对联左右范文

导语：如何才能写好一篇对联左右，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

1、贴对联的位置，面对大门右手边贴上联，左手边贴下联。

2、这是最传统的贴法，一个特例是根据横批写的顺序来贴。

3、对联的横批也指示了对联的方向，横批从左往右写。

4、上联就贴在左手侧，横批从右往左写，上联就贴在右手侧。

5、区分上下联最主要是按照最后一个字的声调，来进行区分的。

篇2

1、面对大门，视自己的右手边为上首，把对联上联贴在大门门框右侧，把对联下联贴在大门门框左侧。

2、对联，汉族的传统文化之一，是写在纸、布上或刻在竹子、木头、柱子上的对偶语句。对联对仗工整，平仄协调，是一字一音的中华语言独特的文化艺术形式。对联相传起于五代后蜀主孟昶。对联是中国汉族传统文化瑰宝。

（来源：文章屋网 ）

篇3

关键词：口语训练；语文教学；情操；方法

随着教学要求的变化，教学观念的更新，教学过程中越来越注重培养学生口语表达能力，《课程标准》中也对不同学段的口语训练提出不同的要求。众所周知，口语表达训练和语文教学密不可分，它能直接影响语文教学的顺利进行和教学措施的适当实施，语文课堂教学也是培养学生口语能力的一个重要的场所。因此，我们不能把口语训练和语文教学割裂开来.应把它融入到语文教学中去，充分利用教学中的有利时机，有意识地培养学生的口语交际能力。

一、以说，说写结合，双管齐下

表面看，说与写之间没有根本联系，但剖其内部本质，却发现两者有着内在的必然联系：说是写的前提，是写的准备过程；写是说的进一步深化，是结果。因此，我们应将两者有效地结合起来，以说来辅助写，以写来带动说，说写结合，双管齐下，将会收到很好的效果。例如，在教学写景文章，当同学们选取了校园景色作为描写对象后，我先让学生到校园里仔细观察，体验校园景色的优美。很多学生都看清了校园里花的种类、形态，花草掩映的景象，树木的姿态等。回到班级，我没有急于让学生考虑如何动笔，而是启发他们将看到的景物说出来，激发说的兴趣，结果，学生情绪高涨，课堂气氛活跃。有的同学说：“我看到花坛里有各种美丽的花，黄的、粉红的、白的，颜色各异，简直就是花的世界。”也有的同学说：“给我印象深刻的是雪松，常青不衰，从它身上我看到了一种坚强不屈的精神。”等学生介绍完后，我让他们再按自己观察的顺序，有条理地介绍校园的风景。在前面发言的基础上，学生的思维更加活跃，介绍方法不同，内容不同，但效果很好。通过详细的叙述，同学们心中已形成了作文的初稿。在学生余兴未了时，我让学生把各自说的内容有条理地写下来，不知不觉，作文的内容已比较充实，既写好了作文，又训练了学生的口语，可谓“一举两得”。

二、有的放矢，集中训练，陶冶情操

根据《课程标准》具体要求，口语训练应在创设的具体情境中进行，为了达到这一教学目标，苏教版教材中明确安排了“口语交际”的内容。对此，教师应充分重视，不能包办代替，更不能敷衍了事，要有一定的目的性和针对性，因为这是集中训练学生口语能力的重要手段。在课堂上，学生大胆发言，或讲事物的具体特征，或讲事情的来龙去脉，或谈社会的良好风气……在这段属于孩子们自己的时间里，让他们畅所欲言，既能有效地训练学生的口语表达，又能净化孩子的心灵，陶冶情操，从小树立良好的人生观和价值观。例如，在教学一个内容是“某同学过生日，应不应该请同学吃饭”（因为其他同学都有请吃饭的现象）的口语交际时，我决定将课堂上绝大部分时间都由他们自己支配，让他们自己发表看法。果然，同学们都大胆地发表自己的意见。有的同学觉得应该请，因为别人都请，自己不请不好意思；有的认为应该请，不请别人会小看自己。针对“要请”的观点，也有部分同学提出质疑：“我们是学生，还没有经济来源，拿什么来请。”“我们读书需要钱，现在再请吃饭，加重父母的负担。”“我们是学生，应努力学习。”“自己从小要节约。”这样，双方同学各执一词，激烈地辩论起来。待辩论结束后，我先肯定学生在活动中的表现，然后指出：“在现在，我们不应该请吃饭，因为没有经济基础。另外，我们要发扬勤俭节约的优良传统。”这样，既达到了训练口语的日的，又净化了学生的思想，陶冶了情操。

三、形式多样，方法灵活

语文课堂教学要训练学生的听说读写能力，促进学生的全面发展。而口语训练也应融入到教学中，促进教学活动的顺利实施。因此，教学中应合理地安排口语训练。一般来说，小学生童真无邓，爱说爱听，在他们平时玩耍或与家人、朋友交谈时，会无拘无束地大胆发言。教师应该根据学生这个特点，采用多种方法，利用和创设各种情趣，让学生畅所欲言，说他们所说，有利于把他们由课外自发地说转化为课内自觉地说。

1.评论

根据课文的内容、书写方法或结构，让学生评论课文的特点和文章的思想，还可以让学生对教师所读范文进行评论。另外，也可以对老师或学生说话的观点进行评论。

2.自我介绍

在谈堂上，教师可以安排这种以自我介绍为主的活动，介绍自已的姓名、性别、出生年月、性格特点、爱好等，借此来训练学生出口成句的能力。

3.接待客人

在课堂上，教师可以创设接待客人的情境，组织学生进行模拟表演，在表演中训练说话，要求能够根据人物身份的不同，模仿出不同的语言、动作、神态等。这样，既活跃了课堂气氛，又收到很好的口语训练效果。

4.产品推销

篇4

同学们在使馆教育处老师们的指导下，积极地适应环境，争取国外导师的支持和帮助，最高效率、最大限度地利用丰富的学术资源和先进的科研条件开展课题研究。经过一段时间的学习，广大同学深刻意识到“国家建设高水平大学公派研究生项目”的重大意义，意识到该项目是提供大量了解学术前沿和把握学科发展方向的重要机会，不但对个人发展具有重要意义，而且对于汲取新加坡高校建设和科研管理的先进经验，促进中国高水平大学建设具有更加重要的意义。

中国驻新加坡使馆教育处的老师们对同学们而言，既是老师又是家长，他们热情接待每一位赴使馆教育处报到的同学，使同学们虽然身在异国他乡，却强烈地感受到了祖国的温暖和亲人的关怀。新同学抵新不久，教育处就专门组织了“国家公派留学人员及联合培养博士生座谈会”。座谈会上，老师讲解了关于公派留学生管理的相关文件，鼓励同学们牢记使命，刻苦钻研，学有所成，报效祖国。会上老师还详细介绍了新加坡的制度、文化和法律法规，对于同学们关心的问题给出了指导和建议。

