近亲及老龄化，加上球虫的困扰、雏鸟成活率低等问题，前景不容乐观[2]。2007年黄喉噪鹛被列入世界急危物种名录，列入《世界自然保护联盟》（IUCN）国际鸟类红皮书。

2 研究综述

2.1 鹛类及噪鹛属鸟类的分类

鹛类主要分布在欧亚大陆东部、南部以及非洲，由于其形态及生态习性多样，一直以来分类方式较为混乱。其中分布于中国的鹛类共计142种，占世界鹛类记录总数284种的50%，中国因此而被称为鹛类王国。相关研究学者对于中国分布的鹛类的分类同样存在许多不同观点，有代表性的大致有3类[3]。第1类的代表学者为Cheng和郑作新，其将鹛类分类为l科、画眉亚科，并认为包含了所有的鹛类、鸦雀类以及山鹛属；第2类的代表学者为Mickinnon和Phillipps，其将鹛类分类为莺科 、噪鹛亚科、莺亚科 、族鹛，并将山鹛属并入扇尾莺科，噪鹛属和P鹛属归入噪鹛亚科，棕胸鸦鹛属并入幽鹛属，与鸦雀类等同归鹛族；第3类的代表学者为郑光美，其将鹛类分类为画眉科，并将文须雀属、红嘴鸦雀属、鸦雀属合为鸦雀科，山雀属并入扇尾莺科，白腹凤鹛单立为画眉科下一属。

我国分布有38种噪鹛属的鸟类，占世界分布噪鹛属种类的70%以上，其中7种为我国特有种。Cibois基于线粒体基因的联合分析指出，噪鹛属的单系性被Bootstrap Probability test、Shimodaira-Hasegawa test以及Swoford-Olsen-Waddel1-HiUis test 3种检验所拒绝，建议做进一步分析验证。Luo 等在基于Cyt b和RAG-1联合分析构建的画眉科鸟类系统发育树中，也否定了噪鹛属的单系性，其中斑背噪鹛（Garrulax lunutus）、灰翅噪鹛（Garrulax cineraceus）、山噪鹛（Garrulax davadi）、白喉噪鹛（Garrulax albogularis）、棕噪鹛（Garrulax poecilorhynchus）、黑脸噪鹛（Garrulax perspicillatus）、白颊噪鹛（Garrulax sannio）（7种）属于噪鹛类Ⅰ，黑顶噪鹛（Garrulax affinis）、橙翅噪鹛（Garrulax elliotii）、赤尾噪鹛（Garrulax milnei）、红头噪鹛（Garrulax erythrocephalus）、红翅噪鹛（Garrulax formosus）（5种）属于噪鹛类Ⅱ，并且2支噪鹛与丽鹛之间的关系也没有得到解决[4]。

2.2 DNA测序技术在鸟类系统发育研究中的应用

传统的鸟类系统学研究以形态学为主，研究争议较多。近年来逐渐开始利用鸟类鸣声进行鸟类系统学研究。同时利用分子遗传学理论与技术进行鸟类系统学问题研究是未来的发展趋势。线粒体DNA是分子系统发育学研究重要的分子标记，具有易分离、进化速度快、母系遗传、缺乏重组和无内含子等特点。Cibois基于线粒体Cytochrome b、12s和16s 3个基因构建了画眉科的系统发育树，对于画眉科鸟类系统发育重建工作意义显著[5]。由于当研究类群的分歧大于10%时，线粒体控制区、ND2以及细胞色素b基因都可能出现替代饱和，因此在科级水平上研究高级分类阶元的系统发育关系时不能仅依靠线粒体基因的序列信息[6]。

与此同时，越来越多的学者建议在重建系统发育关系时增加核基因作为分子标记。Irestedt 等通过线粒体基因cytb和核基因c-myc、RAG-1和myoglobin分析探讨了亚鸣禽中的系统发育关系；Lee等运用线粒体的3个基因（16s rRNA、tRNA-Leu和nad1）研究了全球的鹊属内部的系统发育关系；Slikas等通过线粒体的2个基因（cox2基因、atp8基因）序列分析研究了绣眼鸟属内部物种之间的系统发育关系；Yuri等采用线粒体基因12S rRNA、nad2、atp8、atp6、部分cox2以及6个tRNA基因探讨了燕雀科的系统发育关系[7]；Zuccon 等通过线粒体基因nad2和2个核基因RAG-1和myoglobin分析了椋鸟科的系统发育关系并探讨了椋鸟科在l总科中的位置，2008年又通过3个核基因标记（myoglobin的内含子2，ODC的内含子6和7，以及GAPDH的内含子11）联合线粒体基因nad2和cox2探讨了椋鸟科中的椋鸟属、八哥属、长冠八哥属、肉垂椋鸟属和Fregilupus属之间的系统发育关系[8]。

