打印合同范文

导语：如何才能写好一篇打印合同，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

乙方（承租方）

双方于____年__月__日，就出租打印机设备一事，经双方协商签订合同如下：

一、甲方将_____打印机___台出租给乙方使用，租期为____年（从___年 ___月___日至___年___月___日止）甲方收取乙方打印机押金____元，合同期满后将其押金无息退还给乙方。

二、在租赁期间甲方免费负责打印机的维修和保养，所需零配件及耗材都由甲方负责，打印纸张由乙方自行负责。

三、收费标准：每月最低基本租金为人民币____元，即可免费打印___张，超出部份每张按____元计算。

四、每月__日为抄表结算日，抄表结算后__日内付款，若乙方不按时付款，甲方有权收机器，并从押金中扣除应收租金及第九条所述违约金后，退回余款。

五、在租赁期间打印机出现故障，甲方应在接到乙方通知后工作时间3小时内到达现场进行维修，乙方不可以召唤甲方之外的其它单位维修。未经文秘站:甲方同意乙方不准私自移机及拆动，乙方在使用过程中因使用或保管不当致使打印机的损坏由乙方承担责任。

六、在租赁期间如果乙方遗失打印机，乙方必须赔偿人民币___元整（￥___）给甲方。

七、在租赁期间如甲、乙双方任何一方要求终止合同，要求方必须提前一个月以书面方式通知另一方，并且要求方无条件赔偿500元给对方。

八、在合同期满后，乙方应将打印机及附件退还给甲方。合同到期后壹个月内，甲、乙双方未提出解约，则视为双方自动延长此合同相同租期，双方不用再签任何合同，本合同具有同等租期和同等法律效力。

九、本合同一式两份，甲、乙双方各执一份，经甲、乙双方代表签字、盖章且打印机到位后立即生效。本合同生效后，若双方任何一方有违约行为，应由违约方赔偿人民币伍佰元（￥500.00）给对方。

十、本台打印机起始计数器读为：_______.

十一、本合同未尽事宜，经双方协商一致，可签订补充条款，补充部分作为合同的附件，与本合同具有同等法律效力。

甲方：

乙方：

代表：

代表：

日期：

日期：

地址：

地址：

电话：

篇2

租房协议合同范本一甲方(出租方)

乙方(承租方)

甲、乙双方就租用甲方房屋一事：经甲、乙双方友好协商，达成以下协议：

一、甲方将其归属所有权的，面积平方米，租给乙方使用。

二、乙方的租期从起至日止。为期年。

三、租金现金支付，每月租金，乙方一次性支付一年租金元。

四、甲方须向乙方出示房屋的正本房产证和有关证明。

五、乙方需承担租用期间住房的一切管理费用，其中包括小区管理费，电视收视费，水、电、煤气费和电话费等。

六、乙方在租房期间必须爱护好房屋设施，如有损坏，乙方负责赔偿或修理完善，若乙方需装修或改变房屋结构，需经甲方同意。合约期满按米修去丢原则办理

七、乙方在租房期内，不得将租房作违法经营场所。一经发现，除按法律制裁外，甲方有权收回房屋，所剩租金不退。

八、乙方在租房期间未经甲方同意不得将房屋转租他人，如未经甲方同意转租，此协议无效，安全责任由乙方自负。

九、如租期满，乙方需继续租用，须提前一个月与甲方交涉说明，并提前交清下年租金，如乙方不再续租交清租房期间的所有费用，退还甲方钥匙并结清相关手续给甲方或中介方;如不按此办理责任由乙方承担，甲方和中介方有权在租房期满五天后打开房屋另行出租或使用。

本协议一式两份，经双方代表签字后生效，具有法律效力，双方必须共同遵守。

甲方(租赁人) 身份证号： 联系电话：

乙方(承租人) 身份证号： 联系电话：

签约时间：年 月 日

租房协议合同范本二出租方： (以下简称甲方)________________________

承租方： (以下简称乙方)________________________

甲乙双方经友好协商，乙方为在开发区设立 公司而租用甲方房屋，并就此租宜达成如下协议：

一、甲方同意供给乙方经营用房 平方米，用于该公司经营之用，该房屋坐落于

二、该房屋租金经双方商定为每月 元。该房屋总租金为 元。

三、租金于 交付，每延迟一天按总租金的 计罚。若 天内仍未交纳，甲方有权收回该房屋，并按实际迟付天数依上述计罚比例向乙方收取罚金。

四、乙方同意预交 元作为金，时，当作房租冲抵。

五、租赁期限为 ，从 年 月 日至 年 月 日。在此期间，任何一方要求终止合同，须提前三个月通知对方，并偿付对方总租金 的;如果甲方转让该房屋，乙方有优先购买权。

六、因租用该房屋所发生的除土地费、大修费以外的其它费用，由乙方承担。

七、在承租期间，未经甲方同意，乙方无权转租或转借该房屋;不得改变房屋结构及其用途，由于乙方人为原因造成该房屋及其配套设施损坏的，由乙方承担赔偿责任。

八、甲方保证该房屋无纠纷;乙方因经营需要，要求甲方提供证明或其它有关证明材料的，甲方应予以协助。

九、就本合同发生纠纷，双方协商解决，协商不成，任何一方均有权向开发区人民法院提起诉讼，请求司法解决。

十、本合同未尽事宜，可由双方协商签订补充协议，经公证后与本合同具有同等法律效力。

十一、本合同以双方共同认可并经公证后生效。

甲方(签章)：________________________ 乙方(签章)：_______________________

篇3

关键词：自动化 打印 合同管理

中图分类号：TP311 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2017）02（a）-0108-02

目前物资合同统签统付在全国已经铺展，物资合同签订总量逐年递增[1]。随着2015年5月物资子系统的上线，优化着力方向在于电子合同的制定效率，而占据签约工作较大部分的书面签约部分仍然依靠大量的手工操作，经多重界面跳转打开打印，效率低下，无法与逐步优化的系统同步配套，仍然影响整体工作效率。为了进一步提升整体的工作效率，在物资合同统签统付典型模式的大背景下，借助系统智能化、流程规范化调整的契机，提升电子合同签订的规范性与智能化。

1 项目管理系统简介

项目管理系统是一款基于Html、CSS、Java等语言开发的C/S模式的合同在线管理系统。它包括了合同管理、功能设置、字典管理3大功能模块。其中合同审核包括初始化、合同上传、查询、导出合同、合同审核、合同分类、批量打印、合同删除等功能；功能设置主要包括打印机设置、修改密码、用户注册等功能；字典管理模块包括全局数据设置、客户管理、客户数据导入、用户管理等功能。

2 合同导入模板设计

合同管理模块中的合同导入是以SQL标准模板为基准的。该SQL模板具有的标题列有唯一ID、付款方编号、付款方名称、收款方名称、合同日期、更改日期、合同内容、备注、行业代码、合同代码、合同号码等。具体设计代码如下。