考虑到公派学者、学生的特殊性，如访问、留学时间相对较短，学术层次较高，管理相对独立和集中，使馆教育处老师们指导学生于2007年9月成立了“国家公派学者、学生联谊会(新加坡)”(Chinese Govem-ment-funded Scholars and Students Association[in Singapore]，CGSSAS，以下简称联谊会)。联谊会作为国家公派学者和学生自我管理、自我服务的组织，在广大学者、学生与使馆教育处之间发挥纽带桥梁作用，搭建同学之间交流生活、学习经验，共享信息资源的平台，在使馆教育处的指导下开展工作，为公派学者和学生服务。作为在国外建立公派学者、学生组织的一次尝试，联谊会在工作中进行组织建设，在实践中不断积累经验，目前已经初步建立了组织，制度，并开展了富有成效的工作。

联谊会在建立之初，集中进行了网络平台的建设，先后建立了联谊会论坛“留学心园”(http：//vrhere.省略/)，开通了联谊会博客(http：//v-Fhere.blog.省略/)，通过网络工具促进广大公派学者学生进行思想、经验交流，促进信息共享。目前，“留学心园”论坛集中了大量关于新加坡留学生活经验，留学生学成回国发展及其相关管理政策的实用信息，同时也有广大同学们对于留学生活的体会和感受。

2007年9月～11月，联谊会组织了“赴机场迎接抵新同学”的服务活动。被提供接机服务的同学达到60余人，同时广泛开展了协助联系住房，学校报到等相关的互助活动，得到了同学们的肯定，已经促成了互帮互助、资源共享的良好局面。

在“欢度中秋，喜迎国庆”暨公派旅新学者学生聚会活动中，使馆教育处老师莅临活动现场，与广大学者学生共同庆祝传统佳节，祝福祖国。活动激发了同学们的自豪感，坚定了为国争光的理想信念。

在课余时间，联谊会组织了文艺、体育活动，促进了中国文化在新加坡高校内的传播。

目前，联谊会从促进科研交流、积极参加学术活动等角度开展工作，组织活动。先后组织同学参加了“新加坡国防科技展”、“范曾教授和杨振宁教授公开演讲”、“解读当代中国大学”等多场科技展览会和学术报告会，开展了”慷慨激昂，论剑南洋公派留学生互访系列活动”，讨论科研思想，激发创新灵感，交流学习经验。

联谊会的工作不但在广大公派学者学生中得到了广泛肯定和一致好评，而且也吸引了一些自费留学生同学，在共同参与活动的过程中，加深了彼此的了解，建立了友谊。

篇5

1、二传传球速度越来越快。纵观近几年来的世界排球比赛，优秀二传手利用单、双手跳传技术来升高击球点、加快传球出手速度，缩短球在空中的飞行时间，加快进攻节奏成为明显的特点。

2、二传技术越来越具有攻击性。当今世界排坛二传手作为攻击手的队伍普遍存在。例如：前世界冠军古巴女排，场上6名选手都具有相当的进攻能力，因此他们大胆地由原来的“四、二”配备改打“六、二”配各（就是六名攻手，其中两位是二传手），这正是美国男排主教练比尔预言的未来排球的阵容配备，也是未来排球的发展趋势。其主要特点体现在二传手的攻击性越来越强。进攻意识不断提高，二次扣球和二次轻吊球已经被广泛应用。在比赛中，攻击性强的二传手不仅可以进攻得分，而且也可以有效牵制对方的拦网队员，为进攻手突破对方拦网创造有利条件，效果十分显著。

3、二传的核心作用越来越突出。比赛中，二传是教练员战术意图的直接实施者，是全队进攻战术的发起人和组织者。是全队由守转攻的枢纽。在进攻与防守转换的衔接发挥着越来越重要的作用。二传的核心作用越来越突出。

二、现代排球比赛对二传手的要求

二传的作用不仅要把球既稳又准地调整起来，便于本方队员扣球；而且应根据临场情况灵活巧妙地运用各种隐蔽动作，以迷惑对方，造成对方拦网上的错觉和失误，为本方进攻队员创造有利条件。因此，作为一名优秀的二传队员，必须具备以下几项要求：

1、良好的身体素质和快速、灵活的移动能力。二传手应根据第一次传垫球的方向、弧度、速度和落点准确的判断，并迅速的起动和移动，保持好人与球的位置关系。

2、视野宽广。二传要为本队的进攻创造好机会。因此，二传队员必须有宽广的视野，才能通观全场，胸有成竹，并在一刹那做出正确的判断和行动，而观察必须适时，边移动、边取位、边观察。

3、心理素质过硬。比赛时沉着果断、机智灵敏，战术意识强。能准确判断对方的战术意图。了解自己每个队员及对方的特点和特长，善于激励士气。鼓舞斗志。胜不骄，败不馁。能在激烈的比赛中，团结全队不失时机地组织进攻。

4、技术全面性和运用技术的合理性。例如：一传高而逼近球网，二传手应及时跳起作跳传球。击球部位约在额上，靠近网的一只手用力应稍大，以免使球传过球网。一传离网较远（即调整二传），二传手应迅速回撤取位，传球时观察好出球的位置和距离，使出球的方向与扣球手的助跑路线在网前形成恰当的交叉点。一传平快而冲向球网，二传手应迅速卡位，注意脚步站稳，并使重心稳定，避免触网或过线犯规。传球时，靠近球网的一只手要稍加大用力，以免二传过网或传球落网。

三、优秀二传手的基本训练方法

1、加强基本功训练。基本功是排球技术的基础环节，二传的基本功主要包括手、脚、视野、战术意识以及球性五方面内容。其中手是关键，脚是基础，腰是枢纽，[（视野）是向导，意识是灵魂，它们之间相互作用、相互影响。因此，二传的基本功训练要求：手、脚、[（视野）、战术意识和球感练习几个方面的高度统一。只有抓好二传的基本功训练，才能为二传技术的提高打下坚实的基础。

2、抓好重点技术与特长技术的训练。二传技术的重点主要是指一个球队的主要进攻战术的组织方式对二传球的要求。竞技水平高低的不同，二传技术的重点也因队而异。例如：对于水平较低的球队来说，其二传技术的重点是如何组织各种快攻战术传球；对于具备较高水平的球队来说，其二传技术的重点是在熟练组织各种快速多变战术的基础上，如何提高具有掩护作用的跳传球、晃传球以及各种二传的假动作。同时，二传队员在具备能够组织与全队配合的各种战术球基础上，重点发展二传的特长技术，即“绝活”技术，是现代排球比赛对优秀二传队员的要求。

