七五普法笔记范文

导语：如何才能写好一篇七五普法笔记，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

关键词N新戊酰基，O异丙醇（NPP）酯； 氨基酸； 气相色谱燃烧同位素比值质谱； 营养级

1引 言

氮稳定同位素已广泛用来研究生态系统的特征与过程[1]。其中， 生物体有机质总氮同位素的组成（δ15N）已成为一系列生态学研究的重要手段之一， 尤其是用于评估有机体的营养级和测定氮在食物链中的流动[2]。总氮同位素方法用来评估营养级是基于大量研究的平均观测值：δ15N随食物网的富集指示大约为3.4‰[3]。然而总氮同位素方法也有局限性：（1）不同物种间的δ15N富集程度存在明显差异。DeNiro 和Epstein研究发现， 不同纲属动物（昆虫纲， 哺乳纲等）的

N值会造成所研究生态系统中营养关系的严重误判。

氨基酸单体氮同位素组成是可以准确有效地估算有机体营养级。研究表明， 生物体内谷氨酸（Glu）以及苯丙氨酸（Phe）氮同位素比值差异可以指示其营养级[5～7]。代谢过程中， 谷氨酸快速进行转氨基作用， CN键断裂， δ15N富集较大（+8.0‰）。相反， 苯丙氨酸的主要代谢步骤是增加一个羟基基团转化成酪氨酸， 此过程不伴随CN键断裂， δ15N富集不明显（+0.4‰）， 这种代谢关系的差异导致在特定营养级的有机体中谷氨酸和苯丙氨酸的δ15N明显不同。水生生态系统有机体营养级计算公式为[8，9]：

TLGlu/Phe =1+ （δ15NGlu-δ15NPhe-3.4）/7.6（1）

在文献[10]基础上， 本研究对GC条件、前处理方法以及衍生技术进行了优化。本方法准确性高， 重现性好， 为分析氨基酸氮稳定同位素以及评估水生生物体营养级提供参考。

2实验部分

2.1仪器与试剂

气相色谱燃烧同位素比值质谱仪（GCCIRMS， 美国ThermoFisher公司）； 气相色谱质谱仪（GCMS， 689070000C， 美国Agilent公司）；元素分析仪（EA， 美国ThermoFisher公司）； 氮吹仪（BYN1002， 上海秉越电子仪器有限公司）。

13种氨基酸标准品：丙氨酸， 甘氨酸， 缬氨酸， 亮氨酸， 异亮氨酸， 脯氨酸， 天冬氨酸， 蛋氨酸， 丝氨酸， 苏氨酸， 谷氨酸和苯丙氨酸和γ氨基丁酸， 以及内标氨基酸：正亮氨酸和β氨基丁酸的纯度均为99.9%， 均购于美国SigmaAldrich公司。阳离子交换树脂（Dowex 50W X8 H+， 200～400 mesh， SigmaAldrich公司）用于纯化样品。水解和衍生试剂包括： 12.1 mol/L HCl（ACS级）、 甲醇（色谱级）、 正己烷、 二氯甲烷、 亚硫酰氯、 新戊酰氯、 无水MgSO4， 均购于上海阿拉丁公司。

2.2实验方法

2.2.1生物样品采集、氨基酸提取以及衍生化 本研究的样品为2015年8月10日自阿哈湖水域（东经106°39′， 北纬26°33′）随机采集9种水生生物。所有样品冷冻干燥后， 研磨均匀。准确称取10 mg样品置于反应瓶中， 加入0.5 mL 2.1mol/L HCl后密封， 于110℃下水解24 h。室温冷却后， 水解液在60℃下用氮气吹干。水解产物溶解于0.1 mol/L HCl， 经正己烷二氯甲烷（3∶2， V/V）充分脱脂后，过阳离子交换树脂纯化， 用4 mol/L 氨水洗脱。内标加入洗脱液中， 经氮吹仪吹干， 并按照上述方法进行衍生化。阳离子交换树脂处理后可能存在的背景干扰由相应的空白程序检验。