DROP TABLE IF EXISTS `tpt_contact_tabel`；

CREATE TABLE `tpt_contact_tabel` （

`tpt_id` int（32） NOT NULL，

`tpt_payer_code` varchar（255） NOT NULL，

`tpt_payee_name` varchar（32） NOT NULL，

`tpt_contact_cretime` datetime NOT NULL，

`tpt_contact_upttime` datetime NOT NULL，

`tpt_contact_content` varchar（255） NOT NULL，

`tpt_remark` varchar（255） DEFAULT NULL，

`tpt_industry_code` varchar（255） NOT NULL，

`tpt_contact_code` varchar（255） NOT NULL，

…………

PRIMARY KEY （`tpt_id`，`tpt_contact_code`）

）；

按照这个模板设置的SQL数据表，通过合同管理的合同导入功能，在合同上传后，可将合同信息导入到系统数据库中。

3 总体设计策略

3.1 合同管理数据库具体设计

对于合同管理系统中的合同管理对应一张合同数据表（contact_table），合同管理数据表主要由以下字段组成：唯一ID、合同名称（name）、合同代码（code）、存储路径（path）、是否打印（hasprt）等。具体主要设计代码如下。

DROP TABLE IF EXISTS ` contact _table`；

CREATE TABLE ` contact _table` （

`id` int（32） NOT NULL，

`name` varchar（255） NOT NULL，

`code` varchar（255） NOT NULL，

`store_path` varchar（255） NOT NULL，

`hasprt` int（1） NOT NULL DEFAULT '0'，

PRIMARY KEY （`id`）

……

）；

这里的hasprt表示合同是否打印，如果一条记录被选中后打印，该属性值将被设置为1，有效避免了重复打印。通过合同导入模板外键（合同编号）使得合同管理表与模板表相关联。

3.2 自踊打印关键技术说明

要保证文件能够自动化打印，首先要通过初始化设置，对打印设备进行智能化设置。打印机自动化打印设置步骤如下。

（1）建立打印服务器，并在打印服务器上设置2个共享驱动，驱动1配置为纵向输出，驱动2配置为横向输出。

（2）在项目合同系统上开发打印功能，使得系统可以直接调用打印设备。

（3）用户在选择合同打印时，由打印服务器对打印任务进行负载均衡，产生2个打印队列，分别用驱动1和2进行调用打印设备。

篇4

出租方：(以下简称甲方)

承租方：(以下简称乙方)

甲、乙双方就房屋租赁事宜，达成如下协议：

一、甲方将位于______市______街道______小区______号楼______号的房屋出租给乙方居住使用，租赁期限自______年______月______日至______年______月______日，计______个月。

二、本房屋月租金为人民币______元，按月/季度/年结算。每月月初/每季季初/每年年初______日内，乙方向甲方支付全月/季/年租金。

三、乙方租赁期间，水费、电费、取暖费、燃气费、电话费、物业费以及其它由乙方居住而产生的费用由乙方负担。租赁结束时，乙方须交清欠费。

四、乙方同意预交______元作为保证金，合同终止时，当作房租冲抵。

五、房屋租赁期从______年______月______日至______年______月______日。在此期间，任何一方要求终止合同，须提前三个月通知对方，并偿付对方总租金______%的违约金;如果甲方转让该房屋，乙方有优先购买权。

六、因租用该房屋所发生的除土地费、大修费以外的其它费用，由乙方承担。

七、在承租期间，未经甲方同意，乙方无权转租或转借该房屋;不得改变房屋结构及其用途，由于乙方人为原因造成该房屋及其配套设施损坏的，由乙方承担赔偿责任。

八、甲方保证该房屋无产权纠纷;乙方因经营需要，要求甲方提供房屋产权证明或其它有关证明材料的，甲方应予以协助。

九、就本合同发生纠纷，双方协商解决，协商不成，任何一方均有权向天津开发区人民法院提起诉讼，请求司法解决。

十、本合同连一式___份，甲、乙双方各执___份，自双方签字之日起生效。

甲方：

乙方：

______年______月______日

正规的个人租房合同范本(二)

甲方：_________

乙方：_________

乙方承租甲方管理的上列房屋作为_________使用，双方议定遵守事项如下：

房屋座落：_________区_________楼_________单元_________号 房屋使用面积：_________平方米

一、本租约为乙方取得承租房屋使用权的凭证。甲、乙双方均有遵守国家有关住宅法律和本市房屋政策、法令的义务。

二、房屋租金数额因房屋条件或租金标准变动时，其租额得予调整，每月租金，乙方应于_________日前交清。

三、乙方有下列情况之一时，甲方可以终止租约，收回房屋：

(1)把承租的房屋转让，转借或私自交换使用的;

(2)未经甲方同意私自改变承租用途的;

(3)无故拖欠租金三个月以上的。

四、甲方根据修缮标准检查，维修房屋和设备，保障安全、正常使用。甲方维修房屋时，乙方应积极协助，不得阻碍施工。在正常情况下，如因检查不周，维修不及时，以致房屋倒塌，使乙方遭受经济损失时，由甲方负责赔偿。

五、甲方鉴定房屋危险，不能继续使用，必须腾出时，乙方应按期迁出，其居住房由甲方解决。如乙方籍故拖延不迁造成的一切损失，由乙方负责。

六、甲方对乙方承租的房屋进行翻建大修后，乙方有优先承租权，但事先应签订协议。

七、乙方对承租的房屋及室内装修设备，应负责保管，爱护使用，注意防火、防冻。如有损坏，乙方应负责修复或赔偿。楼梯间、门道、走廊等公用房屋和设施，乙方应爱护使用，注意照管，防止损坏。

八、乙方不得私自拆改、增添房屋或设备。如属必需时，应事先取得甲方同意或另行签订协议后方可动工。否则，乙方应负责恢复原状。

九、乙方退租房屋时，应于七日前通知甲方，并办清以下手续：

(1)交清租金和应交纳的赔偿费。

(2)按照租约负责保管的房屋及装修设备。

(3)撤销租约。

十、乙方承租甲方代管、托管的房屋在发还原主时，甲方得终止租约。

十一、乙方承租的房屋因国家建设，特殊需要必须腾让时，甲方得终止租约。乙方所需房屋按有关规定办理。

十二、本租约自立约日起至_________年_________月_________日止有效。一或_________份，甲乙双方各执_________份，如有未尽事宜，双方协议解决。

十三、其他_________.

甲方(盖章)_________ 乙方(盖章)_________

代表人(签字)_________ 代表人(签字)________

__________年____月____日 _________年____月____日

正规的个人租房合同范本(三)

出租方：______________，以下简称甲方。

承租方：______________，以下简称乙方。

根据《中华人民共和国合同法》及有关规定，为明确甲、乙双方的权利义务关系，经双方协商一致，签订本合同。

第一条 甲方将自有的坐落在____市____街____巷___号______(小区)___栋___单元___楼___号的房屋___间(套)，建筑面积___平方米、使用面积___平方米，类型___出租给乙方作___使用。装修及设备情况：______________________________.

