干细胞培养技术范文
时间：2023-05-04 13:09:18
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篇1
目的： 利用简化无血清培养基和连续传代法，从成体小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞(GNCSCs)，观察细胞体外培养过程中增殖、分化的特点. 用p75， GFAP，Peripherin，αActin作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系. 方法： 将新生1， 5 d的小鼠肠管制成单细胞悬液，接种于无血清DMEM/F12完全培养基中贴壁培养，连续传代培养并观察克隆球的形成过程. 将克隆球接种于含血清的DMEM/F12完全培养基中，观察其分化现象. 用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达. 结果： 成体小鼠肠管中有少数细胞在无血清培养基中存活且增殖形成克隆球. 免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清诱导下可分化为神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞. 结论： 成体肠管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs，在体外GNCSCs可分化为肠神经系统所必须的细胞类型.
【关键词】 肠神经嵴干细胞 小鼠 细胞培养技术 细胞分化 Hirschsprung病
0引言
应用神经干细胞治疗某些神经系统的损伤和退行性疾病，经过较长时间的实践已被证明是行之有效的［1］. 肠神经嵴干细胞（gut neural crest stem cells， GNCSCs）起源于神经管背侧，具有干细胞特性［2］，将其用于治疗先天性巨结肠症及肠神经系统干细胞疾病的研究已引起人们的关注，本实验着重进行GNCSCs的基础研究，为临床应用建立理论基础.
1材料和方法
1.1材料新生1，5 d昆明小白鼠，15只，体质量不拘，西安交通大学医学实验动物中心提供. ① DMEM/F12完全培养基（Gibco）组成：B27添加剂（Gibco），N2添加剂（Gibco），重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF， vitrogen)， β巯基乙醇（Sigma），青霉素和链霉素（华北制药）. ② 促分化培养基组成：DMEM/F12完全培养基除bFGF外再添加100 mL/L肽牛血清. ③ 其他：胰蛋白酶、Ⅳ胶原酶（Sigma），左旋多聚赖氨酸（Sigma）. 一抗：兔抗小鼠NGFRp75（武汉博士德）、兔抗Peripherin多克隆抗体(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗体（DAKO），鼠抗小鼠αActin单克隆抗体（Sigma）SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（博士得生物工程有限公司）. 二抗为TRITC标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉).
1.2方法
1.2.1取材、克隆球的培养颈椎脱臼法处死2组小鼠，将其肠管放入Hanks，清洗，机械分散肠管组织，胰蛋白酶和Ⅳ胶原酶分别消化肠管组织30 min，10 min，终止消化后反复吹打制成单细胞悬液，用200目，400目的滤网过滤，以800 r/min 离心 5 min，弃上清，用预先配置的无血清完全培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数活细胞，以 6×108个/L接种到25 mL培养瓶中，添加培养基至4 mL. 在37 ℃， 50 mL/ L CO2，饱和湿度培养箱中水平放置，贴壁培养. 原代孵育24 h后弃去漂浮的死细胞，以2/3量换液，孵育3 d后进行传代，以6×108个/L接种到25 mL培养瓶中，继续孵育40~48 h后再次传代，如有细胞团块形成则以1代/1~2 d的速度传代，3代之后可形成圆形的克隆球.
1.2.2克隆球的分化用含100 mL/L胎牛血清的完全培养基重悬传代5次后的克隆球，接种于放置有预先包被左旋多聚赖氨酸盖玻片的35 mm培养皿内，每皿2 mL，动态观察克隆球的分化情况.
1.2.3克隆球及其分化细胞特异性标志物的染色应用p75NTR， GFAP， Peripherin，αActin抗体分别检测克隆球及其分化细胞系的性质，封片后分别用光学显微镜和激光共焦显微镜取图.
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2结果
2.1克隆球的生长状况接种初期，倒置显微镜下观察到单细胞和一些呈半球状或不规则的细胞团. 孵育24 h后，贴壁细胞胞呈圆形，胞体小，折光性好，部分贴壁细胞胞体增大，折光性增强，出现分裂相，形成2～5个细胞的细胞团，另一部分呈聚集生长. 3 d后形成十几或数十个细胞构成的克隆球(图1A)，克隆球增大的同时向周围伸出放射状的细胞索，形成较小的次级克隆，这些克隆球形态完整，折光性减弱，周边界线清晰，但其中心密集，界限不清，无法观察到完整的细胞结构 （图1B）. 重新传代培养，可观察到细胞胞体增大，出现分裂相的克隆球数量逐渐增多，杂质细胞减少，在连续传代过程中克隆球逐渐纯化.
2.2克隆球的分化接种含血清培养基12 h后，可见有细胞从克隆球中迁出，迁出的细胞贴壁生长；24 h后克隆球变扁，迁移出的细胞增多，相差显微镜下难以分别形态；48 h后贴壁细胞数量明显增加，逐渐形成单细胞层且细胞形态多元化.
2.3克隆球及其分化细胞系的免疫染色免疫细胞化学方法进行p75， Peripherin， GFAP， αActin免疫染色（图1C，图2， 3）.
3讨论
许多研究表明GNCSCs在ENS的发生和发育起关键作用［3-4］. 目前HSCR的病因与RET等8种基因密切相关［4-5］，在RET等基因缺失模型中， GNCSCs的生存、增殖、迁徙及分化等功能发生障碍，受累肠道的相应神经节出现缺失，表明先天性巨结肠可能是一种干细胞疾病. 由于HSCR及肠神经系统干细胞性疾病在手术治疗后仍遗留有严重的并发症，因此用干细胞来进行临床治疗已成为研究的热点和重点. 鉴于胚胎干细胞的来源限制及免疫排斥问题，成体GNCSCs的研究将为今后的移植试验提供新契机.
GNCSCs的培养方法建立在中枢神经干细胞的基础上. 依据神经干细胞经典的培养方法，再结合GNCSCs“收获率”低、难以分离纯化的特点，联合应用简化的特殊培养剂和神经干细胞培养方法进行体外培养. 连续传10代后，GNCSCs的相对比例明显增加，这种体外培养的方法能有效地分离和纯化GNCSCs，但并不能完全消除其他细胞. 如果继续传代，其纯化程度越高，后续的试验效果将更佳. 连续传代不仅纯化了GNCSCs，还证实了干细胞的自我更新特性. 在体外培养干细胞时，培养条件稍有变化可导致分化机制的启动，因此采用血清促分化法诱导GNCSCs分化既简单又可靠. 通过免疫染色，证实了GNCSCs分化细胞的类型，同时显示了分化的亚型神经元及神经胶质细胞的形态，并表明了成体干细胞的多向分化能力.
参考文献
［1］ 杨帆，杨树源. 神经干细胞研究进展及临床应用前景［J］.医学综述， 2002；8(8):491-493.
［2］ Newgreen D， Young HM. Enteric Nervous System: development and developmental disturbancespart2［J］. Pediatr Dev Pathol，2002， 5(4): 329-349.
［3］ Natarajan D， Grigoriou M， MarcosGutierrez CV， et al. Multipotential progenitors of the mammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture［J］. Development 1999， 126(1):157-168.
篇2
“细胞悬浮培养技术是在传统的转瓶培养基础上发展而来的大量培养动物细胞的新兴技术，目前，该技术在欧美国家仅用于小规模生产人用禽流感疫苗。”此前，山东信得有关负责人说，作为一家同时拥有生物制品、生化制药、兽药制剂、饲料添加剂及兽药原料药五大产品线的高科技公司，山东信得首次实现了细胞悬浮培养技术在动物用禽流感疫苗研发生产中的规模化应用，而这一研发生产过程持续了7年之久，从“十一五”期间就开始了。产技术研究与开发项目引起了业界关注，并得到国家科技部门的支持，作为我国兽药行业加快提升行业生产技术水平的代表项目。
为此，在2010年，山东信得专门成立动物疫苗有限公司，并投资1.5亿元建成了国内首家大规模细胞悬浮培养工艺生产高致病性禽流感灭活疫苗的GMP车间，并于次年初通过了农业部的GMP动态验收，获得GMP证书和兽药生产许可证。2012年，山东信得获得农业部颁发的禽流感细胞苗新兽药证书。
“此次获得重组禽流感病毒（H5N1亚型）灭活疫苗的生产文号，标志着山东信得研发生产的产品将由此进入规模生产阶段，并能面向市场供应。”山东信得有关负责人表示，同时也说明了细胞悬浮培养技术已经打破多年来动物疫苗生产行业一直采用鸡胚生产禽流感疫苗的技术瓶颈，标志着我国在禽流感疫苗的研发和生产方面，已经走到了世界技术前沿，具有极大的引领和示范作用。
据了解，采用细胞悬浮培养技术生产高致病性禽流感疫苗，基本上能够克服鸡胚孵化生产工艺的缺点，是我国动物疫苗生产的发展趋势。具体来说，该技术避免了鸡胚培养中由于含有大量杂蛋白而存在的安全隐患问题，以及由于鸡胚废弃物处理不当而存在的散毒危险。同时，由于各种技术参数由电脑程序统一操控，整个生产过程更加可控，无外源病毒污染和母源抗体影响，疫苗质量批间差异最小化，产品更加稳定。“简单来说，就是技术更先进、质量更可控。”山东信得这位负责人认为，该工艺的改进，给我国乃至世界动物疫苗产业带来了技术升级，将提升疫苗的工业化生产水平，为养殖户提供安全、优质、高效的疫苗。
篇3
【关键词】间充质干细胞；大鼠
【中图分类号】R587.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0044-02