2.2.2生物样品氨基酸混标衍生化标准样品溶液充分干燥后加入1 mL亚硫酰氯异丙醇（1∶4， V/V）于110℃下酯化2 h。氮吹仪吹干后， 再加入1 mL新戊酰氯二氯甲烷溶液（1∶4， V/V） 于110℃下酰化2 h， 生成N新戊酰基和O异丙醇酯， 多余的衍生化试剂经氮吹后完全去除。氨基酸NPP酯溶于0.5 mL二氯甲烷溶液， 用GCCIRMS测定氮同位素值[10]。

2.2.3色谱及仪器条件色谱柱：Agilent DB5ms毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）； 载气： He（99.9999%）， 流速1.4 mL/min； 进样口温度： 250℃； 升温程序： 初始40℃保持2.5 min， 以15℃/min升至110℃，再以3℃/min升至150℃， 最后以6℃/min升至230℃； 无分流模式进样， 进样量1.0～1.5 μL。单个氨基酸保留时间用GCMS确定。氨基酸氮同位素分析使用GCCIRMS进行， 氨基酸衍生化样品先通过GC分离， 然后进入毛细管微反应器（IsoLink）转化为相应的气体， 燃烧产生的水分由全氟磺酸渗透膜去除， 将连通燃烧管与质谱仪的毛细管置于液氮冷阱中， 以固定样品燃烧产生的CO2， 每测定10个样品后， 将冷阱去掉， 以释放固定住的CO2， 防止堵塞毛细管[11]。设定燃烧炉温度为1030℃， 选用N2测定模式， 自动调用m/z 28， 29， 30的离子源参数。

2.3数据处理

数据处理运用ISODAT 软件（Thermo， Fisher）， δ15N峰开始和结束的斜度分别设为0.2和0.4 mV/s， δ15N值的计算如下：

δ15N（‰）=[（Rsample/Rstandard）-1]×1000（2）

其中， Rsample表示所测样品中15N丰度与14N丰度之比， Rstandard表示标准样品中15N丰度与14N丰度之比。

3结果与讨论

3.1衍生条件及GCCIRMS系统

氨基酸是两性离子， 其羧基、氨基以及侧链官能团被完全衍生化前并不适合用气相色谱分离。在本研究中， 氨基酸通过衍生成功转化为NPP酯。该方法的主要优点：所有的衍生化试剂不含氮原子， 因此不需要对氮同位素进行进一步校正；相较乙酰基而言， 新戊酰基的引入进一步减小了氨基酸的极性， 增加了色谱的分离效果。另外， 氨基酸NPP衍生物产生的背景噪音更小[12]。对于气体同位素质谱系统而言， 毛细管柱和燃烧系统是非常重要的， 任一系统表面失活， 都可能会导致灵敏度的下降， 伴随着保留时间的漂移， 信号强度显著下降以及同位素比值不稳定等现象。因此， 每隔20～25个样品，

GCIsoLink燃烧炉都有必要进行重新氧化。通氧后， 氮信号强度是判断仪器是否恢复稳定的最好评判标准。本研究在GCCIRMS通氧后连续测定丙氨酸NPP酯衍生物20次。如图1所示， 丙氨酸氮信号值在第6次进样后达到稳定。GCCIRMS通氧、反吹后， 为保证测定值的准确性， 至少需测定标准样品5次（活化）， 待信号值稳定后才能进行样品的测定。实际过程中， 利用氨基酸混标进行活化。GCCIRMS每批次能测定的样品数量与、 样品性质及通氧时间等因素有关。实验时应注意插入氨基酸标准来检测Isolink的氧化性能， 一旦发现氧化效率降低， 立即停止测样进行通氧氧化。通过氧化、活化， 氨基酸保留时间和氮信号强度会恢复正常。

3.2氨基酸在GCCIRMS中的色谱行为

GC的分离度取决于分析物的挥发性以及与固定相的相互作用。本研究使用非极性气相色谱柱（DB5ms）对氨基酸NPP衍生物进行分离。与其它极性色谱柱相比， 该色谱柱可承受更宽的温度范围，