第二条 租赁期限

租赁期共___个月，甲方从___年___月___日起将出租房屋交付乙方使用，至___年___月___日收回。

乙方有下列情形之一的，甲方可以终止合同，收回房屋：

1.擅自将房屋转租、分租、转让、转借、联营、入股或与他人调剂交换的;

2.利用承租房屋进行非法活动，损害公共利益的;

3.拖欠租金__个月或空置__月的。

合同期满后，如甲方仍继续出租房屋的，乙方拥有优先承租权。

租赁合同因期满而终止时，如乙方确实无法找到房屋，可与甲方协商酌情延长租赁期限。

第三条 租金、交纳期限和交纳方式

甲乙双方议定月租金___元，交纳方式为____支付，计人们币(大写)____________元(元)由乙方在___年___月___日交纳给甲方。先付后用。以后每个___月付款一次，应在付款期末前___天支付。

第四条 租赁期间的房屋修缮

甲方对出租房屋及其设备应定期检查，及时修缮，做到不漏、不淹、三通(户内上水、下水、照明电)和门窗好，以保障乙方安全正常使用。乙方应当积极配合。

第五条 租赁双方的变更

1.如甲方按法定手续程序将房产所有权转移给第三方时，在无约定的情况下，本合同对新的房产所有者继续有效;

2.乙方需要与第三人互换用房时，应事先征得甲方同意，甲方应当支持乙方的合理要求。

第六条 乙方必须遵守当地暂住区域内的各项规章制度。按时交纳水、电气、收视、电话、卫生及物管等费用。乙方的民事纠纷均自行负责。水、电、气底数各是：水____吨，电____度，气____方。

第七条 甲方收乙方押金____元，乙方退房时，结清水、电、气费，交还钥匙后，由甲方退还乙方押金____元。

第八条 违约责任

1.甲方未按本合同第一、二条的约定向乙方交付符合要求的房屋，负责赔偿___元。

2.租赁双方如有一方未履行第四条约定的有关条款的，违约方负责赔偿对方___元。

3.乙方逾期交付租金，除仍应补交欠租外，并按租金的___%，以天数计算向甲方交付违约金。

4.乙方擅自将承租房屋转给他人使用，甲方有权责令停止转让行为，终止租赁合同。同时按约定租金的___%，以天数计算由乙方向甲方支付违约金。

5.本合同期满时，乙方未经甲方同意，继续使用承租房屋，按约定租金的___%，以天数计算向甲方支付违约金后，甲方仍有终止合同的申诉权。

第九条 免责条款

1.房屋如因不可抗拒的原因导致损毁或造成乙方损失的，甲乙双方互不承担责任。

2.因市政建设需要拆除或改造已租赁的房屋，使甲乙双方造成损失，互不承担责任。

因上述原因而终止合同的，租金按实际使用时间计算，多退少补。

第十条 争议解决的方式

本合同在履行中如发生争议，双方应协商解决;协商不成时，任何一方均可向房屋租赁管理机关申请调解，调解无效时，可向经济合同仲裁委员会申请仲裁，也可向人民法院起诉。

第十一条 其他约定事宜

1.___________________________________________________________________________.

2.___________________________________________________________________________.

第十二条 本合同未尽事宜，甲乙双方可共同协商。

本合同一式2份，甲乙方各执1份。从签字之日起生效，到期自动作废。

甲方(签字盖章) 乙方(签字盖章)

身份证号码： ___________________ 身份证号码：___________________

联系电话：___________________ 联系电话：___________________

篇5

关键词：方言；语音；异同

中图分类号：G633.41文献标识码：A文章编号：1006-026X（2013）11-0000-02

汉语方言俗称地方话，只通行于一定的地域，他不是独立于民族语之外的另一种语言，而只是局部地区使用的语言。不同的地域有着自己独特的语音特点，但在相互区别的同时还可能存在一定的关联性。大孤山和庄河方言语音就存在着这样的特点。我们将对它们之间在声母、韵母、声韵配合三个方面的异同进行归纳和区别。

一、声母方面的变化特点

（一）t、th、的发音的变化特点

在大孤山和庄河方言中，没有t、th、这三个舌尖后音，普通话这三个声母在大孤山和庄河方言中一部分读为舌面前音、h、，例如：吃[th55]读作[thi213]、[thi213]；另一部分读为舌尖前音[]、[h]、[s]，例如：插[thA55]读[tshA213]、[tshA213]。

但是其中有一部分字在这两个地域的读音的改变是有区别的。例如：这[t51]读[e42]、[i42]。

（二）r的发音的变化特点

大孤山和庄河方言中没有普通话r声母，普通话的r声母在大孤山和庄河方言中对应三种发音，在声母r的发音上变化上大孤山和庄河方言没有差别。第一种读成齐齿呼i。例如：日[51]读[i42]。第二种读成撮口呼y。如：入团[u51]读[y312]。第三种读l，如：扔[55]在大孤山方言中读[l312]或读[x312]，而在庄河方言中只读[x312]。

（三）普通话中送气与不送气的声母，在部分大孤山发音中正好与之相反，在庄河方言也存在这种现象，但是发生变化的读音没有大孤山方言的比例大。

1.p与ph，例如：扒拉[phA35]读作[pA312]、[phA312]。大孤山方言送气，庄河方言不送气。

2.t与th，例如：糊涂[thu]读作[tu]、[thu]，大孤山方言送气，庄河方言不送气。但堤坝[ti55]读[thi42]、[thi42]，这个字大孤山和庄河方言都变为送气音。

3.t与th，例如：券儿[thyer51]读[tyer42]、[thyer42]，这个字大孤山方言不送气，庄河方言和普通话送气。但畸[ti55]读[thi42]、[thi42]，阄[tiou55]读[thiu312]、[tchiu312]，此二字大孤山和庄河方言都变为送气音。

4.k与kh，在大孤山和庄河方言中，不送气的声母g在一部分字中读成送气的声母k，这一变化两个地域相同。例如：给[kei214]读[khe213]、[khe213]。

5.ts、t与tsh、th，在部分字的读音中互换，在大孤山和庄河方言变化中有异有同。例如，糙[tshu55]读[312]、[h312]，两地读音不同。撞[tu51]读[tshu42]、[tshu42]，两地读音相同。

