耐镉菌株分离筛选及生物学研究

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摘要:探究尾矿污染土壤中耐镉菌株的耐受性。利用含镉LB液体培养基对菌株进行耐受性测试,筛选出4株耐受性较强的菌株;通过各耐镉菌株的生长曲线、菌落特征和镉去除率,确定菌J3为高效耐镉菌株;该菌株在盐浓度为1%,pH值为7.0时,生长状况最佳。最佳生长条件下,该菌株对镉的最大耐受浓度为400mg/L,最适耐受浓度为300mg/L。尾矿污染土壤中含有较丰富的耐镉微生物资源,筛选出的高效耐镉菌株耐受性较好,可为尾矿污染土壤的微生物修复提供可参考菌株。

关键词:镉;分离筛选;菌株;耐受性

随着矿产资源的开发和金属冶炼、工业废水的排放以及化肥和农药的过量或不合理使用,含镉污染物通过各种途径进入到环境,造成土壤的重金属镉污染。镉具有毒性、难降解性,农业土壤被镉污染后易通过食物链在动植物和人体内累计,直接威胁人类健康,必须采取一系列措施来治理重金属污染土壤。土壤重金属污染常见的修复方法有物理修复、化学修复及生物修复等,而生物修复中的微生物修复方法由于所需菌剂体量小、修复周期较短、无二次污染等特点受到广泛关注。功能性微生物能够通过吸附、氧化或还原重金属,把有毒有害的重金属转化为无毒或低毒金属沉淀物,并通过吸附实现重金属的去除[1]。本研究从尾矿污染土壤中分离筛选出4株耐镉功能性菌株,选取对镉去除率最高的菌株,优化该菌株生长条件,确定其耐受性,为土壤中重金属镉的修复提供理论依据和可利用菌株资源。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1土样来源

土样采自选铁完尾矿污染的土壤,全部研磨过60目筛后保存备用。

1.1.2培养基配方

LB液体培养基:胰蛋白胨10.0g,酵母浸粉5.0g,氯化钠5.0g,蒸馏水1000mL,pH值为7.0~7.2。LB固体培养基:胰蛋白胨10.0g,酵母浸粉5.0g,氯化钠5.0g,琼脂粉15g,蒸馏水1000mL,pH值为7.0~7.2。1.2实验方法

1.2.1耐镉菌株的分离

取1.0g土样于9mL无菌水中,充分混合后静置30min,取1mL上清液加入到25mL的LB液体培养基中,30℃,150r/min振荡培养2d[2]。1当培养基浑浊后取200μL加入到Cd2+浓度为50mg/L的液体培养基中进一步富集培养。以此类推,逐步增加培养基中的Cd2+浓度至200mg/L[3]。将Cd2+浓度为200mg/L的液体培养基稀释,取稀释倍数10-3,10-4,10-5的培养液依次涂布到LB固体培养基上进行耐镉菌株的分离纯化[4]。将平板上不同的单个菌落挑取至新的LB固体培养基平板上划线培养,经过数次分离纯化后得到纯菌株。1.2.2高效耐镉菌株的筛选挑取单个菌落接种到Cd2+浓度为200mg/L的LB液体培养基[5],30℃,150r/min振荡培养24h制成种子液,并置于4℃冰箱备用。通过对几种耐镉单菌的菌落形态的观察、生长曲线和镉去除率的测定,筛选出最优菌株,确定为高效耐镉菌株。

1.2.2.1耐镉菌株菌落形态观察

将菌株在LB固体培养基上进行稀释涂布,在30℃恒温培养箱中倒置培养1d后,观察菌落形态、大小和边缘形状等。

1.2.2.2耐镉菌株生长曲线的测定

以1%接种量接种到Cd2+浓度为200mg/L液体培养基中,30℃,150r/min振荡培养56h,延迟期每1h一测,对数期后每4h一测。最后以培养时间为横坐标,以培养菌株OD600为纵坐标,绘制菌株生长曲线。实验空白为未接种的培养基。1.2.2.3耐镉菌株对镉去除率的测定培养条件同1.2.2.2,培养时间为72h,每24h取样测镉去除率。样品以6000r/min离心10min,待沉淀完全后取上清液,按照《水质铜、锌、铅、镉的测定原子吸收分光光度法》(GB7475—87)[6]进行测定。去除率(P):P=(C0-C1)/C0×100%式中:C0———样品Cd2+初始浓度,mg/L;C1———样品经耐镉菌株去除后Cd2+浓度,mg/L。