篇6

关键词：形体训练；微课；示范；纠错；自主探究；合作学习

形体训练是优美、高雅的健身项目，通过长期的练习会改善神经系统和大脑的功能，提高心血管系统功能，矫正人的形体，使每个人的形体都具有独特的魅力。在实践练习中形体训练主要通过舞蹈基础练习，结合芭蕾舞、古典舞、民族民间舞等进行综合训练，以动作为语言，强调基本功训练，以达到塑造人优美的体态，培养高雅的气质的目的。教学中教师借助微课来进行形体训练会使学生耳目一新，有效地帮助学生夯实基础，扎实基本功，达到纠正生活中不正确的姿态的目的，有利于学生综合素质的提高。

一、微课方便示范演示，展示生动形象

古人说“窈窕淑女，君子好逑”“形体不蔽，精神不散，亦可以百数”，通过这些语言可以看到形式的重要性。对于学生而言，形体训练可以培养他们超凡脱俗的气质，使他们看起来高贵、典雅。随着科技的发展，在形体教学中教师亦可以融入微课，通过微课的方式来展示教学内容，达到示范演示的目的，促进学生更加了解动作要领和练习技巧，在观看中培养学生的观察力和感知能力，进而采用模仿的方式来提高自己动作的标准性。

例如在进行形体训练的基本站立姿势，手位脚位练习，气息动作结合练习时，教师就可以把这些基本动作录制成一个简单的微课，时间不用很长，5～10分钟即可，展示出动作的要领和技巧。课堂学习时，教师可以通过播放微课的方式给学生进行示范演示，使学生不仅可以掌握动作要领，而且还可以通过生动形象的视频，看到标准动作，从而提高学生动作的规范性，更加标准地进行练习。在观看微课的过程中，学生可以了解正确的立、坐、卧和走、跑，气息在形体训练中的运用，通过模仿的方式来练习，在观看中体会头面部的形态和表现，即人的声、容、笑、貌。微课的帮助减少了教师的重复示范和展示，方便了学生的学习，在观察中掌握动作要领，提高自己的形体。在形体训练中，基本站姿正确与否，直接影响人各种运动行为的美。

二、微课便于纠错更正，体现动作要领

在传统的授课方式中，教师示范后就会让学生进行模拟练习，学生只是按照自己的理解和认识来模仿。可是学生做的动作有些是不规范的，有些是不标准的，甚至是错误的。学生心中并没有一个清晰地认识，他们的模仿并不到位。有了微课的帮助，学生可以反复观看视频，在观看中了解自己的不足和错误，从而自主地纠正错误，提高自己动作的规范性。微课短小精炼，把形体训练中的要点和重点通过寥寥几句就表达的淋漓尽致，使学生可以关注要点，纠正自己的错误和不足，大大提高了学生的练习效率和学习效果。而且视频的方式具有画面生动形象的优势，方便了学生的记忆和模仿，促进学生进行准队形的练习，实现学有所得，乐在其中。例如在进行腿的训练时，教师就可以把相关的包括胯的开度、腿的力量、膝的直立、脚踝关节的柔韧灵活和脚背的勾绷制作成微视频，通过微课的方式来帮助学生纠正自己的错误和不足。在训练中，学生会围绕着芭蕾基本元素“开、绷、直”来完成。由于刚刚接触这些动作，学生出现不标准是很正常的事情。通过对于微课的观察会促进学生观察细节，在细节中追问、思考、发现，进而形成自己的反思，提高动作的规范性，在训练中形成优雅姿态，也传播了它们高雅的艺术精髓。在视频微课的帮助下，学生把自己的练习情况及时地反馈给了教师，有利于教师及时地评价和指导，促进学生对于动作的掌握，统一了学生的精神美和形体美，提高了学生的内涵修养和高雅的气质、风度。

三、微课适合自主探究，学习目标明确

微课是以微视频为核心，并整合了微教案、微课件等内容，是一种实情境化的教学资源环境。它时间短，内容精，展示出了学习要点和重点，促进学生在学习过程中可以关注要点，提高自己的探究能力。微课是基于网络教学基础上的，它打破了时空的限制，学生可以借助手机、电脑来学习，并不是离开了课堂就不能学习了。这种学习模式使学生感受到了随时随地学习的乐趣，他们可以自主观看，自主探究，自主练习，在实践中提高自己的形体素质和学习能力。通过学生的自主探究，他们会发挥自己的的个性，融入自己的理解和认识，促进学生潜能展现，大大提高了学生的学习兴趣。

例如为了提高学生的柔韧性，教可以采用对肩、腰、腿等部位的拉伸练习来实现。教师把教学内容录制成微课，课堂带领学生一起学习、观看，课下传给学生，鼓励学生自主探究，引导学生养成自主练习的好习惯，让学生在探索和实践中发展柔韧性，实现学生的行为美和形体美。

四、微课实现合作学习，围绕微课探究

微课的内容可以循环利用，反复利用，这大大降低了教师的重复劳动，也方便了学生分反复学习。教师可以通过微课的方式把学习内容提供给学生，鼓励学生通过合作学习的方式来探究学习要点和重点。合作使学生可以畅所欲言，交流彼此的经验和感受，提高学生对于形体练习动作要领的掌握。学生可以通过一边观看一边讨论的方式来学习，大大提高了学生对于动作要领的理解，有利于学生形成自己的体会。

例如，为了提高学生的协调性、弹跳力和耐力，教师可以把舞蹈、健美操等组合动作的练习来发展学生的协调性；采用基本功中的俯卧撑、仰卧起坐、踢腿等动作练习来发展学生的力量和弹跳力；采用跑跳操等练习来提高学生的耐力。学习内容多而复杂，使学生有些望而生畏。为了减少学生的畏惧心理，教师可以鼓励学生合作讨论，通过合作的方式来沟通、交流，表达自己的理解和认识，进而在你一言，我一语中提高认识，锻炼能力，让学生的精力更加充沛、旺盛，使学习和工作更有节奏和效率。

总之，微课融入形体教学中给教师提供了很多方便，使学生可以随时随地进行练习，改善和提高自己的形体，从而帮助学生塑造出优美的线条和身形，培养学生良好的体态、优雅的气质。通过微课的指导和帮助，学生会自主练习，提高了学生的健康水平，改善了身材的不足，实现学生的全面发展。

参考文献：

篇7

【关键词】 低聚原花青素；链脲佐菌素；糖尿病；血糖；脂质过氧化物

【Abstract】 Objective Observing the effect of OPC on reducing blood glucose in diabetic rats.Methods The diabetic animal models were reproduced by streptozotocin （50mg/kg）abdominal cavity injection. The positive control group were treated with metformin hydrochloride （MH），［30mg/（kg·d）］，the other two treatment groups were treated with oligomeric proanthocyanidin ［50、500mg/（kg·d） respectively］， the model control and blank group were treated with NS water. After 4 weeks ， their blood samples were drawn， blood sugar and lipid peroxide were detected.Results The blood sugar and lipid peroxide did not change distinctly in the treatment groups with MH， To compare before and after treatment ，the plasmic glucose level and content of serum lipid peroxide declined distinctly in two treatment groups（P＜0.05 or P＜0.01）and 40 per cent of the models of diabetic rats were reduced.Conclusion Oligomeric proanIhocyanidin has an effect of decrease the plasmic glucose and lipid peroxide level of diabetes rats.