4.普通话中声母n的读音，在大孤山和庄河方言中有一部分n的发音会出现发音部位的改变。并且二者在发音的改变上相同

（1）n变l。例如：能[n35]读[l42]、[l42]。

（2）n变m。例如：泥[ni35]读[mi312]、[mi312]。

（3）n变零声母。例如：虐[ny51]读[y42]、[y42]。

（4）后接i的n都变为舌面前音。例如：你[ni214]读[i213]，[i213]。

二、韵母方面的变化特点

1.与普通话相比，大孤山和庄河方言在韵母数量上都少4个韵母。缺少的韵母是、o、ai、u。

（1）大孤山和庄河方言都没有翘舌音声母t、th、、，所以能与这些声母拼合的也就自然缺失，变成与、h、s拼合的。但与普通话的的发音有区别，舌尖不是抵在上齿背而是抵在下齿背，致使的音值接近浊擦音z，只是摩擦程度小一些。例如：志[t51]读[42]、[42]。

（2）在大孤山和庄河方言中没有o音，与普通话中只跟p、ph、m、f4个声母相拼的o，在大孤山和庄河方言中都发一样的（音。这一变化在声韵配合部分会具体分析。

（3）普通话中复元音韵母ai，在大孤山和庄河方言中大部分变成一种读音，个别变成（。并且两地域有同有异。相同的读音变化，例如：呆[tai55]读[t312]、[t312]。不同的读音变化，例如：麦[mai51]读[m42]、[m213]。

（4）在大孤山方言和方言中没有u韵母，都变为u。例如：嗡[u55]读[u312]、[u312]。

2.普通话u韵母，在大孤山和庄河方言大部分变为。例如：袄[u214]读[213]、[213]。但其中有两个p与u拼合的字，u变为A。剥皮[pu55]读[pA213]、[pA213]，。还有三个不成规律的读音变化，家雀儿[thiu214]读[thy213]、[thy213]、，药[iu51]读[y213]、[y42]，钥[iu51]读[y213]、[y42]。

3.普通话ei韵母，在大孤山和庄河方言中大部分变为e。例如：杯[pei55]读[pe312]、[pe312]。但大孤山方言与庄河方言不同的是，当u与ei拼合时，在大孤山和庄河方言中ei 也变为e。例如：退[thuei214]读[the213]、[the213]。

4.以鼻音n结尾的韵母，在大孤山和庄河方言中都变为相应的鼻化音韵母。an变为，n变为，in变为i，un变为y。例如：按[an51]读[42]、[42]。但与r相拼时不遵循此规律。这在声母部分已具体分析，此处不作赘述。

5.普通话的uo音，在大孤山和庄河方言中大部分都变为u。例如：多[tuo55]读[tu312]、[tu312]。但个别字也有特殊变化，例如：脱衣服[thuo55]读[th213]、[thu213]，这个字在大孤山方言中丢u，与庄河方言不同。

三、声韵配合方面的变化特点

1、p、ph、m、f四个双唇音与o相拼。在大孤山和庄河方言中不读o音，读（音。例如：脖[po35]读[p312]、[p42]。

2、、h、s、t、th、n、l在与韵母uei、uan、uen相拼。在大孤山和庄河方言中丢介音u，剩下的韵母变为[e]、[]、[]。例如：乱[luan51]读[l42]、[l42]。

3、在大孤山和庄河方言中声母l不与i相拼，全变读[le]音。例如：丽[li51]读[le42]、[le42]。

4、n与u相拼的音，大孤山方言变为n与相拼，庄河方言变为n与u相拼。例如：农[nu35]读[n42]、[nu42]。但是“弄[nu51]”比较特殊，在大孤山方言中有两个发音[n42]、[nu42]，在庄河方言只有一个发音[nu42]。

5、k、kh与（相拼的音，在大孤山和庄河方言有一小部分变为k与A相拼。例如：疙瘩[k55]读[kA312]、[kA312]。

6、m与u相拼的音，在大孤山和庄河方言中丢u。例如：木[mu51]读[m42]、[m213]。

7、t、th、与u相拼，在大孤山和庄河方言中有一部分u音变为y音。例如：住[tu51]读[y42]、[y42]；在大孤山方言中ts与u相拼，有一部分u音变为y音，并且ts变为，但庄河方言中则没有这样的变化。例如：租[tsu55]读[y312]、[tsu312]。

在声韵拼合方面的变化除了上述的规律和特点外，还有不成规律性的个别声韵拼合发生音变，并且部分读音，在大孤山和庄河方言的各自发生不同音变（用粗体标明）。如下表：

汉字普通话大孤山方言庄河方言

北Pei214p213p213

车th55h312hi312

斥th51h42hi42

齿th214i213h213

儿r35r312r312

喝x55x213xA213

黑xei55x213x213

津贴in55yn312yn312

脚iu214y213i213

嚼碎iu214y42i213

酵母iu51i42i42

颗、棵kh55kh312khu312

烙lu51lu213lu213

没mei35me42m42

麦mai51m42m213

灭mi51mi42i42

努nu214nu213nu213

弄nu51n42、nu42nu42

怯hi51hy42hy42

扔55x312、l312l312

弱uo51y42y42

谁uei35se312y42

说话uo55y213y213

色s51s213s213

宿舍su51y213y213

塑su51su42su42

脱thuo55th213thu213

我uo214A213u213

尾uei214i213ue213

液体y51i42i42

贼tsei35tse42213

嘱咐tu214y213u213

着急tu35ts312tsu42

拙tuo55ty312ty213

以上就是从描述大孤山和庄河方言的异同来分析丹东到大连过渡地域方言语音的变化特点。主要采用了举例子，并与普通话对比的方法以便于理解。所举的例子都是笔者在家乡东港市大孤山镇生活时使用的常用语与庄河方言进行对比。此中变化特点和区别颇多，可能有疏漏之处，有待进一步的考证和补充。

注释：

①全文音标示例顺序为：普通话、大孤山语音、庄河语音。

参考文献：

篇6

琢磨了很久，许明想出一个办法――找别人代开。客户相中的是自己的产品质量和价格，发票不过是一张纸，只要是真的，谁开的都一样。许明找到同行张有财，请他帮忙。张有财的企业是一般纳税人，能开增值税发票。

虽然这种事儿见不得光，但张有财还是答应了。这种忙不白帮，因为开发票就等于销售，营业税、增值税、所得税都会随之产生，这笔费用自然算到许明头上，此外还有一笔好处费。张有财不怕许明不给钱，因为开发票，客户就得把钱先打入张有财公司的账户，什么时候给许明、给多少，完全是张有财说了算。

发票有了着落，许明顺利拿下订单。2个月后顺利交货，客户把钱打入张有财公司账户。许明觉得自己这事办的漂亮，钱这么轻松就赚到手了。没想到，新麻烦来了。许明问张有财要钱，可对方一拖再拖。当初，许明觉得自己开口求人帮忙，因此也没好意思让对方立什么字据。眼看着张有财赖账，许明可慌了神。