引言
研究表明，骨髓含有造血干细胞（hemopoietic stem cells， HSCs）、内皮祖细胞（endothelial progenitor cells， EPCs）和间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等多种成体干细胞。EPCs主要分化为血管内皮细胞，有助于血管疾病组织的血管新生；而HSCs和MSCs均具有多向分化潜力的特点，研究表明，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）可分化为成骨、软骨、心肌、肌腱、上皮、内皮等几乎所有三胚层类型细胞的能力[1-3]，基于这个特性使BMMSCs成为了中药诱导、临床移植及一些分子生物学实验的种子细胞源。因此，本实验采用最简单普通贴壁培养法分离、培养大鼠BMMSCs，若能得到较为纯净BMMSCs，在节约了培养BMMSCs成本基础上，提供了一种既简单又能稳定获得纯净BMMSCs的方法，为相关的实验提供丰富的BMMSCs。
1 材料和方法
时间及地点：于2009-09/2011-02在遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室完成。材料：清洁级SD大鼠，购自第三军医大学大坪医院动物实验中心[许可证号：SCXK（渝）2007-0005]。本研究所采用的动物实验操作程序经遵义医学院实验动物伦理委员会审议批准。主要试剂：LG-DMEM ，Gibco（New York，USA）
实验方法：
大鼠BMMSCs的分离、培养：颈椎脱臼法处死2～3周龄SD大鼠，无菌条件下手术取下两侧完整股骨（连同肌肉），浸入0.1%新吉尔灭15 min；剥离股骨附着肌肉，并用含双抗的D-PBS反复清洗。剪开股骨两端，用D-PBS冲洗骨髓腔，收集含骨髓细胞的洗脱液，1000 g离心5 min，弃上清，细胞沉淀用含10% FBS的LG-DMEM培养基重悬浮，每只大鼠分离的骨髓细胞接种两个T25培养瓶，置37 °C、5% CO2饱和湿度培养箱培养。每2 d换液1次，同时洗脱未贴壁的血细胞，倒置相差显微镜下每日观察细胞生长情况并照相。当BMMSCs生长汇合度达60～70 %时，采用0.125%胰蛋白酶消化法，按2～5×105个/ml细胞密度进行传代培养。
大鼠BMMSCs表型鉴定：取第3代BMMSCs进行CD45、CD29和CD90表型分子的流式细胞仪检测，具体步骤如下：0.125%胰酶消化BMMSCs并制成单细胞悬液，1000 g离心5 min；弃上清，加入D-PBS振荡混匀，1000 g离心5 min；弃上清，加入适量D-PBS振荡混匀；向预先加入各表型分子抗体的流式检测管内加入100 ?l细胞悬液（细胞数不少于100 000个），各管分别含PE Mouse IgG1/FITC Armenian Hamster IgG、PE anti-rat CD45/FITC anti-mouse/rat CD29及PE anti-rat CD90/mouse CD90.1不同荧光素标记的流式细胞仪检测抗体，振荡混匀，避光孵育20 min；每管加入2 ml D-PBS，振荡混匀，1000 g 离心5 min；弃上清，每管加入250 ?l 1%多聚甲醛固定液，振荡混匀，4 ?C保存待此后上机检测。
篇4
关键词：IPS细胞；分化；造血干细胞
0 引言
目前，临床上普遍使用造血干细胞移植，用于白血病、非霍奇金淋巴瘤、地中海贫血等病的治疗。造血干细胞的主要来源是脐带血、骨髓。如果直接进行骨髓移植，则需要进行人体的白细胞抗原配型，否则发生免疫排异会危及患者生命。现有脐带血库储存的造血干细胞免疫原性弱，但数量供不应求，使其在疾病中的临床应用中受到限制。随着诱导性多能干细胞（IPS）提取技术的出现，使分化自身细胞变为了现实，不但避免了伦理问题，解决了免疫排斥问题，造血干细胞的数量也能满足临床需求。下面将分化研究过程报道如下：
1 材料和方法
1.1细胞株的来源
小鼠骨髓基质细胞OP9购于美国ATCC，诱导性多能干细胞IPS由中科院广州生物医药与健康研究院提供。
1.2试剂和仪器
小鼠骨髓基质细胞OP9的培养基为α-MEM，内含20%的胎牛血清，OP9细胞诱导干细胞分化培养基为α-MEM（15%的DFBS、0.25%胰酶、0.1%明胶），CD34来自MACS公司。抗体为APS-TRA-1-85，半固体培养基购于SCT公司。流式细胞仪为美国AccuriC6型，定量PCR仪为CFX96型。
1.3方法
在六孔板中先铺好1%的metrigel进行细胞培养，每三天添加0.5mmol/L的EDTA，以保持对照组细胞的未分化状态，OP9用细胞培养液培养，培养时放在大小为10cm且铺有0.1%的明胶的盘里，，每隔四天用胰酶消化传代。细胞培养温度为37℃，CO2浓度为0.5，湿度饱和。
OP9细胞进行传代培养4天后，将OP9的培养液换成诱导干细胞分化的培养液，将UC013细胞洗两遍后，再对边缘部位细胞进行消化，将细胞吸出后加入Dispace，再用枪头吹吸混匀细胞后，将其转移到加有分化培养液的细胞盘中摇匀，在与上述培养的温度、空气CO2浓度和湿度相同的条件下进行培养，培养的第二天将培养液换为共培养液，第四天开始每隔一天半换一次培养液，第九天收样品。
免疫磁珠法分选CD34+细胞，将细胞用PBS洗两遍，接着用胰蛋白酶进行消化，制备单细胞悬液，再将细胞收集到离心管中进行离心，收集沉淀，再向其中加入2%血清吹打均匀。过滤后，向其中加入FCR和 CD34标记细胞，30秒后加入流式细胞缓冲液，再离心，然后吸取上清，加入流式细胞缓冲液重悬。将制备好的细胞悬液加入流式细胞仪进行分离，通过流式细胞仪分离柱的CD34-细胞被移出分离柱弃之，最终，通过加压洗脱分离柱上黏附的细胞，即得到CD34+细胞。
用流式细胞术进行检测，将共培养9天后的细胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化后，制备单细胞悬液，收集到离心管中，静置五秒后，用加有2%血清的流式缓冲液重悬，细胞过滤后，加入FCR和抗体，孵育15min，再用流式缓冲液清洗，重悬，最后用流式细胞仪进行检测。
集落形成实验。将分选的CD34+细胞接种到半固体培养基中，放于培养皿中进行培养，每孔接种1万个细胞，培养14-16天。然后，在显微镜下根据集落成的血细胞形成特征，对集落细胞进行分类和计数。同时，提取共培养2、4、6、8、10和12天的细胞的RNA，用RT-PCR法检测各基因在细胞中的相对表达量。
2 结果
2.1细胞培养与观察
观察培养的细胞，结果显示，对照组未分化的人体细胞集落状生长，呈扁平状，排列紧密，没有分化的迹象。实验组培养2天后的细胞，表面布满细胞集落，已进行造血干细胞分化。OP9细胞贴着细胞壁生长，细胞为三角形，周围向外出伸出像纤维状的伪足，细胞排列规则，生长迅速，培养4天后细胞铺满了培养皿底。
2.2诱导造血干细胞分化
通过在本实验组的诱导分化条件下，对实验组和对照组细胞的培养，实验组细胞分化到一定程度后，便开始大量克隆，细胞的形态也发生了分化，接着，OP9细胞开始出现老化迹象。
2.3流式细胞术检测
共培养9天后用流式细胞仪检测细胞造血表面标志物表达情况，用流式细胞仪分析培养细胞的CD34、CD43、CD31的表达情况，结果显示表达上述表面标志物的细胞分别占有比例为20%、2%和7.1%。
2.4 4RT-PCR检测
运用RT-PCR对共培养的细胞进行基因表达检测，结果显示，IPS细胞发生造血分化时，Oct-4基因的表达慢慢消失；造血转录因子基因表达缓慢升高；Runx-1基因在造血干细胞分化12天当中的表达呈波浪式变化，其中分化第二天表达量最高，第四天开始下降，第八天开始升高；CD34在造血分化过程中的基因表达量逐渐增高。
2.5 CD34+细胞集落实验
CD34+细胞在半固体培养基中进行培养，根据造血干细胞的形态特征，对细胞集落进行分类和计数。结果显示，红系集落（CFU-E）、粒系集落（CFU-G）、巨核系集落（CFU-M）、粒―巨核系集落（CFU-GM）集落数量持续升高，混合系集落（CFU-GEMM）的集落数量逐渐降至最低。
3 讨论
随着干细胞技术的发展，通过诱导分化得到造血干细胞已经成为事实。相对于多能干细胞而言，IPS通过导入转录因子以及重编程进行定向分化的比例较低，，但是IPS的获得方法比较简单稳定，避免了胚胎干细胞面临的伦理和法律等问题，使IPS可以应用于细胞替代性治疗，并可以进行疾病的机理研究和肿瘤治疗药物的筛选。IPS细胞分化得到的造血干细胞免疫原性较低，解决了移植排斥的问题。
在本文的研究中，没有外加细胞因子，直接将IPS细胞诱导分化为造血干细胞，结果获得了20%的CD34+细胞，即造血干细胞，CD34是表达于造血干细胞的表面标志物，表明IPS可以分化为造血干细胞，但是转化率比较低。Runx1是调控造血干细胞分化的转录因子，期基因的表达量在分化过程中呈现波浪式的变化，Gata-2的表达则逐渐升高。体外分化得到的造血干细胞在半固体培养基中成集落状态，说明IPS可以向各细胞系进行分化。
现在多能干细胞分化为造血干细胞的方法主要有：一是形成胚状体后再进行诱导生成造血干细胞；二是基质细胞与多能干细胞共培养；三是形成EB后与OP9进行共培养；四是单层诱导ESC生成造血干细胞。利用OP9细胞与胚胎干细胞共培养，可以模拟体内的造血微环境，为研究细胞定向分化为造血干细胞创造了可能性，OP9细胞主要支持早期的造血干细胞分化，并协助B淋巴细胞增殖。基质细胞通过释放的细胞因子支持造血干细胞的分化。这种诱导方法分化时间短，为临床造血干细胞的移植提供了便利。诱导分化过程中不用添加细胞因子，比较经济。但该诱导方法也存在着一定的缺点，即存在鼠源性污染细胞的可能性，加之所用血清的成分的不明确性，限制了其在临床应用。
目前临床上移植造血干细胞主要是用脐血和骨髓来源的造血干细胞，而体外分化和扩增得到造血干细胞只能通过动物试验来获得。将造血干细胞植入重建小鼠体内，可以评价造血干细胞的功能。体外分化获得的造血干细胞和脐血中的造血干细胞与重建小鼠体内造血系统差异较大，需要进一步优化体外诱导多能干细胞分化为造血干细胞的过程，才能满足该实验需求
4 小结
通过将IPS定向分化为造血干细胞的研究，成功诱导了造血干细胞，分化得到的细胞在体外培养中形成了所需的各系集落，本文的研究所采用的技术方法希望可以为IPS细胞在造血疾病中的应用提供一定的实验依据。
参考文献：
[1]张坤等.体外诱导人类诱导性多能干细胞分化为造血干/祖细胞的研究，中国实验血液杂志，2014.01.
