夺冠观后感言范文

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篇1

【摘要】 目的：探讨白细胞介素10（interleukin10， IL10）基因的单核苷酸多态性（singlenucleotide polymorphism， SNP）与乙型病毒性肝炎（乙肝）后肝硬化中医证候的关联。方法：运用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism， PCRRFLP）和聚合酶链反应连接酶检测（polymerase chain reactionligase detection reaction， PCRLDR）相结合的测序方法，检测226例乙肝后肝硬化患者IL10592 A/C、819 C/T和1082 G/A位点的多态性，分析其基因型和等位基因频率的分布，以及这3个SNP位点与乙肝后肝硬化中医证候之间的关系。结果：IL10819位点C等位基因在脾虚湿盛证出现的频率明显高于非脾虚湿盛证（P＜0.001），TT基因型在肝气郁结证出现的频率明显高于非肝气郁结证（P＜0.05）。IL10592 A/C和1082 G/A位点的多态性与乙肝后肝硬化中医证候之间未发现有显著的关联（P>0.05）。结论：IL10819位点C等位基因可能与乙肝后肝硬化患者形成脾虚湿盛证相关，而其TT基因型可能与肝硬化患者形成肝气郁结证相关。

【关键词】 乙型肝炎; 肝硬化; 多态性， 单核苷酸; 证候

Methods: The genotypes of IL10592 A/C， 819 C/T and 1082 G/A sites were determined by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP)， and polymerase chain reactionligase detection reaction (PCRLDR) combined with the sequencing analysis in 226 cases of posthepatitis B cirrhosis. The genotype and allele frequency distribution， and the relationship between the SNPs and TCM syndromes were analyzed.

Results: The frequency of allele C at IL10819 point in spleen deficiency with overabundance of dampness syndrome was significantly higher than that in nonspleen deficiency with overabundance of dampness (P＜0.01) syndrome， and genotype TT in liver stagnation syndrome was significantly higher than that in nonliver stagnation syndrome (P＜0.05). There was no significant relationship between the polymorphisms of IL10592 A/C， 1082 G/A and the TCM syndromes in posthepatitis B cirrhosis (P>0.05).

Conclusion: In patients with posthepatitis B cirrhosis， allele C in IL10819 locus may be related to spleen deficiency with overabundance of dampness syndrome， and TT genotype in IL10819 locus may be related to liver stagnation syndrome.

Keywords: hepatitis B; liver cirrhosis; polymorphism， single nucleotide; syndrome

肝硬化是我国临床最常见的慢性进行性肝病，乙型病毒性肝炎（乙肝）是引起肝硬化的主要原因之一。中医对乙肝后肝硬化的诊疗具有整体动态调整和个体化治疗的特点，辨证施治不但能改善临床症状及肝功能，提高患者生活质量，而且可抑制肝脏炎症反应及纤维组织增生，促进肝纤维化的逆转［1］。阐明中医药个体化诊疗有效性的机制，为中医辨证论治寻找客观的物质基础，对中医临床有效诊治肝硬化意义重大。本研究基于中医体质学说和病证结合的研究思路，从基因多态性角度出发，探讨白细胞介素10（interleukin10， IL10）基因的单核苷酸多态性（singlenucleotide polymorphism， SNP）与乙肝后肝硬化中医证候的关联。

1 资料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 研究对象 自2007年1月到2008年12月，从上海中医药大学附属龙华医院、曙光医院、普陀医院和岳阳中西医结合医院收集了226例乙肝后肝硬化病例，年龄为18～65岁，其中男性153例，女性73例。

1.1.2 诊断标准 乙肝后肝硬化诊断标准参考《病毒性肝炎防治方案》［2］。肝硬化中医辨证标准参照《肝硬化临床诊断、中医辨证和疗效评定标准（试行方案）》［3］诊断为肝气郁结证（42例）、脾虚湿盛证（38例）、湿热内蕴证（39例）、血瘀证（52例）、肝肾阴虚证（46例）和脾肾阳虚证（9例）共6个肝硬化中医证型，由3位副主任或主任医师分别根据226例乙肝后肝硬化中医临床资料进行辨证分型，对辨证分型不一致的病例经讨论后确定其中医证型。

1.1.3 排除标准 所有乙肝后肝硬化病例均排除由其他肝炎病毒感染或酒精、药物等其他因素引起的肝硬化。

1.2 研究方法

1.2.1 血液标本采集和处理 取病人空腹静脉血1 mL，置于含有乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid， EDTA）的2 mL冻存管内（血液∶EDTA=10∶1），盖好混匀。3 000 r/min，4 ℃离心5 min，分离上清液，沉淀物即血细胞，置于－80 ℃冰箱内保存，以备DNA提取用。

