生物学通报范文

导语：如何才能写好一篇生物学通报，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

英文名称：Microbiology

主管单位：中国科学院

主办单位：中国科学院微生物研究所;中国微生物学会

出版周期：月刊

出版地址：北京市

语

种：中文

开

本：16开

国际刊号：0253-2654

国内刊号：11-1996/Q

邮发代号：2-817

发行范围：国内外统一发行

创刊时间：1974

期刊收录：

CA 化学文摘(美)(2009)

中国科学引文数据库(CSCD―2008)

核心期刊：

中文核心期刊(2008)

中文核心期刊(2004)

中文核心期刊(2000)

中文核心期刊(1996)

中文核心期刊(1992)

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中科双效期刊

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期刊简介

篇2

论文摘要：社会医疗保险经办机构应成为医疗服务市场上的具有强大谈判能力的第三方购买者，代表病人向医疗机构购买服务，确保医疗服务的质量与价格相匹配。由于种种原因，我国大学生医疗保险制度长期以来一直未能落实好这项职能。目前，国家正在开展把大学生纳入城镇居民基本医疗保险的试点范围，我们应该以此为契机，理顺关系，创造条件，充分利用医疗服务合同为大学生提供高质量的医疗服务。

医疗服务合同是指由医疗保险机构与医疗服务机构签订的由医疗服务机构为特定的疾病患者提供医疗服务，并由医疗保险机构支付医疗服务费用的合同。世界各国为有效地控制医疗费用，提高医疗服务质量，均采用了医疗服务合同的形式来明确医疗保险机构与医疗服务机构之间的权利义务。大学生纳入城镇居民基本医疗保险后，应充分利用医疗服务合同，明确医患双方的权利义务，为大学生提供价格合理、诊治到位、服务高效的医疗服务。

一、大学生医疗服务合同的性质界定

医疗保险体系的首要功能是为参保者提供医疗保障，确保他们不会因为支付困难而不去看病。医疗保险体系的另外一个重要功能，就是建立医疗服务的第三方购买者。当人们把医疗费用付给医疗保险机构后，医疗保险机构就形成了强大的购买力，成为医疗服务市场上的具有强大谈判能力的购买者，它代表病人向医疗机构购买服务，有能力运用各种手段来控制医疗服务机构的行为，确保医疗服务的质量与价格相匹配。大学生医疗服务合同涉及参保方、医疗保险经办机构和医疗机构三方关系，具有如下性质特征：

1.大学生医疗服务合同是的为他人利益订立的合同。在这—合同中，大学生只享受权利而不必承担义务，合同的订立无须事先通知或征得他们的同意。但自合同成立时起，他们就是债权人，享有独立的权利，在医疗服务机构不履行合同时，可以直接针对医疗机构行使所享受的权利。大学生可以接受医疗合同中为其设定的权利，也可以拒绝接受该权利，但不能变更合同规定的权利，合同的更改权由医疗保险经办机构行使。由于大学生无权参与合同的订立和变更，为了确保合同订立和变更能够真正围绕学生的利益而进行，并能有效地监督和保证全面实际地履行，必须有一个主体集中代表大学生的利益，向经办机构反映诉求并实施监督权，高等学校对此具有不可推卸的责任。

2.大学生医疗服务合同是行政性合同。首先，医疗服务合同的一方当事人为医疗保险机构，它是行政性的机构或具有行政性的事业机构，而它在订立合同时也是以执行行政性事务的名义与医疗服务机构签订合同。其次，医疗服务合同的内容是为疾病患者提供特定的医疗服务，它具有社会公共利益的性质。再次，在医疗服务合同的履行、变更或解除中，医疗保险机构享有行政优益权，即医疗服务机构享有单方面对合同履行监督权，单方面强制履行权和单方面的合同解除权以及单方面的制裁权。最后，医疗服务合同争议的处理只能依据行政程序进行，即通过行政复议和行政诉讼解决当事人之间的纠纷。

3.大学生医疗服务合同具有平等性和隶属性。平等性体现在医疗保险机构与医疗服务机构在签订合同时，医疗服务机构既可以同意与医疗保险机构订立合同，也可以不同意与医疗保险机构订立合同，并可就订约内容相互之间进行协商。但是合同一经签订，合同当事人之间的关系便具有管理和被管理性质。医疗保险机构有权对医疗服务合同的执行情况进行监督检查，并行使制裁权。因此，大学生医疗保险合同能否顺利签订，签订之后能否完全实际履行，经办机构起着至关重要的作用。

二、大学生医疗服务合同现状及原因

我国大学生医疗保障制度一直未能很好地实现医疗服务第三方购买者的职能，保险经办机构通过设定自付线、起付线、封顶线、可报销药品目录等各种手段，对学生的就医行为进行严格的控制，但是对服务提供者的行为却近乎不闻不问。学生作为单个病人出现在医疗服务机构面前，处于明显的弱势地位，没有能力要求医疗服务机构提供与其支付费用相匹配的医疗服务。究其原因，有如下几点：

1.传统大学生医疗费用报销模式妨碍了医疗保险经办方谈判权的行使。改革开放后的大学生医疗保险分为两类，一是大学生公费医疗，二是由各高校自行组织学生参加的商业保险。不论是高校公费医疗的经办，还是商业保险公司费用的报销，都是要求学生在就医时必须支付全额医疗费用，然后再向学校和保险公司寻求报销。在这种模式下，学校和商业保险公司处于被动状态，无法有效行使医疗服务购买者的职能。

2.社会医疗保险机构由于角色定位不当，未能行使购买者的权利。在市场经济环境下，经办机构往往忽视了医疗机构内在的盈利动机，在医疗保险的运作过程中，仅把参保者作为防范对象，没有对医疗机构进行有效的监管。这突出表现在经办机构长期以来只注重医疗保险费用需方控制而忽视供方控制这一现象上。因此，虽然目前社会医疗保险费用支付和补偿已逐步由后付制向预付制过渡，经办机构与医疗机构对等谈判的条件也开始形成，但如果经办机构的观念和角色定位不转变，大学生纳入城镇居民基本医疗保险后，其购买者的权力仍然无法实现。

3.医疗服务市场发育不成熟，卖方市场没有形成，经办机构难以进行公平对等的谈判。由于我国医疗机构的分布和设置不能满足国民对医疗服务的需求，因此吸收民间资本以充实和发展医疗卫生行业成为我国医疗卫生事业发展的大趋势。但由于医疗机构准入门槛过高，限制了民营资本的进入，目前在医疗服务市场发挥作用的，还是数量、条件都有限的公立医院。由于市场发育不充分，没有对公立医院形成竞争压力，市场机制不能发挥作用。在这种情况下，公立医院处于独家垄断的地位，经办机构没有选择和谈判的余地，难以进行对等的谈判。