篇5
一、分子水平的克隆—PCR技术
该科技技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。
PCR由三个基本反应步骤：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链 DNA解旋，使之成为单链，以便它与引物结合;②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合;③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
二、细胞水平的克隆—动物细胞培养技术
动物细胞培养是用酶解法将组织碎块分离成单个细胞，用培养液制成细胞悬浮液，在体外适宜条件下使细胞生长繁殖，并保留一定的结构和功能特性。
(一)细胞培养所需的条件
1.培养液
现多用合成培养液。合成培养液有多种，不同培养液适用于不同细胞。可根据培养细胞的特殊要求进行添加：抗生素、有机补充物(如丙酮酸钠，谷胺酰氨等)、促细胞分裂因子(生长因子类的FGF等)、贴壁和铺展因子(如胶原蛋白，纤粘蛋白等)。
2.血清
在细胞培养液中必须添加一定量的血清方能获得成功。血清中除了含有细胞生长的部分氨基酸外，还有促进细胞生长和贴壁的成分。不同动物血清的作用差别很大，即使同一种动物的不同个体间的差异也很显著。不同种细胞要求血清量也不同，大部分细胞生长液中加入10%血清已可满足细胞生长要求。目前国内外正在研制无血清培养液，以避免血清中某些物质对细胞生长和病毒复制的影响。
3.PH
细胞生长的PH为6.6-7.8，但最适PH 7.0-7.4。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐、磷酸氢盐和血清。
4.温度
细胞培养的最适宜温度应与细胞来源的动物体温一致。
此外，成功的细胞培养还需要严格的无菌操作及洁净的培养器皿。
(二)细胞生长的三个阶段
1.潜伏期
细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。
2.指数生长期
指数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。
3.停滞期
即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。
(三)动物细胞的培养
1.原代细胞(primary cell)
动物组
织经胰蛋白酶等消化、分散、获得单个细胞，在培养皿中大多数组织均可制备原代细胞，但生长的快慢及难易程度不一。原代细胞一般对病毒较易感染，尤其是来源于胚胎或幼畜组织的细胞。
2.二倍体细胞株(diploid cell strain)
将长成的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其细胞染色体数与原代细胞一样，仍为二倍体。此种细胞数量可扩大，对病毒的易感性则基本无变化。
3.传代细胞系(establishell cell line)
与上述两类细胞不同，这类细胞在传代过程中染色体发生异常变异，在体外可无限制分裂。
三、个体水平的克隆—动物细胞核移植技术
所谓细胞核移植技术，就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。
(一)供体核的获得
供体核可以是早期胚胎细胞、胚胎干细胞和体细胞。早期都采用合子核到64细胞期的胚胎细胞核质体分裂球作供体细胞核，80年代开始，随着胚胎干细胞(embryo stem cells，ES)的建立和对其研究的深入，人们对胚胎干细胞在核移植方面的应用前景寄予厚望，但ES建系太困难，仅在小鼠上获得成功。1997年 Dolly羊的出现，开始了体细胞的核移植，并发展很快。
(二)受体细胞去核
作为细胞核移植的受体细胞主要有三类：去核的卵母细胞、受精卵和2-细胞胚胎，其中卵母细胞应用最为广泛。研究证明，体外成熟培养的卵母细胞核移植成功率不如体内成熟的卵母细胞，其原因可能是卵母细胞在体外成熟过程中，需要合成一些蛋白质来完成第一次减数分裂，其活动有可能受到抑制。
(三)核卵重组
在显微操作仪操纵下，用一直径接近卵裂球大的移植针吸取一枚分离出的完整卵裂球，注入去核的受体卵母细胞的间隙中，根据移入的部位不同，可分为带下移植和细胞质内注射。在移植针移开后，对移植卵裂球上方的透明带施加压力使卵裂球与卵母细胞接触。
(四)细胞融合与激活
由于卵细胞去核过程中破坏了卵膜和一部分细胞质，若直接移植，成功率很低，故需对重组胚融合，其采用的方法有仙台病毒法、物理或化学方法(如电融合法、钙离子载体、乙醇、蛋白质酶合成抑制剂等)激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育过程，电融合法更常用。
(五)重构胚培养与移植
重构胚需一定时间的培养，方可移植到受体，家兔和猪重构胚在体外培养24h以内，就可通过非手术移植，而羊和牛重构胚所需培养时间较长，一般发育到囊胚或桑椹胚时移植。
篇6
失误带来美容技术革命
目前笔者采访了GSG的研发中心王健教授。王教授向记者谈到：我们研发中心其实是研发细胞、基因技术和产品的研发机构。对于GSC产品的出现完全是一次意外的失误。一名研究人员将GSC液体瓶错误地放到了细胞培养皿中。事后发现了，但为时已晚。我们都认为这一批细胞培养的实验白做了，但经过7天的培养之后，意外情况出现了：培养皿中的细胞不但没有死掉，反而生长的比以前还要好。特别是培养间充质干细胞的培养皿中，间充质干细胞比其他细胞生长得更好。并且间充质干细胞向成纤维前体细胞分化，而成纤维前体细胞最终发育为成纤维细胞。大家都知道，成纤维细胞是延缓皮肤衰老的最关键的生物物质。
自我调控细胞生长代谢
谈到GSC产品恢复皮肤健康年轻态王教授说道：维持皮肤中各种细胞新陈代谢青春水平不是随心所欲的，有两个关键环节：一是细胞代谢不是越快越好，而是要将细胞代谢的周期调节到年轻时的节奏。二是调节细胞恢复代谢节奏，只能通过自身生理功能来完成。大家都知道，人是无法直接吸收细胞的，皮肤上直接涂抹的细胞也是无法进入人体的，包括一些大分子的蛋白。所谓细胞美容或干细胞美容，都是一种宣传上的噱头。真正意义上的细胞美容是通过小分子的细胞因子通过透皮吸收后，进入人体，与自身细胞上的受体结合，刺激自身细胞活跃起来，加快增殖分化速度，增加新生细胞的数量，满足皮肤的生理需要，从而到达美容的目的。GSC活肤液都是小于10～15个氨基酸的小分子，我们称之为生物细胞因子群。从细胞生物学角度讲，细胞在人体内的生长发育，依赖于一个小环境，也就是“微生态环境”。在这样一个小环境之中，细胞受到多种细胞因子和营养蛋白的调控，才能使细胞本身正常生长发育。单一的或少量的细胞因子是不能为细胞创造一个最佳“微生态环境”的。这些细胞因子的体积很小，可以在皮肤细胞之间通过。因此，可以透皮吸收，进入到真皮与皮下组织之间，激发那里的间充质干细胞的活力，使之加快增殖分化的速度。使真皮组织中成纤维细胞数量增加、活性增强。细胞因子在表皮的基底层部分，激发了那里的基底层表皮干细胞活力，使表皮干细胞加快增殖分化的速度，通过真皮和表皮新生细胞加快生长，使皮肤细胞新陈代谢恢复到年轻状态。
延缓皮肤衰老的法宝
GSC产品首席科学家陆敏医学博士告诉笔者：GSC活肤液能够增加真皮组织中成纤维细胞的数量和活性，这是一场美容界的革命。真皮组织的衰老、塌陷，是造成皮肤暗哑、粗糙、皱纹的主要原因。而真皮组织中胶原蛋白的保有量随着年龄的增加而逐渐减少是造成皮肤衰老的最重要的生理原因。因此，胶原蛋白一定要依靠自身生理功能来补充，真皮组织中的胶原蛋白主要来源于成纤维细胞的分泌。真皮组织中成纤维细胞数量和活性，决定了真皮组织中胶原蛋白数量的多少。GSC活肤液通过增加自体成纤维细胞的数量和活性，达到增加皮肤内胶原蛋白数量的方法，完全是一种生理性调节、依靠自身生理功能提高而达到延缓皮肤衰老的方法，是纯天然、无损伤、保健型的美肤方法。
篇7
[关键词] 骨髓间充质干细胞 光感受器细胞 诱导分化
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)，是一群具有多向分化潜能的均质性成体干细胞，它具有两项干细胞最显著的生物学特性：自我更新 (self-renewa1)能力及多向分化潜能。1968年, Friedenstein[1]等学者首先报告骨髓中存在一种细胞具有高度的自我更新能力和多向分化潜能,他们认为这种细胞可能是间充质细胞的前体。随着研究的发现，MSC具有向中内外胚层组织细胞分化的能力 ,可以在体外被诱导分化为肌肉细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、肝细胞、上皮细胞、神经细胞等[2, 3]。近年来，BMSCs向神经元细胞的分化的研究成为了研究的热点。可利用抗氧化剂、生长因子、维甲酸、共培养等将骨髓间充质干细胞诱导成神经样细胞[4-6]。本文探索了利用视网膜光感受器培养上清液体外诱导BMSCs分化为视网膜光感受器样细胞的可行性。
1 材料和方法
1.1 材料
清洁级健康Sprague-Dawley（SD）大鼠20只40眼，重量100~125g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司； DMEM培养基(美国Hyclone公司) ，Neurobasal培养基（美国Invitrogen公司），B27(美国Invitrogen公司) ，胎牛血清（美国Hyclone公司），0.25％胰蛋白酶（美国Hyclone公司），木瓜蛋白酶（美国sigma公司），多聚赖酸（美国sigma公司），小鼠抗大鼠单CD34-FITC、CD44-PE和CD90-PE，以及相应同型对照单抗小鼠IgG1-FITC, IgG1-PE和IgG2a PE（Beckman-Coulter公司），神经元特异性标志小鼠抗大鼠醇化酶（美国 Fisher Scientific公司），光感受器特异性标志小鼠抗大鼠单克隆抗体视紫质(Rhodopsin)（RET-P1，美国Millipore公司），星形胶质细胞特异性标志小鼠抗大鼠单克隆抗体神经胶质酸性蛋白(GFAP)（美国 Fisher Scientific公司），DAB显色试剂盒（北京中杉金桥公司），总抽提试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），THERMO FORMA 3111 CO2培养箱（美国），OLYMPUS 1×70荧光倒置式相差显微镜（日本），OLYMPUS BH-2型光学显微镜（日本），Beckman-Coulter Epics XL 流式细胞仪（美国），台式高速冷冻离心机（上海），Gene Amp 9700型PCR 扩增仪（美国），Bio-Rad凝胶成像分析系统（Gel DOC2000）（美国），AIR-TECH BCM-1000A型生物洁净工作台（苏州）。