1.2.2 DNA提取 采用DNA提取试剂盒（TIANGEN），用以上血细胞来提取DNA，具体操作参照TIANGEN公司人全血DNA提取试剂盒说明书。

1.2.3 基因型检测

1.2.3.1 聚合酶链反应限制性片段长度多态性检测 IL10592位点的基因多态性分析采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism， PCRRFLP）方法。IL10592的上游引物是5'GGT GAG CAC TAC CTG ACT AGC3'；下游引物是5'CCT AGG TCA CAG TGA CGT GG3';产物片段：412 bp。PCR扩增反应体系为基因组DNA 2 μL、上下游引物各1 μL（10 μmol/L）、Taq酶（宝生物工程大连有限公司）1 U、10×PCR 缓冲液 2 μL、MgCl2 2 μL（25 mmol/L）和dNTPs 2 μL（2.5 mmol/L），加去离子水补至20 μL。使用DNA循环合成仪（Ampgene 9700），先94 ℃预变性5 min，再94 ℃变性45 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共进行40个循环，最后72 ℃ 10 min。将10 μL PCR产物、0.5 μL Afai（宝生物大连工程有限公司）、3 μL去离子水和1.5 μL 10×缓冲液加入同一EP管中，于37 ℃水浴箱中消化2 h。酶切产物加3 μL 6×上样缓冲液混匀后于3%琼脂糖凝胶中电泳，90 V水平电泳（Tanon EPs 300）1.5 h。于凝胶成像系统（Alpha Innotech）下拍照，与分子量标记物比较各片段大小。纯合子AA基因型为176 bp和236 bp片断，纯合子CC基因型为412 bp片断，杂合子AC基因型为176 bp、236 bp 和412 bp片断。

1.2.3.2 聚合酶链反应连接酶检测 IL101082G/A和819C/T位点多态性采用聚合酶链反应连接酶检测（polymerase chain reactionligase detection reaction， PCRLDR）技术分析。PCR扩增反应体系为基因组DNA 1 μL、上下游引物各0.25 μL（10 μmol/L）、Taq酶0.2 μL、10×PCR 缓冲液 2 μL和 dNTPs 0.3 μL（2.5 mmol/L），加去离子水补至15 μL。先94 ℃预变性2 min，再94 ℃变性20 s，62 ℃退火 20 s，72 ℃延伸40 s，共进行40个循环，最后72 ℃ 3 min。以上PCR产物2 μL，10×Taq DNA 连接酶缓冲液1 μL，Taq DNA 连接酶（40 U/μL）0.125 μL，每条探针（10 bp）0.01 μL，加去离子水补至10 μL。先94 ℃ 30 s，再60 ℃ 3 min，共进行20个循环。取1 μL连接产物，加2 μL上样loading Dye 95 ℃变性3 min，立即冰水浴，然后上测序仪（ABI 377型）检测。上下游引物、探针和产物大小见表1。该实验过程和基因型分析在上海捷瑞生物工程有限公司实验室实施。

表1 PCRLDR法所用引物、探针和产物大小（略）

Table 1 Sequences of primers， probes and size of products in PCRLDR

1.2.3.3 测序 为验证检测方法的准确性，每一个位点均从所有样本中随机抽取5%的样本进行测序检验。测序委托生物芯片上海国家工程研究中心实验室实施。测序结果与以上方法的检测结果一致。

1.3 统计学方法 计数资料采用χ2检验或Fisher精确检验，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 IL10592 A/C位点的基因型与乙肝后肝硬化中医证型的关系 乙肝后肝硬化患者的中医证型与基因型的统计分析表明，各中医证型的AA、AC+CC与中医证候基因型总例数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.2 IL10819 C/T位点的基因型与乙肝后肝硬化中医证型的关系 乙肝后肝硬化患者的中医证型与IL10819 C/T位点基因型的统计分析表明，6个中医证型间的差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。将CT和CC基因型合并后，分析各中医证型的TT、CT+CC与中医证候基因型总数之间的差异，在乙肝后肝硬化患者中，CT+CC基因型在脾虚湿盛证中出现的频率［94.73%（36/38）］明显高于非脾虚湿盛证［5.26%（2/38）］，差异有统计学意义（P＜0.05）；CT+CC基因型在脾虚湿盛证中出现的优势比和95%可信区间为10.055 ［2.360，42.849］，而在非脾虚湿盛证中出现的优势比和95%可信区间为0.771 ［0.518，1.147］。另外，TT基因型在肝气郁结证中出现的频率［52.387%（22/42）］明显高于非肝气郁结证［32.07%（59/184）］，差异有统计学意义（P＜0.05）；TT基因型在肝气郁结证出现的优势比和95%可信区间为1.969 ［1.014，3.824］，而在非肝气郁结证出现的优势比和95%可信区间为0.845 ［0.560，1.276］。

