PBL教学法实例讲解如何发现引物污染

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摘要:目的验证以问题为基础(pbl)教学法在提高学生处理聚合酶链反应(PCR)污染能力方面的作用。方法以PCR假阳性为实例,采用PBL教学法引导学员合理设立空白对照,通过重复试验探究污染来源。结果学员在思维引导帮助下逐步发现PCR污染来源于引物污染,并对试验方法及理论有了清晰的认识。结论以实例讲解为基础的PBL教学法可有效提高学生认识和处理PCR污染的能力。

关键词:以问题为基础教学法;实例讲解;定量聚合酶链反应;引物污染

随着生物科技的发展,以聚合酶链反应(PCR)为主的核酸试验应用越来越广泛[1],实验室质量控制和生物安全是PCR技术初学者应掌握的重要内容[2]。不论是中学、大学实验课的学生还是实验技术方面的初学者对避免核酸污染等质量控制的意识均不强。由于PCR耗时较长,注意力不易集中[3],容易受核酸污染,必须设计空白对照才能及时发现假阳性结果[4],但枯燥的理论讲解学生不易接受,教学效果不好。以问题为基础(PBL)教学法是一种基于“问题”为中心的教学模式,是目前国际上较为流行的一种教学法。案例选择和问题设计是PBL教学法的主要切入点,对初学者理解抽象问题非常有帮助。本文围绕在一次PCR教学试验中发现空白对照管中有核酸污染的实例,遂把PBL教学法应用于枯燥的对照重复试验,理清了发现和判定核酸污染来源的过程,学生们反映教学效果很好,理解较为深刻。

1资料与方法

1.1学生情况及试验事件

小班教学,学生5人,教学过程发现空白对照管有核酸扩增,于是采用PBL教学法[5],以实例为引导,设计教学试验,结合实际图表,启发学生分层思维,最终引导学生们找到污染源。

1.2一般资料

组织来源为6份液氮冻存的SD大鼠肝脏组织。大鼠来源的Yes相关蛋白(YAP)引物两种,分别由美国Invitrogen和中国上海生工公司设计合成,均具有较好的特异性。

1.3仪器与试剂

荧光定量PCR仪为RocheLightCycle(2.0)系统,软件版本3.5。采用Trizol总RNA试剂提取总RNA,取材器械、冻存管及双蒸水(ddH2O)均经1%二乙基焦碳酸酯水处理。反转录试剂盒(DRR03S)及荧光定量PCR试剂盒(DRR041S)均购自TaKaRa宝生物工程大连有限公司。

1.4方法

PBL教学法采用案例选择、问题设计、思维导图、情景教学等,以实例为线索,以学生为主导。

1.5试验技术方法

RNA提取应用Trizol、氯仿、异丙醇提取,75%乙醇洗涤RNA沉淀。应用凝胶电泳法(琼脂糖)鉴定RNA未被降解,以紫外分光光度计对RNA样品进行纯度分析和定量。反转录合成cD-NA按试剂盒配制反应体系。1.6统计学处理采用LightCycler数据分析软件对数据进行分析处理。直观比较Ct值[6],Ct值越大,起始模板数越低。

2结果

2.1以实例为引导,使学生直观认识什么是核酸污染

PCR扩增试验结束后发现“空白对照管”的反应曲线清晰可见,说明该反应体系内有核酸扩增,可推断空白对照管反应体系内存在核酸污染。通过反应曲线图学生们对“假阳性”有了直观认识。

2.2问题出在哪里?

引导学生自问自答空白对照管中含有3种成分:ddH2O、引物及PCR试剂,其中ddH2O的配制、分装、加样过程操作较多,比较容易污染,而且ddH2O较引物和PCR试剂更容易获取,应作为首先排除对象。

2.3与学生一道设计验证试验

选用新的ddH2O作为对照,重复试验,同时原ddH2O同步参与重复试验,试验反应条件不变,引物不变,挑选扩增曲线较好的7号样品作为cDNA模板,观察在含新ddH2O的反应体系中是否有核酸扩增,结果见表1。通过比较PCR结束后的Ct值可比较反应体系的起始模板核酸量,Ct值越大,核酸量越小。

2.4ddH2O污染的可能性很小

学生们一致认为,B管和D管均无模板,但均有核酸扩增,Ct值差别不大(即起始模板数差别不大),所以2个反应体系均有核酸污染,且污染程度相近。因B、D这2管分别为不同的ddH2O,2次配制的ddH2O均有污染的可能性较小。特别是B、D这2管的Ct值相近,污染程度相同,故暂不考虑污染源是ddH2O。另外,学生们认为,A管和C管有相等数量模板,ddH2O不同,因Ct值差别不大,说明起始模板数差别不大,同样说明2次配制的ddH2O无明显差别。因此,前、后2次ddH2O均被污染的可能性均很小,综合分析后考虑为ddH2O以外的试剂有污染。