1.2 方法
1.2.1骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定
取清洁级SD大鼠，4mL／kg水合氯醛 (100g/L)进行腹腔麻醉。碘伏消毒，无菌条件下取出大鼠的双侧胫骨和股骨， 分别剪断股骨干和胫骨中间及两端的干骺剪断，用含有肝素的培养液10mL进行反复冲洗骨髓腔，冲洗液经200目不锈钢标准筛网过滤组织块以及已凝血块后，进行离心后用20%FBS的DMEM培养基制成单细胞悬液接种于25cm2 培养瓶中，24h后首次换液去除未贴壁细胞，以后每2d换液一次，换液前PBS洗去部分未贴壁细胞，当70％～80％细胞达到融合时用0.25%胰蛋自酶消化传代，进行扩增培养。用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD44和CD90的表达[7]。
1.2.2视网膜光感受器细胞的分离培养和鉴定
在暗环境下无菌取下清洁级SD大鼠的眼球，游离出完整的视网膜神经上皮层。利用木瓜蛋白酶进行消化分离出光感受器细胞，用Neurobasal培养基A 1mL（加入1:50的B27和0.5mM L-glutamine）进行避光培养，两天换液一次，将视网膜光感受器细胞培养换液的上清液收集于干净玻璃瓶中，通过0.22um过滤筛过滤后按2:3比例与DMEM培养液混合后备用。分别把消化前和消化后的视网膜片进行HE染色,在显微镜下观察，同时对分离的光感受器细胞进行免疫细胞化学鉴定。
1.2.3对大鼠骨髓间充质干细胞进行诱导以及鉴定
将3代的rMSCs接种在6孔板中。分为2个对照组，4个实验组。实验组加入光感受器细胞上清液与10%FBS的DMEM培养基（2:3）进行诱导，对照组用Neurobasal培养基A与10%FBS的DMEM培养基（2:3）进行培养，在倒置相差显微镜下观察细胞的生长及分化情况，诱导后14天，行免疫细胞化学和Rt-PCR鉴定，免疫细胞化学：PBS洗涤3次，多聚甲醛固定，0.2％Triton-X作用10 min，过氧化酶阻断，非免疫动物血清孵育 10 min，加Rhodopsin(1:100), NSE(1:200) ,GFAP(1:100) 抗
体，4℃过夜，加入生物素标记的第二抗体，链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶溶液，DAB溶液显色，苏木素复染，中性树胶封固，在显微镜下观察。RT―PCR法检测实验组和对照当中的GFAP，NSE， Rhodopsin的表达。Rhodopsin引物上游引物ATGTTCGTGGTCCACTTCA3’，下游引物5’ CGTTGTCCTCA
GCCGATG 3’，扩增长度为107bp；NSE引物上游引物：5’ CTGTGGTGGAGCAGGAGA 3’，下游引物5’ GGGAGATAGC
GGTGTAAC 3’，扩增长度为156bp；GFAP引物上游引物：5’TAGGAGTGGTAGGGCAGACTTG3’，下游引物5’GCAACC
AGGAATAGACCTTCACAA 3’，扩增长度为482bp；内参Rat GAPDH 为5’CAGTGCCAGCCTCGTCTC 3’，BC050110为5’ AGGGGCCATCCACAGTCTTC 3’，扩增长度为595bp。参照TRIZOL试剂说明书对诱导的MSC分别提取总RNA，进行反转录、PCR扩增，将 PCR产物电泳后进行图像分析仪采集图像。
统计学处理：采用SPSS13.0统计软件包(statistical package for the social science)分析，采用t检验。
2 结果
2.1骨髓间充质干细胞的鉴定
培养的大鼠的BMSCs接种后24小时开始贴壁，前3天细胞增殖慢，数量比较少，第3开始细胞的增长速度明显增加，7天后就达到融合状态，呈现漩涡状、状。第三代时，细胞仍呈梭形，生长旺盛。BMSCs标志鉴定结果表明，培养的第三代BMSCs干细胞表面标志CD90阳性（CD90+/CD34-：92%），基质细胞表面标志CD44阳性（CD44+/CD34-：93%）（见图1）。
图1 大鼠MSC流式细胞仪检测结果（A: CD90+/CD34-：92%;B: CD44+/CD34-：93%)
2.2 视网膜光感受器细胞的鉴定
取下来的视网膜在消化前后分别进行HE染色，消化前可以很清楚地观察到九层细胞，说明取下来的是完整的视网膜神经上皮层，不含有色素上皮，消化后的视网膜片，光感受器层的细胞变少，其它层细胞完整，光感受器细胞的免疫细胞化学示，光感受器细胞的特异标志物视紫红质的表达率达95%以上。
2.3 大鼠骨髓间充质干细胞的诱导
实验组BMSCs诱导后的第4天细胞形态开始变化，可见小的突起。随后细胞便圆，突起增长，出现少量神经样细胞的形态，到14天最为明显，出现一、二级分支，相互之间连接呈网状。对照组也有少量的细胞呈神经样的形态。诱导后的神经元样细胞GFAP，NSE，Rhodopsin呈强阳性。非神经元样细胞呈多边形或梭形，上述抗体染色呈弱阳性。阴性对照未见染色。
免疫细胞化学鉴定，共培养2周后，阳性细胞计数结果显示： rMSC的Rhodopsin表达率实验组为35.1%±6.2 %（图2A）,而对照组中无Rhodopsin阳性的细胞（图2B）， rMSC的NSE表达率实验组为33.6%±4.0 %（图3A），对照组为10.6%±5.0%（图3B）, rMSC的GFAP实验组的表达率为9.6%±1.5 %（图4A），对照组为：13.7%±3.0 %（图4B）； 对照组与实验组进行两样本的t检验NSE：F =0.09，方差齐，P < 0.001，有统计学意义，GFAP：F =1.726，方差齐，P ＞0.05，无统计学意义。
A:实验组大量表达Rhodopsin(×100)；B:对照组未表达Rhodopsin(×100)
图2 免疫细胞化学rMSCs表达Rhodopsin结果
A:实验组大量表达NSE(×100)；B:对照组少量表达NSE(×100)
图3 免疫细胞化学rMSCs表达NSE结果
A:实验组表达有GFAP(×100)；B：对照组表达有GFAP(×100)
图4 免疫细胞化学rMSCs表达GFAP结果
RT-PCR鉴定结果分析显示，实验组MSC的GFAP、NSE、Rhodopsin均有表达，其中GFAP表达比较弱；而对照组的只表达GFAP和NSE，且均较弱，未见Rhodopsin条带(图5)。
A:为实验组，GFAP、NSE、Rhodopsin均有表达；B:为对照组，只表达GFAP和NSE。
图5 Rt-PCR检测GFAP、NSE、Rhodopsin
3 讨论
本实验模拟视网膜体内发育的微环境诱导骨髓间充质干细胞成为视网膜细胞，利视网膜光感受器细胞培养上清液对骨髓间充质干细胞进行向视网膜样细胞诱导。本实验关于视紫红质的检测，实验组表达率高达35.1 %±6.2 %，对照组没有表达，说明其光感受器条件培养基能使MSC向光感受器细胞方向转化。从而验证了大鼠MSC确实可以在体外被诱导为表达视紫红质的光感受器样细胞，Tomita M[8]研究表明不管是利用BDNF, NGF, and bFGF或与视网膜片共培养，均未发现表达Rhodopsin的证据。Anthony等[5]对BMSCs向视网膜光感受器细胞诱导分化进行了体内外实验。利用维甲酸、牛磺酸和EGF体外将小鼠 BMSCs成功诱导为视网膜光感受器样细胞，诱导后的细胞可以表达视网膜光感受器细胞特异性标志物：视紫红质、视蛋白和恢复蛋白，最近国内学者单纯用EGF也可以诱导rMSC表达Rhodopsin[9]。本实验当中NSE表达率也明显高于对照组，而GFAP，两组表达并无差异，说明，光感受器条件培养基促进rMSC向神经元细胞方向分化，而对于胶质细胞方向分化并无诱导作用。本实验的对照并未加诱剂的rMSC也能表达神经元特异性标志，Tomita M[8] 研究说明没有生长因子诱导的MSC没有向神经方向分的证据，强调生长因子在神经分化中的重要地位，但是也有许多学者提出了在未诱的条件下仍发现神经特异性标志物的表达，Tondreau T等[10]发现未诱的的MSC也可以表达神经特异标记物，如Nestin和β微管蛋白Ⅲ，酪氨酸羟化酶等。Deng J[11]研究中也证实，体外培养大鼠的MSC具有自发表达早期的神经标记物(如Nestin和β微管蛋白Ⅲ)，也有细胞表达成熟神经细胞的标记物，如神经微丝M（FNM），这些跟本实验对照组仍能诱导的MSC能表达NSE相一致。
我们的实验利用光感受器细胞上清液模拟视网膜体内发育的微环境诱导骨髓间充质干细胞成为视网膜光感受器样细胞，视网膜神经细胞培养上清液可能在骨髓间充质干细胞的存活与分化方面起重要作用。尽管BMSC向神经细胞分化的研究已获得了一些令人鼓舞的结果，但是还面对了许多待进一步解决的问题：（1）对于BMSC的鉴定一直都没有一个统一的说法，对BMSC的细胞学特点和分化各阶段细胞标志物的进一步研究；（2）光感受器细胞在体外的外节容易脱落变性，如何进一步保持其完整性以及存活时间；（3）体外BMSC向视网膜样细胞诱导分化模式和分子调控机制还不甚清楚，其诱导的微环境还比较复杂，有的学者直接采用鸡尾酒式的加入好几种生长因子进行诱导，对于其中各生长因子具体作用以及相互间的作用仍不清楚；（4）对于本实验诱导出来表达视紫红质的MSC细胞的与真正的光感受器细胞之间不管是从形态上还是都有很大的差距，缩短这一差别，将MSC真正应用于眼科临床，还需进一步深入的研究探索。
参考文献：
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[2] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential ofhuman mesenchymal stem cells[J]. Science, 1999,284(5411):143-147.