2.3 蓝冠噪鹛行为学研究

2.3.1 噪鹛属鸟类的行为学研究。噪鹛属鸟类的行为学研究对蓝冠噪鹛行为学研究具有一定的参考意义，鸟类行为的研究主要是从其行为节律分布情况，各种行为谱在整个行为中占有的比重，进一步又将行为分为繁殖期行为和非繁殖期行为。

噪鹛属鸟类行为的研究国内外都比较常见，其行为学研究也得出了一定的结论。朱 峰等在四川省南充市市郊观察了白颊噪鹛（Garrulax sannio）的繁殖行为。结果显示，白颊噪鹛的营巢成功率为73.3%，影响其巢址选择的主要因素依次为巢位及巢的稳固因素、隐蔽因素、食物因素；孵化期亲鸟的离巢时间随着孵化天数的增加而减少，离巢次数随着孵化天数的增加而增加；育雏期亲鸟喂食频次随着雏鸟日龄增加而增加，在7：01―10：00和17：01―19：00时喂食频次最高，在6：30―7：00和10：01―14：00时最低[9]。

柴璐艳等对四川大学望江校区白颊噪鹛（Garrulax sannio）在非繁殖季节时的行为节律及时间分配进行观察和研究。结果表明：白颊噪鹛在非繁殖季节集5～14只的群体，6～8只最多（58.82%），在日出前（25.69±8.17）min苏醒开始活动，日落后（40.23±4.16）min进入树上夜栖；在行为节律上，白颊噪鹛的觅食、运动、警戒、保养、社会行为等5种行为均具有极显著的节律性变化；时间分配方面，白颊噪鹛的觅食时间占52.04%±6.10%，运动时间占13.43%±1.84%，保养时间占13.11%±3.00%[10]。

柯坫华等分析研究了江西省吉安市境内的黑脸噪鹛家族群的夏季分布格局。研究发现，黑脸噪鹛主要分布在市郊疏林灌丛环境，而在城市居民区未见分布。同时测量了家族群相互之间的最近距离，其家族群之间的最小距离平均为600 m，最小的家族群间距为230 m[11]。

吴丽荣在山西芦芽山国家级自然保护区对山噪鹛的生态进行了观察。结果表明：该鸟多在山地疏林灌丛间栖息，在本区种群遇见率为2.35只/km。巢多筑在阳坡灌木、小乔木横枝上，每窝产卵3～5枚，卵由雌鸟孵化，孵化期13～14 d，孵化率为97.44%，巢内育雏12～13 d[12]。

2.3.2 野生蓝冠噪鹛行为学研究。由于蓝冠噪鹛地理分布及数量稀少的原因，对其野外行为观察有一定的局限性，目前对野生状态下蓝冠噪鹛行为研究的文章数量有限。刘智勇等进行了江西省婺源县黄喉噪鹛调查初报，其深入婺源县兵林营自然保护小区，对分布的60余只黄喉噪鹛繁殖群体进行观察。首次记录了自然生境、鸟巢、鸣声、活动与觅食等[13]。洪元华等对黄喉噪鹛华南亚种（Garrulax galbanus courtoisi）4个繁殖地开展了生境调查，并对其繁殖期的活动情况地进行了比较分析。结果表明：黄喉噪鹛华南亚种对天然常绿阔叶林适应性很强，应着手保护天然常绿阔叶林，以维护黄喉噪鹛的自然生境[14]。廖为明等通过研究婺源黄喉噪鹛华南亚种的分布种群、繁殖生态，并分析其栖息地的植物物种，揭示该鸟类与村落环境的依赖关系，对于维持生态平衡意义显著[15]。