打官司，没证据！来硬的，张有财势力比自己大多了。难道自己辛苦一场，不但没赚钱，反倒赔了一大笔？许明气得唉声叹气，正巧在大学法律系念书的儿子小强放假回家，听说原委后，认为父亲办事太糊涂：“爸，不是我说您，这么大的事，怎么能口头一说就完事呢。”许明急得干瞪眼：“那咋办，难道就只能吃哑巴亏？”小强想了想说：“也不是没办法，只能一搏了。”

第二天，许明来到张有财公司要钱，张有财早就吩咐好了秘书挡驾。激动的许明和秘书吵了起来，后来竟然晕了过去。毕竟是在自己公司出的事，张有财马上打120急救……

几天后，小强带着礼品来找张有财。这让张有财有些发毛：“你这是……”小强忙递上礼物，说：“感谢大伯及时把我爸送到医院，医生说再晚一会，命就保不住了。我爸现在一阵清醒一阵糊涂，以前是错怪了大伯你。我这仓促接班，以后还得大伯你多指点呢。”

听小强这么说，张有财心里高兴，看来许明不但不追究，而且只要医生证明他脑子不清醒，自己就白捡了一笔巨款。张有财高兴，言语间也放松了很多。小强一个劲儿给张有财戴高帽，张有财被捧得云里雾里，把自己吹得神乎其神，说自己如何开发票捞好处，谁都拿他没办法，聊到最后，张有财竟说：“别学你爸，这种找人开发票的事儿，怎么能不立字据呢？我这算给他上一课！”

回到医院，小强趁身边没人，悄悄地把经过和许明说了。原来，许明根本就没事，那天晕倒，完全是演戏。小强对许明说：“爸，张有财就是个无赖，跟他没道理可讲，咱们还是打官司吧，我拿到证据了。”许明上下打量小强，“你说的证据在哪儿呢？”小强从衬衫口袋里拿出录音笔说：“我和张有财的谈话都让我录了下来。”

在法庭上，面对许明的指控，张有财矢口否认，而且还倒吐苦水，说自己明明是见义勇为，出于好心把许明送到医院，结果反倒被赖上了。而且医生说许明脑子坏了，他的话不能当真，自己比窦娥还冤。

见张有财不认账还反咬一口，许明也豁出去了。他向法官讲述了以往的经历，关键的是当庭播放了小强和张有才的谈话录音。张有财非常震惊，他提出异议，认为小强偷录他们的谈话，不能作为证据。

法官仔细听了这份录音，二人的谈话听得非常清楚，张有财在吹嘘时不知不觉漏了底，法庭因此认定，张有财欠账事实成立。法院最终判决：许明提交的录音取证手续合法，能够作为证据。对于代开发票的行为，法院移交税务机关进行核查后处理。

录音是否可以作为证据在庭审中使用，依据法律规定：对于一方当事人提出的有其他证据佐证并以合法手段取得的、无疑点的视听资料或者与视听资料核对无误的复制件，对方当事人提出异议但没有足以反驳的相反证据的，人民法院应当确认其证明力。小强就是利用关键证据“录音”才打赢了官司。

篇7

近期，浦发银行在业内率先打通了企业手机银行和银企直连服务渠道，为一大批已经使用财务或资金管理系统与银行对接的银企直连客户带来了移动金融的“福音”。

今后，企业客户可以通过浦发企业手机银行进行企业账户管理、查询，并对已通过银企直连系统提交的业务进行授权和审核，这不仅可以解决管理机制严密的大型企业、集团性企业高管经常外出、难以及时通过公司财务或资金管理系统进行紧急付款或业务授权等问题，还可以帮助一些财务管理系统中授权机制不太完善的中小企业增强企业管理。例如公司财务系统中授权层次不够的企业，通过银企直连发送交易指令后，可通过增加手机银行审核的方式来增加授权管理层次，从而既能享受到银企直连系统所带来的付款记账一步处理、来账自动核销、电子自动对账等业务的好处，还能通过手机银行增加财务管理层次并享受移动办公的优势。

在电子银行服务领域，浦发银行一直走在同业的前列。该行以客户为中心，紧跟各种最新IT技术，不断探索用更好的科技手段和服务方式来充实电子银行的服务内涵。浦发银行的银企直连服务不仅包括传统的存贷款信息查询、理财账户信息查询、转账支付、工资等基本金融服务功能，还包括集团账户管理、人民币资金池、外币资金池、银行理财账户管理（活期/定期存款互转、活期/通知存款互转等）、电子商业汇票（出票、收票、提示付款、背书转让、贴现、质押等）、备付金存管等新型的金融服务功能，全面满足各类客户在金融电子化方面的需求。如今，浦发银行通过打通企业手机银行和公司网银、银企直连等电子渠道的服务功能，为企业客户带来更加多样化、便捷、高效的多渠道金融整合服务体验，不仅可以帮助企业加强财务管理、降低成本，而且更能增加便利、提高效率，让企业客户有更多的时间捕捉市场商机，助力企业客户的快速发展。

继去年推出面向企事业单位客户的企业手机银行WAP服务和iPhone、Android客户端服务以来，今年，浦发银行先后推出了iPad、Symbian（触摸屏）、Symbian（键盘）、WindowsPhone客户端等服务，成为银行同业中首家、也是目前惟一能为企事业单位客户提供全版本企业手机银行的银行，让企事业单位客户能够充分体验移动办公的便捷和高效。与此同时，浦发银行注重渠道整合，努力通过网上银行、直联银行、手机银行、电话银行、自助银行五大电子渠道为企业客户提供最佳的移动金融、多渠道整合的公司电子金融服务。

浦发银行现金管理部总经理曲丽萍表示，该行将继续坚持以客户为中心，秉持“新思维、心服务”的理念，努力为企业客户打造更加便捷、高效、专业的产品和服务体验。

篇8

关键词：银杏达莫；血塞通；脑梗死

脑梗死是临床常见病之一，疾病的致残率、致死率高，在治疗脑梗死的治疗中，如何减少患者的脑梗死后遗症，降低伤残率是临床医师在不断探索的问题。2011年1月～2013年6月，我院采用银杏达莫联合血塞通治疗脑梗死，取得较为满意的临床效果，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料 选取我院2011年1月～2013年6月收治的脑梗死患者92例，按照1995年中华神经科学会提出的《各类脑血管疾病诊断要点》[1]中相关诊断标准，经影像学检查后，所有患者均确诊，其中男58例，女34例，年龄41～81岁，平均年龄（61.3±5.8）岁，10例患者合并糖尿病，34例患者合并高血压，12例患者合并高血脂，22例患者合并冠心病；92例患者分为对照组和观察组，每组46例，两组患者一般资料无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2方法 对照组给予血塞通注射液400mg，加入0.9%氯化钠注射液250ml静脉滴注，1次/d，2w为1个疗程；观察组在此基础上给予银杏达莫注射液20ml，加入0.9%氯化钠注射液250ml静脉滴注，1次/d，2w为1个疗程。两组的其他治疗措施如神经营养药的应用、功能康复训练、危险因素的干预等同样。