1.2.3生长条件对高效耐镉菌株生长的影响

1.2.3.1盐浓度对高效耐镉菌株生长的影响为避免其他无机盐离子对菌株生长造成影响,探究盐浓度对高效耐镉菌株生长的影响实验中,盐浓度调节采用NaCl,这与LB液体培养基中无机盐离子种类一致。取种子液0.5mL接种于50mLNaCl浓度分别为0%,0.5%,1%,2%,4%,5%的LB液体培养基中,30℃,150r/min恒温振荡培养36h,取样测定OD600值。

1.2.3.2pH值对高效耐镉菌株生长的影响

为避免其他盐离子对菌株生长的影响,探究pH值对高效耐镉菌株生长的影响实验中,pH值调节采用HCl和NaOH,这与LB液体培养基中无机盐离子种类一致。取种子液0.5mL接种于50mLpH值分别为5.0,6.0,7.0,8.0,9.0的LB液体培养基中,30℃,150r/min恒温振荡培养36h,取样测定OD600值。1.2.4高效耐镉菌株对镉的耐受性实验在最佳生长条件下,将高效耐镉菌株接种到Cd2+浓度分别为200mg/L、250mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L的LB液体培养基中,最佳盐浓度和pH值下,30℃,150r/min振荡培养56h。

2结果与分析

2.1高效耐镉菌株的筛选结果

2.1.1不同耐镉菌株菌落形态差异经过富集培养、分离纯化,筛选出4种对Cd2+具有较高耐性的菌株,分别编号为J1、J2、J3和J4。各菌株菌落形态如图1所示,菌落特征差异2.1.2不同耐镉菌株生长曲线差异对四种耐镉菌株进行生长曲线的测定,结果如图2所示。由图2可知,各菌株Cd2+浓度为200mg/L的液体培养基均可正常生长,0~8h内处于延迟期;8~16h处于对数生长期;16~44h处于稳定期;培养44h后,各菌株开始进入衰亡期。2.1.3不同耐镉菌株对镉的去除率不同耐镉菌株对镉的去除效果如图3所示,去除速率见图4。由图3、图4可知,0~24h,J1和J4去除速率较快,各菌株去除速率均大于1.10%/h,24h时,对镉的去除率分别达到了41.6%和36.3%,而J2、J3对镉去除率分别为27.2%,26.3%;24~48h之间,J2和J3对镉的去除速率加快,分别为0.96%/h和1.13%/h,远超过J1、J4的0.09%/h和0.31%/h,48h时,J2和J3镉去除率分别达到了50.2%和53.5%,而J1和J4的去除率均为43.8%;48~72h之间,各菌株对镉的去除速率均减慢,最快的为J2和J3,但去除速率只有0.14%/h,而J1和J4无增长,72h时,对镉的去除率最高的菌株为菌3达56.9%,J1、J2和J4分别为43.3%,53.5%和43.9%各菌株对镉去除速率变化规律与2.1.2中各菌株生长时期出现时间一致,0~24h,各菌株陆续从对数生长期进入到稳定期,菌株数量大幅度增长,对Cd2+需求量迅速变大,此期间各菌株对镉的去除速率最大;24~48h,各菌株基本处于稳定期,此阶段各菌株基数最大,J2和J3仍以较大速率去除镉,且贡献将近一半的去除率,而J1和J4可能受培养基中营养物质消耗、毒性产物积累等不利因素的影响较大,对镉的去除速率大幅降低;48~72h,各菌株处于衰亡期,菌株数量急剧下降,活性降低,对镉的去除速率减慢,甚至不再去除。综合各菌株菌落形态、生长曲线和镉去除率可知,J3在含镉200mg/L的液体培养基中生长最好,镉去除率最高,确定为高效耐镉菌株,后续实验将对该菌株作进一步研究。

2.2高效耐镉菌株最佳生长条件的确定

微生物吸附重金属的过程与菌体的生长代谢密切相关,菌体的正常生长是高效富集去除重金属离子的保证。微生物生长过程中受外界环境影响,若培养条件适宜,微生物就可正常生长,反之则会使生长受到抑制甚至变异或死亡。因此,确定菌体的最佳生长条件,对菌株是否能高效去除重金属离子至关重要。