2.3.3 人工种群蓝冠噪鹛行为学研究。由于历史的原因，2010年之前人工饲养的蓝冠噪鹛只存在于香港及欧美地区的动物园或鸟类公园，对其圈养环境下的研究多集中于一般的日常管理。虽然这些机构饲养蓝冠噪鹛逾20年，但是一直以来雏鸟第1年的成活率都不足50%，除了疾病和近亲繁殖等因素外，人们还试图研究亲鸟的育雏行为与环境、种群等的内在关系。Anais Tritto研究了法国牟罗兹动物园4个靛冠噪鹛的繁殖行为，以此分析可能导致雏鸟过早死亡的原因。最初员工提出的假设是亲鸟未能担负起育雏的责任，但研究显示事实并非如此，而与之有关可能包括喂食的频率、营养，或者也可能存在的病原体[16]。此外改善饲养环境，如植被的疏密、高低等，不仅会影响亲鸟的一般日常行为，同时也可能有利于繁殖季节里的配对行为的正常表达，而地面的垫料以及是否提供巢材都会影响亲鸟的筑巢行为。

3 结语

目前虽然国际鸟类保护联盟已经将蓝冠噪鹛列入世界急危物种名录，但我国尚未将这一濒危物种明确保护级别，所以加强对蓝冠噪鹛的研究已经迫在眉睫，对蓝冠噪鹛的研究包括栖息地的研究、行为学的研究、遗传基因等多方位的研究，只有深入的研究才能了解其濒危的根源所在，因此才为蓝冠噪鹛的保护提供理论和实践基础。

4 参考文献

[1] 何芬奇，杨岚.黄喉噪鹛分类地位新议[J].动物学杂志，2006，41（5）：127.

[2] ROGER WILKINSON，HE FEN-QI.Conservation of Blue-crowned Lau-ghingthrush（Garrulax courtoisi）in Wuyuan，Jiangxi，and the search for ‘lost’ populations in Yunnan and Guangxi，China[J].Birding ASIA，2010（13）：100-105.

[3] 雷富民，杨岚.中国鸟类的DNA分类及系统发育研究概述[J].动物分类学报，2009（2）：309-315.

[4] 罗旭，屈延华，尹祚华，等.画眉科鸟类系统发育及分类地位商榷[J].动物分类学报，2009（3）：485-498.

[5] 熊伟.部分雀形目鸟类的CoI和Cytb基因序列测定及其系统发育研究[D].雅安：四川农业大学，2010.

[6] 钱朝菊.雀形目13种鸟类线粒体全基因组序列的测定与分析[D].芜湖：安徽师范大学，2013.

[7] 戴传银，陈凯，张瑞莹，等.基于线粒体基因COI和cytb序列的山雀科、攀雀科及长尾山雀属鸟类的分子系统发育分析（英文）[J].ChineseBirds，2010（2）：112-123.

[8] 王洋坤，胡艳，张天真.RAD-seq技术在基因组研究中的现状及展望[J].遗传，2014，36（1）：41-49.

[9] 朱峰，周材权，杨志松，等.四川南充白颊噪鹛的繁殖行为观察[J].动物学杂志，2010（4）：150-155.

[10] 柴璐艳，赵璐玲，纪维雯，等.城市白颊噪鹛群体非繁殖季节的行为节律及时间分配[J].四川动物，2014（1）：66-70.

[11] 柯坫华，龙婉婉，黄族豪，等.合作繁殖鸟类黑脸噪鹛的夏季族群分布格局[J].井冈山大学学报（自然科学版），2011（2）：108-111.

[12] 吴丽荣.山西芦芽山自然保护区山噪鹛的生态观察[J].四川动物，2005（4）：156-157.

[13] 洪元华，郑磐基，刘智勇.黄腹噪鹛在中国婺源的重新发现[J].动物学研究，2002（5）：383-404.

[14] 洪元华，俞社保，廖为明.婺源黄喉噪鹛繁殖生境研究[J].江西农业大学学报，2006，28（6）：907-911.

篇10

【关键词】 IgA肾病； 原发性肾小球疾病； 中医药治疗

中图分类号 R692 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2014）26-0161-03

IgA肾病是大量免疫复合物沉积在肾小球系膜区的一种原发性肾小球疾病，临床上以血尿和或蛋白尿为主要表现，是我国最常见的原发性肾小球疾病。西医学在发病机理和诊断方面有较深研究，治疗方面尚无特效药物，中医药在IgA肾病治疗的研究较多，且疗效确切，显示出一定优势，现将中医药治疗IgA肾病的近况以综述形式阐述。