【Key words】 oligomeric proanthocyanidin; streptozotocin; diabetes; blood glucose

已有相当证据表明糖尿病及其并发症的发生、发展过程与氧化应激增强密切相关［1，2］。马尾松原花青素 （oligomeric proanthocyanidin，OPC）是从马尾松树皮中提取出来的一类多酚化合物，具有极强的抗氧化活性，是一种很好的自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂［3，4］。一次性大剂量注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）可致β细胞坏死而无胰岛炎，制成无炎性1型糖尿病模型，成模后即出现多饮、多尿和多食表现，其症状体征与临床病人比较相似［5］。本文建立 STZ大鼠糖尿病模型，观察马尾松OPC对DM病理模型血糖水平的影响，为预防和治疗糖尿病的OPC药物开发和临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂 马尾松原花青素（OPC）：桂林莱因生物科技股份有限公司（含量98%）；链脲佐菌素（STZ）：美国Sigma公司；盐酸二甲双胍片：浙江国光生物制药有限公司；血糖（FBG） 试剂盒、脂质过氧化物（LPO） 试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供；柠檬酸、柠檬酸钠等试剂均为分析纯。

1.1.2 实验动物 健康雌性SD大鼠，体重320～330g，购自中国科学院上海实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（沪）2003-0003；使用许可证号：ZYXK（浙）2003-0003。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型（DM）制备 参照文献方法［5］，用 0.1mol/L、pH 4.2的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液配制成0.5％ 的溶液，一次性腹腔注射 STZ（50mg/kg）的方法复制大鼠糖尿病模型，72h（禁食12h）后测定FBG，FBG大于11.1mmol/L者可确定为糖尿病模型大鼠。

1.2.2 分组与给药 造模前随机分出10只大鼠作为正常对照组，造模后确定的DM模型大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组（盐酸二甲双胍）、OPC高剂量给药组、OPC低剂量给药组，每组12只。高剂量组按每日500mg/kg给药，低剂量组按每日50mg/kg给药，模型对照组和正常组每日灌等容量蒸馏水。阳性对照组按每日30mg/kg给药，均于上午灌胃1次，连续治疗4周。

1.3 指标测定 各组大鼠取血前禁食12h，分别断尾取血，供测定血清 FBG、LPO；血糖测定采用葡萄糖氧化酶法，LPO测定采用TBA法，均按试剂盒说明操作。

1.4 统计学处理 各组实验数据以均数±标准差表示，应用 SPSS 11．5统计分析软件进行组间均数差异的 F检验，每两组间均数比较采用 q检验。P

转贴于 　2 结果

2.1 大鼠血清FBG变化 检测结果表明，模型组动物FBG在整个实验过程中一直处于升高趋势，且与正常组差异具有非常显著性（P

2.2 血清 LPO变化 实验结果见表2。模型对照组与正常组相比，血清LPO含量明显升高 （P

3 讨论

链脲佐菌素通过自由基损伤β细胞，使β细胞功能受损，胰岛素合成减少，引发糖尿病［6］。本研究显示OPC具有显著降低糖尿病大鼠血糖，干预 DM 发展的作用，以高剂量作用更为显著，其中有40%的DM大鼠FBG值恢复正常。OPC的作用可能与其强大抗氧化能力有关，能够有效对抗活性氧自由基引起的β细胞毒性的作用、修复胰腺组织氧化损伤作用［7］。

从目前临床所用的降糖药物来看，各种西药都有一定的局限性和肝肾功能损害、胃肠道反应等不良反应，而抗糖尿病中成药的应用也存在着药物组分、含量不明、疗效缓慢等问题，马尾松OPC是从天然植物中提取，具有高效、低毒、高生物利用率的特点，随着世界“回归自然”热潮的形成，OPC有望成为一种新的安全的糖尿病预防和临床治疗药物。

【参考文献】

1 段有金．氧自由基与糖尿病．日本医学介绍，1999，20（7）：331-332.

2 郭婷，逢键粱，王晓波．氧自由基与胰岛素依赖型糖尿病发病机制．国外医学·生理、病理科学与临床分册，1999，19（4）：320-321.

3 吴春，陆海燕，代丽君，等．原花青素的抗氧化活性研究．哈尔滨商业大学学报（自然科学版），2005，21（4）：457-460.

4 刘叶玲．原花青素的药理学研究进展．现代医药卫生，2006，22（15）：2321-2322.

5 黄琛，顾志峰，曹晓蕾，等．Ⅰ型糖尿病大鼠模型建立及稳定性研究．现代检验医学杂志，2007，22（3）：49-51.

篇8

【摘要】 目的 探讨丹参酮ⅡA(TanⅡA)对谷氨酸(Glu)联合β淀粉样蛋白2535 (Aβ2535)诱导PC12细胞、Meynert核(nbM)神经元损伤的保护作用。方法 培养PC12细胞，用MTT法观察TanⅡA三个不同浓度(2.5、5.0、10 μmol/L)对Glu联合Aβ2535损伤PC12细胞的保护作用;运用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术，检测急性分离nbM神经元在Glu联合Aβ诱导损伤时细胞内钙离子浓度(〔Ca2+〕i)变化，及不同浓度TanⅡA对这种〔Ca2+〕i变化的影响。结果 MTT检测结果表明，TanⅡA 各组细胞活力、损伤程度与单纯Aβ+Glu损伤组相比有显著差异(P

【关键词】 阿尔茨海默病;β淀粉样蛋白;谷氨酸;Meynert基底核;PC12细胞

【Abstract】 Objective To explore the protection of TanshinoneⅡA (TanⅡA) on damage of PC12 cells and nucleus basalis of meynert (nbM) neurons induced by glutamate (Glu) and βamyloid protein 25～35 (Aβ25～35). Methods MTT assay was used to observe the protection of different dosages of Tan ⅡA(2.5， 5.0， 10 μmol/L)on cellular damage induced by Glu and Aβ2535. Laser scanning confocal microscopy (LSCM) technique was adopted to detect the change of the intracellular free calcium concentration (〔Ca2+〕i). Results There were significant differences on the cell survival and the extent of damage between the each Tan ⅡA group and Aβ+Glu group (P

【Key words】 Alzheimer′s disease (AD); βamyloid protein (Aβ); Glutamate (Glu); Nucleus basalis of Meynert (nbM); PC12 cells