三、充分发挥医疗服务合同的作用，为大学生提供公道合理的医疗服务

要在公正平等的基础上订立大学生医疗服务合同，必须理顺医疗保险机构和医院以及保险机构与学校的关系，在政府的参与下，推动大学生医疗费用的支付从公共报销模式向公共契约模式的转型。医疗保障机构必须代表学生同医疗服务机构订立契约，在契约中采取各种支付手段(如费用包干制、按人头收费、按病种收费、按服务内容收费等)的组合，来引导医疗服务机构在控制费用和维持质量上保持平衡，为学生争取最大权益。

1.健全完善医疗费用预付机制，为公共契约的订立创造条件

预付制是订立公共医疗服务契约的前提条件，医疗费用由医保经办机构直接向医疗服务机构提供，经办机构便可以有效地行使其医疗服务购买者的职能，迫使医疗服务机构不断提高医疗水平和保证服务质量。随着医疗保险费用支付和补偿机制的不断健全和完善，供方控制越来越受重视并日益加强对其监控的力度，预付制正逐步取代传统的后付制成为医疗保险费用的基本方式，订立医疗服务合同的条件正在形成。目前这项工作的重点是要尽快理顺医保经办机构与各级医院(特别是初级医院)的经费预付关系，为经办机构全面履行医疗服务购买职能创造条件。

2.加快医疗体制改革，发育完善医疗服务市场

市场机制作用的发挥，在于同行业之间形成竞争，优胜劣汰，迫使每一经济实体不断改进技术，提高服务质量。从政策上来说，占我国各级医疗机构绝大多数的公立医院，既不是完全财政拨款的福利性单位，又不是以营利为目的经济实体。这种政策上的盲区致使它既没有能力为国民提供医疗卫生福利，又没有担心生存发展的危机。由于患者和医疗保险经办机构别无他选，只能接受由他们单方制定的各种条件，毫无讨价还价之力。加大医疗体制力度，放低医疗领域准入门槛，鼓励民间资本进入医疗领域，实行充分竞争，是克服上述问题的最好良方。通过竞争，让医疗保险经办机构有更多的选择余地，让那些条件苛刻，经营无方，不能为患者提供等价优质服务的医疗单位失去订单和市场，迫使他们改进和提高服务水平。

3.落实各方责任，切实把学生的利益发在第一位

篇3

【摘要】 为了研究兔骨髓间充质干细胞(rBM-MSC)的生物学特征及其对不同生长因子的反应，使用贴壁培养法从兔骨髓单个核细胞中获得间充质干细胞（MSC），在光学显微镜和电子显微镜下观察其基本生长行为和生物学特征；使用流式细胞仪检测rBM-MSC的免疫学表型；RT-PCR法检测其胶原表达；诱导rBM-MSC多向分化并使用特异性染色和RT-PCR予以鉴定；最后使用MTT法检测IL-1、3、8和HGF对rBM-MSC生长增殖的影响。结果显示：贴壁生长的rBM-MSC具有典型的成纤维样细胞形态，可传15代以上，第5代rBM-MSC高表达基质受体CD44（32％），低表达造血细胞标记CD45（4.7％）；RT-PCR显示高表达I型胶原，弱表达II型胶原，不表达X型胶原；在不同的诱导条件下，rBM-MSC 可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。rBM-MSC对IL-3最为敏感，10 ng/ml的低浓度IL-3可显著促进细胞增殖达32％以上（P

【关键词】 骨髓； 间充质干细胞；生长因子；兔

Biological Characteristics of Rabbit Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and Their Response to Different Growth Factors

AbstractThis study was aimed to analyze the biological characteristics of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (rBM-MSCs) and their response to different growth factors. Rabbit BM-MSCs were separated from bone marrow mononuclear cells by using adherent cultivation. Biological characteristics were investigated by optical and electron microscopy. Immunophenotype of rBM-MSCs was measured by flow cytometry. The expression of collagen was detected by RT-PCR. Differentiation potential was identified by specific staining and RT-PCR. The response of rBM-MSCs to IL-1， 3， 8 and HGF with different concentrations were tested by MTT. The results showed that the rBM-MSCs gave rise to a population of adherent cells characterized by the presence of a predominant cell type with a typical fibroblast-like morphology and could be cultured for over 15 passages. CD44 was highly expressed on F5 rBM-MSCs (32%) and CD45 was lowly expressed (4.7%). Type I collagen was highly expressed， while type II collagen was lowly expressed and type X collagen was not detected on rBM-MSCs using RT-PCR method. In various conditions inducting differentiation， rBM-MSCs could differentiate into the osteoblast， chondrocyte， adipocyte and neuron-like cells. The rBM-MSCs were sensitive to IL-3， even low concentration (10 ng/ml) of IL-3 could promote the proliferation of rBM-MSCs effectively (>32％， P

Key wordsbone marrow; mesenchymal stem cell; growth factor; rabbit

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell， BM-MSC）具有高度自我更新和多向分化的潜能，在不同的诱导条件下，可分化为多种组织细胞类型，如骨髓基质细胞、成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞［1］。目前对人和小鼠等物种的BM-MSC

已有深入研究，但对兔BM-MSC的生物学特性，尤其是其免疫学表型和对不同生长因子的反应鲜有报道。兔的形体较大，便于进行移植和观察，对兔BM-MSC的生物学特性进行深入的研究对实验生物学具有重要意义。本研究采用贴壁培养法，在体外培养、扩增兔BM-MSC，对其形态特征、表面标记、多向分化功能以及对不同细胞因子的反应进行初步研究，为以后的移植模型研究奠定基础。

材料和方法

实验动物

3月龄雄性新西兰大白兔6只，体重1.8± 0.2公斤/只，购自山东省农科院兔场。

兔BM-MSC的分离培养

对兔按3％戊巴比妥钠1 ml/kg体重行耳缘静脉麻醉，无菌取股骨骨髓1 ml（肝素终浓度50 U/ml）。用淋巴细胞分离液（上海华精生物公司产品，相对密度1.077）获得单个核细胞，以4×105/ml的密度悬浮于含10％小牛血清（杭州四季青产品）的高糖DMEM（Gibco/BRL公司产品）中，置100％湿度、5% CO2、37℃条件下培养72小时后全量换液，弃非贴壁细胞，每3天全量换液，约2周后贴壁细胞铺满80％瓶底， 用0.25％胰蛋白酶（Gibco/BRL公司产品）常规消化传代。

电子显微镜观察和细胞组织化学染色

取第5代BM-MSC进行扫描电子显微镜和透射电镜观察，并进行常规碱性磷酸酶染色（ALP）和糖原染色（PAS）。

免疫表型检测

取第5代处于对数生长期的BM-MSC，消化后用含0.1％ BSA的PBS悬浮，调整密度为1×106/ml，分别标记鼠抗兔CD44、鼠抗兔CD45和鼠抗MHC-I型分子抗体（IgG1，Serotec公司产品）10 μl，室温放置30分钟；另取1管作IgG同型对照；以缓冲液洗去未结合抗体，再加入200 μl FITC－羊抗鼠二抗（IgG，Beckman Coulter公司产品），避光孵育20分钟，缓冲液洗去未结合抗体，流式细胞仪（CYTOMICSTMFC 500型，Beckman Coulter公司产品）检测，结果用CYTOMETER 1.0软件分析。