2.2.1不同盐浓度对高效耐镉菌株生长的影响

培养基中盐浓度会影响菌体细胞渗透压高低,体系中盐浓度过高时,菌体会处于高渗透压环境下,受Na+作用,细胞就会失水收缩,使菌株生长受到抑制,不同微生物对渗透压的适应能力参差不齐[7]。不同盐浓度对高效耐镉菌株生长的影响如图5所示。由图5可知,在盐浓度为1%时,菌体OD600为1.749,高效镉去除菌菌株生长情况最好;盐浓度低于1%时,菌体OD600最低为1.651,菌株生长所受影响不大;高于1%时,随着盐浓度增加,体系渗透压增大,菌株生长逐渐受到影响,菌体OD600从1.709降至1.415。因此,高效耐镉菌株最佳生长盐浓度为1%。2.2.2不同pH值对高效耐镉菌株生长的影响菌体生长过程中机体内时刻发生酶促反应,而pH值会直接影响菌株相关代谢酶的活性,只有在适宜pH值范围内酶促反应速率才能达到最高,最有利于重金属离子吸附去除,过低或过高的pH值都会使菌体生长受到抑制[8]。不同pH值对高效耐镉菌株生长的影响如图6所示。由图6可知,随pH值升高,菌株生长量呈现出先增加后降低的趋势。当在pH值为7.0时,高效耐镉菌株在液体培养基中的生长状况最好。因此,高效耐镉菌株最佳生长pH值为7.0。2.3最佳生长条件下高效耐镉菌株对镉的耐受性在最佳生长条件下,即盐浓度1%、pH值7.0时,测定高效耐镉菌株对镉的耐受性,结果如图7所示。由图7可知,当液体培养基Cd2+浓度为200mg/L、250mg/L、300mg/L时,菌株生长曲线相差不大,进入对数生长期时,菌体OD600分别为0.134,0.130,0.100,进入稳定期时菌体OD600分别为1.458,1.449,1.376,说明Cd2+浓度在小于300mg/L时对高效耐镉菌株生长影响不大;当Cd2+浓度为400mg/L时,高效耐镉菌株在培养基中的生长量显著下降,但生长规律符合该菌株生长曲线;Cd2+浓度为500mg/L时,培养基中的菌株几乎不生长,无明显生长规律,这是由于重金属Cd2+毒性较大,高浓度Cd2+产生的毒性抑制了菌株生长[8]。以上结果表明,高效耐镉菌株对镉耐受性较强,对镉的最大耐受浓度为400mg/L,最适耐受浓度为300mg/L

3结果与讨论

具备重金属耐受性菌株的筛选是研究微生物修复的重要环节,当前从重金属污染土壤中分离筛选菌株是最有效的途径之一。本研究从尾矿污染土壤中分离筛选出4株耐镉菌株,菌株均可在Cd2+浓度为200mg/L的液体培养基中生长,充分说明尾矿污染土壤中存在较为丰富的耐镉微生物资源;并且菌J3生长最好,对镉去除率最高,达到了56.9%,确定菌J3为高效耐镉菌株。高效耐镉菌株最佳生长盐浓度为1%,最适生长pH值为7.0;最佳生长条件下,高效耐镉菌株对镉的最大耐受浓度为400mg/L,最适耐受浓度为300mg/L,说明高效耐镉菌株具有较强的耐镉性。本研究筛选出的高效耐镉菌株对重金属Cd耐受性较好,可作为试验材料之一应用于重金属镉污染的微生物修复,为Cd污染土壤的微生物修复提供了可利用的菌株资源。下一步需对高效耐镉菌株进行分子鉴定,探明菌属,方便研究应用;另外挖掘合适的载体和介质,使得施加到土壤中的菌株可最大限度地发挥其对金属的固定作用。

参考文献

[2]解琳,郝宇,齐欣,等.一株耐铅镉真菌的分离鉴定及其吸附特性的研究[J].微生物学报,2020,60(4):780-788.

[3]卢福芝,李启虔,何海燕,等.一株抗镉真菌的分离鉴定及特性研究[J].环境工程,2016,34(4):64-67+85.

[4]邢尧.耐镉菌株的筛选及其对镉去除与转化复合菌剂的研究[D].沈阳:沈阳农业大学,2020.

[5]吴翰林.耐镉木霉菌株的筛选、鉴定及其降镉能力探究[D].长沙:湖南农业大学,2016.

[6]水质铜、锌、铅、镉的测定原子吸收分光光度法GB/T7475—1987[S].北京:中国环境科学出版社,1987.

[7]金忠民,郝宇,刘丽杰,等.一株铅镉抗性菌株的分离鉴定及其生物学特性[J].环境工程学报,2015,9(7):3551-3557.

[8]徐淑霞,杜文涛,王晓雅,等.1株耐Cd细菌的分离、鉴定及其吸附特性研究[J].河南农业科学,2017,46(5):71-76+83.

作者:张晨 郭爱红 单位:河北环境工程学院学报