苏武传教案范文

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篇1

关键词硫胺素焦磷酸核酶开关； 增强绿色荧光蛋白； 基因表达调控； 荧光生物传感器； 哺乳细胞

1引 言

核酶开关是近些年出现的一种人工基因调控开关。常见的核酶开关由锤头状核酶和适配体组成[1]。作为一种顺式作用元件，在特异识别适配体的配体作用下，无需蛋白质辅助，即可通过调节自身裂解反应，调控mRNA的翻译，已应用于多种细胞的基因调控[2～6]。迄今，随着指数富集配基系统进化技术（SELEX）[7]技术发展，越来越多的适配体被筛选出来，能特异性地结合小分子、蛋白质、多肽、氨基酸、抗生素和金属离子等各种配体[8～11]。相比于天然的核酶开关，人工核酶开关具有基因表达可控性、结构可组装性、靶基因特异性等特点[12]。配体与适配体区的结合引起的构象变化可用来调控下游基因的表达，转化成相关的化学信号，如报告基因的荧光变化等，可实现对配体在活细胞内的原位、可视化检测。如今，合成生物学的发展及核开关在逻辑门中的运用，更推动了基于核酶开关的生物传感器在真核细胞内的广泛应用[13]。

硫胺素焦磷酸（Thiamine pyrophosphate，TPP） 是维生素B1在细胞内的主要活性形式，也是糖、脂肪酸和氨基酸氧化代谢中重要的辅助因子，对维持细胞正常代谢、细胞生长和增殖等发挥极其重要的作用。TPP 核酶开关是唯一同时存在于原核生物和真核生物中的天然核糖开关，在植物和真菌中较为常见[14～17]。其在真核细胞中主要作用于premRNA的内含子剪切，可实现对基因精确和有效的调控。无论是在真核中，还是原核生物中，TPP核酶开关对TPP都有高的特异性和亲和力，而细胞中的其它组分或相似产物与核酶开关适配区结合能力很弱[18～20]，对核酶的活性影响很小。文献[21～24]报道，将TPP适配体与天然核酶组装成人工的TPP核酶开关，用于体外、原核细胞或藻类等细胞中调节靶基因的表达。目前，在哺乳细胞中运用的核酶开关适配体结构多限于茶碱、四环素、金属离子等配体的适配体[25，26]。这些配体为细胞外源物，且常具有一定细胞毒性。而TPP是真核细胞的一种重要的代谢中间物，在细胞体内含量较低，人工建立的核酶开关用于调节哺乳细胞内的基因表达还未见报道。

迄今为止，原核生物中报道的人工TPP核酶开关有正调控和负调控两种类型[21]，一般置于靶基因5′端。通过配体与适配体的作用，调控核酶剪切与否，释放或封闭RBS序列以促进或关闭下游基因的表达[27]。真核生物中因无RBS 序列，核酶开关通过抑制mRNA剪切上调靶基因的表达，或激活mRNA剪切来抑制靶基因的表达[28，29]。目前，人工核酶开关的设计一般通过理性设计通信模块元件序列，再整合到细菌或酵母mRNA中进行功能筛选与优化[30，31]。

2实验部分

2.1仪器与试剂

Eppendorf mastercycler nexus PCR仪（德国Eppendorf公司）； Nikon ECLIPSE TI倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）； BD Accuri C6流式细胞仪（美国BD公司）。

焦磷酸硫胺素（>95.0%，美国Sigma公司）； 茶碱（>99.0%，北京百灵威科技有限公司）； DpnI酶（50 U/μL，美国NEB公司）； T4 连接酶（5 U/μL，美国Invitrogen公司）； lipofectamine 2000转染试剂、DMEM培养基（美国Invitrogen公司）； 小牛血清（美国Gibco公司）。