目前西医治疗阿尔茨海默病(AD)主要是停留在缓解症状上。相比之下，祖国医学在延缓衰老以及老年性疾病的防治方面有着丰富的理论和实践经验，具有潜在的优势和广阔的开发前景。中药丹参〔1〕属于活血化瘀类中药，同时具有养血安神功效。丹参酮ⅡA(TanⅡA)为丹参有效成分之一，为脂溶性、樱红色、针状结晶。TanⅡA分子式C19H18O3，分子量294.33，含有醌型结构，易被氧化还原，可参与机体的多种生化反应而有多种生物活性，如降低血液黏滞度、扩张冠状动脉、抗血小板聚集、清除氧自由基、抗脂质氧化、抗肿瘤、抗菌、消炎、雌激素样作用、保护神经元细胞及改善心脑缺血等广泛的药理作用。在心肌缺血/灌注损伤防治中，TanⅡA具有类异搏停样L型钙通道阻断剂作用〔2〕。本研究将探索TanⅡA对谷氨酸(Glu)联合β淀粉样蛋白2535(Aβ2535)诱导PC12细胞、Meynert核(nbM)神经元损伤的保护作用，以便为寻找有效防治AD中药提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料 TanⅡA (西安鸿生生物技术有限公司);噻唑蓝(MTT)(Sigma公司);DMEM培养基(Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青生物工程公司);Glu、Aβ2535、Fluo3/AM、HEPES、钙离子载体Ionomycin均购于美国Sigma公司;EGTA(Amresco)。PC12细胞为张葳蕤惠赠。实验动物：正常SD大鼠(10～15 d)，体重约20～30 g，雌雄不拘，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 PC12细胞的培养及大鼠nbM神经元的急性分离 PC12细胞用含有15%新生牛血清的DMEM培养基培养，置37℃、5% CO2培养箱内，隔2 d换液一次，当细胞生长达70%～80%融合时传代、继续培养。取对数生长期的细胞用于实验。急性分离nbM神经元的方法参照文献〔3，4〕：根据包新民等〔5〕所编的大鼠脑立体定位图谱来定位nbM。大鼠在10%水合氯醛腹腔麻醉下，快速断头取脑，移入冰的标准细胞外液(通O2)中冰浴约1 min，快速修剪后黏到标本台上放入切片机槽内切活脑片，片厚400 μm，将切片移入标准细胞外液中(通O2)，孵育平衡50 min;31℃条件下，用 0.016% pronase E消化20～30 min;再移入标准细胞外液中平衡1.5～2 h，用特制的针扎取nbM，放入充氧的标准细胞外液中，使用不同内径并经过热抛光的Pasteur玻璃管吹散组织块，使之成为单细胞悬液。移细胞悬液至多聚赖氨酸预处理的Petri培养皿中，20 min后待神经元完全贴附于培养皿上，用标准细胞外液轻轻冲洗培养皿2～3次，洗掉未贴壁的细胞及组织碎片，继续下一步实验。整个实验过程在20℃～26℃条件下进行。

1.2.2 主要溶液及其配制 Aβ的“老化处理”：将Aβ2535溶解于消毒的三蒸水，37℃孵育72 h，使其变成聚集状的Aβ，储备浓度10 μmol/L，4℃保存，用时用DMEM培养液稀释成工作浓度;TanⅡA配制：用二甲基亚砜(DMSO)避光震荡溶解TanⅡA干粉，配成1 mmol/L储备浓度，4℃保存;用时再和培养液稀释成工作浓度;标准细胞外液(mmol/L)：NaCl 150，KCl 5，CaCl2 2，MgCl2 1，HEPES 10，葡萄糖10，将以上成分按浓度溶解于去离子水中，用Trisbase将pH值调至7.4;Fluo3/AM，用DMSO配成885 μmol/L，置20℃避光保存。

1.3 实验处理

1.3.1 PC12细胞的实验处理 取对数生长期的PC12细胞，使其密度约105个/ml，每孔100 μl，接种于96孔板。实验分3组：空白对照组、Glu组、Aβ+Glu损伤组，Aβ+Glu损伤组又分为单纯Aβ+Glu损伤组和TanⅡA组，其中TanⅡA组再分为2.5、5.0、10 μmol/L三个浓度亚组。用100 nmol/L的Aβ提前处理Aβ+Glu损伤组细胞12 h，再加入5 mmol/L Glu处理24 h，TanⅡA组将Glu和TanⅡA同时加入处理24 h，倒置显微镜下观察形态学变化，MTT法观察细胞活力。其中空白对照组加等量的培养液代替。

1.3.2 MTT法检测 取对数生长期的PC12细胞，使细胞密度约105个/ml，每孔100 μl，接种于96孔板。按照上述实验分组(每组8孔)和处理后进行MTT 检测：每孔加入噻唑蓝(5 mg/ml)20 μl，置于37℃、5% CO2培养箱孵育4 h，小心吸弃每孔的培养液后，每孔加入150 μl DMSO，置振荡器震荡至紫色结晶完全溶解，酶联免疫检测仪492 nm 波长，630校正参数，测定光密度(OD)值，以对照组存活率为100%作为基准，来研究分析其他各组变化。重复实验3次。

1.3.3 大鼠nbM 神经元〔Ca2+〕i测定 实验分为空白对照组和Aβ+Glu损伤组，Aβ+Glu损伤组又分为单纯Aβ+Glu损伤组、TanⅡA组，其中TanⅡA组再分为2.5、5.0、10 μmol/L三个浓度亚组。nbM神经元Fluo3/AM负载：急性分离的nbM神经元接种于Petri培养皿。Petri培养皿加入终浓度为8.85 μmol/L的Fluo3/AM 100 μl，37℃避光孵育40 min负载。上机检测细胞负载情况，用标准细胞外液洗去负载液。〔Ca2+〕i动态变化的LSCM检测：将装有负载好的nbM 神经元的Petri培养皿置入载样台，在TCS SP2型激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)下动态扫描细胞荧光强度变化，激发波长488 nm，发射波长526 nm。首先在荧光屏的直视下找出Fluo3负载良好的细胞，观察其荧光图像，于静息状态下快速预扫描2～3 min，获得基线值，然后用微量进样器加入干预因素即时进行检测，并绘出细胞〔Ca2+〕i变化的荧光光密度曲线图。每40 s扫描一次，共扫描40 min。〔Ca2+〕i计算公式为：〔Ca2+〕i=Kd×〔(F-Fmin) /(Fmax-F)〕。Kd是Fluo3与Ca2+反应的解离常数，Kd=400 nmol/L;F为所测到的荧光光密度值;Fmax为加入8 μmol/L的Ionomycin使Ca2+饱和后所测得的最大值;Fmin为加入10 mmol/L EGTA测得的最小值。