1.3疗效判定标准 根据全国第四届脑血管病学术会议制定的疗效评定标准[2]，分基本痊愈、显效、有效、无效四级对临床效果进行评定，以基本痊愈、显著进步、进步计算有效率。基本痊愈：功能缺损评分减少91%～100%，病残程度为0级；显著进步：功能缺损评分减少46%～90%，病残程度为1～3级；进步：功能缺损评分减少18%～45%；无效：功能缺损评分减少17%左右，治疗前、后症状没有任何改善或者出现病情加重。

1.4统计学处理 采用统计学软件SPSS18.0对所得数据进行处理，计数资料用χ2检验，计量资料用t检验。P

2结果

2.1两组患者临床疗效比较 观察组总有效率89.13%，对照组总有效率76.0%，观察组总有效率明显高于对照组（χ2=4.357，P=0.0384），二者差异有统计学意义，见表1。

2.2两组治疗前后神经功能缺损评分比较 观察组治疗前神经功能缺损平均评分（61.1±19.4），治疗后下降为（46.6±7.3），治疗前后比较，差异明显（t=3.687，P=0.0463）；对照组治疗前神经功能缺损平均评分（60.3±18.7），治疗后下降为（56.3±6.9），治疗后下降程度不明显（t=1.084，P=0.782）。两组患者治疗后神经功能缺损评分比较，观察组明显优于对照组（t=6.874，P=0.0178），二者差异有统计学意义。

3讨论

银杏达莫注射剂是银杏黄酮和双嘧达莫的复方剂，银杏黄酮具有改善患者脑缺血导致的记忆功能障碍、扩张脑血管以及冠脉血管等；而双嘧达莫可以控制患者血小板聚集，有效清除自由基，可以缩小急性脑梗死的面积。其可抑制血栓烷素TXA2的形成，有效抑制患者血小板、上皮细胞以及红细胞摄取腺苷，部分腺苷的浓度变高，直接作用于血小板的A2受体，对腺苷酸环化酶产生一定的刺激，促使血小板内的环磷腺苷增多，起到抑制血小板聚集的作用，同时可加强患者内源性PGI2的功能，促进患者恢复脑及心肌功能，明显改善心脑缺血症状[3]。血塞通是一种三七皂苷的中成药制剂，三七属于五加科植物，药性温和，味道微苦，具有消肿止痛的效果，用乙醇溶解该药，起到活络的良好作用，使患者的血液流动性变强，有效抑制血栓的形成，有利于促使神经功能以及神经细胞的恢复，能够很好地促进患者肢体功能瘫痪的恢复，临床良好的效果也已得到实践证实[4]。本研究中，治疗组患者采用银杏达莫联合血塞通治疗，其治疗总有效率达到89.13%，明显高于对照组，充分说明了银杏达莫联合血塞通在治疗脑梗死患者中的良好效果，说明此二药联用有协同作用。

总之，银杏达莫联合血塞通治疗脑梗死，可有效改善脑梗死患者神经功能缺损症状，促进患者肢体功能瘫痪恢复，治疗效果显著，值得临床推广应用。

参考文献：

[1]中华神经科学会.各类心血管疾病诊断要点[J].中国乡村医药，1996，1（2）：10-11.

[2]陈清棠.脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准（1995）[J].中华神经科杂志，1996，29（6）：381.

篇9

关键词：合同结算纠纷 关键问题 防范对策

随着我国社会经济体制的不断完善和人们法律意识的逐渐加强，工程合同成为了工程项目开展过程中维护双方利益的重要法律依据。合同结算纠纷是工程纠纷中比较常见的一种纠纷形式，对各方的利益都造成了严重的影响，因此，避免合同纠纷问题显得尤为重要。

一、引发合同结算纠纷的原因分析

（一）合同内容问题

合同内容纠纷问题在合同结算纠纷中出现的较多，争端也比较大。由于发包方在合同签订中占据先天优势，在拟定合同时可以加入有利于发包方的相关条款，而由于承包方在相关技术人员方面比较缺乏，对工程合同的内容理解又不够全面和谨慎，没有发觉合同中的相关问题，使得合同结算时出现矛盾。

（二）合同变更问题

合同变更是指工程施工过程中，发包方出于某些原因进行的工程量和合同的更改。合同变更问题同样容易造成合同结算纠纷，究其原因是因为双方在达成工程承包意向后未经第三方公证，并且合同变更前承包方没有及时了解工程总量及隐秘工程量，使得工程延期，从而造成了合同计算纠纷的问题。

（三）合同违约问题

合同违约分为承包方合同违约和分包方的合同违约，这种现象也是造成合同结算纠纷的主要原因。承包方合同违约主要表现在工程时间违约和工程质量的违约，没有按照书面合同上所规定的时间内交工，或是工程质量没有符合标准；分包方合同违约则是不能及时支付工程材料费用、工程设备费用等相关费用，导致了工程的延期和停工现象的发生。

（四）工程尾款问题

当工程交工后，为保证工程的使用质量，发包方往往会按照合同条款扣押部分工程尾款，作为一年内工程质量保修金，确保承包方在一年内对工程履行相关的保修义务，保修期过后再将剩余尾款结交给承包方。而工程尾款问题常常因为承包方在进行工程维修时服务质量使发包方不满意，而最终导致了合同结算纠纷事件。

（五）工程材料问题

工程材料问题同样也会影响合同结算进度。由于材料市场价格的变动影响，承包方为牟取个人利益或减轻工程资金负担，使用部分合同之外的建筑材料进行工程施工，从而导致了发包方的不满，造成了合同结算纠纷。

二、合同结算纠纷的相关预防措施

（一）合同内容的推敲

在进行工程合同签订之前，作为承包方，应该仔细阅读工程合同，认真推敲工程合同中的所有条款，加大对合同审核工作力度。要明确合同内容是否合法、有无缺项漏项、是否存在不公平性、合同中有无涉及自然因素对工程进度影响的说明、工程结算价格是否合理等问题，同时征求工商管理部门对合同的鉴定及合同签名进行公证。我国已经出台相应的法律政策，明确了工程合同内容及有关说明，承包方可以按照国家标准进行合同的审核，确定合同的有效性。而发包方，也应该依照相应的合同范本进行合同的拟定，确保合同的有效性及合法性，避免合同纠纷问题的出现。

（二）合同变更中工程量的计算

在工程施工过程中合同变更是非常普遍的，但合同变更需要在合理的条件下才能进行签订，从而保证工程的顺利竣工。因此，在合同变更时，承包方同样需要仔细阅读工程变更条款，认真计算合同变更所增加的工程量，找出隐秘工程量，然后按照工程量进行工期的延长，确保没有任何异议之后，方能签订变更合同，并且同样征求工商管理部门的公证和鉴定。