2.3 IL101082 A/G位点的基因型与乙肝后肝硬化中医证型的关系 乙肝后肝硬化患者中医证型与基因型的统计分析表明，各中医证型的AA、AG+GG与中医证候基因型总数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表2 乙肝后肝硬化中医证型与IL10592 A/C位点的基因型（略）

Table 2 Genotypes of IL10592 A/C and syndrome types of traditional Chinese medicine in posthepatitis B cirrhosis

表3 乙肝后肝硬化中医证型与IL10819 C/T位点的基因型（略）

Table 3 Genotypes of IL10819 C/T and syndrome types of traditional Chinese medicine in posthepatitis B cirrhosis

表4 乙肝后肝硬化中医证型与IL101082A/G位点的基因型（略）

Table 4 Genotypes of IL101082A/G and syndrome types of traditional Chinese medicine in posthepatitis B cirrhosis

3 讨论

证候的研究是中医科研的重点、难点和热点，中医的整体观念和辨证论治往往通过这一环节来体现。中医证候是一种对患者症状和体征的归纳，反映了疾病过程中机体某一阶段的病因、病位以及病机等整体病理状态。中医学认为“有诸内必形诸外”，疾病证候既然是有规律的病理表现，就必然有其规律性的物质基础。中医体质学说认为体质与疾病的发生有着密切的关系，表现为病理性体质是其相关疾病发生的主要物质基础［4］。研究证明，人类基因多态性在阐明人体对疾病和毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。由此可见，中医的体质学说与基因多态性可能存在内在联系。

人体的DNA序列及其变异，反映了人类的进化过程。研究不同人群和不同个体的DNA序列变异，即多态性，有助于了解人类疾病的发生、发展以及对药物治疗的反应。现已知，至少93％的人类基因都存在SNP［5］，而且SNP已成为遗传易感性研究的主要生物学标记之一，并与感染性疾病的进展有关［6， 7］。研究表明，中医的证型与SNP存在着密切的关联。例如，尤劲松等［8］发现5HTTLPR多态性SS型个体可能是肝火上炎证和肝阳上亢证的易感人群，吴依芬等［9］发现ABCA1基因K等位基因可能是冠心病痰浊证、血瘀证的保护因素。而且，基因的多态性在很大程度上还影响疾病的不同证型以及药物的疗效［10］。但迄今为止尚未见有基因多态性与乙肝后肝硬化证候研究的相关报道。

IL10主要由巨噬细胞分泌，它能下调Th1型细胞因子的表达，是一种强有力的免疫抑制因子和协调刺激分子［11］，从而影响机体对乙型肝炎病毒的清除。Miyazoe等［12］的研究提示IL10启动子的多态性与乙肝的进展有关。

本研究探讨了IL10592、819和1082共3个SNP位点与226例乙肝后肝硬化中医证候的关系。在IL10819位点，脾虚湿盛证C等位基因出现的频率明显高于非脾虚湿盛证（P＜0.001），其优势比约为10，推测IL10819位点含有C等位基因的肝硬化患者更容易形成脾虚湿盛证。TT基因型在肝气郁结证中出现的频率明显高于非肝气郁结证（P＜0.05），其优势比约为2，推测IL10819位点是TT基因型肝硬化患者更容易形成肝气郁结证的物质基础。其余两个SNP位点（IL10592、1082）基因型与肝硬化的肝气郁结证、脾虚湿盛证、湿热内蕴证、血瘀证、肝肾阴虚证和脾肾阳虚证比较，差异均无统计学意义，它们的多态性可能不影响肝硬化患者中医证候的形成。

从虚、实分类的角度，将肝气郁结证、湿热内蕴证和血瘀证归为实证，肝肾阴虚证和脾肾阳虚证归为虚证，脾虚湿盛证归为虚实夹杂证，探讨了乙肝后肝硬化实证、虚证和虚实夹杂证与IL10592、819和1082共3个SNP位点基因多态性的关联，统计结果未发现有显著的相关性（结果未显示）。

本研究发现IL10819 C/T位点的多态性可能是乙肝后肝硬化患者产生某一特定证候的物质基础，且能为肝硬化证候药物基因组学研究提供参考。然而，影响肝硬化证候形成的SNP可能会有许多，仍有大量筛选SNP的工作要做。而且，基因多态性对个体而言是恒定的，证候在肝硬化的发展过程中会出现动态变化，具有不确定性。因此，我们需要进一步探讨肝硬化相关基因型与证候变化的关联，以期阐明证候的变化规律。

参考文献

1 Liu P， Hu YY， Liu C， Xu LM， Liu CH， Sun KW， Hu DC， Yin YK， Zhou XQ， Wan MB， Cai X， Zhang ZQ， Ye J， Tang BZ， He J. Multicenter clinical study about the action of Fuzheng Huayu Capsule against liver fibrosis with chronic hepatitis B. J Chin Integr Med. 2003; 1(2): 8998， 102. Chinese with abstract in English.