1.4 统计学处理 所有数据均以x±s表示，组间的显著性采用单因素方差分析，数据处理过程由SPSS13.0软件完成。

2 结 果

2.1 各组PC12细胞形态学变化 倒置显微镜下形态学观察结果(图1)可见对照组细胞表面光滑、光晕明显、突起长，胞体呈梭形、锥形和椭圆形等;Glu损伤组胞浆内有细小黒色颗粒，细胞形状和对照组比较无明显差异，但细胞周围光晕减弱、细胞密度降低;经100 nmol/L Aβ2535预处理的细胞与对照组比较变化不明显，当再加入5 mmol/L Glu继续孵育24 h后，部分细胞突起回缩，胞体肿胀，胞浆内出现大量黑色颗粒物质，细胞密度显著降低，个别细胞完全崩解;用不同浓度TanⅡA处理后，细胞形态接近对照组，没有明显变化。细胞密度比Glu损伤组明显提高。

2.2 TanⅡA对Glu联合Aβ2535诱导PC12损伤的影响 Aβ+Glu组细胞存活力比对照组降低了12.3%，有显著性差异(P

2.3 TanⅡA对大鼠nbM 神经元〔Ca2+〕i的影响 见表1，与空白对照组比较，Aβ+Glu组〔Ca2+〕i水平显著升高(P

A～F：分别为空白对照组;Glu组;Aβ+Glu组;Aβ+Glu+TanⅡA 2.5、5、10 μmol/L组

图1 各组PC12细胞形态学变化(×250)

3 讨 论

制备可靠的AD模型将有助于研究、寻找AD的有效防治措施，因此建立AD动物模型和细胞模型的研究一直是国内外学者探索的热点。以往用PC12细胞模拟AD细胞模型〔6〕的报告不少，本研究应用的细胞模型是借鉴本课题组前期研究采用原代培养基底前脑神经元模拟AD细胞模型方法〔7，8〕，其特长在于：将亚毒性剂量(100 nmol/L)的Aβ2535与Glu(5 mmol/L)联合作用于PC12细胞和急性分离nbM神经元，在细胞水平以模拟出AD病变发生发展过程中的一个重要的侧面，即与AD病相关的β淀粉样蛋白的神经毒性，谷氨酸的兴奋性毒性的机制，为筛选开发防治AD新药奠定了基础，提供了实验依据。

Aβ是一个含有39～42个氨基酸的肽，为β淀粉样蛋白前体蛋白(βAPP)水解产物。Aβ在脑内沉积是AD组织病理学特征性改变。Aβ引起神经毒性重要部位是第25～35位的氨基酸序列。Glu是哺乳动物脑内正常的且含量最高的兴奋性氨基酸，参与中枢神经系统的信号传递，对神经系统正常功能的维持及学习记忆功能起重要的作用。研究表明兴奋性氨基酸产生的兴奋性毒性与Aβ细胞毒性有协同作用〔7，9〕。早期的Glu持续兴奋作用最终可导致Glu能递质系统衰竭而引起Glu及其受体或受体后改变，这种变化有利于APP产生Aβ。突触间隙高浓度的Glu可间接的通过酸化环境增加Aβ的聚合，导致具有神经毒性的淀粉样蛋白纤维数量增加〔10〕。生理状态下，Glu对神经细胞的兴奋作用快速而短暂，导致神经细胞去极化，产生兴奋性突触后电位，直接参与脑的学习和记忆活动〔11〕;病理情况下，中枢神经系统内的兴奋性/抑制性氨基酸平衡被打破，组织内Glu浓度急剧升高，神经元上的NMDA受体门控的通道是Glu引起的Ca2+内流的主要途径，当其过度激活时可致细胞内钙超载，激活系列链式反应直接导致神经元的退行性病变和迟发性坏死。

1989年Disterhoft〔12〕提出了AD和脑老化的胞内钙(〔Ca2+〕i)平衡自体失衡假说，认为神经细胞内的生理钙浓度是维持其正常功能所必须的，但〔Ca2+〕i的持续升高会导致神经元损伤，为AD的退行性变提供了最后共同通路。本研究采用Glu联合Aβ2535诱导PC12细胞、nbM神经元损伤，一方面表现为PC12细胞活力降低;另一方面观察到了nbM神经元〔Ca2+〕i增加，提示Glu和Aβ2535联合作用可能激活了神经元上NMDA受体，引起Ca2+通道过度开放，Ca2+内流增加致细胞内钙超载。

中药丹参已在临床广泛应用，TanⅡA是丹参提取物有效活性成分之一，文献报道〔13～15〕其具有多种功效。本实验结果表明TanⅡA能提高PC12细胞活力，LSCM观察分析显示TanⅡA浓度在2.5～10 μmol/L之间均可以减轻Glu联合Aβ引起的nbM神经元内钙超载。但TanⅡA对PC12细胞和nbM神经元的神经保护作用在本实验采用的浓度范围内不存在剂量依赖关系。本研究提示，TanⅡA通过提高细胞存活力和维持细胞内钙离子浓度稳态以对抗Glu联合Aβ2535损伤作用。TanⅡA防治AD的详细作用及其机制有待于进一步深入研究。

参考文献

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11 李爱林.谷氨酸的兴奋性毒性于脑创伤〔J〕.国外医学·神经病学分册，2005;32(3)：2314.

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13 邹晓静，孟宪芳，姚尚龙.丹参酮ⅡA对乙醇诱导PC12细胞损伤的保护作用〔J〕.中国药学杂志，2006;10(41)：15536.