2.2哺乳细胞中TPP核酶开关质粒的构建

将来源于Schistosoma mansonii锤头状核酶 （HHR） 序列插入pEGFPN1载体EGFP基因的3′ UTR 区。 pEGFPN1质粒为模板，5′ 重叠延伸PCR方法构建无TPP适配体区的pEGFPHHR。PCR反应： 94℃预变性2 min，94℃ 30 s， 60℃ 30 s， 72℃ 1 min， 25个循环； 72℃延伸10 min。PCR反应体系： 5 μL 10 × Phusion DNA polymerase buffer， 4 μL 10 mmol/L dNTP， 2 μL 10 μmol/L primer F， 2 μL 10 μmol/L primer R， 1 μL Template， 0.25 μL Phusion DNA polymerase； 加ddH2O至50 μL。PCR产物用乙醇回收，DpnI酶37℃消化PCR产物中过量的质粒模板1 h，用乙醇回收产物，T4 DNA ligase连接转化至感受态细胞，后涂布至含有相应抗性的LB平板中37℃过夜培养。挑取单克隆培养，提取质粒并送上海生工生物技术公司测序，GenBank中BLAST序列比对。测序成功产物作为模板用于后续带有TPP适配区on/off型核酶开关的构建，其构建方法同上，其序列与相关引物见表1。所有寡核苷酸及引物由上海生工生物技术公司合成。

2.3哺乳细胞的培养及瞬时转染

HEK293细胞于添加10% 小牛血清的DMEM中，37℃， 5% CO2培养。转染前一天，以5×104/孔密度，添加0.5 mL DMEM/孔铺于24孔板。根据转染条件，以每孔1 μg pEGFPTPPHHR质粒与2 μL lipofectamine 2000转染细胞，pEGFPN1与pEGFPHHR分别为阴性与阳性对照，4 h后换新鲜培养基并添加不同梯度浓度（0～150 μmol/L）的TPP或茶碱（Theophylline）。

2.4转染后细胞内EGFP表达的荧光显微镜观察与流式细胞仪分析

细胞转染48 h后， PBS洗涤，荧光显微镜下以488 nm 激发波长，515～545 nm发射波长观察EGFP

3结果与讨论

3.1pEGFPTPPHHRON/OFF质粒的构建

人工TPP核酶开关有正调控和负调控两种类型，无论对于原核生物或真核生物，人工核酶开关上调或抑制表达的关键取决于连接适配体结构域与核酶结构域的通信模块，即连接适配体区（Stem Ⅲ）与锤头状核酶（HHR）（图2A）茎环结构（StemⅡ）之间的寡核苷酸序列，故TPP适配区与HHR核酶的接头序列是决定核酶开关是“Switch on”还是“Switch off”的关键。在负调控（Switch off）开关中，无配体时，锤头状核酶（HHR）的活性结构得不到维持，从而抑制HHR核酶的剪切。而TPP配体的结合，可引起核酶开关茎环结构Stem Ⅱ与Stem Ⅰ 之间活性结构的稳定，剪切发生。反之，正调控（Switch on）结构具有初始稳定的HHR剪切结构，而TPP的结合反而破坏了HHR的活性结构，从而抑制剪切的发生[21，23]。根据原核生物中优化的连接适配体与核酶的6个寡核苷酸的不同序列，共构建了3种Off（pEGFPTPPHHRoff1，2，3）开关及两种On（pEGFPTPPHHRon1，2）开关的质粒（图2B）（后续以TPPHHRon/off简称）。

为保证其在真核生物中的调节活性，所有开关设计均插入在目的基因EGFP 3′ UTR区。由于待插入的HHR和TPP适配体片段位于EGFP基因下游，缺少合适的限制性内切酶位点，且序列较短，仅约120～140 bp。传统的PCR酶切连接方式的回收效率较低， 影响后续重组载体的构建，故本实验中利用Overlap extension PCR cloning[32]将核酶开关片段插入质粒中的方法更为高效准确。设计两条5′ 末端磷酸化的上下游引物，引物的一部分为带插入的序列，另一部分分别和质粒插入位置的下游和上游互补，以模板质粒扩增全长。