2.5教员思维引导,学生制订方案

教员提示:试验所用引物一般来自2家公司,每次所用引物是经过分装的。学生们思考后认为,分装引物过程存在污染的可能,如需验证引物污染,可以选取未开封、未分装的原引物。另外,可选用另一家公司的引物同时做对照,发现原引物出厂时已被污染。进一步重复试验,试验条件不变,目的是验证原分装引物中是否有核酸污染。见表2。Ct值很大说明起始模板的核酸量很小,Ct值为0.00,说明反应体系内不含核酸模板。

2.6引物

1(首次试验分装后的引物)为污染源学生们逐条分析:H管含标准模板,扩增同前,提示引物2可用。F管、G管无扩增,说明ddH2O、PCR试剂、引物1'(新开封的引物1原装液)及引物2(另一家引物公司设计及制备的引物)均无核酸污染。E管反应体系未加入cDNA模板但仍有核酸扩增,考虑引物1有污染,结合E管扩增曲线Ct值远远大于有标准模板扩增的H管,说明起始模板数很小,这符合试验中引物加样量较小的实际情况。全体学生一致认为,分装引物1内的核酸污染是污染源,推测是引物分装或加样过程中污染。

3讨论

在分子生物学教学实践中,有关PCR中核酸污染的内容是一个难点。在理论层面,学生们基本掌握核酸污染方式中最重要的是气溶胶污染[7],因此,包括PCR在内的核酸试验被要求在生物安全柜内进行操作。在污染源分型上亦不难理解,常见污染类型包括:(1)标本污染,包括收集标本的容器污染,标本密封不严造成交叉污染及核酸提取过程中吸样枪污染。(2)PCR试剂污染[8],包括加样枪、容器、ddH2O等溶液被PCR核酸模板污染。(3)PCR产物污染,有报道PCR产物污染离心机,导致气溶胶颗粒在离心机气流作用下进入到未盖严的离心管中[9-10]。本文通过激发学生的逆向思维分析,主动了解污染类型及污染可能来源,使孤立的试验方法变得系统,使试验教学更生动、高效,增强了学生的主动性,提高了学习效率。教学中常常强调PCR污染的监测可通过对照试验来实现,阴性对照尤为重要,每次PCR务必做阴性对照,包括不加模板的空白对照、不加引物的空白对照及模板和引物均不加仅有试验试剂的空白对照等。但学生们没有切身感受,常有侥幸心理,为了减少试验步骤、节省时间会省略部分甚至全部阴性对照的配制。本研究就是没有设置无引物的对照,所以导致无法在发现假阳性的第一时间判断污染的来源。本教学试验中发现空白对照有DNA扩增,污染来源不明,当无法准确判断污染源时需进一步设计对照试验,以找出污染源。进一步的试验仍需要设立空白对照,根据下一步试验结果确定或排除某类污染源,最后通过试验验证污染源。引物污染较隐蔽,对试验结果的影响容易被忽视,只有设立良好的空白对照,才能及时发现假阳性和判定假阳性的来源。引物污染具有不易被发现的特殊性[11-12],由于担心原装引物内有污染,试验中学生们拓展思维,应用了2个不同的引物进行PCR扩增,一个是新开封的引物原装液,另一个是另一家引物公司设计及制备的引物,从2个层级搜寻污染源,最终发现是分装的引物内有核酸污染,可能是在分装过程或使用过程中被污染。这期间,学生参与了试验设计方案,对设计过程及试验过程均透彻理解。教学中教员进一步强调,鉴于核酸污染的发生率较高,并且所导致的后果严重,PCR实验室内应采取相应的措施防范污染。一些单位参照美国PDCA[P策划(P)、实施(D)、检查(C)、处置(A)]质量管理循环体系,在控制实验室污染方面已经取得明显效果[13]。另外,通过加强PCR分析前的质量控制[14]、对实验室进行环境监测,均有利于提高检测结果的准确性[15]。以上诸多措施均是避免PCR污染的有效方法,但如果不设空白对照却无法发现污染源,如果空白对照不够全面,亦无法判定污染来源。空白对照的设立是PCR发现和判定假阳性的关键,是避免试验结果受核酸污染影响的重要手段。PBL教学法的目的是提高学生发现问题、解决问题的能力,因此,设计问题要紧密结合PCR的实际,由浅入深、层层推进,让学生能够思路清晰、逻辑清楚地完成实验流程,从而解决试验中的问题。本文应用PBL教学法加实例教学,把复杂的PCR污染问题逐步转化为层次分明、逻辑清楚的科学问题,突破传统教学模式。在试验教学过程中,教师由知识的传授者转变为逻辑分析的引导者,通过学生自主学习和理解解决疑难问题。

作者：王成 赵刚 孔亚林 蒲猛 戴竞耀 刘承利 单位：空军特色医学中心 肝胆外科 外科学教研室