诱导分化及鉴定

成骨细胞取第5代处于对数生长期的BM-MSC，约60％融合时加入成骨细胞诱导培养液（含10％小牛血清，地塞米松0.1 μmol/L，维生素C 0.2 mmol/L，β-甘油磷酸钠50 mmol/L，Sigma公司产品），每3天全量换液1次，2周后行碱性磷酸酶染色和茜素红S染色。

软骨细胞取培养第5代处于对数生长期的BM-MSC，约60％融合时加入软骨细胞诱导培养液（含10％小牛血清，TGF-β1 3 ng/ml（PeproTech EC公司产品），地塞米松 0.1 μmol/L，β-甘油磷酸钠 5 mmol/L，维生素C 0.2 mmol/L，胰岛素 2 μg/ml，丙酮酸钠 30 μg/ml，牛血清白蛋白 0.4 mg/ml，亚硒酸 2 μg/ml，亚油酸 2 μg/ml，Sigma公司产品），诱导2周后甲苯胺蓝染色检测胶原表达，RT-PCR检测软骨特异性Ⅱ型、Ⅹ型胶原和aggrecan基因表达。

脂肪细胞取第5代处于对数生长期的BM-MSC，约90％融合时加入脂肪细胞诱导培养液（含10％小牛血清，胰岛素6.25 μg/ml，地塞米松 0.1 μmol/L，IBMX 0.25 mmol/L，吲哚美辛 100 μmol/L（均为Sigma公司产品），2周后油红O染色鉴定。

神经细胞取第5代处于对数生长期的BM-MSC，约90％融合时加入预诱导培养液（含10％小牛血清，bFGF 10 μg/L（PeproTech EC公司产品），48小时后加入神经细胞诱导培养液（含10％小牛血清，1％ DMSO，BHA 50 μmol/L，Sigma公司产品），3天后RT-PCR检测神经细胞特异性nestin和NF-M基因表达，免疫组织化学鉴定神经特异性抗原NSE的表达，一抗为鼠抗兔NSE，二抗为生物素化羊抗鼠IgG（武汉博士德生物公司产品）。

基因表达的RT-PCR检测

细胞总RNA提取使用TRIzoL试剂 (Invitrogen公司产品)，反转录按照RT-PCR试剂盒（购于北京博大泰克生物公司）说明书操作。所得cDNA用于PCR扩增，引物见附表（上海博亚生物公司合成）:扩增程序为95℃ 30秒，65℃ 45秒，72℃ 45秒，5个循环；95℃ 30秒，60℃ 45秒，72℃ 45秒，20个循环；95℃ 30秒，55℃ 45秒，72℃ 45秒，4个循环；最后72℃ 延伸10 分钟，PCR产物使用 2% 琼脂糖凝胶电泳分析。

不同细胞因子对兔BM-MSC增殖的影响

取第5代处于对数生长期的BM-MSC，以2 000个细胞/孔的密度培养于96孔板中，培养基为含10％小牛血清的高糖DMEM，分别加入不同浓度的IL-1、3、8和HGF（PeproTech EC公司产品），每组设12个复孔，培养48小时后常规MTT法检测MSC对不同生长因子的增殖反应，酶联检测仪(INTEC公司产品，Reader 2010型)检测492 nm处吸光值。Table. Primer sequence（略）

统计学处理

计量数据用X+SD表示，组间差异分析用 t 检验， P

结果

细胞形态及特异性染色

兔骨髓单个核细胞在贴壁培养72小时后可见少量细胞贴壁，10天后BM-MSC能铺满80％瓶底，以成纤维样细胞为主，HE染色可见核内有2-4个明显核仁（图1A）；扫描电子显微镜下可见大部分细胞表面光滑（图1B），少数梭形细胞有丰富的表面片状皱褶；透射电子显微镜观察显示，膜光滑有少量微绒毛的成纤维样细胞占大多数，该细胞核与细胞质比约为1∶5，细胞核中常染色质丰富、分布均匀，图1C可见双核仁，核仁大而结构清晰，核膜完整，可见内质网、高尔基复合体、线粒体、溶酶体和一些髓鞘样小体，胞质中分别有大量核糖体和微丝。BM-MSC细胞膜微绒毛较多，靠近这些突起的细胞质中分布有致密的微丝，形成一条高电子密度带（图1D）。细胞化学染色2%-3％的细胞碱性磷酸酶阳性，在胞质内有红棕色沉淀，阳性细胞在形态上与阴性细胞没有差异（图1E）；糖原染色全部细胞均为阳性，胞质含大量紫红色糖原颗粒（图1F）。

诱导分化结果及其鉴定

加入成骨细胞诱导培养液2-3天后，细胞开始从长梭形缩短为多角形，细胞体积增大，诱导14天后茜素红S染色为阳性，碱性磷酸酶阳性细胞大幅增加，表现出成骨细胞的特点（图2A-C）；加入软骨细胞诱导培养液后，细胞由长梭形显著缩短为椭圆形，体积增大，甲苯胺蓝染色呈阳性（图2 D、E）。RT-PCR结果表明其表达软骨细胞特异性的aggrecan基因，Ⅱ型胶原的基因表达也较诱导前增多，表现为软骨细胞分化的特点；但Ⅹ型胶原不表达（图2 I: 1-4）；成脂肪细胞诱导后细胞胞浆内开始出现细小脂滴，细胞排列无序，显微镜下可观察到高折光性的脂滴。油红O染色显示脂肪细胞内大量的大颗粒状脂滴（图2F）；神经预诱导剂加入后细胞形态变得细长，加入二次诱导剂后6小时内约有60％的细胞死亡脱壁，剩余的细胞有50％表现为神经元样细胞特有的形态，伸出细长的伪足（图2G，H）。这些细胞表现为NSE免疫组化染色阳性；RT-PCR结果显示其表达神经细胞特异性基因Nestin和NF-M（图2 I: 5-6泳道）。

细胞表型及RT-PCR检测

兔BM-MSC细胞上CD44抗原表达阳性率为32％；CD45表达阳性率为4.7％，MHC-Ⅰ型分子表达阳性率为1.8％；流式细胞仪测定结果见图3A-D。RT-PCR显示第5代的兔BM-MSC高表达Ⅰ型胶原，弱表达Ⅱ型胶原，不表达X型胶原、aggrecan、nestin和NF-M基因（图3E）。