并可以得到氨基酸峰之间的最佳基线分离（如图2a和图2b）。目标化合物峰的基线分离是准确测定同位素值的首要条件， 尤其对于复杂的生物样品而言。氨基酸衍生物保留时间与引入的烷基的长度相关， 其次还与气相色谱柱的极性相关。在本研究中， 13种氨基酸可以得到基线分离（如图2a和图2b）， 低分子量、非极性的氨基酸， 例如丙氨酸、甘氨酸， 与固定相作用不强烈， 所以首先被洗脱出来。其次被洗脱出来的是较高分子量的中性氨基酸（例如缬氨酸， 亮氨酸）以及低分子量的极性氨基酸。最后被洗脱出来的是更高分子量的极性、芳香族氨基酸， 因为它们能与固定相发生强烈作用（图2b）。样品水解过程中， 天冬酰胺和谷氨酰胺会转化为天冬氨酸和谷氨酸， 因此GCCIRMS 测量得到的天冬氨酸的δ15N 值代表了天冬氨酸中的氮和天冬酰胺中的氨基氮的δ15N 值， 谷氨酸的δ15N 值代表了谷氨酸中的氮和谷氨酰胺中的氨基氮的δ15N 值。

3.3GCCIRMS测定氨基酸氮同位素比值的精密度和准确度

为了评估测定结果的精确度以及检验本系统是否适用于自然丰度的氨基酸氮同位素比值的测定， 6个同样浓度的氨基酸混合标准溶液分别衍生化， 并用GCCIRMS 测定其δ15N值。GCCIRMS测定的氨基酸δ15N值与EAIRMS测定的值相比， 评估测定结果的准确性（表1）。结果表明， GCCIRMS测定值具有较高的精密度， 所有氨基酸的δ15N值精密度都在1‰以内。EAIRMS和 GCCIRMS测定结果高度相关， 回归斜率接近1， 相关系数为0.98（图3）。经过校正， 这两种仪器的测量值之间的差异小于1‰。另外， 采用BlandAltman 法评估EAIRMS和 GCCIRMS测定结果的一致性。结果表明， GCCIRMS测定结果的平均偏差接近0.0‰， 明显位于仪器精确度范围内（图4）。因此， GCCIRMS测定

氨基酸氮同位素没有造成明显的同位素分馏， 并且本方法得到的δ15N值EAIRMS具有同等的准确度。

3.4氨基酸δ15N分析所需样品量

GCCIRMS分析氨基酸氮同位素所需的样品量是优化δ15N测定结果的准确度和精确度必须考虑的另一个重要参数。Merritt 等[13]认为δ15N的测定值和进样量之间存在一定的相关性。Takano等[14]发现当氨基酸峰高（m/z 28）大于100 mV时， δ15N测定值的精确度较高（1σ=0.5‰）， 约相当于30 ng N的进样量。同样的， Styring等[15]发现在100～1200 mV的信号强度范围内， 氨基酸δ15N测定值重复性最佳。本研究同样证实了这种现象， 0.3～4.5 nmol氨基酸标准经过衍生后测得的信号值与对应的δ15N值具有一定的相关性， 如图5所示。为得到准确可靠的δ15N值， 本实验中进样量为不少于20 ng N， 大致相当于200 mV（m/z 28）信号强度。与文献[14，16]相比， 可能是由于同位素质谱仪以及燃烧炉性能的提高， 因此本研究所需进样量减少。

3.5阳离子交换树脂对于氨基酸δ15N测定的影响

利用阳离子交换树脂纯化氨基酸样品被认为是一种有效方法， 可以去除一部分无机化合物， 并且将氨基酸从复杂的亲水化合物中分离出来， 如糖、有机酸等。这些干扰化合物会大量消耗衍生剂， 也可能会对GCCIRMS系统的燃烧和还原炉造成损害[14，15]。尤其是， 当样品中的目标化合物和其它含氮化合物不能基线分离时， 会导致目嘶合物的δ15N测定值与真实值偏差较大[17]。因此， 为了得到准确可信的δ15N值， 样品纯化是非常必要的。

如图6所示， 过柱前后氨基酸δ15N值具有较好的相关性， 即使使用氨水洗脱树脂中富集的氨基酸， δ15N值差异也不明显。这说明使用此方法能够有效排除非氨基酸类物质对检测结果的干扰。

为了验证阳离子交换树脂可能带来的杂质化合物， 空白溶液经完整的前处理过程后衍生并用GCCIRMS分析。如图2c所示， 色谱图中没有明显的背景化合物， 因此使用阳离子交换树脂对生物样品进行纯化是非常有效的手段。