（三）避免合同违约发生

合同违约，对于承发双方都会造成严重的损失，因此，避免合同违约现象的发生才是消除双发经济损失的最好方法。作为发包方，应该深入了解承包方的实际施工能力，审视承包方的施工资格，确保工程的如期完成。同时，发包方应该督促工程监理人员对工程施工中的质量进行严格把控，以免造成严重后果；而作为承包方，同样需要了解工程发包方的资历和经济状况，对于风险较大的工程应该征求相关管理部门意见，杜绝合同违约事故出现。

（四）严格把控服务质量

在工程保修期，若工程出现一定质量问题，承包方应该认真履行维修义务，做好工程维修工作，保证工程尾款的顺利结算。同时，承包方在工程施工期间也应该注意服务质量，严格工程管理，确保承发双方的良好合作关系。

（五）做好工程内容的统计和汇总

工程日记是承包方施工过程中必须要认真记录的，这有利于把握工程施工进度，还能够为承包方提供一定的法律依据。承包方同样需要做好工程施工材料的统一和审核，若工程材料需要变更，则必须向发包方认真汇报，待双发达成共识并签订书面协议后，方能进行工程材料的更改，从而避免因工程材料导致的合同结算纠纷问题。

总结

工程合同是确保承发双发利润的重要工具，为避免合同计算问题的出现，需要承发双方明确合同内容，认真履行合同义务，确保合作过程的顺利结束。从以往合同纠纷的原因中需求问题答案，并在工程开展过程中进行注意，不仅能够将双方的损失降到最低，还能够保证我国建筑工程事业的健康发展，对我国经济发展、社会发展都有着非常重要的意义。

参考资料：

[1]张鹏，周宏.浅淡建设工程结算纠纷的几个原因[J].油气田地面工程，2008.8

篇10

【关键词】 丙型肝炎病毒；核心蛋白；突变；原核表达

Expressions of different deletion mutated HCV core protein genes in E.coli

【Abstract】 AIM: To construct the recombinant plasmids expressing fulllength HCV core protein gene and 3 different deletion mutated hepatitis core protein genes and to express them in E.coli. METHODS: Entire HCV core protein gene and 3 different deletion mutated gene fragments from HCV core protein which respectively coded 1-191aa， 1-59aa plus 81-191aa， 1-169aa， 1-59aa plus 81-169aa were amplified by PCR and cloned into expression vector pRSETA， thus forming different recombinant plasmids （pRSETAC573， pRSETAC510， pRSETAC507， pRSETAC444）， which were transformed into E.coli BL21 （DE3） pLysS and induced by IPTG. SDSPAGE and Western blot were used to test and identify expressed 6×Hisfusion proteins. RESULTS: Restriction analysis and sequencing confirmed that the 4 recombinant plasmids expressing entire HCV core protein gene and 3 different deletion mutated hepatitis core protein genes were successfully constructed. Both SDSPAGE and Western blot analysis showed entire HCV core protein gene and 3 different deletion mutated hepatitis core protein genes were expressed， and the respective molecular weights of the products were about 21×103， 19×103， 19×103 and 16.5×103. The fusion protein production accounted approximately for 20% of total bacterial protein. CONCLUSION: Different deletion mutated HCV core protein genes were expressed efficiently in E.coli.

【Keywords】 hepatitis C virus; core proteins; mutation; prokaryotic expression

【摘要】 目的： 构建丙型肝炎病毒（HCV）全长及3种不同缺失突变的核心蛋白基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达. 方法：用PCR方法扩增基因型为1b型的HCV核心蛋白的全长及3种不同缺失突变的基因片段，对应氨基酸分别为C573：1-191aa，C510:1-59aa+81-191aa，C507:1-169aa，C444:1-59aa+81-169aa. 将其克隆到高效表达载体pRSETA中构成重组质粒（pRSETAC573，pRSETAC510，pRSETAC507，pRSETAC444），转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS. IPTG诱导表达6×His融合蛋白，表达产物经SDSPAGE及Western blot检测和鉴定. 结果： 经酶切鉴定及测序证实全长及3种不同缺失突变的核心蛋白基因的原核表达载体构建正确. 经SDSPAGE及Western blot显示在Mr约为21×103， 19×103， 19×103， 16.5×103处出现融合表达条带. 融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的20％. 结论：全长及3种不同缺失突变的丙型肝炎病毒核心蛋白基因均在大肠杆菌中得到有效表达.

【关键词】 丙型肝炎病毒；核心蛋白；突变；原核表达

【中图号】 R512.630.27

0引言

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus， HCV）感染已成为全球性的社会公共卫生问题，迄今尚无有效的预防性疫苗. HCV核蛋白基因相对保守［1］并且能诱导CTL反应及ADCC，有可能用于开发HCV预防及治疗性疫苗. 我室曾扩增羧基末端的20个氨基酸和（或）第60~80位氨基酸多肽基因缺失的核蛋白基因，并在真核细胞中表达成功，初步证实突变掉上诉两个肽断能提高机体免疫反应［2-3］. 为进一步探讨不同缺失突变核心蛋白对免疫反应的影响，我们构建了HCV核心基因不同缺失突变基因片段的原核表达载体并在大肠杆菌中进行了表达.

1材料和方法

1.1材料

1.1.1质粒与菌株源质粒pCI573， pCI510， pCI507， pCI444系本室将不同缺失突变的核心蛋白基因克隆入真核表达载体pCIneo中构建而成，其中分别插入了自西安地区患者血清中克隆的1b型HCV完整的核心蛋白基因（573 bp）， 60～80位氨基酸缺失的核心蛋白基因片段（510 bp）， 羧基末端20位氨基酸缺失的核心蛋白基因片段（507 bp）， 同时突变掉60～80位氨基酸和羧基末端20位氨基酸的核心蛋白基因片段（444 bp）. 原核表达载体pRSETA为Invitrogin公司产品，中间克隆载体pGEMT easy为Promega公司产品. E. coli JM109由本室保存，BL21为Invitrogin公司产品.

1.1.2工具酶及主要试剂DNA快速提取试剂盒购自上海华瞬生物工程公司、高保真PCR 试剂盒、DNA分子量标准、蛋白分子量标准均为大连宝生物工程公司产品，HindⅢ， BamHⅠ， T4 DNA连接酶、胶回收试剂盒购自Promega公司. 抗His抗体购自Invitrogin公司，二抗及显色试剂购自Sigma公司.

1.2方法

1.2.1PCR引物设计根据源质粒pCI573， pCI510， pCI507， pCI444中HCV核心蛋白基因起始密码子下游及终止密码子上游核苷酸序列设计了3条引物（上海鼎安生物技术有限公司合成）: 上游引物P1: 5′ GTGCGGATCCATGAGCACGAATCCTAAAC 3′， 下游引物： P2: 5′ TCGCAAGCTTTCACAAATTTCCCTGTTGTTGCATA 3′， P3: 5′ TCGCAAGCTTTCAAGCGGAAGCTGGGGTGGTCAG 3′. 在其上游引物引入BamHⅠ酶切位点、下游引物引入HindⅢ酶切位点.