[3] Bianco P, Riminucci M, Gronthos S, et al. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications[J]. Stem Cells, 2001,19(3):180-192.
[4] Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J]. J Neurosci Res, 2000,61(4):364-370.
[5] Kicic A, Shen WY, Wilson AS, et al. Differentiation of marrow stromal cells into photoreceptors in the rat eye[J]. J Neurosci, 2003,23(21):7742-7749.
[6] Ullian EM, Sapperstein SK, Christopherson KS, et al. Control of synapse number by glia[J]. Science, 2001,291(5504):657-661.
[7] 谢茂松,徐国兴,李琼,等.大鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的比较[J]. 国际眼科杂志, 2007,7(5):1285-1287.
[8] Tomita M, Mori T, Maruyama K, et al. A comparison of neural differentiation and retinal transplantation with bone marrow-derived cells and retinal progenitor cells[J]. Stem Cells, 2006,24(10):2270-2278.
[9] 张枝桥, 董方田, 等. 大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为光感受器样细胞的研究[J]. 中华眼科杂志, 2008,44(6):540-544.
篇8
【摘要】 ［目的］探讨骨髓基质干细胞移植对股骨头缺血性坏死的治疗作用和修复机理，为临床应用提供依据。［方法］24只新西兰大白兔随机分为两组，A组为髓芯减压组，B组为干细胞移植组。采用液氮冷冻法造模。A组钻孔后植入空白明胶海绵，B组钻孔后植入复合有骨髓基质干细胞的明胶海绵。术后每组分别于2、4、6、8周各处死3只动物，做X线及组织学检查。［结果］（1）X线结果：2周时A、B组钻孔区均呈低密度，4周时A组钻孔边缘密度增加，B组整个钻孔区密度增加，8周时A组钻孔区均呈低密度，边缘形成硬化线，B组钻孔区形成骨小梁结构。（2）组织学结果：2周时A组钻孔区出现少许炎症细胞，边缘出现较多成骨细胞并有骨组织形成，至8周时，钻孔区内形成骨髓组织，只在边缘形成骨小梁结构。2周时B组钻孔区有大量的成骨细胞，边缘有较多骨组织形成，4周时钻孔区内充满新生骨小梁结构，8周时钻孔区内骨小梁成熟，小梁有骨髓组织填充。［结论］骨髓基质干细胞对兔股骨头缺血性坏死有良好的修复作用。
【关键词】 股骨头缺血性坏死； 动物模型； 骨髓基质干细胞； 细胞培养； 移植
Experimental study on treatment of femoral head necrosis in rabbit with transplantation of bone marrow stromal cells∥
Abstract：［Objective］To investigate the repairing effect and mechanism for treatment of femoral head necrosis on transplantation of bone marrow stromal cells.［Method］Twenty-four Newzland rabbits were pided into two groups randomly，Group A as core decompression group and Group B as Bone marrow stromal cells autograft group.Animal femoral head neorosis model was made by freezing method with liquid nitrogen.After freezing and drilling，The drilled necrotic cavities of Group A was implanted with gelatin sponge，while of Group B was with gelatin sponge combined by bone marrow stromal cells.Three animals in every group were sacrificed respectively at 2，4，6，8 weeks and subjected to radiograph and microscope examination.［Result］（1）Radiograph examination:At 2 weeks，the drilled holes in Group A and B all presented low density images.At 4 weeks，the density in the drilled holes increased in group B and the density around the drilled holes increased in group A.At 8 weeks，sclerotic line formed around the drilled holes in Group A and trabeculae appeared in the drilled holes in group B.（2）Microscope examination:in group A，at 2 weeks，a few inflamatory cells appeared in the holes with many osteoblasts and ostoid appeared around the drilled holes.At 8 weeks，marrow formed in the drilled holes in group B，at 2 weeks，there were a large amount of osteoblasts in the drilled holes and some ostoid formed around thc drilled holes.At 4 weeks，the drilled holes were full of trabeculae.At 8 weeks，the trabeculae matured with the marrow appeared in the intertrabecular space.［Conclusion］Bone marrow stromal cells autografting may be an effective way to treat rabbit femoral head necrosis.
Key words：femoral head necrosis； animal model; bone marrow stromal cell； cell culture; transplantation
近年来一些研究发现骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cell，BMSC）减少与股骨头缺血性坏死有密切关系。有报道用自体红骨髓移植治疗股骨头缺血性坏死取得了较好的疗效。认为移植于股骨头内BMSC的数目决定着治疗的成败。本实验用移植体外增殖的BMSC治疗兔股骨头缺血性坏死，探讨BMSC在早期股骨头缺血性坏死治疗中的作用及修复机理，为临床提供理论依据和合理的治疗方法。
1 材料与方法
1.1 动物分组
成年新西兰大白兔24只，雌雄不限，年龄4～5个月，体重2.5～3.5 kg。由白求恩国际和平医院动物实验室提供。随机分为A、B 2组，每组12只。A组为髓芯减压组，B组为细胞移植组。
1.2 主要试剂
地塞米松磷酸钠注射液，浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字：H330220827，批号：041105。DMEM细胞培养液，GIBCO公司。胎牛血清，杭州四季青公司。
1.3 BMSC的获取和培养
从实验动物髂后上嵴处抽取骨髓。全骨髓培养。用硬膜外穿刺针刺入髂骨1～1.5 mm，以含有100 μ／ml肝素0.2 ml的5 ml注射器，迅速抽取骨髓2 ml，所获骨髓种植于6孔细胞培养板内，每孔种植1 ml，每只实验动物种植2个孔。加入含20%胎牛血清DMEM液5 ml，反复吹打，再加入地塞米松10-8 mmol／L，微型震荡器上震荡2 min，然后放入细胞培养箱内培养。培养箱温度37 ℃，含5%CO2，100%饱和湿度。5 d后换液，冲去红细胞，可见多个成纤维细胞克隆贴壁生长。待细胞长满培养孔面积一半时，用0.25%胰蛋白酶消化，原孔传代，2～3 d可见细胞长满培养孔，将其按1×106／cm2密度传入细胞培养瓶内。待第3代细胞长满后，消化细胞并将细胞配成2×106／ml细胞悬液，复合于3 cm×4 cm的明胶海绵上。每块明胶海绵含细胞悬液50 μl，共10万个细胞，在细胞培养箱中孵育4 h备用。
