消化系统非癌组织细胞突变的意义

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【摘要】体细胞突变随着机体衰老而不断积累，进而驱动癌症的发生发展，而慢性炎症、诱变剂暴露等因素则大大加速该过程。描绘并理解非癌组织细胞如何累积和选择这些突变，对于认识癌症的发生发展过程至关重要，但目前人们在这方面的认识仍非常有限。借助近年来快速发展的高通量高深度二代测序技术，人们得以逐渐清晰地认识非癌组织细胞中的突变累积及克隆演进动力学。非癌组织细胞中的突变具有广泛性、克隆性、选择性，既有可能影响肿瘤发生，也有部分突变利于组织修复及再生。这些研究成果加深了人们对非癌组织细胞突变导致组织稳态失衡及肿瘤发生的认识，为探究癌症的起源提供了新的方向和思路。在此，本文对更新活跃、易于突变累积的消化系统器官(食管、结直肠、肝脏组织)在本领域的研究进展进行综述，以丰富本问题的认知。

【关键词】体细胞突变;非癌组织;食管;结直肠;肝脏

突变是指生物体、病毒基因组核苷酸序列的改变。造成突变的可能原因包括染色体重组、DNA错误复制、DNA修复机制缺陷、诱变剂暴露、病毒感染等。突变通过核苷酸替换、片段插入或缺失、染色体重排和拷贝数变化等方式，在一级结构上改变DNA序列，进而导致编码蛋白量和质的变化［1］。一方面，突变是自然选择的最初来源，是生物进化的动力;另一方面，经典理论认为，关键癌基因、抑癌基因或其调控序列上发生的突变则是导致肿瘤发生的重要原因:突变将赋予早期肿瘤细胞克隆扩增优势，以及不受控制的生长、组织侵袭破坏、血管生成和逃避凋亡等能力。上述机制不断驱动基因在肿瘤细胞中正向选择，并造成肿瘤细胞克隆扩增，最终形成肿瘤演进过程中的正反馈，促进肿瘤形成和发展［2-3］。然而，在形态正常的细胞中，突变是如何选择与累积的，细胞的生物学行为又是如何受其影响的，人们在这方面的认识尚较为有限。

1发现非癌组织细胞突变的测序技术

从测序通量与准确性上来说，一代测序(Sanger测序法)虽是鉴定DNA序列改变的“金标准”，但其通量低、操作繁琐费时的弊端限制了人们对突变基因集的整体认识［4］。如今，以Illumina等公司为代表的二代测序技术利用桥式扩增及多片段拼接原理，则可对DNA进行高通量突变检测，比如全基因组测序(wholegenomesequencing，WGS)及全外显子测序技术(wholeexomesequencing，WES)。在二代测序平台上，WGS可对生物体整个基因组序列进行测序，以获得完整的基因组信息;WES可以检测基因组上编码区的突变情况，能够发现直接影响蛋白质氨基酸序列的遗传变异，目标性更强，测序成本也相对低廉，测序后数据的分析也相对简单［5］。对于非癌组织细胞来说，突变往往仅存在于分散且数量有限的克隆之中［6］，因此，识别非恶性组织中的体细胞突变，需要通过足够深度的测序才有可能得以实现［7-8］。近年来，随着高通量深度测序技术的发展，人们在非癌组织中发现了越来越多的突变累积，比例甚至高达37%。也就是说，在100个非癌形态和/或非癌生物学行为的“正常”细胞中，有近40%带有不同程度的基因突变［9-10］。这些带有突变的细胞群以小克隆的形式存在，在组织发育及细胞命运决定方面发挥着未被认识的新功能。目前，已在食管［11-13］、结直肠［14-16］、肝脏［17-19］、皮肤［20］、支气管［21］、子宫内膜［22-23］、尿路上皮［24-25］、血液［26-28］等多种类型的非癌组织中发现有体细胞突变的存在。其中，食管、结直肠上皮黏膜及肝脏是人体更新最为活跃的部位之一，此处的非癌组织突变易于产生“放大效应”，因此，本文主要就前三种消化系统器官组织的非癌细胞突变作一概述。

2非癌组织细胞突变的发现及其意义

借助超深度的测序技术，人们得以在非癌组织中探究体细胞突变情况。在某些情况下，部分发生突变的基因呈现聚类趋势，称为突变特征(mutationalsigna-ture，MS)。目前，人们已发现一百多种不同的MS，包括由紫外线照射或吸烟等外部因素引起的MS、由DNA修复机制缺陷等内在因素引起的MS两大类。MS的发现揭示了癌症发生中突变过程的多样性，对理解癌症的病因、提出新的治疗和预防措施均具有重要意义［1，29-31］。