刘平， 胡义扬， 刘成， 徐列明， 刘成海， 孙克伟， 胡德昌， 尹有宽， 周霞秋， 万谟彬， 蔡雄， 张志清， 叶军， 唐宝璋， 贺佳. 扶正化瘀胶囊干预慢性乙型肝炎肝纤维化作用的多中心临床研究. 中西医结合学报. 2003; 1(2): 8998， 102.

2 Chinese Society of Infectious Diseases and Parasitology and Chinese Society of Hepatology of Chinese Medical Association. Prevention and treatment program for viral hepatitis. Zhonghua Chuan Ran Bing Za Zhi. 2001; 19(1): 5662. Chinese.

中华医学会传染病与寄生虫病学分会， 肝病学分会. 病毒性肝炎防治方案. 中华传染病杂志. 2001; 19(1): 5662.

3 Zhang YX， Wei BH. Clinical diagnosis， syndrome differentiation of traditional Chinese medicine and curative effect evaluation of hepatocirrhosis (trial project). Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 1994; 14(4): 237238. Chinese.

张育轩， 危北海. 肝硬化临床诊断、中医辨证和疗效评定标准(试行方案). 中国中西医结合杂志. 1994; 14(4): 237238.

4 Wang WB， Cao FL， Li H， Xiao Y. Study on the relationship between constitution type in north Han healthy nationality and HLA gene polymorphisms. Harbin Yi Yao. 2002; 22(2): 12. Chinese.

王文宝， 曹峰林， 李辉， 肖云. 北方汉族健康人的中医体质类型与HLA基因多态性的相关研究. 哈尔滨医药. 2002; 22(2): 12.

5 Sachidanandam R， Weissman D， Schmidt SC， Kakol JM， Stein LD， Marth G， Sherry S， Mullikin JC， Mortimore BJ， Willey DL， Hunt SE， Cole CG， Coggill PC， Rice CM， Ning Z， Rogers J， Bentley DR， Kwok PY， Mardis ER， Yeh RT， Schultz B， Cook L， Davenport R， Dante M， Fulton L， Hillier L， Waterston RH， McPherson JD， Gilman B， Schaffner S， Van Etten WJ， Reich D， Higgins J， Daly MJ， Blumenstiel B， Baldwin J， StangeThomann N， Zody MC， Linton L， Lander ES， Altshuler D; International SNP Map Working Group. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 2001; 409(6822): 928933.

6 Helminen M， Lahdenpohja N， Hurme M. Polymorphism of the interleukin10 gene is associated with susceptibility to EpsteinBarr virus infection. J Infect Dis. 1999; 180(2): 496499.

7 MozzatoChamay N， Mahdi OS， Jallow O， Mabey DC， Bailey RL， Conway DJ. Polymorphisms in candidate genes and risk of scarring trachoma in a Chlamydia trachomatisendemic population. J Infect Dis. 2000; 182(5): 15451548.

8 You JS， Hu SY， Zhang HG. Study on emotion measurement of liver syndromes in TCM and its correlative study on polymorphism of serotonin (5HT) transporter gene. Zhongguo Yi Yao Xue Bao. 2004; 19(11): 669671. Chinese with abstract in English.

尤劲松， 胡随瑜， 张宏耕. 中医肝证情绪测量及与5羟色胺转运体基因多态性相关的研究. 中国医药学报. 2004; 19(11): 669671.

9 Wu YF， Zhou YC， Zhang XS. Association between traditional Chinese medicine syndrome of coronary atherosclerotic heart disease and polymorphism of R219K of ABCAl gene in Chinese Han male patients. Zhongguo Zu Zhi Gong Cheng Yan Jiu Yu Lin Chuang Kang Fu. 2006; 10(7): 79. Chinese with abstract in English.

吴依芬， 周迎春， 张学森. 中国汉族男性冠状动脉粥样硬化性心脏病患者中医证型与ABCA1基因R219K多态性的关联性. 中国组织工程研究与临床康复. 2006; 10(7): 79.

10 Lu QS， Lei Y， Chen KJ. Relationship of the A1166C polymorphism of AT1R gene with TCM syndrome and efficacy of Chinese hypotensor in patients with essential hypertension. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2005; 25(8): 682686. Chinese with abstract in English.

卢全生， 雷燕， 陈可冀. AT1R基因多态性与原发性高血压中医证型及降压中药疗效的关系. 中国中西医结合杂志. 2005; 25(8): 682686.