1.4 动物造模及细胞移植
所有动物双侧股骨头均参加实验。取俯卧位。硫贲妥钠40 mg/kg腹腔麻醉。后侧入路，暴露股骨头后不脱位。用液氮棉球连续冷冻3 min。自然复温后，用直径为3.5 mm钻头从股骨颈内后侧向股骨头内钻入4 mm，到达关节软骨下。A组钻孔后，植入明胶海绵。B组钻孔后，植入复合有自体BMSC的明胶海绵，关闭伤口。术后连续3 d臀大肌注入硫酸庆大霉素注射液，2 ml／只，每日1次。两组各于术后2、4、6、8周各处死3只动物，作大体观察、X线检查和组织学观察。
2 结果
2.1 BMSC的生长观察及鉴定
骨髓培养到第5 d，冲去表面红细胞，可见每个孔内有3～7个成纤维细胞样克隆集落贴壁生长，呈放射状，直径大小不等。单个细胞呈长梭形，胞浆丰富，细胞核居中，换液2～3 d后细胞克隆增大，待细胞生长占满培养孔一半时，消化传代。消化传代后细胞首先呈圆形透亮，2～4 h后贴壁生长变成短梭形，2～3 d后细胞长满培养瓶底，呈长梭形紧密排列。3代细胞接种后2～7 d呈指数生长，倍增时间为48 h。
2.2 动物的一般观察
术后1周内，动物双侧后肢轻度跛行，运动减少，采食减少。而后采食增加，运动增多，步态转好。2周后恢复术前状态，伤口Ⅰ期愈合。
2.3 股骨头标本大体观察
术后2周标本，A、B 2组股骨头外形均圆，关节软骨呈苍白色，A组有1个标本关节软骨面有少许剥脱。4周标本，两组股骨头外形均圆，关节软骨呈苍白色，所有关节软骨轻度剥脱。6周时，除A组有1个股骨头标本轻度塌陷外，两组其余股骨头标本外形均圆，软骨呈苍白色，关节软骨剥脱加重。8周股骨头标本，两组股骨头外形均圆，关节软骨剥脱比6周时加重，部分关节软骨下骨轻度暴露，软骨呈苍白色。
2.4 X线观察
A、B 2组标本在钻孔缺损区以外的变化大致相似，术后2周，两组股骨头密度有所增加，4周标本，除股骨头密度略比2周时增高外，其余无明显变化，6周标本，骨小梁结构出现紊乱，软骨下囊性变，8周标本，股骨头密度高，骨小梁结构紊乱加重，软骨下囊性变明显。两组标本在钻孔缺损内有着不同的变化，术后2周时，2组钻孔缺损区密度低，4周标本，A组钻孔缺损区中心密度低，边缘密度有所增高，B组整个钻孔缺损区密度增高。6周标本，A组仍呈现钻孔缺损区中心低密度，边缘高密度，B组钻孔缺损区出现骨小梁结构。8周标本，A组钻孔缺损区中心密度低，边缘密度增高，形成硬化线，B组钻孔缺损区有正常骨小梁结构。
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2.5 组织学观察
A、B组缺损区以外的病理变化过程大致相似，都出现了坏死和修复现象，在缺损区内，两组修复现象有很大不同。A组2周标本，缺损区内有少量炎症细胞，边缘有较多成骨细胞，并且有类骨质和骨小梁产生（图1）。4周与2周比差别不大，缺损区边缘骨小梁增多。6周缺损区出现骨髓组织。8周缺损区边缘仍然在修复，缺损区出现大量骨髓组织无骨小梁组织（图2）。B组2周标本缺损区内有大量的成骨细胞（图3），缺损边缘有较多的类骨质和新生骨小梁。4周标本，缺损区内有大量骨小梁及类骨质填充。6周标本缺损区内出现比较成熟的骨小梁，骨髓组织出现。8周标本缺损区内骨小梁成熟，骨髓组织形成（图4）。
3 讨论
股骨头缺血性坏死与多种致病因素有关，除创伤性股骨头缺血坏死发病机理清楚外，非创伤性股骨头缺血性坏死发病机理并不完全明了。治疗早期股骨头缺血性坏死的目的主要是促进坏死股骨头的修复，避免出现股骨头塌陷。髓芯减压是治疗早期股骨头缺血性坏死的常用方法，其有效率在30%～90%之间〔1〕。
有报道〔2〕髓芯减压可以打开骨质，增加股骨头血流量，但组织学发现髓芯减压管道内，充满着幼稚的骨髓和无骨小梁结构组织，股骨头修复并不完全。这可能是由于爬行替代过程中BMSC太少所致〔3〕。Hernigou等〔4〕研究了激素和酒精股骨头缺血性坏死患者髂骨BMSC和造血干细胞数目的变化，通过对骨髓培养形成的粒细胞巨噬细胞先祖细胞（GMP）和成纤维细胞克隆形成集落单位（FCF）计数评价骨髓造血干细胞和BMSC的活性。发现股骨头缺血性坏死患者GMP和FCF计数与健康骨髓捐献志愿者相比有明显下降。表明股骨头缺血性坏死与BMSC减少密切相关。
严军等〔5〕通过自体骨髓移植治疗兔Perthes病模型的实验研究，发现自体骨髓移植组坏死骨修复较空白对照组活跃，骺板损伤处可见少量软骨细胞，单纯钻孔组以纤维修复为主。认为由于BMSC数目较少，自体骨髓移植治疗兔Perthes病模型能力有限，体外培养增殖BMSC，增加植入细胞数目，结合适当的细胞载体，可能更有利于股骨头坏死的修复。Valerie等〔6〕运用髓芯减压加经过离心方法处理的自体红骨髓移植方法治疗13例18个处于ARCOⅠ～Ⅱ期缺血坏死的股骨头，随访24个月，骨髓移植组10个关节只有1个髋关节进入到Ⅲ期，而对照组8个关节有5个髋关节进入到Ⅲ期。
骨髓移植治疗股骨头缺血性坏死可以增加股骨头内的BMSC数量，增强其修复能力。但是骨髓中含有BMSC数量有限，必然影响到骨髓移植后的修复效果。研究发现骨髓中每10万个有核细胞中才含有1个BMSC，因此增加BMSC数量仍然是这项技术的焦点。尽管人们采用各种各样的离心方法处理骨髓，以增加单位体积内有核细胞数目，但是这种方法作用毕竟有限，难以达到临床要求。因此本实验采用体外培养增殖的BMSC移植于坏死的股骨头内，以提高单位体积内移植细胞数目。
本实验发现单纯行髓芯减压的股骨头，2周标本缺损处成骨细胞稀少，只在钻孔边缘形成少量的类骨质及骨小梁，随着时间的延长，钻孔区逐渐形成骨髓组织，这一点与文献报道一致。而移植骨髓基质干细胞组，2周标本缺损处有大量的成骨细胞，钻孔边缘形成较多的类骨质及骨小梁。4周时钻孔区已经被新生骨小梁填满。6周标本骨小梁相对成熟，骨髓出现。8周标本形成正常骨小梁和骨髓组织，本实验每个股骨头内移植的骨髓基质干细胞数目为10万个，这表明BMSC数目在股骨头缺血性坏死修复过程中起着重要的作用。
本实验在股骨头缺血性坏死修复过程中出现了膜内化骨和软骨化骨两种形式，其规律是在坏死骨小梁周围以膜内化骨为主，在软骨面和骺板附近以软骨化骨为主。这可能与BMSC周边环境中不同的诱导因子有关。两组在钻孔缺损区以外都出现同样的坏死和修复过程，说明骨传导在修复过程中并未起明显作用。
本实验采用BMSC移植治疗兔股骨头缺血性坏死取得了良好的效果，但干细胞移植的最佳密度和数量以及其与诱导因子及载体结合后对股骨头缺血性坏死修复的效果都需进一步研究。 【参考文献】
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篇9
这个名为SCLGL实验室的主人是日本东京大学医学助教授、圣释（北京）生物工程有限公司首席科学家郭镭。郭是世界首例成人活体肝移植手术的实施者、东京大学名誉教授幕内雅敏（Makuuchi Masatoshi）的学生，并曾荣获美国脏器移植学会青年研究学者奖。
但在反对者眼中，干细胞研究早已臭名昭著。它总是与人类胚胎、克隆人或者是电影《弗兰肯斯坦》中那些奇丑无比的人形怪物联系起来。自从 1998 年“干细胞研究之父”美国科学家詹姆斯·汤姆逊（JamesThomson）成功分离出人类胚胎干细胞以来，围绕干细胞展开的拉锯战就从未停止过。
体积微小的干细胞可令人了解生命如何从一个单一细胞发展而来，但这项研究目前在很多国家尚处禁地。在郭镭眼中，这是一项令人振奋而且大有前途的研究，其重要性不亚于基因排序研究。孟山都公司前CEO理查德·马奥尼（Richard Mahoney）说：“生物学是下一波引发巨变的科学浪潮，而干细胞的早期开发则是孕育这些变化的源泉。”
解冻期或即将很快到来。2011年，韩国食品药品管理局准许由FCB-Pharmicell公司开发的心脏病治疗药物Hearticellgram-AMI自7月1日起投放市场销售。它的问世标志着世界首例干细胞治疗药物在韩国正式诞生。
按所处发育阶段划分，干细胞可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。这种细胞可分裂、转变成为各种器官、组织，因此或将被用于修复、治疗损伤、病变的组织，这一技术被称为再生医疗。来至人类胚胎的全能干细胞，可以增殖并分化为全身200多种细胞类型，并进一步形成机体的所有组织和器官。
支持者认为干细胞可治疗心脏病、肝病、糖尿病等其他疾病。而最有发展前途、效果最好、用途最广的干细胞则是胚胎干细胞，它只存在于细胞分裂但尚未开始发育的前几天里。当然，人们对其争议亦最激烈—它是胚胎的一部分，它们在皮氏培养皿中由体积只及针头十分之一大小的细胞球培养而成，在提取过程中，胚胎将被摧毁。正因如此，胚胎干细胞研究在道德伦理范畴上产生了严重分歧，其反对者包括教皇保罗二世及美国前总统布什。
干细胞对于当今那些药物无法治疗的顽症患者来说堪称福音—成熟细胞之间通过数以千计的细小分子实现交流，其中每个分子均包含特定的“细胞语言”，多数顽症是由分子间语言交流的突然缺失而造成的，而传统药物每次仅能对付某一种分子。例如帮助心脏病人打通阻塞血管以暂时遏制心脏病的发作，但不足以阻止所有诱发心脏病的分子病理因素。
而干细胞治疗则不然。作为早期发育敏感度极强的细胞，它可熟练地运用“细胞语言”，同时迅速弥补分子缺失信息。例如对于心脏病病人，它的反应是形成血管和心肌。对于神经细胞损伤，则是取代已经死去的神经细胞，从而成为与大脑的对话中毫厘不差的组成部分。美国路易斯维尔大学心脏中心主任Roberto Bolli教授曾利用仅产生心肌细胞的干细胞来修复心脏衰竭患者。治疗前，其心脏泵血量平均仅为全身血液量的30%。治疗四个月后，这一数字提升至38.5%。一年后则飙升至42.5%。