1.2.2目的片段的扩增分别以质粒pCI573， pCI510， pCI507， pCI444为模板进行PCR扩增，扩增过程中模板与引物对应如下：pCI573， pCI510为P1， P2； pCI507， pCI444为P1， P3. 循环参数为94℃ 5 min， 94℃ 1 min， 55℃ 50 s， 72℃ 1 min共进行30个循环，最后于72℃延伸10 min. 取5 μL PCR反应液在10 g/L的琼脂糖凝胶电泳上进行扩增产物检测分析.

1.2.3重组质粒的构建及鉴定将4种PCR产物按1：3与中间载体pGEMT easy连接，转化感受态细胞JM109，挑阳性克隆接种扩增，小量提取质粒DNA，并以HindⅢ， BamHⅠ双酶切进行鉴定后交上海鼎安生物技术有限公司测序. 测序正确后将中间连接产物pGEMT easy573， pGEMT easy510， pGEMT easy507， pGEMT easy444用HindⅢ， BamHⅠ双酶切，胶回收酶切产物与经相应双酶切的pRESETA质粒连接. 转化感受态细菌JM109，挑阳性克隆接种扩增，小量提取质粒DNA，并以HindⅢ， BamHⅠ双酶切进行鉴定后交上海鼎安生物技术有限公司做序列测定.

1.2.4融合蛋白的诱导表达将重组质粒pRSETAC573， pRSETAC510， pRSETAC507， pRSETAC444转化BL21感受态细菌. 30℃振摇扩增转化细菌，3 h后（A600 nm约为0.6）加IPTG至终浓度为1 mmol/L诱导表达，分别于1， 3， 5和7 h后收菌. 12 000 g离心5 min，菌体沉淀重悬于100 μL 20 mmol/L磷酸盐缓冲液中，于液氮中和42℃反复冻融4次，以最大速度4℃离心10 min，然后分别在上清和沉淀中加入100 μL及200 μL 1×SDSPAGE上样缓冲液，置于-20℃备用.

1.2.5SDSPAGE融合蛋白定量及Western blot检测融合蛋白用18％的分离胶SDSPAGE电泳后将蛋白转移到NC膜上，以50 g/L脱脂奶TBST封闭，以小鼠抗His抗体（1∶100）为一抗，生物素标记的抗鼠抗体（1∶500）为二抗进行抗原抗体反应.然后将NC膜浸入含链酶亲和素过氧化物酶（1∶500）的TBST中室温振摇1 h，最后用葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍氨法显色.

2结果

2.1表达载体的构建及鉴定亚克隆重组质粒pGEMT easy573， pGEMT easy510， pGEMT easy507， pGEMT easy444以及终载体pRSETAC573， pRSETAC510， pRSETAC507， pRSETAC444用HindⅢ， BamHⅠ双酶切后，用琼脂糖凝胶进行电泳分别在约573， 510， 507和444 bp处出现条带，与预期分子量相符（图1）. DNA双向测序证实插入片段序列及读码框均正确，表明质粒构建成功.

图1重组质粒的限制性酶切分析（略）

2.2融合蛋白的表达与分析经SDSPAGE电泳检测，在Mr约21×103， 19×103， 19×103， 16.5×103处出现条带，均与预期的目的条带分子量一致. 条带随诱导时间延长颜色加深，经IPTG诱导5 h时目的蛋白量最多. 经薄层扫描测定，融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的20%. 表达蛋白大部分以包涵体形式存在于菌体沉淀中，上清中也可见明显蛋白条带（图2）.

2.3融合蛋白的Western blot结果显色后Mr约21×103， 19×103， 19×103， 16.5×103处出现蓝色条带，与预期的所要表达的6×His融合不同缺失突变核蛋白分子量大小相符，表明目的蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达(图3）.

图2融合蛋白表达的SDSPAGE分析（略）

图3融合蛋白的Western blot分析（略）

3讨论

近年来，核心蛋白的抗病毒免疫成为丙型肝炎的一个研究热点，但研究发现全长的核心蛋白不能诱导有效的CTL效应. 有学者推测核心蛋白的某些区段对机体免疫反应有抑制作用，为证实这一推断，国内外学者［4-7］对HCV核心蛋白各个区段的功能作了大量研究. 有研究［8］用截去HCV基因羧基末端的核心蛋白（1~176位氨基酸）的表达产物免疫小鼠，发现核蛋白特异性抗体滴度在初次免疫第16周时急剧升高到1∶8000并至少持续到27 wk，同时诱导出特异性T细胞增殖反应. 另一研究小组［9］研究证明：截去羧基末端的核蛋白基因的质粒免疫小鼠能够刺激IFNγ的产生，并诱导出强烈的核蛋白特异性迟发性超敏反应. Langhans等［10］报告来源于HCV核心蛋白第59~83氨基酸合成肽具有抑制HCV感染者外周血T细胞针对核心蛋白的增殖反应. 作者认为该多肽片段干扰了对核蛋白的抗原提纯. 为进一步探讨不同缺失突变核心蛋白对免疫反应的影响，我们将全长及3种不同缺失突变的核心蛋白基因在大肠杆菌中进行大量表达.

我们采用了原核表达载体pRSETA，该载体有两个特点：一是含有T7启动子，可被T7 RNA聚合酶识别，T7 RNA聚合酶的转录效率比大肠杆菌RNA聚合酶高5倍，能够高效转录mRNA，大量表达目的蛋白. 二是载体上携带有6个His残基，分子量仅为840，对目的蛋白的结构和生物学活性影响很小，而且便于纯化. 本研究用该载体获得了目的蛋白的高效表达，同时我们还观察到IPTG最佳诱导时间为5 h. 为减少核心蛋白本身的细胞毒性作用，采取了30℃诱导. 总之，本研究成功构建了不同截短核心蛋白基因的原核表达载体，获得了正确的表达蛋白，为进一步研究HCV核心蛋白各区域的免疫学功能打下了基础.

参考文献

［1］ Hijikata M， Kato N， Ootsuyama Y， et al. Gene mapping of the putative structural region of the hepatitis C virus genome by in vitro processing analysis［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 88 (1991):5547-5551.

［2］ 洪沙，黄长形，杨为松，等. 第60~80位氨基酸多肽片断缺失的HCV核蛋白在真核细胞中的表达［J］. 第四军医大学学报，2005，26（12）：1101-1104.

［3］ 洪沙. 缺失突变对丙型肝炎核心蛋白免疫的影响［D］. 西安：第四军医大学博士论文集， 2005.

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