不同细胞因子对兔BM-MSC增殖的影响

酶联检测和MTT结果显示，兔BM-MSC对IL-1、3、8和HGF的反应模式基本相同，均为低浓度促进兔BM-MSC的增殖，高浓度反而抑制细胞生长，抑制效应随细胞因子浓度增加而增加；兔BM-MSC对IL-3的反应最为明显，10 ng/ml的IL-3可显著促进细胞增殖达32％以上（P

讨论

目前分离MSC的方法多基于其黏附贴壁和体外快速增殖能力，鉴定MSC则主要是根据其形态和功能。目前普遍认为BM-MSC表达CD13、CD29、CD44、CD59、CD105、CD166和HLA-ABC，不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117和HLA-DR［2］。由于兔基因组计划尚未完成，兔分化抗原的抗体难以得到，本实验仅能选择CD44和CD45。细胞黏附分子CD44属于基质受体（matrix receptor），是分布极为广泛的细胞表面单链穿膜糖蛋白，在淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞表面均能检测到它的表达，专一性结合透明质酸盐并介导其内吞，在细胞-细胞和细胞－基质间作用中发挥重要作用［3］。我们的实验结果显示，约1/3的兔BM-MSC表达CD44，与猕猴BM-MSC的数据相同［4］，但较人BM-MSC的数据（>94％）为低［5］，这证明了物种间存在差异。我们培养得到的兔BM-MSC高表达I型胶原，弱表达Ⅱ型胶原，不表达Ⅹ型胶原和aggrecan基因。胶原是细胞外基质的主要成分之一，目前已发现 19种胶原分子，I型胶原的分泌是MSC的标志之一，可有效地促进BM-MSC的黏附、增殖和分化［6］，有关报道证明，如将人BM-MSC向软骨细胞方向诱导分化，则aggrecan基因、Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原的表达就会显著增加［7］，我们的试验结果显示，将兔BM-MSC向软骨细胞方向诱导分化后，表达aggrecan基因和Ⅱ型胶原，而不表达Ⅹ型胶原，这与人BM-MSC数据有差异。兔BM-MSC除向软骨细胞分化以外，我们还成功地使其诱导分化为骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞，证明了其具有多向分化潜能。骨髓中BM-MSC的含量仅占1/106个有核细胞，并且随着年龄的增加或体质的衰弱，BM-MSC的数量逐渐减少［8］。因此要获得足量的MSC，大量扩增纯化是十分必要的。根据我们的实验结果， 第5代之前的兔BM-MSC具有旺盛的增殖速度，倍增时间约为40小时，细胞形态狭长；从1 ml骨髓中获得的BM-MSC传代7-8次所得细胞数目可达5×108，已经能够足够满足体内移植和一般实验研究所需。随着重复传代，细胞变得宽大，生长速度下降，这和人BM-MSC中的研究结果相似，随着BM-MSC的衰老，其对生长因子的反应能力和多向分化能力也会显著下降［9］。BM-MSC除表达IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、 LIF、G-CSF、GM-CSF、M-SCF、FL 和SCF等多种细胞因子外，还能对bFGF、BMP、胰岛素、TGF-β1和HGF等多种细胞因子作出增殖或分化响应，证明其表达多种因子受体［11-13］。本实验检测了不同浓度的人IL-1、3、8和HGF对兔BM-MSC生长的影响。结果显示，低浓度的人IL-1、3、8和HGF能促进兔BM-MSC的增殖，而高浓度则抑制其增殖，其中低浓度IL-3对兔BM-MSC的促增殖作用最为显著，而高浓度的IL-3的抑制效果也较其他细胞因子明显。BM-MSC本身不表达IL-1和IL-3［11，13］，IL-3主要由活化的T细胞产生， 而IL-3受体主要表达于造血细胞上并介导造血细胞的增殖、分化或激活。有文献表明，人脐静脉内皮细胞也表达IL-3受体，并可被TNF或IFN上调。混合IL-3 和IFN可上调脐静脉内皮细胞表达MHC II类分子并分泌IL-6和G-CSF等造血生长因子［14］。根据我们的结果，IL-3受体也表达于BM-MSC，IL-3可能通过IL-3受体促进BM-MSC的增殖并使其表达更多的造血生长因子。总之，本研究成功地分离、培养了兔BM-MSC，检测了其免疫表型和多向分化能力，与文献报道的其他物种MSC的特性类似，并检测了不同生长因子对其生长增殖的影响，为下一步应用兔作为移植模型的研究奠定了基础。

参考文献

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篇4

资料与方法

实验过程：于猪宰杀后30min内清洁条件下取出心脏，经过取瓣、修剪、灭菌培养等处理，制备20只主动脉瓣膜，分别随机分成5组，通过程序性降温，采用液氮冷冻（-196℃）保存，将瓣膜完全浸润在冻存液中。分别经过2周、4周、6周、8周、10周深低温储存后，解冻后测定不同储存时限瓣膜生物力学指标。

检测指标：生物学检测指标主要有组织厚度，组织含水量，热皱缩温度；强度、组织伸长比。

统计分析：所有数据资料均以（χ±s）表示。采用SPSS 13.0、SAS 10.0统计学软件进行统计处理，所有数据正态性检验后，两样本均数采用组间或配对t检验，显著性标准为P

结果

深低温保存不同时限5组瓣膜厚度、组织热皱缩温度及组织含水量随着保存时限延长呈逐渐递增趋势（f=8.238，p=0.074），但无统计学意义；破坏强度及伸长比各组间存在明显差异，经统计学检验有显著性差异，见表1。

讨论

由于目前临床运用的人造心脏瓣膜

存在诸多的缺陷，机械瓣膜耐久性很好，但是术后抗凝的不当会引起出血和血栓的发生，组织工程瓣膜能很好地解决这一问题。最近研究表明其在细胞方面：不易黏附上去，胶原、弹力蛋白和蛋白聚糖等天然固有成分的缺失，力学性能较差。其主要原因为静态环境下培养的瓣膜上的内皮细胞黏附力低下，同时人体心脏瓣膜的结缔组织具有复杂的结构和分布形式，以耐受瓣叶起闭过程中不断变化的应力作用。以上研究提示生物瓣膜的细胞和纤维支架两者都是造成瓣膜衰败的重要因素。

同其他类型瓣膜相比同种瓣膜术后患者无须抗凝治疗，广泛应用于瓣膜替换手术及婴幼儿复杂先心病矫治术中。1962年Ross首次把人同种异体主动脉瓣应用于临床并取得成功，1986年O'Bfien首创了液氮超低温冷冻保存技术，提高瓣膜耐久性，有效地减少了由人工瓣膜引起的心内膜炎的发生率。其机制主要在于深低温环境可中断细胞的代谢，将损伤减到最小。同时，有文献报告冷冻保存技术能抑制移植物内皮细胞黏附因子的表达。因此目前如何提高同种瓣膜质量与最适宜保存时限之间的关系受到学者们越来越多的重视。