用人类基因组科学公司（Human Genome Sciences）的首席执行官哈兹尔廷（William Haseltine）的话来说，干细胞似乎是在“提醒身体它知道如何治愈自己”。哈佛大学神经生物学家伊万·施耐德（Evan Snyder）则称其为“神奇的种子”。
不过，要想获得这些神奇的种子却并非易事。它需要数以亿计的实验室硬件投资—其投资回报周期长达十年甚至更久，政策法律伦理巨大，风险投资家亦踌躇不前。
异度空间
不过，郭镭却幸运的多。一场奇遇改变了他的命运。
2008年3月，国家卫生部批准吉林大学第二附属医院开展干细胞移植技术临床应用，郭是这一项目的主要负责人。这是中国首次正式批准干细胞技术进入临床应用的单位。这可能是全球范围内接受干细胞临床诊疗人数最多的医院，人数可达数千人之多。
2010年12月，科技部中国生物技术发展中心官方网站的《“863”计划生物和医药技术领域项目申报指南》显示，干细胞治疗技术临床转化及应用研究、数字化医疗工程技术开发作为主题项目获得资助，而体外诊断技术产品开发、重大化工产品的先进生物制造则作为重大项目获得资助。上述4个项目科研经费高达7.87亿元。
郭镭亦一度是该项目最有力的申请者之一，一路闯入最后评审环节。因郭精湛的医术，病人中不乏慕名而来者。
2011年5月，一架极致奢华的专机飞抵长春，机上有两位尊贵的客人—沙特亲王·本·图尔基·沙特和王妃哈娜·雅德。哈娜1991年因交通意外而患有高位脊椎损伤。在来长春之前，哈娜曾在美国马里兰州约翰霍普金斯医院进行诊治，后者连续20年名列全美最佳医院榜首。但哈娜治疗效果却并不理想，需要借助呼吸机，静脉营养维持生命。
郭镭为哈娜制定严格的干细胞治疗方案。经过近80天的诊疗，哈娜先后接受了十余次干细胞移植，病情得到显著缓解。离开长春时，她已脱离呼吸机正常呼吸，正常吞咽食物，借助助步器直立行走。
彼时，伟东集团有限责任公司董事长、融银资本投资管理有限公司董事长王端瑞正在吉林省负责一个基金。王端端所居住的香格里拉饭店亦是沙特王族下榻的饭店，倍感好奇的王端端向郭提出试用干细胞的请求。不久前，王端端曾在美国迈阿密被灼伤眼睛，看东西如坠雾中，后经检查得知其眼球过早老化，这种病在正常人中只有千分之几的可逆概率，有失明之忧。郭在三个月内为王端端注射三针干细胞，后者眼睛很快出现好转。
这一神奇经历吸引了王端端，由此对干细胞着迷。
提取这些干细胞并非易事。在郭镭的实验室内，你能看到如下场景：身穿白大褂的技术人员将营养液从移液管中滴至皮氏培养皿中—数以千计的培养皿被储存在小冰箱里。要想进入它们的地盘，你必须洁净全身，身着无菌服。这里的人担心的是闯入者会让细胞感染病菌，而不是相反。“这可能是你在地球上能进入的最洁净的地方。”王端端告诉《环球企业家》。
保证干细胞质量的关键因素之一就是实验室基础设施的规划与数据化建设。为了确保质量，郭镭必须对以下要素进行控制：标准统一的操作程序、极其苛刻的人员管理、科学规范的数据采集，分析，挖掘程序等等。其管理流程全部由云中心数据支持。
从昂贵的电子显微镜中看过去，其中一些培养皿中的梭形旋涡状物质看似假睫毛一样漂在粉红色水中，另一些则像被压扁的虫卵。其实，粉红色液体是氨基酸、细胞因子等营养物质，而“虫卵”则是从“假睫毛”中生长的神经干细胞。这些细胞正在圣释实验室中大量培育，以便取代由于病变受损的神经细胞，治疗帕金森综合症、老年痴呆症等。
实验室彷佛一个与世隔绝的容器，内部空气负压为8至10兆帕以避免外部气体溢入。地板用没有任何接缝的特殊材质制成，用于打扫地面的水需蒸馏净化两次，用于清理实验操作台面的超纯水则还需加入过氧乙酸、新洁尔灭等消毒材料，价值数十万的制水机占地相当于一辆迈腾轿车的占地面积，其材质亦为316不锈钢—通常这种材料被用来制作手术刀。
其中，风淋室、细胞培养室可达万级洁净，小于0.3微米粒径的微尘数量被严格控制在每立方米1万个以内，走廊内则是十万级洁净，操作台则是百级。实验室内的空气亦经过三层过滤，特制的空气滤网每45天即会更换一次。周围则是精密设备。比如热电CO2培养箱、流式细胞仪、COBE Spectra 血细胞分离机、Millipore Quotation超纯水处理系统、Eppendoref微量移液器、尼康倒置显微镜等。这些设备价值不菲，仅一台流式细胞仪其售价就高达数百万元。
在这里，制造干细胞的原料是脐带组织，由一些合作医院提供。当孕妇生育完成后，脐带必须在三个小时以内送至实验室。超过此时间则被废弃。为了保持其活性，这些细胞被冷冻在-196℃的液氮中。不过，别指望解冻复苏后很快就会培养出大量的细胞，即使小心翼翼，亦只有0.1%到1%的细胞能够存活下来。
实验室负责人梁素丽博士每天长时间用显微镜观察细胞，熟悉分化前的细胞特征，以预测下一步细胞的变化。实验人员每天例行的记录内容林林总总，包括二氧化碳气泵、耗材使用、仪器设备使用记录、液氮量、室内压力、温度、湿度等等。为了确保实验室的无菌操作，SCLGL实验室每天为实验员提供四套无菌制服。试剂及耗材均为符合医疗人体应用标准的进口一次性材料，例如镊子、试剂管、枪头等，每天消耗量高达数百个，仅此一项每日花费就达数千元。“这里的实验环境是我之前工作的单位没法比的，你能想象在一栋别墅里做实验吗？”梁素丽对《环球企业家》说。
在漩涡中
类似的干细胞培养试验曾经招致了科学家的尖锐批评。斯坦福大学干细胞研究先驱伊夫林·魏斯曼（Irving Weissman）在《自然》杂志上与人合撰的报告里警告说：“一哄而上搞试验，可能会给患者造成危险。”魏斯曼认为，对干细胞的临床应用操之过急的医生犹如莽撞的牛仔。
郭镭亦认为上述质疑不无道理。时至今日，临床医生们并不知晓干细胞究竟应该如何应用才能让治疗效果稳定，甚至最好，从细胞种类、细胞质量、细胞活性单位、移植周期到病人临床化验指标等均不确定。就连哪种移植方式效果最好，亦无公认做法—比如治疗肝病，是单纯静脉注射？肝动脉介入？还是门静脉介入？临床医生颇感犯难。最激烈的批评是针对胚胎干细胞的—分离人体胚胎干细胞必须破坏早期胚胎。而脐带干细胞引发的宗教和伦理问题则小得多。
干细胞疗法市场的主角显然是郭镭这样的医生。越来越多的研究者竞相加入这场全球性的科研竞赛。全球干细胞医疗领域是一个两年内有着800亿美元发展潜能的“金矿”。而未来5年，中国干细胞产业规模将会从目前的20亿元增长到300亿元，年均增长率达170%。
长期以来，对这一领域的研究执牛耳者是美国，其论文数量是排名第二的日本的3.92倍，美国专利总数占全球总量的56.77%，而中国专利排名仅为第七名。全球前20位顶级研究机构中，其中16家为美国所有，3家为日本所有，1家为加拿大所有。
现在，中国人试图扳回一局，亦将干细胞研究上升为国家战略。仅“十一五”期间，中国通过973计划、863计划、发育与生殖国家研究重大科学研究计划和国家自然科学基金等给予其重点投入。
与西方研究多集中于基础性研究不同，而中国的独特优势在于临床经验。颇具讽刺意味的是这“得益”于中国糟糕的医疗监管环境以及管理的滞后。一些医疗机构已经急不可耐地将干细胞应用到临床治疗当中。在严谨的西方医学界，如此草率的应用并不合理。但空白的监管灰色地带正促使许多病人飞往中国接受干细胞治疗，有时甚至演变为彻头彻尾的医疗欺诈。
早在2007年，国家食品与药品监督管理局基本停止了干细胞药物的审评工作，而对于干细胞临床治疗的应用和监管却并无规定。“国家执业医师法允许医院可以进行实验性治疗，许多搞干细胞的就钻了空子。“说句实话这种情况蛮严重的，很多上海地区大医院都没有放开，小的医院却在随便做。”上海长海医院干细胞研究中心副主任付强对《环球企业家》说。 2009年，卫生部将干细胞技术归入“第三类医疗技术”，指其“涉及重大伦理问题，安全性、有效性尚需经规范的临床试验研究进一步验证”，并要求若用于临床治疗，须经卫生部审批。
2012年1月，中国卫生部下令停止所有未经批准的干细胞临床项目。
但上述规定并未有效执行。“乱象背后还是利益因素，一方面是病人需求与医院盈利驱动，另一方面源于中国传统中医文化对‘偏方’的容忍度较高，干细胞走的是非正常药品的开发途径，用类似中医验方手法和氛围在做。”中科院动物干细胞研究所主任胡宝洋说。
国家干细胞工程技术研究中心主任韩忠朝亦称中国干细胞之“乱”，最显著的症状就是“被严重扩大使用了”。此外，还有费用高昂、资质缺失、质量失控等问题。
此外，学术界对干细胞安全性亦有疑虑，称其可能会引发致癌基因的活性—在京都大学以老鼠为对象的试验中，有20%产生了肿瘤。“人与老鼠还是很很大区别的。干细胞质量若规范化控制，几乎是零风险。”郭镭对《环球企业家》说。为了验证这一点，郭镭则身体力行—他静脉注射干细胞已超过五年，至今无碍。不过，胡宝洋却并不这么看。“现有干细胞的安全性都是基于非正常途径获得数据，病人治疗后的癌症及癌症风险尚不好说，毕竟现有的跟踪研究还不够的，而风险并不会长期阻止干细胞走向临床试验。”胡说。
改变
“若要了解干细胞疗法的所有好处，就必须解决一些紧迫问题： 哪些细胞能派上用场？怎样和何时植入这些细胞效果最好？对哪些患者最适用？除非懂得干细胞疗法的临床医生们能更好地理解其对病患究竟做了些什么，否则这些疑问无解。”郭镭说。
郭希望圣释能改变这一切。“每个养细胞的人都知道，要确保干细质量恒定，养干细胞比养孩子都难。”郭镭说。首当其冲的是确保原料安全性，即脐带原料是否携带肝病、甲乙丙肝、爱滋病以及基因染色体图谱是否存在缺陷等。一旦确认合格，医院会让孕妇对所有检查结果签字确认，告知并签署脐带处理同意书。此外，圣释在干细胞培养传代过程中、冷冻保存前、移植应用前会进行总计六次安全性检测。为了确保万无一失，其中三次为外检。