3.6氨基酸氮同位素方法初步评估阿哈湖淡水生态系统常见物种营养级

本研究通过对自然界生物个体中氨基酸氮同位素的测定评估该有机体的营养级。氨基酸的氮同位素组成以及TLGlu/Phe值如表2所示。根据所得TLGlu/Phe 值， 可以有效确定淡水生态系统的有机体营养级。大部分淡水生态系统中的食物链始于初级生产者（TL = 1，例如藻类和植物）。一般认为食草动物的营养级为2， 杂食性动物处于2～3之间， 而肉食性动物则处于3以上。在本研究中， 以白鲢和草鱼为代表的草食性鱼的的TLGlu/Phe≈2， 分别为1.9和 2.1。初级生产者水绵和黑藻的TLGlu/Phe 值分别为1.0和1.2。黄颡鱼是一种被公认的凶残的食肉型鱼类， 其TLGlu/Phe=3.2。包括花鲢、鲫鱼、鲤鱼以及日本沼虾在内的水生生物被认为是杂食性动物， TLGlu/Phe 值处于2.3～2.4之间。表2中的TLGlu/Phe 值和个体预期的营养级高度符合。因此， 氨基酸氮同位素法能准确反映有机体在自然淡水生态系统中的营养级。

4结 论

本研究采用氨基酸NPP酯衍生方法对前处理、衍生以及GC条件进行优化， 有效分离了13种氨基酸， 通过GCCIRMS测定得到准确可靠的δ15N值。阳离子交换树脂纯化氨基酸是一种有效的方式， 氨基酸标准经纯化后其δ15N值变化幅度低于1‰。在进样量不低于20 ng N时， GCCIRMS测定氨基酸δ15N值精度较高。本方法可以广泛应用于大部分生物样品中氨基酸δ15N值的y定。另外， 应用本方法测定阿哈湖水生生态系统中生物个体的氨基酸的δ15N 值， 进而计算对应的营养级， 所得结果与预期值高度相符，说明本方法可以有效估计自然生态中的某特定生物体的营养级。

References

1Fry B. Stable Isotope Ecology， New York： Springer Science & Business Media， 2007： 1-2

2Hobson K A. Mar. Ecol. Prog. Ser.， 1992， 84： 9-18

3DeNiro M J， Epstein S. Geochim. Cosmochim. Acta， 1981， 45（3）： 341-351

4Bronk D A， Glibert P M. Marine Biology， 1993， 115（3）： 501-508

5Chikaraishi Y， Steffan S A， Ogawa N O， Ishikawa N F， Sasaki Y， Tsuchiya M， Ohkouchi N. Ecol. Evol.， 2014， 4（12）： 2423-2449

6Naito Y I， Bocherens H， Chikaraishi Y， Drucker D G， Wiing C， Yoneda M， Ohkouchi N. J. Archaeol. Sci.， 2016， 6： 720-732

7Chikaraishi Y， Ogawa N O， Doi H， Ohkouchi N. Ecol. Res.， 2011， 26（4）： 835-844

8Dore J E， Brum J R， Tupas L M， Karl D M. Limnol. Oceanogr.， 2002， 47（6）： 1595-1607

9Ohkouchi N， Tsuda R， Chikaraishi Y， Tanabe K. Mar. Biol.， 2012， 160（4）： 773-779

10Corr L T， Berstan R， Evershed R P. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2007， 21（23）： 3759-3771

11LI GuoHui， ZHONG QiDing， WANG DaoBing， SHEN ShiGang. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society， 2016， 37（1）： 60-67

李国辉， 钟其顶， 王道兵， 申世刚. 质谱学报， 2016， 37（1）： 60-67

12XU ChunYing， MEI XuRong， LI YuZhong， ZHONG XiuLi. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2008， 24（4）： 151-156

徐春英， 梅旭荣， 李玉中， 钟秀丽.中国农学通报， 2008， 24（4）： 151-156

13Merritt D A， Hayes J. J. Amer. Soc. Mass Spectrom.， 1994， 5（5）： 387-397

14Takano Y， Kashiyama Y， Ogawa N O， Chikaraishi Y， Ohkouchi N. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2010， 24（16）： 2317-2323

15Styring A K， Kuhl A， Knowles T D， Fraser R A， Bogaard A， Evershed R P. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2012， 26（19）： 2328-2334

16Molero G， Aranjuelo I， Teixidor P， Araus J L， Nogues S. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2011， 25（5）： 599-607