1 病因病机

王珍等[1]认为，IgA肾病以正虚为本，气阴两虚乃为其最常见证型。邪实为标，邪实之中又以风热、湿热、瘀血等为常见，演变过程中往往虚、实、邪夹杂。并常夹有上焦风热或痰热，中、下焦湿热。病久气血运行不畅，致血脉瘀阻滞。瘀血阻滞脉络可使血不归经，溢于脉外；或瘀血蕴久化热，使热毒更盛，迫血妄行；或瘀血阻滞气机，导致脏腑功能失调，失于疏泄固摄，均可进一步加重血尿，从而使病程缠绵难愈。纵观IgA肾病的发生和发展，先天禀赋不足、气阴两虚是本病发生的始动因素，而湿、热、毒、瘀诸邪不但参与疾病的发生，更是导致病情转变的主要病理因素。曾莉等[2]认为IgA肾病病机多热在下焦。热有虚实之分。实热多因感染外邪，上犯咽喉，肾络与咽相通，故伤肾络而尿血。虚热则内因素体阴虚，外复感热邪，灼伤阴津，导致肾阴不足，虚火灼伤肾络而尿血。脾肾气虚、久病入络、气滞血瘀亦可导致血尿。范军芬等[3]认为根据疾病的发生发展过程，本病属本虚标实、虚实夹杂之证。本虚有气血阴阳亏虚及脏腑虚损；标实主要为湿、热、瘀等，标实是导致疾病恶化的主要病理因素。病位涉及肺、肾、脾、肝，肾是本病中心所在。有学者以《黄帝内经》“病久入深，营卫之行涩，经络时疏故不通”及叶天士“久病入络”为理论指导；以病程长、反复发作，舌暗脉涩为辨证依据；提出“肾络瘀阻”病机学说，认为“肾络淤阻”是慢性肾脏疾病的中医发病机制，“肾络瘀阻”为贯穿 IgA 肾病始终的基本病机[4-6]。周迎晨等[7]认为，IgA肾病的病位在肾，但临床的疾病发生、发展常与肺、脾、肾三脏的功能状态有关。

2 分型辨证论治

王珍等[1]治疗IgA肾病分急慢两型。急性期急性期，多为风热壅盛、迫血下行证，常在外感病后出现。外感咳嗽发热后，治疗以疏散风热、解毒利咽、凉血止血为主，常选用银翘散与小蓟饮子化裁。下焦湿热型治以清热利湿、助运化湿、凉血止血为主，方用八正散合小蓟饮子加减。慢性期宜分型辨证论治，多分为肺（脾）肾气虚证、脾肾阳虚证、肝肾阴虚证、气阴两虚证四证。肺（脾）肾气虚证以玉屏风散合四君子汤加减；脾肾阳虚证以右归丸加减；肝肾阴虚证以知柏地黄丸合二至丸加减；气阴两虚证以参苓白术散加六味地黄丸加减。慢性迁延期以气阴两虚多见，采用滋补肾阴、补益脾气为主要治法，常用药为黄芪、太子参、白术、茯苓、陈皮、山药、生地、玄参、薏苡仁、白扁豆，并依据患者气虚或阴虚的偏重随症加减。余秉治常谓：慢性肾炎病在肾、治在脾，强调调理后天脾胃的重要性，补气健脾法贯穿治疗始终。

洪钦国治疗IgA肾病采用辨病、辩证和辨证相结合，将IgA肾病分为急性发作期和慢性进展期处理。急性发作期偏于邪实，治以祛邪为主；慢性进展期偏于正虚，治以扶正为主。急性发作期分为风热扰肾型、下焦湿热型；慢性进展期分为气虚不摄型、气阴两虚型、阴虚内热型。风热扰肾型，治以疏风清热，利咽止血。方用银翘散合滋阴养咽药，加入玄参、生地黄、沙参等。下焦湿热型治以清热泻火，凉血止血。方用小蓟饮子加减。气虚不摄型治以补气摄血。方用补中益气汤或归脾汤加减。气阴两虚型治须益气养阴止血。选用生脉饮加减。阴虚内热型宜滋阴降火，凉血止血。方用知柏地黄汤合二至丸加减。血尿者加用大蓟、小蓟、白茅根、侧柏叶、茜草、地榆等清利止血；蛋白尿者加用芡实、金樱子、莲肉、莲须、桑螵蛸等补肾固涩；慢性咽炎者配合玄麦甘桔汤；易感冒者配合玉屏风散。弱病情绵长，久病入络，血尿经久不愈，常选用活血止血法，常用益母草、泽兰、三七粉、丹参、当归、蒲黄、茜草、马鞭草等。张丽等[8]认为IgA肾病，在发作前多因外感邪毒，而发呼吸道或皮肤感染，病在上焦，治宜疏风清热，利咽解毒，凉血止血。方用银翘散、小蓟饮子加减。急性发作期以清热利湿解毒为基本原则，旨在清解上、中、下三焦的湿热毒邪，控制炎症反应，达到截流澄源的目的。常选用大柴胡汤、八正散等为主方，临床随症加减。若毒伤肾络，久病入络，脏腑虚损，气机失调，血脉不利，壅滞成瘀。多以补肾活血与止血药物并用，不能一味止血。病久亦郁，肝主疏泄，调畅一身气机，为三焦气机之枢道，病久湿热淤血等标实之证形成。治宜疏利三焦气机，得气血津液运行正常。常以柴玉平肝汤加减，多选用柴胡、陈皮、白芍、川芎、栀子、枳壳、瞿麦等，每每疏肝利胆，调畅三焦气机。

