艾滋病抗病毒治疗与实验室检测进展

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实验室检测是艾滋病临床诊断、病程进展监测、抗病毒治疗启动、治疗效果监测、耐药性检测及调整治疗方案等诊疗工作不可或缺的技术支撑。为满足不断增加的艾滋病诊断和治疗相关的防治需求，全国艾滋病实验室网络不断发展壮大。特别是实施“四免一关怀”政策以来，实验室网络建设快速持续发展，检测技术和检测策略也适时进行完善、更新，为艾滋病诊断和治疗提供了有力的技术支持和质量保证，助力我国艾滋病防治工作取得显著成效。

1艾滋病检测实验室网络建设与发展

2006年发布的《全国艾滋病检测工作管理办法》中，将艾滋病检测实验室分为三类，分别为参比实验室、确证实验室和筛查实验室［1］，规定了各类实验室的具体管理办法，为全国艾滋病实验室网络规范化管理奠定了基础。在《中国遏制与防治艾滋病行动计划》（2006－2010年）中提出实验室建设发展应建成覆盖县级以上的国家艾滋病监测体系和筛查实验室网络［2］，健全市级以上确证实验室网络。之后的“十二五”和“十三五”《中国遏制与防治艾滋病行动计划》进一步为实验室网络建设与发展提供了强大的发展动力［3-4］。截至2021年底，我国已有筛查实验室13261个和检测点35912个，覆盖了96.9%的县级行政区域。确证实验室739个，覆盖了91.7%的地级行政区域。遍布全国的筛查和确证实验室，为各地进行艾滋病诊断提供了技术保证。同时，随着抗病毒治疗需求增加，CD4细胞、病毒载量、基因型耐药检测技术平台也得到了快速发展。截至2021年底，全国各级疾病预防控制系统和医疗机构等共有1195个实验室具备了CD4细胞检测能力，446个实验室具备了病毒载量检测能力，61个实验室具备了基因型耐药检测能力，为国家免费抗病毒治疗工作的大规模开展提供了检测技术保障，使我国超过百万HIV感染者的治疗效果得到科学评估。实施“四免一关怀”政策以来，2004年在自愿咨询检测门诊实施免费抗体筛查检测，2006年起在疾病预防控制机构实施免费CD4细胞检测和病毒载量检测，2008年起在疾病预防控制机构实施免费抗体确证检测［5］，这些免费政策有力促进了全国艾滋病筛查、确证和治疗相关的检测工作。

2艾滋病检测质量保证体系的建立和发展

为加强艾滋病检测工作的规范化管理，不断完善检测质量，为临床诊断和治疗监测提供准确的检测结果，有效服务于临床诊断和治疗相关的检测需求，国务院出台了一系列政策文件对艾滋病检测实验室网络的建设提出具体要求和发展目标［2-4］。艾滋病检测质量保证体系也在同步建立和完善，目前已建立了国家级质量保证体系和省级质量保证体系［5］。

2.1国家级质量保证体系

国家级质量保证体系以中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心参比实验室为核心，负责组织编写和修订一系列检测质量保证指南，指导各级实验室的艾滋病检测质量保证工作。主要包括《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测质量保证指南》《HIV-1病毒载量检测及质量保证指南》《HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南》等［6-8］。此外，参比实验室组织各类检测项目的国家级培训，对各级实验室开展现场技术督导，以及对艾滋病检测试剂质量进行监测。国家级质量保证体系的一个重要技术支撑是参比实验室组织的国家级能力验证（ProficiencyTesting，PT）。自1998年启动血清学检测能力验证（包括快速筛查、ELISA筛查、WB确证）以来，先后启动CD4细胞检测能力验证（2003年）、HIV-1病毒载量检测能力验证（2005年）、HIV-1基因型耐药检测能力验证（2006年）。国家级质量保证体系的不断发展完善，有效覆盖了全国各省的确证实验室，CD4细胞、病毒载量和耐药检测实验室，实验室的考评合格率不断提升，近年来各检测项目的考评合格率均稳定达到95%以上。此外，参比实验室还组织开展乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、梅毒非特异性抗体、梅毒特异性抗体、HIV-1新发感染等检测项目的能力验证。每年对所有能力验证结果和实验室质量管理情况进行综合考评。自2013年起，全国艾滋病检测实验室管理信息全部纳入电子信息管理平台，所有质量管理考评结果通过电子信息系统进行录入和统计，极大提升了网络实验室的信息收集和管理能力。

2.2省级质量保证体系

各省（自治区、直辖市）也逐步建立和发展了以艾滋病确证中心实验室为核心的省级质量保证体系，包括对辖区内筛查实验室的血清学抗体检测能力验证，对辖区内所有艾滋病检测实验室的质量管理考评，对下级实验室进行检测技术和质量控制的分级培训和现场技术督导。部分省份实现了质量管理考评的电子化数据上报与管理。省级质量保障体系的建立有力推动和促进了省级以下艾滋病检测实验室的质量管理和检测质量，基本满足了各地不断增加的诊断和治疗检测需求。