2．1食管

食管是人体中最容易接触外源物质的器官之一，食管上皮细胞直接接触多种外源性刺激物，大大增加了突变的发生概率。Martincorena等［11］对9名20～75岁的志愿者的食管上皮样本进行了平均覆盖率为37×的全基因组测序以及74个癌基因的超深度(870×)靶向测序，鉴定出了8919个体细胞编码突变，并发现突变数量及突变克隆的大小随着志愿者年龄的增长而增加，为突变累积学说提供了确切证据。对突变基因的分析结果显示:在角质形成细胞分化中起关键作用的信号通路相关分子(NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、TP63、AJUBA)、细胞氧化应激相关分子(NFE2L2、TP53)、细胞周期蛋白(CCND1)、蛋白质修饰分子(PIK3CA、CUL3)、表观调控分子(KMT2D)均存在不同程度的突变累积，其中至少有11个基因与食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscarcinoma，ESCC)的发生密切相关。有趣的是，该研究还发现NOTCH1在食管非癌细胞中的突变频率远超癌变细胞。除NOTCH1基因外，Yokoyama等［13］在不同年龄、不同生活方式的139例ESCC患者中发现，非癌组织的PPM1D、NOTCH2、ZFP36L2、FAT1、NOTCH3、CHEK2和PAX9的突变频率均显著高于ESCC。这些以往被归为促癌基因的分子在非癌组织中的突变累积更高，提示这些癌基因仍为野生型的食管上皮更易发生肿瘤，刷新了人们的认识。此外，研究者在非癌食管组织的样本中总结了与重度吸烟、酗酒等生活方式相关的MS，并发现了与载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽家族(apolioproteinBmRNA-editingenzymecatalyticpolypeptide，APOBEC)等酶活性相关的MS，提示对于已出现酶活性MS的潜在ESCC患者来说，改善生活习惯可能为其带来更大的获益［32］。衰老通过累积突变使组织细胞获得多克隆性，是肿瘤发生的重要机制之一［33-34］。上述研究均发现衰老食管上皮中累积的突变与肿瘤中存在的突变存在部分重合，这提示ESCC发生后，细胞获得突变的速率及频率大大增加，可能是肿瘤演进的关键原因。进一步了解非癌食管组织中的突变情况，借此筛选出癌组织中的独有突变，这有助于发现并鉴定更多的癌基因，从而为肿瘤早期诊断和靶向治疗提供重要指导。

2．2结直肠

结直肠癌在全球发病率排名第三，死亡率排名第二［35］。不良的生活行为如高脂饮食、长期吸烟及酗酒均是结直肠癌发生的高危因素［36-37］。肠壁中广泛分布的三级淋巴器官、肠腔中高丰富度的肠菌生态与外源物质、肠道上皮黏膜高度活跃的更新周期，这些特点使结直肠更易于受到急慢性炎症攻击。Lee-Six等［14］利用显微切割及WES技术，在11～78岁志愿者的2035个非癌结肠隐窝中发现了可能驱动肿瘤发生的突变集，其中包括抑癌基因如AXIN2、STAG2及具有典型错义突变的癌症基因如PIK3CA、ERBB2、ERBB3、FBXW7等。研究者进一步发现，正常结直肠上皮、腺瘤、结直肠癌细胞中基因突变的相对频率也各不相同，例如:结直肠癌中APC、KRAS、TP53的突变非常普遍，但在非癌隐窝中非常稀少;而ERBB2、ERBB3等驱动突变在非癌隐窝中普遍存在，但在结直肠癌细胞中则较为少见。就这一点来说，结直肠上皮非癌性细胞与癌性细胞的突变模式是与以往认识相吻合的。溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)是结直肠癌发生的高危因素。与健康个体相比，UC患者结肠上皮细胞处于慢性炎症微环境中，较多的炎症因子及自由基分子使得细胞可能出现较高频率的基因突变［38］。Kakiuchi等［15］对健康人及UC患者的肠道隐窝分别进行全外显子测序，发现UC患者中存在多克隆性的隐窝重塑。在这些由NFKBIZ、TRAF3IP2、ZC3H12A、PIGR、HNRNPF等基因突变而被正向选择的克隆中，上皮间质细胞中IL-17和其他促炎信号均处于明显下调状态，提示上述正常隐窝中的基因突变兼有降低免疫反应的功能。一方面可能是慢性炎症过程中的适应性改变，对机体有益;但另一方面，带有突变的克隆间质处于免疫抑制状态，也可能为肿瘤发生过程中的免疫逃逸现象提供了分子基础。在长期慢性炎症状态下，血液中的PBMC也可能存在突变［26-27］。为排除这种因素的干扰，Nanki等［16］在除去免疫细胞中可能存在的突变后，利用人结直肠类器官模型及WES，进一步验证了NFKBIZ、ZC3H12A和PIGR在UC患者中处于突变状态。但UC患者肠上皮细胞中普遍存在的NFKBIZ突变却较少出现在UC相关性结直肠癌中，这提示结直肠癌发生过程中存在针对NFKBIZ突变细胞的负向选择机制，NFKBIZ突变不利于结直肠癌发生。这个推测在NobuyukiKakiuchi的NFKBIZKO突变小鼠模型中得以验证:研究人员发现带有该突变的小鼠在诱变剂的处理下，结直肠肿瘤发生比例也显著降低，这可能与NFKBIZ突变不利于结直肠上皮细胞生存有关［16］。上述研究不仅描述了结直肠癌发生过程中隐窝携带驱动突变，并在肿瘤演进过程中逐渐建立选择优势的路径;也同时展示了结直肠癌突变克隆的范围、驱动突变频率等演进动力学指标，有助于深化人们对肿瘤发生发展过程的理解。