3 专方专用

欧娇英等[9]用滋阴益肾方治疗IgA肾病。滋阴益肾方（女贞子12g，墨旱莲12 g，麦冬12 g，黄芪30 g，白术12 g，茯苓15 g，薏苡仁30 g，积雪草30 g，鹿衔草20 g，六月雪30 g，白花蛇舌草30 g，白茅根15 g）随症加减1个月为1个疗程，连续服用2个疗程。与单纯的尿激酶法进行对比。结果表明滋阴益肾方是治疗IgA肾病的有效措施，与单纯的尿激酶相比该方法具有明显改善IgA肾病患者的临床症状，减少IgA肾病的蛋白尿和血尿，延缓疾病的进展和缩短病程，也有预防IgA肾病复发的作用，无明显的不良反应。赵志新等[10]用常规治疗合五子固肾汤为治疗组（协定方药物组成：黄芪30 g，太子参15 g，枸杞子15 g，菟丝子15 g，五味子9 g，车前子15 g，覆盆子20 g，石韦10 g），对蛋白尿严重者，加芡实20 g，益智仁30 g肾功能异常者，加大黄15 g；水肿者，加泽兰30 g，茯苓15 g。每日1剂，每次150～200 ml，每日2次，8周为1个疗程。对照组常规治疗，结果发现治疗组疗效显著（P

4 中成药治疗

杨柳等[13]将盐酸贝那普利、双嘧达莫为基础治疗治疗。在此基础上，治疗组加用黄葵胶囊治疗。治疗组患者治疗12周后24 h尿蛋白定量、尿RBP及尿β2-MG水平与对照组比较差异均有统计学意义（P0.05）。黄葵胶囊可以减少IgA肾病湿热证患者的尿蛋白，其疗效与福辛普利相似。蒋易容等[15]利用计算机检索关于黄葵胶囊治疗IgA肾病的试验，进行Meta分析。结果显示：黄葵胶囊在减少IgA肾病患者尿蛋白，提高IgA肾病疗效方面优于对照组，但在改善肾功能、改善血尿、降血脂等方面与对照组差异无统计学意义。无研究报道治疗期间不良反应。说明黄葵胶囊可减少IgA肾病患者的尿蛋白，提高IgA肾病疗效确切，但其安全性有待进一步研究。张永秀等[16]将102例患者随机分为A组（缬沙坦组80 mg，1次/d）和B组（金水宝4粒，3次/d与缬沙坦联合治疗组80 mg，1 次/d），观察12周，A、B两组治疗前后尿蛋白变化，每组均较治疗前存在显著性的降低。治疗后B组下降的幅度较A组更明显（P

5 最新进展

随着分子生物学、分子遗传学技术的发展和人类基因组计划的完成，认为IgA肾病是一种多基因、多因素复杂性状的疾病，遗传因素在IgA肾病的发病机制中起重要作用。陈香美、Lim等研究提示IgA肾病发生与Megsin基因遗传变异有关[17-19]。masutani等[20]研究认为IL-4基因多态性可以影响IgA肾病的易感性和疾病发展进程。