3艾滋病检测技术和检测策略的发展

自1985年美国批准第一种HIV抗体酶联免疫检测试剂以来，艾滋病检测技术和策略不断发展。作为我国艾滋病检测工作的纲领性文件，《全国艾滋病检测技术规范》不断发展和完善（2004版，2009版、2015版、2020版）［9］，适时纳入国内外最新的检测技术和策略进展，更好地满足我国艾滋病检测工作需求，有效指导各级实验室的艾滋病检测工作。

3.1HIV血清学检测

HIV血清学检测可用于HIV感染者的筛查和确证。我国目前广泛用于HIV感染者血清学筛查的酶联免疫检测和快速检测主要使用检测抗HIV1/2抗体的第三代筛查检测试剂，检测窗口期为感染后3~4周。近年发展的可同时检测HIV-1p24抗原和抗HIV1/2抗体的第四代筛查检测试剂，检测窗口期缩短到感染后2周左右，在我国各级检测实验室的应用日益增加。化学发光免疫检测是近年来发展的新技术，由于用发光底物替代ELISA显色底物，背景很低，因此灵敏度优于常规的酶联免疫检测。化学发光免疫检测可以实现高度自动化和高通量分析、快速出报告，已成为临床测定微量抗原或抗体的主流技术［10］。快速检测试剂一般操作简单，在10~30分钟内出结果。目前，我国批准的快速检测试剂可使用包括血液、口腔黏膜渗出液、尿液在内的多种样本，满足了不同应用场景的需求。2019年，我国药品监督管理局批准了国际上首个基于尿液样本检测的快速检测试剂，也可用于HIV自我检测，进一步提高了HIV筛查检测的可及性［11］。筛查检测的技术进步促进了HIV感染者的早期检测和发现。

3.2HIV-1病毒载量检测

我国于1997年引进HIV-1病毒载量检测技术，早年主要使用基于反转录PCR（Reversetranscriptase-polymerasechainreac⁃tion，RT-PCR）、核酸序列依赖性扩增（Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）、分枝DNA（BranchedDNAsignalamplification，bDNA）等原理的检测技术，2010年以来基于实时荧光定量PCR（Re⁃al-timePCR）原理的检测技术逐渐发展。2015年和2019年，基于bDNA和NASBA原理的检测技术已经分别停用，基于实时荧光定量PCR的病毒载量检测技术逐渐成为主流［12］。2016年以来国产HIV-1病毒载量检测试剂不断发展，多项研究显示国产检测试剂与进口检测试剂之间的差距逐渐缩小［13-14］。HIV-1病毒载量即时检测（molecularpoint-of-careTest⁃ing，POCT）技术可快速获得结果，有效减少从采样到反馈结果的时间，适合在资源有限地区应用。近年来，WHO推荐将病毒载量即时检测用于及时监测HIV感染者的抗病毒治疗效果，以加快结果返回和临床决策的时间［15］。我国已有通过国家药品监督管理局认证的HIV-1病毒载量即时检测设备，检测过程可在90分钟内完成［16］。既往HIV-1病毒载量检测主要用于监测抗病毒治疗的效果，或辅助HIV感染诊断。随着我国持续推动扩大检测策略，越来越多的早期感染者可以通过抗原抗体或抗体筛查发现，而抗体确证检测方法由于窗口期较长（4~5周），存在延迟诊断的情况［17］。为尽早明确感染状态，2015年的《全国艾滋病检测技术规范》明确提出使用病毒载量检测作为补充试验的策略［18］，对于筛查试验有反应者建议核酸检测或2~4周后复查。在2018年的《中国艾滋病诊疗指南》和2019年的《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》行业标准中［19-20］也明确提出对于成人、青少年及18月龄以上儿童，HIV抗体筛查试验有反应和血浆病毒载量大于5000拷贝/mL时，即可诊断HIV感染。核酸检测作为补充试验策略，可极大提高HIV-1抗体不确定样本的诊断率及诊断效率，缩短诊断周期，使感染者及早获得治疗［21-22］。