篇9

【关键词】 泮托拉唑； 幽门螺杆菌； 慢性胃炎； 对照研究

胃炎是临床最为常见的消化道疾病之一，是指任何病因引起的胃黏膜炎症，常伴有上皮损伤和细胞再生。慢性胃炎的发病率较高，占接受内镜检查患者中的80％～90％。Hp是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃癌和黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的重要病因。根治Hp感染至关重要，但仍有近20％的患者采用推荐的根除方案治疗后，Hp仍未转阴，其原因主要与菌株对抗生素耐药有关［1］。近几年来，由于幽门螺杆菌耐药性增加，标准三联治疗的根除率有所下降［2］。本研究采用泮托拉唑5 d疗法治疗幽门螺杆菌感染的慢性胃炎，取得了较好的效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 入选2010年6月～2011年6月本科住院及门诊有明显异常的慢性胃炎且幽门螺杆菌阳性患者60例。入选标准：（1）符合第三次全国幽门螺杆菌感染若干问题共识制定的纳入标准［3］；（2）患者有消化不良症状，并经胃镜检查证实为慢性胃炎；（3）胃镜胃黏膜活检病理组织切片染色及快速尿素酶法检测Hp均阳性；（4）治疗前1个月内未用过抗酸剂、铋剂及抗生素。排除标准：（1）合并有心、肝、肾功能异常者；（2）妊娠期及哺乳期女性；（3）伴有哮喘、自身免疫性疾病、精神疾病等其他系统性疾病有可能影响观察过程者或长期服用类固醇激素或非甾体抗炎药者；（4）有消化性溃疡出血或中晚期癌症者；（5）对试验中任一种实验药物过敏者。60例患者中，男39例，女21例。年龄25～72岁，平均43.5岁。将患者随机入选三联、四联组，每组各30例。两组患者的性别、年龄差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 方法 治疗组实行PAC方案：泮托拉唑40 mg(2次/d)+阿莫西林1.0 g(2次/d)+克拉霉素500 mg(2次/d)，口服7 d。四联治疗组实行PBMT方案：泮托拉唑40 mg(2次/d)+胶体次枸橼酸铋220 mg(2次/d)+四环素750 mg(2次/d)+甲硝唑400 mg(2次/d)，口服5 d。治疗结束后至少停药4周后复查13C-尿素呼气试验，结果≤4‰为Hp阴性，表示根除成功。所有患者治疗期间随访记录服药期间的不良反应，包括头痛、头晕、嗜睡、恶心、食欲不佳、腹泻、呕吐、便秘、皮疹等，评估治疗药物的安全性。

1.3 统计学方法 应用SPSS 11.5统计软件，Hp根除率均以按实验方案(PP)和按意图治疗(1TT)分析表示，计量资料以均数±标准差（x±s)表示，两组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P

2 结果

2.1 一般情况 三联治疗组30例，有1例因恶心、呕吐自行停药，1例患者失访；四联治疗组30例，1例患者失访。

2.2 根除率比较 三联治疗组根除成功18例，四联治疗组根除24例。三联治疗组ITT根除率为60.0%(18/30)，低于四联治疗组的80.0%(24/30)；三联治疗组PP根除率为64.3%(18/28)，亦低于四联治疗组的82.8%(24/29)，两组Hp根除率比较差异均有统计学意义（P

2.3 安全性比较 各组患者的不良反应无差别，均以恶心、食欲不佳较多见，腹泻、呕吐、皮疹较少见，且症状较轻，停药后不良反应自行消失。三联和四联治疗组不良反应发生率分别为53.3%(16/30)和60.0%(18/30)。

3 讨论

Hp根除治疗是治疗慢性胃炎、消化道溃疡等上胃肠道疾病以及不明原因的缺铁性贫血等胃肠外疾病的重要方面。目前推荐使用的一线根除治疗方案是PPI三联，即联合应用质子泵抑制剂(PPI)和两种抗生素，抗生素一般从克拉霉素、甲硝唑和阿莫西林中选取两种［4］。传统四联疗法Hp根除率可达到90%以上，但是很少用于一线治疗，多用于三联方案根除治疗失败后的补救治疗。四联疗法不能广泛应用的一个重要原因是该方案治疗复杂，不良反应发生率高，患者的依从性也较差。在抗生素选择上，随着克拉霉素和甲硝唑耐药率不断增高，对于甲硝唑、克拉霉素耐药率较高的地区，不少研究尝试使用左氧氟沙星、呋喃唑酮等耐药率较低的抗生素组成新的一线治疗方案，以提高Hp根除率，但不良反应较高，效果也不是很明显［5，6］。

有研究表明， 4 d疗法疗效与7 d疗法相同，但费用明显减少，是效价比较好的方案［7］。因此本研究采用了四联的5 d治疗方案。本研究结果显示，三联治疗组ITT根除率为60.0%，低于四联治疗组的80.0%；三联治疗组PP根除率为64.3%，低于四联治疗组的82.8%，两组Hp根除率差异均有统计学意义，表明四联疗法的疗效较三联疗法好，且不良事件发生率也无明显差别，体现了四联疗法在根治幽门螺杆菌方面的优势，如患者的依从性好，三联疗法不能根除，可使用四联疗法进行治疗。

我国“第三次幽门螺杆菌感染若干问题共识报告”中指出，为提高Hp根除率，避免继发耐药，可以将四联疗法作为一线治疗方案。总之，泮托拉唑、铋剂、四环素和甲硝唑的5 d四联方案Hp根除率高，疗程更短，不良反应少，用药安全。

参 考 文 献

［1］ Gradam DY.Antibiotic resistance in Helicobacter pylori:implication for therapy.Gastroentero logy,1998,115(5):1272-1277.

［2］ Villoria A,Garcia P,Calvet X,et al.Meta-analysisl high-dose proton pump inhibitors vs.standard dose in triple therapy for Helicobacter pylori eradication.Aliment Pharmacol Ther,2008,28:868-877.

［3］ 张万岱,萧树求,胡伏莲.对幽门螺杆菌若干问题的共识意见(2003,中国).中华医学杂志，2004,84:522-523.

［4］ Chey WD,Wong BC.American college of Gastroenterology guideline on the management of helicobacter pylori infection.Am J Gastroenterol,2007,102:1808-1825.

［5］ 邹建,董洁,于晓峰.左氧氟沙星三联方案与常规四联补救方案治疗幽门螺杆菌感染的荟萃分析.世界华人消化杂志,2009,17:1160-1165.

［6］ 李予,王晓艳,沈守荣.4种三联疗法根治幽门螺杆菌的临床疗效观察.中南大学学报(医学版),2008,33:1129-1131.

篇10

[关键词] 骨髓间充质干细胞 视网膜色素上皮细胞 全反视黄酸 共培养 诱导分化

BMSCs是来源于骨髓的非造血干细胞，具有多潜能分化特性。与存在伦理学争议的胚胎干细胞及增殖能力有限的视网膜祖细胞相比，BMSCs以其具有自体同源性、易分离和操作简单等显著优势，成为视网膜细胞移植治疗的理想供体。已有研究表明，视网膜细胞培养上清液能够体外诱导胚胎干细胞向神经细胞分化[1]。本研究旨在探讨BMSCs诱导分化的条件培养基。

1 材料和方法

1.1 主要仪器

THERMO FORMA 3111 CO2培养箱（美国）；AIR-TECH BCM-1000A型生物洁净工作台（苏州）；OLYMPUS 1×70荧光倒置式相差显微镜（日本）；OLYMPUS PMCB20摄影器材（日本）；OLYMPUS BH-2型光学显微镜（日本）。

1.2 试剂

DMEM/F12培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶（均为Gibco公司）、PBS粉（Sigma）、实验用体重为80g清洁级sD大鼠。培养基（DMEM、DMEM／F12）、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；抗体为鼠抗人角蛋白-18单克隆抗体（北京中杉公司），小鼠抗大鼠神经元特异性标志烯醇化酶（NSE），星形胶质细胞特异性标志小鼠抗大鼠单克隆抗体神经胶质酸性蛋白(GFAP)，光感受器特异性标志小鼠抗大鼠单克隆抗体视紫质(Rhodopsin)，(均为Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 hRPE细胞的取材、原代、传代培养及鉴定