活性同种瓣膜是指细胞或组织维持自身和与外界能进行正常交换的能力。而正常心脏瓣膜细胞成分又由内皮细胞及间质细胞构成，内皮细胞维持瓣膜表面的张力和通透性，抵抗血流冲击导致的损伤等；而瓣膜间质绌胞除了对瓣膜基质的改建、重构及对损伤的修复具有重要意义；细胞外基质是生物力学性能的主要决定物质，也提供了细胞黏附生长的正常结构和生理环境。

同时在实验研究中发现瓣膜组织在程序降温及深低温保存后呈现一系列的变化，最早的改变是细胞固缩、水肿等现象。更严重的是细胞出现碎裂。整体看来，细胞结构模糊。这样变化解释了该实验中，通过检测生物力学发现瓣膜组织在瓣膜厚度、组织热皱缩温度及组织含水量随着保存时限延长呈逐渐递增趋势。生物力学性能中主要决定物质的细胞外基质在深低温环境下受到不同程度的破坏，造成各实验组随着时间推移破坏强度及伸长比逐渐下降的结果，符合以前临床和动物试验的结果。

篇5

【摘要】

目的 探讨Th1和Th2细胞因子表达谱研究在V型疮性肾炎(VLN)患者中的作用。方法 分离血清，通过抗体芯片技术同时检测4种Th1和5种Th2细胞因子表达谱，并探讨其与临床指标之间的相关性。结果 ①细胞因子表达谱：在同时检测的9种细胞因子中，VLN患者有4种表达上调，除了IL2属于Th1细胞因子外，其他三种(IL4、IL10和IL13)均属于Th2细胞因子，其中IL10较健康对照升高了10倍以上。②相关性研究：Pearson相关分析显示IL10与SLIEDAI呈正相关、与血红蛋白浓度呈负相关；此外，IL4和IL13均与尿蛋白浓度呈负相关，IL1与血肌苷之间呈正相关。结论 VLN患者体内细胞因子表达异常以Th2细胞因子为主，提示抗Th2细胞因子可能在V型狼疮患者中具有一定的治疗作用。

【关键词】 狼疮性肾炎；细胞因子；免疫

ABSTRACT: Objective To study the effects of cytokines Th1 and Th2 in Class V lupus nephritis (VLN). Methods Serum concentration of Th1 cytokines (IFNγ， IL1， IL2 and TNFα) and Th2 cytokines (IL4， IL5， IL6， IL10 and IL13) were simultaneously analyzed using fast quant human Th1/Th2 protein array， and Pearson analysis was used to evaluate the association between cytokines and clinical parameters. Results ① Cytokine profiling: Among the 9 cytokines detected simultaneously by fast quant human Th1/Th2 protein array， the expression of four cytokines was upregulated obviously， namely， Th1 cytokines (IL2) and Th2 cytokines (IL4， IL10 and IL13); that of IL10 was 10 times above the normal control. ② Pearson correlation analysis: There was a positive correlation between IL10 and SLEDAI (r=0.877， P

KEY WORDS: lupus nephritis; cytokine; immunity

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus， SLE) 是一种T细胞介导的、自身反应性B细胞高度增生、大量高亲和力的致病性的自身抗体产生的自身免疫性疾病[1]。狼疮性肾炎(lupus nephritis， LN)是SLE患者较常见的最严重的并发症和死亡的主要原因之一[2]。LN患者病程反复，伴有进展性的组织病变，疾病的死亡率居高不下，目前主要是通过应用非特异性免疫抑制剂和进行抗炎治疗。如果能了解SLE导致肾损伤的发病机制，发现新型的低毒性治疗方法，会更好的进行特异性的治疗，改善狼疮性肾炎患者的预后。

伴随着免疫细胞的数量和功能上的异常，细胞因子网络的变化对LN病程的演进有重要的作用：Th1型和Th2型细胞因子比例失调、细胞因子水平分泌增加或减少、细胞因子间相互的拮抗或协同作用增强或减弱等都参与了LN的发病过程[3]。但是，LN属于一种以肾脏形态学异常为基础的临床综合征，而且LN发病机制十分复杂，同一个患者可以同时存在多种细胞因子的异常，不能孤立的看待某一种细胞因子的异常，而多种细胞因子间的相互作用可能更为重要。因此，本实验以V型LN患者为基础，通过系统生物学的研究方法，借助高通量的抗体芯片技术同时观察V型LN患者血清多种细胞因子(包括Th1细胞因子和Th2细胞因子)的变化，以期从免疫学网络失衡角度阐明LN可能的发病机制，为治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病例选择

按照1982年美国风湿病协会SLE的诊断标准[4]选择狼疮性肾炎患者20例，均为女性，具有肾脏累及的临床表现；均进行肾活检。根据1985年WHO改良病理分型标准进行分型诊断符合弥漫膜性肾炎(V型)，根据SLEDAI评分(SLE Disease Activity Index)标准判断LN患者肾活检时疾病活动情况[5]，所有患者3月内未使用霉酚酸酯(MMF)或环磷酰胺(CTX)等强免疫抑制剂治疗。同时选择年龄和性别匹配的健康志愿者20例作为正常对照。

1.2 血清细胞因子检测

清晨抽取空腹静脉血5mL，离心后留取血清，-70℃保存待测。血清细胞因子的检测采用德国Whatman公司提供的抗体芯片，同时定量检测9种细胞因子的表达，其中包括4种Th1细胞因子IL1(白细胞介素1)、IL2(白细胞介素2)、IFNγ(γ干扰素)、TNFα(肿瘤坏死因子α)和5种Th2细胞因子IL4(白细胞介素4)、IL5(白细胞介素5)、IL6(白细胞介素6)、IL10(白细胞介素10)、IL13(白细胞介素13)的表达。每个因子检测设立3个复孔，取平均值。具体操作简述如下：玻片装上孵育室并将玻片/孵育室一起装入玻片夹；70μL封闭液室温封闭15min；常温孵育样品过夜(轻微振荡)；洗涤5次；生物素标记的抗体室温孵育60min(轻微振荡)；洗涤5次；StreptavidinCy5室温孵育45min(轻微振荡)；洗涤5次；DiH2O冲洗玻片并干燥；扫描玻片，进行资料分析。

1.3 其他实验室检查

所有患者同时进行以下检查：①24h尿蛋白定量：采用双缩脲比色法，正常值＜0.4g/24h；②自身抗体：抗核抗体(ANA)采用间接免疫荧光法，抗双链DNA(dsDNA)采用短膜虫法；③补体C3、C4：采用散射比浊法。

1.4 统计学方法

结果以均数±标准差表示。组间差异采用Students t检验，并通过Pearson相关性分析研究细胞因子表达及淋巴细胞亚群与临床指标之间的相关性。以P

2 结 果

2.1 患者的临床实验室的相关检查

V型LN患者一般临床资料见表1。V型LN患者白细胞、血红蛋白、补体C3和C4均明显低于健康对照组。与健康对照相比，白细胞计数分别为(5.015±1.426)×109/L和(6.271±2.730)×109/L(P