其次是细胞形态及质量。区分细胞质量和活性需要诸多数据，涉及分子水平、蛋白水平、基因水平、染色体水平、细胞形态，细胞活性、分化能力等六个方面。研发人员可以锁定某种细胞治疗某种病，并研究出分离及检验方法，圣释会在干细胞培养的每个阶段拍摄细胞形态的照片，记录其生长细节。行业内对细胞功能性检测通常不到5项，而圣释则多达42项。“我要求每一步都做数据分析，按照标准化、规范化的流程操作，确保干细胞活性恒定。”郭说。圣释对细胞活性要求严格，其存活率要在95%之上。
干细胞生长周期长短各异，短则两天，长则一个月甚至更久。期间影响细胞生长质量的要素颇多，若想实现干细胞的安全有效、活性恒定颇为艰难。既要保证细胞的活性，又得阻止它们发育。这是一个障碍重重的世界，
只要在郭镭的实验室里待上几个小时，你就会了解干细胞科学家将要忍受多么大的幽闭恐怖。实验室里拥挤不堪，你必须从一群实验人员中挤出一条缝来，还得小心别碰倒旁边的显微镜以及各种试剂。为确保适宜的细胞培养环境，仅空气处理净化程序就极为复杂，空气必须经过气流—初效空气处理—空调—中效空气处理—风机送风—净化管道—高效送风口—洁净室—带走尘埃—回风夹道—新风、初效空气处理，并辅以臭氧消毒，如此重复以实现空气净化。实验室内，抽风机、过滤空调的噪声巨大，此外，因为实验室里空气温度恒定，长年维持60-80%的湿度，不见阳光，这种感觉梁素丽将其形容为“西安夏天最闷热时的感觉”。
通常，每次试验短则三个小时，长则持续十二个小时。“最忙的时候，你必须没日没夜都在实验室呆着。”梁素丽说，“你必须训练一个助手在自己生病或休假的时候来培养细胞。一个人单独做这份工作实在是太费心了。”
在梁看来，郭镭的最大优势在于其是临床医生与实验室科学家的混合体。“你在中科院找一个年纪差不多培养干细胞的人，可能比郭厉害，但他做的细胞敢不敢在临床上用，给什么疾病的用，要注意哪些注意事项，怎么去规避风险？他不知道。”王端端解释说。
细胞培养一半靠理论，一半靠经验。王端端认为若将其产业化，仅凭经验是不行的，一个颇为大胆的想法是借助计算机控制干细胞的培养周期、质量控制、活性单位等具体生长指标，结合诊疗者的生理性、病理性检测指标，用计算机处理海量信息数据，进行数据挖掘，建立干细胞标准数据库。
对于特殊疾病治疗来说，临床实践尤为重要。郭镭选择与有治疗特长的三级甲等医院进行研究合作，例如北京大学第一附属医院、总医院等。“它们对病人的判断、积累及治疗效果往往更科学。”郭镭说。
圣释要求专家组成员必须具备副教授以上的职称，以便对干细胞治疗过程中的反应做出正确判断。干细胞并非注射后一劳永逸，会被疾病“清洗”，清洗时间长短因人而异，治疗时间间隔亦各不相同。经验丰富的临床医生根据患者各项指标判定疗效，确定再次注射的时间。只要出现任何异常反应，医生应将其完整记录。如遇困难，专家成员则对症状、体征及化验结果进行会诊，并确定用药方法。整个治疗过程会被整合到数据库。以帮助医生调整治疗准确度。
“所谓风险就是认知的风险，”郭镭估计超过60%的医生对干细胞并还不了解亦不认可。例如在注射干细胞前是否需要为病人麻醉，外科大夫们并不知晓。
时至今日，郭镭本人已亲身经历过超过千例临床治疗过程。“针对某些特定疾病，未来干细胞诊疗也许会替代传统的药物治疗，成为全新的第三类诊疗技术。数据化、标准化的实验室是干细胞临床应用必要前提。”郭说。
这一构想最终得到王端端的支持。“一个科研项目能与临床研究结合，并用临床的数据支持实验室的数据采集，我认为这个商业模型太好了。”王端端说。
在王端端的支持下，在此后的两年间，王端端、郭镭前往世界各地考察各大实验室。王端端主要观察实验室如何服务于企业及商业化，郭则看实验室标准化管理、数据化的深度挖掘及先进设备仪器。。令王端端印象最深的是以色列的一家实验室，其实验设备的人性化程度令人赞叹不已。例如椅子的大小、高低、宽窄及材料等均依照实验室人员体型定制。“一个真正顶级的实验室一定是服务于人的，如果能为人创造出舒适的环境，他就能创造出伟大的作品。”王端端感慨的说。
回国之后，两人展开了分工。王端端负责搭建IT系统，郭则负责实验室硬件及标准化流程。圣释花费巨资邀请德国公司依照全球药厂的标准进行流程梳理，并请专业设计公司提供实验室设计并施工。
最棘手难题在建立一套与现有实验室环境相匹配的运营数据化体系。郭镭希望将云计算和原材料管理BOM系统软件引入实验室的细胞管理，同时开发了干细胞体外分离、培养、冻存管理、干细胞运营管理、公司财务管理、干细胞诊疗、电子病历及数据挖掘分析统计等系统软件。“未来行业的竞争，就是数据化管理、标准制订和专业服务。最有价值的不是产品本身而是数据和标准。海量的数据和科学的标准就意味着发言权。”王端端说。
不过，若想从疾病治疗中赚到真金白银并非易事。目前干细胞的市场化尚处初期，一些业内人士称干细胞治疗至少需要5至10年才能实现临床应用。
“我感觉现在是黎明前最黑暗的时候，这个行业的人都很迷茫，不知道下一步该怎么弄。
也许大突破就在最近几年会发生。“付强说。
欧美的情况亦不乐观。2011年，干细胞医疗先锋美国Geron公司曾决定退出对干细胞用于治疗脊髓损伤造成的瘫痪者的研究项目。就商业化产品而言，目前尚无干细胞治疗药品获得美国食品药品管理局的批准。
这与美国苛刻的医疗监管体系有关。例如Geron若想申请临床试验，必须有足够的动物实验数据证明其安全性才行，其申请材料厚度可达数尺。而中国的监管宽松程度令人瞠目结舌。“大多数的情况是不做动物实验，就直接临床了。”胡宝洋说。
改变或将发生。2011年10月，科技部会同中科院、自然科学基金会等部门在北京召开了第一届国家干细胞研究指导协调委员会成立大会。胡宝洋透露今年两会前后，中国有可能出台干细胞的相关监管条例，并对干细胞医院临床资质、实验要求等实行准入制。
“未来最大的风险就是你管理的不够严格，质量出问题”。王端端说。不过，在纷繁复杂用于治疗疾病的临床试验之外，亦有最便捷变现之道—将干细胞引入高端人群的保健领域。在圣释实验室旁侧，一栋别墅已被改建为康复病房，病人在经过仔细检查之后会被注射干细胞。
这一生意正处于监管盲区之中—国家并未对干细胞保健从业资质有过详细且可行的限定。“从疗效上看确实很明显，但干细胞到底通过什么途径实现的，科学家尚不清楚。效果是肯定的，原因和机制不明白，这种情况政府如何监管？我也说不出来，只能走一步看一步。”胡宝洋对《环球企业家》说。
圣释甚至吸引了超豪华酒店悦榕庄的注意。悦榕庄品牌及创始人何光平、张齐娥夫妇在2011年元旦曾放弃欧洲度假之旅，专程飞往长春。在参观郭镭的干细胞实验项目之后，何光平夫妇与王端端谈及将干细胞与SPA产品融合的事宜。当年9月，悦榕庄即与圣释签订正式合作协议，计划将干细胞诊疗融入悦榕庄SPA产品中。2014年，吉林悦榕庄将成为第一家引入干细胞诊疗的酒店，还将扩展到10家。
不过，眼下可不是举杯庆贺的时候。两场突如其来的变故差点毁了这一切。在过去一年，圣释曾不止一次卷入商业间谍案中，实验流程和数据险些泄密，实验室电脑及移动硬盘亦两次被盗。公安机关调查结果显示此事乃内部员工所为，后者竟是竞争对手安插的卧底。几名员工因此锒铛入狱。
篇10
此前，为了研究未经批准的干细胞系，研究人员不得不建立独立的、私人融资性质的实验室，然后还要经过一系列繁琐的会计程序，以确保联邦拨款的每一分钱都不会用在干细胞研究中。但这样的情况不会再继续下去了。取消禁令“将给这一领域和其他领域的研究人员大开方便之门。”旧金山加利福尼亚大学的干细胞研究人员阿诺德 克里格斯汀作如上表示。
乔治・Q・戴利博士在波士顿儿童医院研究儿童血液病，他说，他利用私人资金进行研究，已获得15条人类干细胞株，如今他首次可以向美国国立卫生研究院(NIH)申请拨款来研究这些干细胞。
奥巴马总统支持胚胎干细胞研究的时机正与世界干细胞研究取得重大进展的背景不谋而合，日本生物学家山中伸弥在2007年发现，成体细胞能够重新编程回到胚胎状态，其容易程度令人惊讶。这项技术“有可能最终使得胚胎干细胞用于治疗和诊断的技术变得相形见绌。”干细胞用于治疗的前景虽然还很遥远，但如果能用病人自己的身体细胞进行治疗，可避免免疫排斥问题。
美国一些国会议员和其他一些倡导与疾病作斗争人士一直看好人类胚胎干细胞研究，认为它是快速治愈一些顽固性疾病的可靠途径。
但在私下里，许多研究人员的胚胎干细胞研究目标定得还是比较实际，他们主要的兴趣在于从一些特定疾病的患者那里获得胚胎干细胞系，通过跟踪观察这些细胞在试管内的生长情况了解疾病如何发展的基本知识。
尽管美国杰龙生物医药公司利用人体胚胎干细胞医治脊髓损伤病人的试验已在今年1月获得美国食品和药物管理局(FDA)批准，许多科学家还是认为，把干细胞衍生的组织移植到患者体内还有很长的路要走。胚胎干细胞有其自身缺陷，它们易产生肿瘤，从干细胞中分离出来的成体细胞有可能会受到患者自身免疫系统的排斥。此外，无论是什么样的疾病过程造成了病人组织细胞的死亡，也同样有可能杀死外来移植的细胞。所有这些问题也许都有可能得到解决，但至今为止还没有一个得到解决。
克林顿总统曾过允许NI H给研究员提供资金研究人体胚胎干细胞的设想，但一直没实行这项政策，直到2001年8月才开始有了这方面的研究，当时的美国总统布什寻求以一种不同的方式同避国会对干细胞研究的限制，规定研究人员可以使用在此之前获得的干细胞系进行研究。
奥巴马将克林顿当年提议的政策付诸实行，但美旧国会的限制依然存在。研究人员仍然禁止使用联邦资金来获得新的人类胚胎干细胞系。不过，他们将被允许对私人投资实验室里培养出来的新的干细胞系进行研究。