采用眼杯消化法[2]，沿角巩缘后3.5mm环形剖开眼球，弃除眼前节、玻璃体及神经视网膜获得眼杯，用0.25%胰酶消化获取HRPE细胞、15％胎牛血清的DMEM/F12培养液培养，细胞接近融合状态时进行传代培养。将第二代hRPE细胞置入六孔板中，孔板中放入18×18盖玻片，利用免疫细胞化学EnVision法检测角蛋白表达。

1.3.2 BMSCs的分离培养，传代培养及鉴定

清洁级SD大鼠，无菌条件下取出双侧股骨，从股骨干和胫骨干中间剪断，用10mLDMEM/F12培养液+20%FBS+肝素反复冲洗骨髓腔，冲洗液经200目不锈钢标准筛过滤掉大的团块后充分吹打混匀获取细胞悬液，接种于25cm2培养瓶中，置于37℃ 5%CO2的培养箱内培养。3d后首次换液，换液时倒除旧的培养液，加入含0.04%EDTA的PBS 4mL，37℃孵育10min，倒除PBS，加入新的完全培养液。当第3代MMSC细胞融合达80%~90%时，利用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD44和CD90表达对细胞纯度进行鉴定[3]。

1.4 实验分组

1.4.1 hRPE培养上清液+BMSCs+RA组：取二代hRPE细胞悬浮液含2000个细胞接种在transwell六孔双层培养板的上层，将BMSCs接种于下层培养板中，接种密度2.0×103个细胞/孔，在双层六孔板的每孔中加入终浓度为1μmol/L的RA，同时在下层放入18mm×18mm盖玻片进行细胞爬片，隔天换液。（还是每日半定量换液）倒置相差显微镜下观察细胞形态。

1.4.2 hRPE培养上清液+BMSCs组：取二代HRPE细胞悬浮液含2000个细胞接种在六孔transwell六孔双层培养板的上层，将MSC接种于下层培养板中，接种密度2000个细胞/孔，同时在下层放入18 mm×18mm盖玻片进行细胞爬片，隔天换液。倒置相差显微镜下观察细胞形态。

1.4.3 单独BMSc置于六孔板中爬片

2周后取出盖玻片进行GFAP，NSE， Rhodopsin，细胞化学染色。

1.5 免疫细胞化学染色

将双层六孔板中爬有HRPE和诱导前、后的BMSCs的玻片取出。

PBS润洗3min×3次；

4％多聚甲醛室温下固定20min，PBS冲洗3min ×3次；

0.1％TritonX.100室温下处理l0min，PBS冲洗3min ×3次；

3%H2O2去离子水孵育10min，阻断内源性过氧化物酶PBS冲洗3min ×3次；

羊血清孵育20min，封闭非特异性结合，勿洗；

适当稀释度的一抗（角蛋白 1:300），GFAP 1:100，NSE 1:10，Rhodopsin 1:25，4℃孵育过夜，PBS冲洗3min ×3次；阴性对照片为用PBS 代替一抗；

二抗（生物素标记的羊抗鼠IgG抗体）37℃ 湿盒孵育30min，PBS冲洗；

DAB显色6min；

苏木素复染；

中性树胶封片。

1.6 统计学分析

将三种培养条件下所表达的阳性细胞进行定量分析。利用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对GFAP、NSE、Rhodopsin表达进行定量分析，每个标本随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度，以每个5个视野的平均光密度的平均值作为该例的测量值；同时选取至少10个随机视野，每个视野在200倍物镜下统计阳性细胞数和整个视野细胞总数，计算阳性细胞率，测量值均以 表示，统计数据采用SPSS13.0统计软件处理。组间差异采用ANOVA分析。以P

2 结果

2.1 hRPE以及BMSCs的取材和原代、传代培养参照文献[2]、[3]报告的方法

2.2 诱导分化的细胞形态学观察及鉴定

hRPE培养上清液+BMSCs+RA组共培养3d后原来梭行的BMSCs 胞体已发生收缩，呈锥形，细胞边缘变得不规整，有零星的细的突起（图1A）。在诱导后14d后，BMSCs 呈渐进性的向神经元样细胞转化，有较多的长突起，有些长突起末端形成生长锥样的膨大及丝性伪足呈典型的核周体形态，多极状（图1B）； 同时BMSC在诱导7D后，部分细胞发生迁移并相互之间建立突触联系(图1C)。与hRPE培养上清液+BMSCs+RA组相比，不加RA则分化细胞明显减少，也少有建立突触联系的细胞（图1D）。

A：3d×400；B:14d×400；C:7d×400；单独BMSCs:D:×400；

GFAP免疫细胞化学染色 E：×400; NSE免疫细胞化学染色F:×400；Rhodopsin免疫细胞化学染色G:×400；BMSCs+RA共培养:H:7d×400。

图1 RPE培养上清液+BMSCs+RA共培养

2.3 统计学结果分析

利用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统分别对两种诱导条件下GFAP、NSE、Rhodopsin表达进行定量分析。

3 讨论

BMSCs是目前备受关注的一群具有多向分化潜能的成体干细胞。具有高度可塑性，在一定诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞以及基质细胞等中胚层细胞分化的能力。近年来，BMSCs 向神经细胞的分化研究受到了极大的关注。本试验所用到的RA是一种维生素A的代谢产物，它可以影响脊椎动物的发育和许多类型细胞的分化。RA常被用来进行诱导多潜能干细胞向神经细胞分化的研究，但机制尚不明确。RPE 细胞可分泌多种细胞因子这些细胞因子, 包括PEDF、FGF、 TGF2β、IL21 等。其中PEDF是一种多效的神经营养因子。对中枢及外周神经系统的许多部位的神经元具有神经营养、神经保护和神经分化作用；bFGF能诱导体内视网膜的重建，刺激所有源自中胚层的细胞以及许多源自神经外胚层和内胚层细胞的增生；bFGF可介导神经元的分化、对光感受器具有重要的保护作用；TGF2β可在正常RPE 细胞中表达。可调控细胞生长、分化、细胞外基质合成。本试验将三者共培养两周，结果显示：BMSCs可以高表达神经胶质细胞及神经元细胞特异性标志GFAP和NSE，同时我们还惊喜地发现诱导分化后的BMSCs表达光感受器细胞特异性标志Rhodopsin。这进一步证明了，BMSCs不仅可以向非间充质细胞转化，还可以跨胚层由起始的中胚层向外胚层发育，这为临床上进一步治疗视网膜和视神经疾病奠定了基础。

参考文献：

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