2.2 血清细胞因子的表达谱

V型LN患者所检测的9种细胞因子中有4种较对照组升高，除IL2属Th1细胞因子外(P

为明确细胞因子增长情况，我们以健康对照组细胞因子平均值为基数，观察了每种细胞因子增长幅度，发现V型LN患者升高最明显的细胞因子是IL10，较对照组升高了10倍以上，其他几种细胞因子增高幅度均在3～5倍之间，提示在LN中存在明显的细胞因子的比例失衡，细胞因子网络之间的平衡被打破，表现为细胞因子上调幅度不均一。表2 V型狼疮性肾炎和健康对照组Th1、Th2细胞因子浓度的变化（略）

2.3 相关性研究

Pearson相关分析显示，主要是Th2细胞因子与临床表现之间存在明显的相关性，尤其是IL10，如IL10与SLIEDAI呈正相关(r=0.877，P

3 讨 论

LN是我国最常见的继发性肾小球肾炎，其临床和肾脏病理改变存在显著的不均一性和多样性，不同的病理类型不仅反应了形态学上的差异，更可能蕴含不同的发病机制。V型病变表现为膜性病变，以上皮侧免疫复合物沉积和补体沉积为主要特征，临床上以大量蛋白尿为突出表现，但其发病机制尚未完全阐明。

如前所述，细胞因子参与免疫反应的每一个环节。细胞因子网络中，Th1/Th2细胞因子的失衡尤为受到研究者的关注，目前有Th2优势、Th1优势以及Th1向Th2转化发展的优势等[6]不同的假说。但是，Th1/Th2各代表了一组细胞因子，如果能同时检测多种细胞因子表达，将对研究细胞因子失衡在LN中的作用具有重要意义。抗体芯片可以一次性的检测上百上千种蛋白质的表达丰度，具有特异性强，敏感性高，检测范围广等优势。因此，本实验采用系统生物学的研究方法，通过高通量的抗体芯片技术对V型LN患者体内9种细胞因子(包括Th1和Th2细胞因子)同时进行分析，以便全面了解V型LN患者体内细胞因子的表达情况。

本实验首先对细胞因子表达进行综合分析，发现所检测的9种细胞因子有4种明显升高，包括一种Th1细胞因子和3种Th2细胞因子。但是，增长幅度显著不同，以Th2细胞因子增长最明显，其中IL10增加最显著，较健康对照组升高10倍以上，提示VLN患者体内细胞因子表达平衡被打破。作为Th2细胞因子的代表， IL10 在SLE 体液免疫激活和自身抗体产生中有不可忽视的促进作用。已有研究发现，IL10基因多态性不仅与LN 全身活动性相关，还对肾脏的临床活动和免疫病理损害产生影响[7]。自身抗体的产生是SLE发病机制中的关键因素，与其相应的自身成分结合成循环免疫复合物在机体各处沉积，激活补体系统，引发炎症反应，造成广泛的组织损伤[89]。作为B细胞活化和增殖的促进因子，IL10血清水平的升高恰好可以解释LN患者免疫系统的功能失调。

目前，关于细胞因子与LN疾病的相关性研究主要集中于细胞因子与狼疮疾病活动性指数、自身抗体之间的相关性上。但是，在此方面却存在较大争议。例如，RAPLEY等报道IL6水平与SLE活动性相关[10]，WAIS却认为IL6与SLE活动性无相关性[11]；作为一种Th1细胞因子，IFNγ在SLE发病机制中具有重要作用[12]，而在本研究中发现VLN型患者体内IFNγ无明显改变，考虑与患者入选标准不同、细胞因子检测方法不同有关。本实验中发现主要是Th2细胞因子与临床表现之间存在相关性。例如，IL10与SLEDAI呈正相关，与血红蛋白浓度呈负相关；IL4和IL13均与尿蛋白浓度呈负相关，提示Th2细胞因子可能参与肾脏疾病进展。但是，本研究主要选择未经过强免疫抑制剂治疗的患者，如果能增加部分活动性相对较弱的病例，或对入选患者进行免疫抑制剂治疗后做纵向对比分析，可能会提供更有意义的数据，可通过治疗前后细胞因子的变化判断LN治疗的效果，即细胞因子可能成为判断LN病情及治疗效果的生物学标记物。

狼疮性肾炎是发病机制复杂的异质性疾病，不仅淋巴细胞参与其中[13]，复杂的细胞因子免疫调控网络，及其受体间平衡紊乱也可能参与狼疮性肾炎的发生、发展。本研究发现V型狼疮性肾炎患者体内存在广泛的淋巴细胞异常及细胞因子表达谱异常，提示显著的免疫功能紊乱。这可能是目前免疫抑制剂治疗狼疮性肾炎的基础。但是，本课题仅限于未经强免疫抑制剂治疗的患者，如果能增加部分治疗后的随访观察结果，可能会对狼疮性肾炎的免疫学发病机制及免疫抑制剂的治疗机制提供进一步的理论基础。

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篇6

关键词：微生物学习；细菌分类；方法

中图分类号：G642 文献标识码：B 文章编号：1002-7661（2015）16-006-02

简单地说，微生物就是我们人类用肉眼很难将其观测到的细微生物。细菌是微生物中的一类，属于原核生物，按照形态可以分为球菌、杆菌以及螺旋菌。细菌虽然微小，但是其分布极为广泛，在人体中，细菌的数量要远远超过人体细胞的总量，其重要性由此可见。

一、关于微生物学的学习

在生物专业学习中，微生物学是其重要分支之一，可以应用于工业生产（例如酿酒、酸奶制作等）、医药（例如医学中细菌病毒检测、药品中各种菌素片等）、生物工程以及细胞工程等等。由于微生物是我们肉眼看不见或者看不清的细微生物，所以如果没有显微镜，认识起微生物来就不够直观，这也导致了人类历史中很长一段时间虽然有很多利用微生物的事件被记载，但都没有意识到微生物的存在。所以在学习微生物学的过程中，要注重学生自己亲身观察实践，利用显微镜等仪器，将微生物直观地展示在学生眼前。

当然在现代社会，绝大部分学生对微生物已经不陌生，但是在没有学习微生物学之前真正对其了解并喜爱的可能不多，在微生物学习过程中，还要注重学生学习兴趣的培养，在学习之初，要通过微生物与人类息息相关的实例以及多媒体教学的视觉冲击吸引学生的注意力，然后通过提出与生活有关的问题引发学生的思考，让其对微生物学产生好奇，然后利用显微境等仪器引导学生解答问题，激起学生成就感，从而引发其兴趣。