随着肾活检的广泛经行，中医学者发现IgA肾病的中医证型与IgA肾病的病理有一定关系。陈香美等[21]研究发现IgA肾病的中医分型与IgA肾病病理分级及病变程度有相关性且通过中医辨证分型可推测肾脏病理改变程度，即IgA肾病临床与病理加重的过程在一定程度上反映了中医证型的演变过程，即脾（肺）肾气虚气阴两虚肝肾阴虚脾肾阳虚。

综上所述，中医药联合西药治疗IgA肾病临床疗效优于单纯西医治疗，且方法不拘一格，可依据各医家的辩证论治、分期论证灵活用药。目前中医对于IgA肾病的病因、病理等方面的研究明显落后于西医。中医所提出的辨证分型多是各医家在自己的经验上进行的，用药也是根据经验用药加减，没有统一的辩证标准，虽临床疗效显著，但是客观性不够，导致祖国医学走出国门困难重重，对祖国医学的长远发展不利。目前应利用现代技术，如蛋白质组学技术、建立动物模型等研究方法来深入研究中医的分期分型与现代医学的关系，建立统一的辩证标准。

参考文献

[1]王珍，冯婷婷.余秉治治疗IgA肾病的临床经验[J].湖北中医杂志，2010，15（6）：22-23.

[2]曾莉，汤水福.洪钦国教授治疗IgA肾病经验简介[J].新中医，2010，42（5）：110-111.

[3]范军芬，李学铭.治疗IgA肾病临证经验撷菁[J].浙江中医杂志，2012，47（1）：10-11.

[4]赵玉庸，许庆友，丁英钧.“肾络淤阻”病机学说及临床应用[C].第21次中华中医药学会肾病分会学术会议论文汇编：21-22.

[5]潘莉，丁英钧，常风云，等.络病理论在IgA肾病中的应用[J].辽宁中医杂志，2010，37（9）：1683-1684.

[6]王聪慧，王筝，丁英钧，等.赵玉庸治疗IGA肾病经验[J].中医杂志，2012，15（8）：645-647.

[7]周迎晨.邹燕勤教授治疗IgA肾病经验[J].长春中医药大学学报，2012，28（5）：799-800.

[8]张丽，张兴坤，张宗礼.张宗礼教授治疗IgA肾病经验[J].长春中医药大学学报，2011，10（2）：191-192.

[9]欧娇英，蔡浙毅，刘琨.滋阴益肾方治疗IgA肾病的临床观察[J].辽宁中医杂志，2010，37（2）：296-297.

[10]赵志新，金玉龙.五子固肾汤治疗IgA肾病蛋白尿的临床研究[J].中华中医药学刊，2012，30（8）：1892-1893.

[11]赵宝生.分消走泄治疗法应用于肾病患者的临床分析[J].中医中药，2012，2（19）：79-80.

[12]夏滨祥，宋艳丽，丁爱国.补阳还五汤结合西药治疗IgA肾病50例的临床观察[J].航空航天医学杂志，2011，22（9）：1146-1147.

[13]杨柳，陈钦开.盐酸贝那普利、双嘧达莫联合黄葵胶囊治疗IgA肾病21例疗效观察[J].南昌大学学报，2010，50（6）：69-70.

[14]王丽萍，张勇，陈建，等.黄葵胶囊治疗IgA肾病湿热证蛋白尿的临床观察[J].中成药，2010，32（1）：18-21.

[15]蒋易容，张紫媛，文集，等.黄葵胶囊治疗IgA肾病疗效和安全性的系统评价[J].中国循证医学杂志，2012，12（9）：1135-1140.

[16]张永秀，彭涛，郭玲，等.金水宝联合缬沙坦治疗IgA肾病疗效观察[J].实用医药杂志，2010，27（5）：413-414.

[17]曾海江，李静，黄郁波.环孢素A治疗难治性肾病综合征的临床观察[J].中国医学创新，2014，11（19）：70.

[18]陈香美，谢院生.IgA肾病的发病与治疗[J].中国中西医结合肾病杂志，2006，7（12）：683-686.

[19] Lira C S，Kim S M，Oh Y K，et al.Megsin 2093T-2180C haplotype at the 3' untranslated region is associated with poor renal survival in Korean IgA nephropathy patients[J].Clin Nephrol，2008，70（2）：101-109.

[20] Masutani K，Miyake K，Nakashima H，et al.Impact of interferongamma and interleukin-4 gene polymorphisms on development and progression of IgA nephropathy in Japanese patients[J].Am-J-Kidney-Dis，2003，41（2）：371-379.