3.2不同TPP浓度下HEK293细胞内EGFP基因表达分析

首先通过荧光@微镜观察瞬时转染48 h后HEK293细胞内EGFP报告基因表达，结果表明：相比阴性对照pEGFPN1转染细胞的EGFP高表达，阳性对照pEGFPHHR质粒转染的细胞荧光明显降低，表现出良好的核酶剪切功能，但无TPP浓度依耐性 （图3A）。而随着TPP浓度升高TPPHHRon1，2转染细胞的绿色荧光的强度有着明显的增强趋势； 反之，而在构建的3个off型开关转染细胞中，只有TPPHHRoff1随着的TPP浓度的升高，EGFP表达明显下降（图3B）。

但TPPHHRoff2，3均未见荧光强度的降低，其强度接近于阴性对照， 且无TPP浓度依赖性。这可能是因为接头序列的不完全配对造成了mRNA二级构象的不匹配[23]，而这种改变在哺乳细胞中会受到更多因素的影响，核酶更难以发挥正确的剪切功能[31]。

为进一步考察不同TPP浓度对EGFP表达的影响，利用流式细胞仪对上述EGFP表达量有改变的转染细胞株平均荧光强度进行定量分析（图4）。相比阴性对照，pEGFPHHR转染细胞株荧光强度降低近80%，表明此构建体系中HHR核酶在哺乳细胞中保持其强劲的剪切作用。在构建的两个激活型开关中，TPPHHRon1在TPP浓度达50 μmol/L 时荧光表达明显升高； 150 μmol/L 时，平均荧光强度可增大约3.1倍，接近于报道中作用于原核细胞的Turn on功能[21]，另一TPPHHRon2荧光强度虽有升高，但开关调节功能较微弱，150 μmol/L的TPP调节只增加1.8倍的表达。而在构建的TPPHHRoff1中，TPP浓度为100 μmol/L 时，平均荧光强度降低了2.3倍，之后随配体浓度继续增加（150 μmol/L），其对EGFP表达的进一步抑制未有明显效果。发现3种对TPP有响应的核酶开关，其对TPP敏感浓度约为50～100 μmol/L，实验中曾将TPP浓度加大到500 μmol/L，但其在各种转染细胞株中并未见明显作用效果。相对于以往报道中茶碱在哺乳细胞中调节浓度均为1～10 mmol/L， 所构建的TPP核酶开关对TPP底物作用的敏感性大大提高。但此结果也证实了虽然核酶开关在原核生物或低等真核生物细胞中有良好的调控作用，但其结果并不完全适用于哺乳细胞。在很多报道中， 原核生物系统中的核酶开关可达到1.2～10倍的调节功能[23，30]，虽远小于体外100～10000倍的调节幅度[22]，但在真核哺乳细胞中的调节效果更低，且调控能力亦会因转基因或宿主细胞种类的不同而有所改变[31]。相比于原核生物相对简单的转录翻译机制，其核酶开关在真核细胞中mRNA二级结构的正确形成常会受到更多转录翻译等相关因子的影响，更增加了其调节的难度和不确定性。

为了检测TPP核酶开关的特异性，在平行样本中均加入了茶碱。实验表明，茶碱的添加并不能激活核酶开关发生构象变化，从而影响报告基因绿色荧光蛋白的表达。结果表明，这些原本适用于原核生物的核酶开关对适配体较高的特异性在哺乳细胞内仍能得到较好的保留。

4Y 论

研究了原核生物筛选的基于TPP适配体的两种类型的核酶开关，通过TPP配体与人工核酶的变构作用，激活或抑制核酶的剪切，实现了在哺乳细胞中调节报告基因绿色荧光蛋白（EGFP）的表达。此方法可用于间接检测哺乳细胞内微环境中的TPP浓度，这种基于变构活性来调节下游报告基因活性的策略，利于通过荧光检测用于哺乳活细胞内代谢物或因子的无标记、无损伤、可视、高效的检测。虽然相对于体外检测，这种细胞内原位检测方法所需的本底浓度水平较高（umol/L），但今后随着合成生物学中基因表达的级联放大技术的发展和逻辑门等方法的结合运用， 这种基于核酶开关的生物传感器将在提高哺乳细胞检测敏感性和运用广泛性方面具有极大的潜力[33]。