二、微生物学习中细菌分类概述

在微生物学习中，《伯杰氏系统细菌学手册》以及《伯杰氏细菌鉴定手册》是细菌分类以及细菌鉴定的权威以及代表作品，由于生物技术在不断进步，所以这两部手册也在不断修订。

目前，对细菌种类的研究主要是在细菌分类基础上，对细菌菌株进行鉴定；以及构建系统发育树研究细菌进化关系；也有在同一属的细菌范畴内对细菌的种进行分群聚类研究。这些研究都是以细菌分类为基础，从中也可以看出在微生物学习中细菌分类的重要性。

在学习细菌分类的过程中，要注意细菌分类是不断进步不断更新的，这主要是由于生物技术不断推陈出新、研究细菌分类的方法就在不断进步。同时还要注意技术的更新换代是一个连续的过程，新技术是在原有技术的基础上不断探索发明的，所以要注意不要因为有了新技术，就将原有的完全抛弃，也许在研究过程中可以只使用新技术，但是在学习时，也应该对历史有所了解和认识。所以学习细菌分类时，应该全面、连贯。

三、微生物学习中细菌分类方法探讨

对细菌进行分类，方法非常重要。所以，在微生物学习中，细菌分类方法具有重要地位。目前，细菌分类的方法主要包括特征分类法、数值分类法、组分分类法、分子生物学分类法以及多相分类法等。

1、特征分类法

不同的细菌，其形态、代谢以及生存环境存在一定差异，在生物技术不发达的年代，人们依据形态、生理以及生存环境等基本特征对细菌进行分类。不过由于细菌体积微小，使得这些特征的观察较为笼统，所以这种分类方法比较粗犷，很难对细菌进行进一步区分。特征分类法是一种古老、相对较为宏观的分类方法。

2、数值分类法

随着计算机技术的发展，数值分类法开始大规模兴起。细菌的表性特征有很多，将这些特征全部进行检测，然后利用计算机技术对这些特征进行归纳分类，这就是数值分类法。相对特征分类法，数值分类法要精细一些，但是其需要测定的特征很多。由于数值分类法能够定量反应细菌特征，所以目前该方法应用依然较为广泛。

3、组分分类法

组分分类法主要利用质谱、光谱、气相色谱以及高效液相色谱等技术检测细菌的化学组分。需要检测的细菌化学组分主要来源于细胞壁、细胞膜脂肪酸、枝菌酸、磷脂、醌、以及蛋白质等。检测细胞壁主要是检测其氨基酸和糖分；脂肪酸和枝菌酸都是细胞膜的重要组成成分；磷脂是极性脂；醌是非极性脂，存在于线体膜以及细胞质膜；蛋白质组分检测是采用全细胞蛋白质凝胶电泳技术。

4、分子生物学分类法

分子生物学分类法主要包括16S rRNA基因等序列分析、GC含量分析、DNA指纹技术、ITS序列分析、DNA-RNA杂交技术以及DNA-DNA杂交技术。目前，该方法应用广泛，用于细菌分类、多样性分析的基因除了16S rRNA基因外，还有16S～23SrRNA基因、tuf基因、hsp60基因、pheS基因等。当然，16S rRNA基因在利用基因序列分析进行细菌分类研究中应用最为广泛。

5、多相分类法

多相分类法就是综合上述几种方法进行细菌分类，该方法是一种综合的方法，将几种单一方法结合起来，互相验证、补充，可以得到更为合理可信的结论。

四、结束语

微生物学习中，细菌分类是一项系统但又繁琐的工作，而且细菌分布广泛、变异快，新种不断被发现，将新种进行鉴定和分类应该采用多种方法，而不能简单的通过单一方法就下结论，多相分类法就是用多种单一方法进行分类鉴定，所以相对更为全面可靠。

参考文献

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篇7

关键词：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）；聚γ-谷氨酸；硝酸钠；补料发酵；生物量

中图分类号：TQ920.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）04-0903-04

Optimizing Sodium Nitrate Fed-batch Culture on Poly（γ-glutamic acid） Fermentation by Bacillus licheniformis WX-02

XU Shang-hua，HU Li-fang，CHEN Shou-wen

（Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Huazhong Agricultural University ， Wuhan 430070，China）

Abstract： Bacillus licheniformis WX-02 was used to study the ways of improving poly（γ-glutamic acid）（γ-PGA） yield. The optimal conditions of sodium nitrate feeding for γ-PGA fermentation by Bacillus licheniformis WX-02 by flask-shaking fed-batch fermentation were the initial sodium nitrate concentration 10 g/L， and 5 g/L of sodium nitrate added when fermentation to 12 h. The fermentation was carried out in a 3 L fermentor， showing that the maximum of biomass and γ-PGA yield was 4.5 g/L and 38.7 g/L with increase of 55.2% and 14.8%， compared with the control. It is indicated that adding sodium nitrate can increase biomass， enhance the utilization of glutamate， and improve the γ-PGA fermentation.

Key words： Bacillus licheniformis； poly-gamma-glutamic acid； sodium nitrate； feeding fermentation； biomass

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 地衣芽孢杆菌WX-02，由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室筛选和保藏，保藏号为CCTCC M208065。

1.2 方法

参考文献：

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英文名称：Bulletin of Science and Technology

主管单位：浙江省科技技术协会

主办单位：浙江省科学技术协会

出版周期：双月刊

出版地址：浙江省杭州市

语

种：中文

开

本：大16开

国际刊号：1001-7119

国内刊号：33-1079/N

邮发代号：32-95

发行范围：国内外统一发行

创刊时间：1985

期刊收录：

中国科学引文数据库(CSCD―2008)

核心期刊：

中文核心期刊(2008)

中文核心期刊(2000)

期刊荣誉：

Caj-cd规范获奖期刊

联系方式

期刊简介

篇9

关键词：PCR；农业技术；发展简史；基本原理

中图分类号： Q555 文献标识码：A

在生物学领域中，聚合酶链式反应作为体外扩增基因序列的生物技术占有很重要的位置，并且与分子克隆技术和DNA序列分析方法构成了分子生物学实验工作和学习的基础。PCR技术的发明成为了生物界的里程碑并且是分子生物学的一项伟大的革命，它随之带来的是分子生物学以及生物技术在工业和产业的推进和发展[1]。

1 PCR技术发展简史

1971年Khorana最早提出了一个大胆的设想，那就是核酸体外扩增。但是，当时对于基因的排序和测序分析方法并不成熟，还没有发现对热定性的DNA聚合酶，所以这个想法没有任何实际意义的[2]。1985年美国的Kary Mullis受到高速公路的启发，在科学Science杂志上发表了PCR技术学术论文。20世纪80年代初，美国科学家Keohanog通过对实验室中所使用的酶的改进，大大提高了扩增的可实行性[3-5]。在之后的几十年里，PCR技术已经发展为十几种研究领域。