2．3肝脏

肝脏是人体重要代谢器官，大多数的药物及毒物均在肝脏中进行分解代谢，而部分代谢产物具有比原形更活跃的促突变能力，这一特点使肝脏更易暴露于促突变物质中。另一方面，肝脏是一个易于受到炎症、缺血缺氧等内部因素打击的器官。同时，肝炎病毒、酗酒等因素是导致肝脏慢性损伤的重要原因［39-41］，也是突变产生的重要因素。这些特点使肝癌的发生率占据所有恶性肿瘤的第五位［35］。为揭示肝癌发生的遗传学基础，Kim等［18］研究了肝癌高危病变—肝硬化中再生结节(regenerativenodule，RN)组分细胞的突变情况。对205个肝硬化RN进行了30个肿瘤相关基因的深度靶向测序，在其中47个RN中检测到阳性结果:HCV相关RN中含有ARID1A、ARID2和TP53的体细胞突变;HBV相关RN中发现了NCOR1、TSC1和CDKN1A的体细胞突变;提示病毒感染相关的RN可以获得具有癌症相关基因突变的细胞亚群，为研究肝炎－癌转化的机制提供了分子基础。令人意外的是，这205个RN中均未检测到端粒酶逆转录酶(telomerasereversetranscriptase，TERT)启动子突变，提示TERT激活可能是肝硬化RN发展为肝细胞癌的关键因素。除此之外，Brunner等［17］通过对482个正常肝组织和肝硬化组织的显微切割样本进行70×WGS，发现在正常肝细胞存在1%～5%的突变驱动克隆;在正常肝组织和肝硬化样本的突变数据中，均包含抑癌基因ACVR2A、ARID2、ARID1A、TSC2等基因的失活突变，但肿瘤中的差异突变则只剩下ACVR2A，并带有较多ALB突变。ALB编码白蛋白，在正常肝组织中具有较高的转录频率，在该项研究中由于插入缺失突变而失活。这似乎提示插入缺失突变可能优先发生在多次转录的模板基因中。高转录活性的基因为何易于发生插入缺失突变，这同样是一个值得深入探究的科学问题。有意思的是，Zhu等［19］通过CRISPR技术建立小鼠基因突变模型，对测序结果突变频率较高的PKD1、KMT2D、ARID1A等基因进行了体内水平的验证，发现这些突变在一定程度上能促进肝组织再生。这提示并不是所有的突变均只是单方面的有害突变，有些还可能有助于增加肝细胞的适度再生，有益于肝脏功能。肝脏具有的MS集合有助于解释其从慢性肝病到肝癌的复杂转变过程。慢性肝病组织比正常肝脏脂质存在更多高度动态变化的克隆，这些克隆被纤维化带所隔离，具有显著区域性特征。值得注意的是，肝脏非癌组织带有的部分突变既可能促进肝组织再生，也可具有促进肿瘤的潜能。这些突变如何在损伤修复－肿瘤发生过程中“博弈”?其综合效应为何?可能更大程度上依赖于突变特征以及克隆规模，尚有待于进一步研究。

3展望

由于很难捕捉到非癌组织“突破”至早期肿瘤的节点，因此大多数非癌细胞累积突变的研究样本只能取自已经发生肿瘤的手术患者。对处于肿瘤发生最起始阶段细胞的突变研究仍非常有限，造成我们对肿瘤起源细胞的性质、突变时空节点、所涉及的遗传事件和分子机制以及这些事件如何受到微环境或接触致癌物的影响等，至今仍知之甚少。另一方面，基因突变频率也并不是肿瘤发生与否的唯一决定因素，发生突变的基因对细胞发育的影响程度也同样重要。这就要求后续研究不仅要发现更多、更早期的突变，且更需要在患者长期随访或转基因动物模型中对突变基因功能进行验证，以为肿瘤发生提供更为坚实的证据。这个过程可能艰难而漫长，但也许将会带来上世纪七八十年代后癌基因发现的另一个高峰。通过超深度测序技术对非癌组织进行的深入研究，可能会取得意料之外的收获。前文已述，出现在一些慢性疾病(如慢性肝病)组织细胞中的突变可能会通过促进组织再生发挥对机体保护作用，这种现象在未来可能会成为解决一些慢性疾病治疗的关键，同样值得深入研究。

作者：喻博 崔红娟 陈东风 王涛 陆军 单位：军医大学大坪医院消化内科 西南大学医学研究院癌症研究中心