3.3CD4细胞检测

CD4细胞检测是判断HIV感染者免疫状况、临床分期，评价抗病毒药物治疗效果的重要指标。常用的CD4细胞检测方法分为两类，一类是流式细胞仪测定法，包括双平台法（DPT）和单平台法（SPT），另一类是非流式细胞仪测定法，如基于成像技术的细胞计数仪。双平台法始于20世纪90年代，使用血液分析仪检测淋巴细胞总数，同时使用流式细胞仪CD3/CD4或CD3/CD4/CD45抗体检测CD4细胞所占淋巴细胞百分比，由此计算出细胞数。双平台法计算结果的影响因素较多，不同实验室差异较大且操作步骤复杂，结果稳定性较低。单平台法于1996年提出，可应用流式细胞仪配以三色、四色流式试剂和内参绝对计数微球，一步获得T细胞亚群的相对数（百分比）和绝对数，计数结果的重复性和准确性都能得到良好保证。我国学者通过研究确定了我国部分省及少数民族健康人T淋巴细胞参考值范围［23］，并通过研究我国感染者的外周血T淋巴细胞14种表型正常参考值［24］，以及样本存放温度及时间对于外周血CD4细胞测定结果的影响［25］，为我国建立CD4细胞计数技术平台奠定了基础。我国CD4细胞计数检测一直使用进口仪器配套进口试剂，价格昂贵且实验室运行成本高，通过对临床通用性CD4细胞检测试剂进行研制，国产CD4荧光单克隆抗体试剂于2014年获得国家药品监督管理局注册［26］。近年来CD4细胞的即时检测设备也在不断发展，目前国内外已有多种基于微流控芯片或成像技术的CD4细胞即时检测设备。我国药品监督管理局也批准了多个CD4细胞即时检测设备，检测过程可在20分钟内完成，为HIV感染者提供了CD4细胞的现场检测方式［27］，为基层艾滋病治疗效果监测提供了更多便捷可靠的技术手段。

3.4HIV-1基因型耐药检测HIV耐药是指病毒因

发生变异而对某种药物敏感性降低。耐药变异株的出现源于HIV的快速复制更新和HIV反转录酶的高错配率，导致高突变率和新病毒株不断产生。在抗病毒药物存在的情况下，耐药毒株被药物选择成为优势株。H1V感染者的耐药检测对于抗病毒治疗具有重要指导意义。HIV耐药检测方法可分为基因型检测和表型检测。HIV-1耐药基因型检测基于对耐药相关基因突变的检测，检测病毒基因的pol区是否存在与抗反转录病毒药物（如蛋白酶抑制剂、反转录酶抑制）易感性降低相关的突变，并利用耐药基因型解释系统判断是否耐药以及耐药程度。目前我国HIV-1基因型耐药检测采用商品化试剂盒或实验室自建（In-house）方法。商品化耐药检测试剂盒检测费用高昂，难以在我国广泛应用，因此我国主要使用In-house方法。2010年国内首个以In-House方法为基础的全国HIV-1基因型耐药检测质量保证参考标准的研究，推动了国内HIV-1基因型耐药检测的实验室标准化［28-29］。2015年我国自主研究制备的基因型耐药能力验证质控品保证了从耐药样本采集、保存到传递送样的标准化和检测结果准确性［30］。近期有研究根据中国HIV-1主要流行株，在扩增蛋白酶区和反转录酶区的基础上，建立了扩增整合酶区的基因型耐药检测方法［31］。近年发展的二代测序技术是一种快速、高通量的测序方法，能同时对多个样本进行全基因深度测序，也被广泛应用于HIV-1耐药基因型检测［32］。HIV-1耐药表型检测基于体外培养技术，通过检测待检样本中病毒生长所需的药物半抑制浓度或90%抑制浓度（IC50或IC90），与敏感参考株的IC50或IC90进行比较，得到耐药倍数，进而判断待检测样本的耐药程度。国内实验室基于假病毒pNL4-3Lac的表型耐药性检测方法结合了pSG3Aenv和pNL4-3检测系统的优点，能高通量评价HIV对药物的耐受性，可用于感染者耐药性分析和抗病毒药物筛选［33］。

4挑战与展望

我国已经建立了数目庞大的艾滋病检测实验室网络和较为完善的分级质量保证体系，实验室检测技术能力不断增强，国产检测试剂与进口试剂的差距逐渐缩小，为全国艾滋病治疗工作提供了有力的技术保障。但检测工作仍然面临着新的挑战，在实验室网络建设方面，艾滋病确证实验室布局不合理问题日益突出。目前全国70%~80%的确证实验室分布在疾病预防控制机构，如何推动医疗机构开展确证检测，推动核酸诊断策略的临床应用，是尽快广泛实现艾滋病一站式诊疗服务面临的关键挑战之一。此外，对于数量持续增长的各类艾滋病检测实验室，如何进行合理有效的分级管理和分级质控，也是保证检测质量的持续挑战。随着精准治疗、个体化治疗的发展和治愈案例的出现，以及临床对快速获得检测结果的迫切需求，未来将会有更多实验室检测新技术助力提升临床诊断和治疗监测服务，包括进一步缩短窗口期的检测新技术，即时核酸检测技术促进感染者及时获知抗病毒治疗效果、尽早发现耐药、提高治疗依从性；核酸定量检测也将不仅限于RNA，定量检测HIV-1DNA的技术将有助于了解细胞基因组中整合的前病毒DNA水平，为评估治疗效果和判断预后提供更加精准的技术手段；受HIV高度变异和复杂准种的影响，目前的基因型耐药检测方法尚不能检出占病毒准种20%以下的劣势耐药毒株，亦需要发展新的检测技术。

作者：金聪 邱茂锋 潘品良 姚均 肖瑶 邢文革 吕毅 刘佩 蒋岩 单位：中国疾病预防控制中心 性病艾滋病预防控制中心