2常用的PCR技术

2.1 原位PCR

原位PCR是在组织切片或组织细胞里进行的PCR反应，它具有高度特异敏感和细胞定位能力，可以在细胞和分子水平上检测转特定的基因序列 [2]。

2.2 不对称PCR

不对称PCR是在PCR反应过程中采用两种不同浓度的寡核苷酸引物，经过若干轮采用循环后，待低浓度的引物被消耗尽，随后的循环只产生高浓度的产物既延伸产物，结果产生了大量的特异单链DNA[2]。

2.3 逆转录—PCR

逆转录PCR是以反转录DNA即cDNA作为模板进行PCR反应，能够使mRNA呈现多态性并且利用基因表达测定的强度和鉴定已被转录的序列是否发生突变，主要克隆mRNA的3’和5’的末端序列，以及可以从非常少量的信使RNA样品中构建cDNA文库[5]。可以使分析一些极为微量的RNA样品变为可能[6-8]。

2.4 反向PCR

PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。

2.5 多重PCR

多重PCR在同一个PCR反应系统中加入了两对或两对以上的寡核苷酸引物，并且同时能扩增出数量较多的核酸片段的PCR，其反应原理和操作过程一般与其他PCR相同[4-7]。

2.6巢式PCR

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对PCR引物扩增完整的片段。第1对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第2对引物称为巢式引物结合在第一次PCR产物内部，使得第2次PCR扩增片段短于第1次扩增 。

2.7锚定PCR

用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增[8]。

2.8重组PCR

重组PCR就是使两个不相邻的基因片段重组在一起的PCR。但是重组PCR所重组的基因片段长度都在1kb左右，因此在长片段的重组技术和提高准确度来说目前还有比较大的难度。

2.9定量PCR技术

PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。目前，主要采用定量的PCR方法主要包括设立内参照物的定量PCR、极限稀释法、荧光定量PCR、FQ-PCR、定时定量PCR等。

2.10 热不对称性PCR

热不对称性PCR是以基因组的DNA作为模板，并且利用依照目标的序列已知序列设计出3个具有较高退火温度的嵌套特异性引物，和一个长度较为短Tm值的随机简并引物进行组合，通过3轮具有热不对称的温度循环进行分级和扩增PCR，并且在获得已知序列的侧翼序列后用3个嵌套特异性引物分别与简并引物组合来进行PCR反应。

3 结论

PCR技术是一种极为重要的分子生物学研究的基础技术，还可以成为基因工程来提供目的基因，并且广泛地应用在亲自鉴定、个体识别、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR技术已经渗透到生物科学的各个领域。

参考文献

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篇10

关键词：生物；教学技巧；语言点拨

中图分类号：G632 文献标识码：A 文章编号：1002-7661（2012）21-144-01

点拨教学法是教学中的一种重要的教学技巧，随着时代的进步，点拨法有了新的发展中的内容和要求，语言点拨作为一种传统的教学技巧，在新的教学要求下也要与时俱进：在现代教育科学思想理论的指导下，贯彻启发式教学原则，灵活综合运用各种具体教学方法的一种现代化和科学化的教学，是贯彻素质教育、提高学生能力的有效方法。

生物课程是一门基础性的实验性的学科，对培养学生的能力有着天然的优势，在生物课程中，点拨是一种重要的教学技巧，对培养学生的综合能力有着不可取代的作用。

语言点拨是指在学生学习的过程中，思维或语言产生障碍时，教师借助精练恰当的语言进行点拨，帮助学生突破障碍，使思维进程加快，语言表达流畅。有以下几种点拨方法：

一、辅助点拨 当学生的思维活动因智力水平或努力程度不够等原因，在解决难度较大的问题显得力不从心时，就需要教师助一臂之力。例如，当讲完“爬行类”时，教师若直接让学生回答“为什么青蛙和鳖都能生活在水中，又能生活在潮湿的陆地，但它们却不属同类生物”这一问题时，不少学生有一定困难。这时教师可设计几个带有启发性的阶梯问题进行点拨：二者的呼吸方式有何不同？二者的皮肤有何不同？二者的生殖和发育有何不同？这样学生便可由表及里地抓住事物本质，解决学习中的疑点、难点，形成良好的认知结构。

二、旁敲侧击 它是指教师不直接点明思路，而是间接的、暗示的、曲折的进行点拨，或言在此意在彼的启发；或旁敲侧击的暗示；或迂回曲折的诱导；或在问题的峰回路转处巧设标志，使其洞天叠出、曲径通幽；或让学生从旧知孕育出新知的生长点；或让学生在解决问题时找到与之有联系的相似点、相关点，受到启发，展开联想，产生灵感，找到解决问题的最佳途径。例如讲“血液循环”时，让学生回答“左心房连接的血管是动脉血管还是静脉血管？其中流动的是动脉血，还是静脉血”这一问题，当学生答不上来时，教师可采用从旁点拨的方式进行启发：“和左心房相连的血管的血液流向何处？它的另一端连接的是什么器官？这个器官的作用是什么？”这样学生便会茅塞顿开，不仅知其然，而且知其所以然，加深了对问题的理解。

三、一语破的 教师在教学中采用直截了当、开门见山、一语破的的点拨方法。例如学生有时解答问题，尽管心中清楚，但由于对个别词语的遗忘，或表述水平有限，一时难以找到恰当的词语来表述，导致“水壶装饺子倒不出来”的情景，这时教师可直接给学生提供词语，帮助其越过语言障碍，得到答案。

四、轴辐点拨 任何一个学生难于理解的知识点都有其关键点，这个关键点与相关的知识点就像古代车轮的轴与辐的关系，教师以某一教学内容为中心进而引发出与之相关或相同的教学内容就是轴辐点拨。如在引导学生阅读“遗传工程”这段短文时，可抓住克隆技术这个概念，由点到面地进行点拨：克隆技术可消除遗传疾病；可制造人的各种器官；可使灭绝的生物复活；动植物可实施车间化生产等等。使学生具有扩散性、广阔性、灵活性。

五、向心聚点 它是与轴辐点拨相反的一种点拨方法，是教师为集中解决某一问题由点到面、由此及彼进行点拨。例如讲“生物进化的规律”时，教师可点出鱼类、两栖类、爬行类、哺乳类的生活习性、形态结构、生理特征的异同，学生会不难发现生物的进化规律是：由水生到陆生，由简单到复杂，由低等到高等，从而总结出规律性的东西，加深对问题的理解，使其思维具有深刻性。

上面所谈，只是教学实践中的几个举例，而不是语言点拨内容与方式的齐全罗列。我只能说，像这些做法就是点拨，而不能说，点拨法仅限于此。一言以蔽之，生物教学过程中的语言点拨法，应根据具体内容选择适当的点拨方法，“当点则点，当拨则拨”，做到潇洒自如，游刃有余，从而显示出高超的点拨艺术的魅力。只有这样，才能真正地发挥好教师的主导作用和学生的主体作用。

参考文献

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