17Ricci M P， Merritt D A， Freeman K H， Hayes J. Org. Geochem.， 1994， 21（67）： 561-571

篇2

一、深入开展法治宣传教育

1、突出抓好十八届五中全会精神的学习宣传。充分利用各类普法阵地、普法平台、普法载体，在全系统深入开展系列法制宣传活动，引导广大干部、群众深刻理解和把握全面推进依法治国和依法治市建设，学习十八届五中全会一系列新论断、新部署、新要求，培育法治理念，塑造法治信仰，不断增强厉行法治的积极性和主动性，努力成为社会主义法治的忠实崇尚者、自觉遵守者、坚定捍卫者。

2、突出抓好以宪法为核心的中国特色社会主义法律体系的宣传教育。开展“学习宪法、尊法守法”主题活动。把主题活动作为重要载体，突出宣传宪法，系统宣传中国特色社会主义法律体系，大力宣传宪法法律至上、法律面前人人平等、权由法定、权依法使等基本法治观念。认真开展“12?4”国家宪法日暨全国法制宣传日系列宣传活动，不断深化以宣传宪法为主要内容的专项主题教育活动。

3、突出抓好与卫生、计生工作密切相关法律法规的宣传教育。重点学习和宣传《传染病防治法》、《人口与计划生育法》、《职业病防治法》、《精神卫生法》、《执业医师法》、《省人口与计划生育条例》、《公共场所卫生管理条例》等法律法规的学习宣传，进一步增强卫生计生工作人员和广大群众知法、用法、自觉守法意识。

二、强化法律素养，扎实抓好重点对象普法教育工作

4、强化领导干部法治思维。抓住领导干部这个“关键少数”，推动落实领导干部学法活动。进一步健全党组中心组学法和学法讲座制度，党组中心组全年集中学法活动不少于2次，举办法制讲座不少于2次。坚持和完善领导班子和领导干部重大决策前法律咨询制度。充分发挥好领导干部带头学法守法用法的表率作用，推动卫生计生系统普法教育工作的深入开展。

5、抓好机关公务员的学法用法工作。坚持和完善国家工作人员学法用法制度，大力推进公务员学法用法活动和依法行政培训工作，进一步增强法治意识和依法行政能力，公务员依法履职情况好，办事效率高。机关工作人员坚持集体学法与自学相结合，每人要有学法笔记和学习心得，每年有针对性的学法时间不少于30学时。

6、抓好卫生计生行政执法人员的学法用法工作。一方面要学习熟知卫生计生相关法律法规，另一方面在执法过程中加强法律法规的宣传，同时运用法律条款准确，提高执法效率和水平。

7、抓好卫生计生专业技术人员的学法用法工作。深入学习《传染病防治法》、《精神卫生法》、《执业医师法》、《护士条例》等，进一步增强法律意识，提高法律素养，依法开展执业活动。各级医疗机构每年针对在职医师、护士的法律培训不能少于2次。

8、抓好管理相对人的宣传培训。继续深入开展“法律六进”活动，积极宣传卫生计生法律法规，有效提高广大人民群众尊法守法意识，营造单位和社会学法用法的良好氛围。

三、积极创新普法宣传的载体和形式，健全普法教育机制

9、扎实推进法制文化阵地建设。巩固发挥报刊、广播、电视等大众传媒的独特优势，加大媒体法制宣传教育力度，创新传统媒体普法的方式方法。广泛利用各类公共活动场所，融入法制元素，建设法制走廊、法制宣传栏和法制宣传橱窗，形成覆盖机关、城乡的法制文化阵地网络。加大应用新媒体开展法制宣传教育的力度，推进网络、移动通讯法制宣传教育力度，积极运用微博、微信、QQ群开展普法，扩大新媒体普法的覆盖面。全系统各单位均要设立固定的法制宣传阵地，不断更新法制宣传内容。

10、进一步健全普法教育机制。改进普法宣传教育方式，建立“谁执法谁普法”制度，推进落实国家机关“谁执法谁普法”的普法责任制。结合本行业制定颁布重点普法目录，明晰行政执法部门普法清单、明确普法责任。把法治宣传教育纳入精神文明创建内容，把尊法守法用法情况作为精神文明创建的重要指标。

四、强化领导，完善普法工作运行机制，注重考评宣传